Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

टाइप 1 मधुमेह और एकाधिक ऑटोइम्यून रोगों के लिए एक उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस 7-प्लेक्स परख एक साथ स्क्रीनिंग

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/61160
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 1
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Beijing Hospital, National Center of Gerontology; Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Department of endocrinology, Guangzhou First People's Hospital, School of Medicine, South China University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

हम एक साधारण मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख का मॉडल बनाते हैं जो 7 ऑटोएंटीबॉडी परख को एक साथ जोड़ता है। परख टी 1 डी और कई अन्य ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए स्क्रीनिंग करने में सक्षम है, एक साथ, जिसमें सीलिएक रोग, ऑटोइम्यून थायरॉयड रोग और ऑटोइम्यून पॉलीग्लैंडुलर सिंड्रोम 1 शामिल हैं।

Abstract

आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज (आईएबीएस) का व्यापक रूप से टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) निदान और भविष्यवाणी में उपयोग किया जाता है। बीमारी की भविष्यवाणी में इंसुलिन (आईएए), ग्लूटामेट डिकार्बोक्सिलेज -65 (जीएडीए), इंसुलिनोमा एंटीजन -2 (आईए -2 ए), और जिंक ट्रांसपोर्टर -8 (जेडएनटी 8 ए) के लिए चार प्रमुख आईएबी समान रूप से महत्वपूर्ण हैं। वर्तमान में, टी 1 डी के निदान वाले 40% तक रोगी अन्य ऑटोइम्यून विकारों को विकसित करते हैं। दुर्भाग्य से, माप के लिए एकल ऑटोएंटीबॉडी का उपयोग करने वाले वर्तमान स्क्रीनिंग विधियां बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग अध्ययनों के लिए श्रमसाध्य और अक्षम हैं। हमने हाल ही में इन वर्तमान मुद्दों को संबोधित करने के लिए एक सरल मल्टीप्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) परख विकसित की है। परख सभी 7 ऑटोएंटीबॉडी परीक्षणों को एक कुएं में जोड़ती है। प्रत्येक कुएं में तीन आईएबी (आईएए, जीएडीए और आईए -2 ए), ऑटोइम्यून थायरॉयड रोग का पता लगाने के लिए थायरॉयड पेरोक्सीडेज (टीपीओए) और थायरॉयड ग्लोब्युलिन (टीएचजीए) के लिए ऑटोएंटीबॉडी, सीलिएक रोग के लिए ऊतक ट्रांसग्लूटामिनेज (टीजीए) के लिए ऑटोएंटीबॉडीज और ऑटोइम्यून पॉलीग्लैंडुलर सिंड्रोम -1 (एपीएस -1) के लिए इंटरफेरॉन अल्फा (आईएफएनए) के लिए ऑटोएंटीबॉडी शामिल हैं; जिनमें से सभी एक साथ टी 1 डी और अन्य प्रासंगिक ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए स्क्रीन करते हैं। मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख एकल ईसीएल परख मंच पर आधारित है, लेकिन इसके बजाय मल्टीप्लेक्स प्लेट का उपयोग करता है, जो 10 तक के कई ऑटोएंटीबॉडी परखों को एक ही कुएं में जोड़ता है। एकल ईसीएल परख से मुख्य अंतर यह है कि द्रव-चरण में गठित प्रत्येक एंटीबॉडी-एंटीजन कॉम्प्लेक्स को मल्टीप्लेक्स प्लेट पर एक लिंकर सिस्टम के माध्यम से प्रत्येक कुएं पर एक विशिष्ट स्थान पर नियंत्रित किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में 7-प्लेक्स ईसीएल परख को मानक रेडियो-बाइंडिंग परख (आरबीए) और एकल ईसीएल परख के खिलाफ मान्य किया गया है, जिसमें नए निदान किए गए टी 1 डी रोगियों के एक बड़े समूह और आयु-मिलान स्वस्थ नियंत्रणों का उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उत्कृष्ट परख संवेदनशीलता और विशिष्टता होती है।

Introduction

टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) एक गंभीर पुरानी बीमारी है जो बचपन में सबसे आम है। वर्तमान में, संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 1.4 मिलियन लोगों के पास टी 1 डी है; आश्चर्यजनक रूप से, टी 1 डी की घटनाएं दुनिया भर में हर साल 3-5% की दर से लगातार बढ़ रही हैं और पिछले दो दशकों में दोगुनी हो गई हैं, खासकर छोटे बच्चों में 1,2। रक्त परिसंचरण में आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज (आईएबीएस) वर्तमान में सबसे विश्वसनीय बायोमार्कर हैं। नैदानिक टी 1 डी विकसित होने से वर्षों पहले आईएबीएस दिखाई दे सकताहै। वर्तमान में, टी 1 डी निदान और जोखिम स्क्रीनिंग में चार प्रमुख आईएबीएस का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसमें इंसुलिन (आईएए), ग्लूटामेट डिकार्बोक्सिलेज -65 (जीएडीए), इंसुलिनोमा एंटीजन -2 (आईए -2 ए), और जिंक ट्रांसपोर्टर -8 (जेडएनटी 8 ए) शामिल हैं। टी 1 डी विकास की भविष्यवाणी में ये चार आईएबी समान रूप से महत्वपूर्ण हैं। टी 1 डी के वर्गीकरण को हाल ही में रोग चरण 1 4 के रूप में सामान्य ग्लूकोज चयापचय के साथ किसी भी 4 आईएबीएस के ≥2 की उपस्थिति के रूप में फिर से परिभाषित किया गयाहै।

डायबिटीज ऑटोइम्यूनिटी स्टडी इन द यंग (डेज़ी) में, यह पता चला था कि टी 1 डी के लिए जोखिम वाले चार बच्चों में से एक को आइलेट, सीलिएक, थायरॉयड या रुमेटीइड ऑटोइम्यूनिटी में प्रगति करने की संभावना थी और अधिक आश्चर्यजनक रूप से, लगभग 40% रोगी जिन्हें टी 1 डी का निदान किया गया है, अंततः एक अतिरिक्त ऑटोइम्यून स्थिति विकसित करते हैं 5,6,7 . इन ऑटोइम्यून बीमारियों की भविष्यवाणी और निदान के लिए ऑटोएंटीबॉडी की पहचान आवश्यक है और रोगियों के लिए बेहतर नैदानिक देखभाल प्रदान करनी चाहिए। इन कई ऑटोइम्यून स्थितियों के लिए स्क्रीन करने के लिए वर्तमान में कोई आसान और सस्ता तरीका नहीं है। मानक रेडियो-बाइंडिंग परख (आरबीए) का उपयोग करके वर्तमान स्क्रीनिंग विधियां, एकल ऑटोएंटीबॉडी माप के साथ, बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए श्रमसाध्य और अक्षम हैं।

यहां, हम नव विकसित सरल मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख का वर्णन करेंगे, जिसे हमने एकल ईसीएल परख मंच 8,9,10,11 का उपयोग करके प्रमाणित किया है। मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख केवल 15 μL सीरम का उपयोग करके 7 ऑटोएंटीबॉडी परीक्षणों को एक ही कुएं में जोड़ती है, और एक साथ टी 1 डी और कई प्रासंगिक ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए स्क्रीनिंग करने में सक्षम है जिसमें सीलिएक रोग, ऑटोइम्यून थायरॉयड रोग और एपीएस -1 शामिल हैं। एक ZnT8A ईसीएल परख उस समय विकसित नहीं की गई थी और मल्टीप्लेक्स परख में शामिल नहीं थी। मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख टी 1 डी और कई ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए सामान्य जनसंख्या स्क्रीनिंग में उच्च थ्रूपुट के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करता है।

Protocol

अनुसंधान प्रोटोकॉल कोलोराडो मल्टीपल इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. बफर तैयारी

  1. लेबलिंग बफर (2x PBS, pH 7.9) बनाएँ। आसुत विआयनीकृत (डीडी) पानी के 400 एमएल का उपयोग करके, 10x PBS का 100 mL जोड़ें। समाधान के पीएच को समायोजित करने के लिए, 7.9 तक पहुंचने तक NaOH जोड़ें।
  2. पहले से बनाए गए लेबलिंग बफर के 588 μL में 1 मिलीग्राम बायोटिन को भंग करके 3 mM बायोटिन बनाएं। रु सल्फो-एनएचएस के 150 एनएमओएल को 50 μL लेबलिंग बफर में भंग करके 3 mM Ru Sulfo-NHS बनाएं।
  3. 1x PBS के 500 एमएल लेकर और घोल में 5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) जोड़कर एंटीजन बफर (1% बीएसए) बनाएं। एसिटिक एसिड समाधान का 0.5 एम तैयार करें। ट्रिज़मा बेस का उपयोग करके 1 एम ट्रिस-एचसीएल बफर तैयार करें और पीएच को 9.0 पर समायोजित करें।
  4. कोटिंग बफर (3% ब्लॉकर A) के लिए, 1x PBS का 500 mL लें और 15 ग्राम ब्लॉकर A जोड़ें। 1x PBS के 5000 mL को ट्वीन 20 के 2.5 mL के साथ मिलाकर वाशिंग बफर (0.05% ट्वीन 20, PBST) तैयार करें। सर्फेक्टेंट के साथ 500 एमएल डीडी पानी और 500 एमएल 4एक्स रीड बफर टी जोड़कर रीडिंग बफर (सर्फेक्टेंट के साथ 2एक्स रीड बफर टी) बनाएं।
    नोट: परख के बीच स्थिरता रखने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस समाधान दोनों लेबलिंग प्रक्रिया से ठीक पहले बनाए जाते हैं और भविष्य के उपयोग के लिए बनाए और संग्रहीत नहीं किए जाते हैं।

2. बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस के साथ प्रत्येक एंटीजन प्रोटीन को अलग से लेबल करना

नोट: अधिक प्रभावी लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए, ≥0.5 मिलीग्राम / एमएल की एंटीजन प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग करें।

  1. प्रत्येक एंटीजन प्रोटीन की दाढ़ संख्या और बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस की दाढ़ संख्या की गणना करें। बायोटिन या आरयू सल्फो-एनएचएस के लिए एंटीजन प्रोटीन के दाढ़ अनुपात के अनुसार लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए एंटीजन प्रोटीन में बायोटिन या आरयू सल्फो-एनएचएस की उचित मात्रा जोड़ें।
    1. एंटीजन के लिए जिसमें छोटे आणविक भार (≤10 केडीए) होते हैं, जैसे कि प्रोइन्सुलिन प्रोटीन, 1: 5 (एंटीजन: बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस) के दाढ़ अनुपात का उपयोग करें। एंटीजन के लिए जिसमें जीएडी प्रोटीन जैसे बड़े आणविक भार (>50 केडीए) होते हैं, 1: 20 के दाढ़ अनुपात का उपयोग करें। एंटीजन के लिए जिसमें मध्य आणविक भार (10-50 केडीए) है, 1: 5-1: 20 के बीच समायोजित दाढ़ अनुपात का उपयोग करें।
  2. बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस दोनों के लिए, प्रत्येक एंटीजन भार को उनके संबंधित आणविक भार से विभाजित करें ताकि प्रत्येक के लिए एंटीजन मोलर नंबर प्राप्त किया जा सके। बायोटिन के लिए मात्रा प्राप्त करने के लिए दाढ़ संख्या को एकाग्रता से विभाजित करें। Ru Sulfo-NHS के लिए इसे दोहराएं।
  3. चरण 2.2 में निर्धारित उचित दाढ़ अनुपात का उपयोग करके बायोटिन के साथ एंटीजन प्रोटीन मिलाएं। फिर Ru Sulfo-NHS के लिए भी ऐसा ही करें।
    नोट: लेबलिंग प्रतिक्रिया की दक्षता के लिए, बफर सिस्टम में ट्राइस या ग्लाइसिन जैसे किसी भी कम करने वाले रसायनों को साइज़िंग स्पिन कॉलम द्वारा 2x PBS बफर, pH 7.9 में आदान-प्रदान करने की आवश्यकता होती है। बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस के लिए लेबलिंग प्रोटोकॉल समान हैं।
  4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रतिक्रिया ट्यूबों को कवर करें और उन्हें 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें। पन्नी के साथ प्रतिक्रिया ट्यूबों को कवर करने का कारण यह है कि बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस अभिकर्मक दोनों प्रकाश संवेदनशील हैं।
  5. प्रतिक्रिया ट्यूबों के दौरान 2 एमएल या 5 एमएल स्पिन कॉलम को प्राइम करें (स्पिन कॉलम का आकार कॉलम पर अपलोड किए गए वॉल्यूम से निर्धारित होता है)। स्पिन कॉलम को 2x PBS बफर के साथ भरें और फिर इसे हर बार 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, कुल तीन बार।
  6. प्रतिक्रिया ट्यूबों के इनक्यूबेशन समाप्त होने के बाद लेबलिंग प्रतिक्रिया बंद कर दें। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, लेबल एंटीजन प्रोटीन को एक बार स्पिन कॉलम के माध्यम से पारित करके शुद्ध करें। फिर 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर कॉलम को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. अंतिम मात्रा द्वारा मौजूद एंटीजन प्रोटीन की मात्रा को विभाजित करके कुल लेबल एंटीजन एकाग्रता की गणना करें। प्रति ट्यूब शुद्ध लेबल एंटीजन प्रोटीन का एलिकोट 50 μL और लंबे समय तक उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट स्टोर करें।
    नोट: यह जानना महत्वपूर्ण है कि हर बार जब स्पिन कॉलम एंटीजन प्रोटीन से गुजरता है, तो लगभग 90-95% प्रतिधारण दर होगी।

3. परख के लिए दो लेबल एंटीजन के लिए सर्वोत्तम एकाग्रता और अनुपात परिभाषित करें (चेकरबोर्ड परख)

नोट: चूंकि इस 7-प्लेक्स परख में ईसीएल-आईएए परख को सीरम नमूनों के एसिड उपचार की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रत्येक एंटीजन के लिए चेकरबोर्ड परख को लेबल एंटीजन मिश्रण के साथ इनक्यूबेट करने से पहले इस चरण से गुजरना पड़ता है।

  1. मल्टीप्लेक्स परख चलाने से पहले प्रत्येक एंटीजन के लिए अलग से चेकरबोर्ड परख लागू करें। चरण 3.2-3.6 एक उदाहरण के रूप में GAD65 का उपयोग करेंगे।
  2. लेबल जीएडी 65 प्रोटीन के कमजोर पड़ने की गणना करें। बायोटिनिलेटेड जीएडी 65 के पहले मिश्रण समाधान की अनुशंसित लक्षित एकाग्रता 2000 एनजी / एमएल है और आरयू सल्फो-एनएचएस लेबल जीएडी 65 1000 एनजी / एमएल है। यदि स्टॉक समाधान में जीएडी 65 लेबल वाले बायोटिनाइलेटेड और आरयू सल्फो-एनएचएस दोनों की एकाग्रता 1.0 μg / μL है, तो 560 μL में बायोटिनाइलेटेड GAD65 के लिए आवश्यक मात्रा 1.12 μL होगी, और Ru Sulfo-NHS के लिए आवश्यक मात्रा 700 μL में GAD65 लेबल वाली मात्रा 0.7 μL होगी।
  3. एक ट्यूब में 240 μL स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित लिंकर 1 और 1% बीएसए के 160 μL के साथ बायोटिनाइलेटेड जीएडी 65 प्रोटीन के 1.12 μL मिलाएं। मिश्रण को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूब में 160 μL स्टॉप घोल जोड़ें और मिश्रण को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एक सीरियल कमजोर करें। मिश्रण के 280 μL को एक नई ट्यूब में लें और 1: 2 कमजोर पड़ने के लिए 280 μL स्टॉप घोल जोड़ें। कई नए ट्यूब तैयार करें। जीएडी 65 एंटीजन लेबल वाले बायोटिन के लिए क्षैतिज सीरियल कमजोर पड़ने को चलाने के लिए इस चरण को दोहराएं (पिछले प्रकाशन12 को देखें)।
  5. आरयू सल्फो-एनएचएस के 0.7 μL लेबल GAD65 (1 μg/μL) प्रोटीन को 700 μL स्टॉप सॉल्यूशन के साथ मिलाएं। फिर मिश्रण के 350 μL को एक नई ट्यूब में लें और 1: 2 कमजोर पड़ने के लिए 350 μL स्टॉप घोल जोड़ें। कई नए ट्यूब तैयार करें, जीएडी 65 एंटीजन लेबल वाले आरयू सल्फो-एनएचएस के लिए ऊर्ध्वाधर सीरियल कमजोर पड़ने को चलाने के लिए इस चरण को दोहराएं।
  6. दो सीरम नमूने तैयार करें, एक नमूना जीएडीए के लिए अत्यधिक सकारात्मक और एक नमूना जीएडीए के लिए नकारात्मक, प्रत्येक में 0.75 एमएल की मात्रा हो। 96-वेल पीसीआर प्लेट के बाईं ओर हर कुएं में 15 μL सकारात्मक सीरम का एलिकोट करें। 96-वेल पीसीआर प्लेट के दाहिने आधे हिस्से में हर कुएं में 15 μL नकारात्मक सीरम का एलिकोट करें।
  7. प्रत्येक कुएं में 0.5 एम एसिटिक एसिड का 18 μL जोड़ें और मिलाएं। आरटी में 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एक नई 96-वेल पीसीआर प्लेट तैयार करें। सीरियल कमजोर पड़ने के अनुसार प्रत्येक कुएं में बायोटिन लेबल एंटीजन के 17.5 μL और Ru Sulfo-NHS लेबल एंटीजन के 17.5 μL जोड़ें (पिछले प्रकाशन12 को देखें)।
  8. चरण 5.2 से 9.1 में वर्णित शेष परख चरणों को जारी रखें।
  9. संबंधित नकारात्मक नमूना संकेतों के खिलाफ उच्च सकारात्मक नमूने से सिग्नल अनुपात निर्धारित करें। बायोटिन लेबल एंटीजन और आरयू सल्फो-एनएचएस लेबल एंटीजन के लिए सबसे अच्छी एकाग्रता का चयन उस बिंदु की पहचान करके करें जिसमें सकारात्मक से नकारात्मक संकेत का उच्चतम या उच्चतम अनुपात है। इस अनुपात गणना में, नकारात्मक नमूनों से प्राप्त कम पृष्ठभूमि संकेत पर विचार करें।
    नोट: चेकरबोर्ड परख से आरयू सल्फो-एनएचएस और बायोटिन लेबल एंटीजन प्रोटीन की इष्टतम सांद्रता नीचे दिखाई गई है: जीएडी 65 के लिए 30 एनजी / एमएल और 200 एनजी / एमएल, प्रोइन्सुलिन के लिए 120 एनजी / एमएल और 120 एनजी / एमएल, आईए -2 के लिए 10 एनजी / एमएल और 42 एनजी / एमएल, टीजी के लिए 80 एनजी / एमएल और टीपीओ के लिए 80 एनजी / एमएल, टीपीओ के लिए 8 एनजी / एमएल और 16 एनजी / एमएल। टीएचजी के लिए 31 एनजी/एमएल और 31 एनजी/एमएल, और आईएफएन के लिए 12 एनजी/एमएल और 12 एनजी/एमएल।

4. मिश्रित लिंकर-युग्मित एंटीजन समाधान बनाएं

  1. चेकरबोर्ड परख के आधार पर प्रत्येक एंटीजन के लिए इष्टतम एकाग्रता का चयन करें। बायोटिन और रु सल्फो-एनएचएस लेबल एंटीजन को तर्कसंगत कामकाजी एकाग्रता में पतला करें।
  2. विशिष्ट रूप से बायोटिनिलेटेड एंटीजन प्रोटीन में से प्रत्येक के लिए अलग-अलग लिंकर बांधें। एक 96-वेल प्लेट परख के लिए, 4 μL बायोटिनाइलेटेड GAD65, TPO, TTG, THG, proinsulin, IFN-α और IA-2 प्रोटीन को 240 μL स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित लिंकर 1, 2, 3, 4, 8, 9 और 10 के साथ अलग ट्यूब में मिलाएं (चित्रा 1)। फिर प्रति ट्यूब पीबीएस / 1% बीएसए के 156 μL जोड़ें। मिश्रण को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक ट्यूब में 160 μL स्टॉप समाधान जोड़ें और उन्हें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक ट्यूब से लिंकर-युग्मित एंटीजन के 400 μL लें, और सभी 7 एंटीजन को एक साथ मिलाएं। 1.2 एमएल स्टॉप समाधान जोड़ें और फिर मिश्रण में जीएडी 65, टीपीओ, टीटीजी, टीएचजी, प्रोइन्सुलिन, आईएफएन-α और आईए -2 एंटीजन लेबल वाले आरयू सल्फो-एनएचएस के 4 μL जोड़ें। अब एंटीजन समाधान परख में उपयोग करने के लिए तैयार है।

5. लेबल एंटीजन के साथ सीरम नमूने को इनक्यूबेट करें

नोट: चूंकि इस 7-प्लेक्स परख में ईसीएल-आईएए परख को सीरम नमूनों के एसिड उपचार की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रत्येक सीरम को इस 7-प्लेक्स परख के लिए लेबल एंटीजन मिश्रण के साथ इनक्यूबेट करने से पहले एसिड उपचार चरण की आवश्यकता होती है।

  1. 96-वेल पीसीआर प्लेट के लिए प्रति कुएं सीरम का 15 μL। प्रत्येक कुएं में 0.5 एम एसिटिक एसिड का 18 μL जोड़ें और मिलाएं। आरटी में 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक कुएं में एक नई 96-वेल पीसीआर प्लेट और 35 μL एंटीजन समाधान का एलिकोट तैयार करें।
  2. जबकि प्लेट अभी भी इनक्यूबेट हो रही है, एंटीजन प्लेट में हर कुएं में 1 एम ट्राइस पीएच 9.0 बफर का 13 μL जोड़ें। ट्रिस बफर और एंटीजन के मिश्रण को सीमित करने के लिए प्रत्येक कुएं के किनारे बफर जोड़ें। इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, एसिड उपचारित सीरम के 25 μL लें, और तुरंत इसे एंटीजन प्लेट पर हर कुएं में डालें। घोल को उत्तेजित करें और प्रकाश जोखिम से बचने के लिए प्लेट को पीसीआर सीलिंग पन्नी के साथ कवर करें।
  3. आरटी में, प्लेट को एक शेकर पर रखें, 1 घंटे के लिए कम गति पर सेट करें। बाद में, प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और प्लेट को 18-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट होने दें।

6. मल्टीप्लेक्स प्लेट तैयार करें

  1. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से एक मल्टीप्लेक्स प्लेट लें और प्लेट को आरटी में आने दें। एक बार मल्टीप्लेक्स प्लेट आरटी पर होने के बाद, प्रत्येक कुएं में 3% ब्लॉकर ए का 150 μL जोड़ें। मल्टीप्लेक्स प्लेट को सीलिंग पन्नी से ढक दें। प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: परख दिन 1 में चरण 4 से 6 शामिल हैं।

7. सीरम/एंटीजन इनक्यूबेट को मल्टीप्लेक्स प्लेट में स्थानांतरित करें

  1. अगले दिन, टेबल पर पेपर तौलिए रखें और रेफ्रिजरेटर से इनक्यूबेटिंग मल्टीप्लेक्स प्लेट लें। प्लेट से सभी बफर को खाली करें। ऐसा करने के लिए, प्लेट को उल्टा पलटें और इसे तैयार पेपर तौलिए पर थपथपाएं जब तक कि किसी भी कुओं में कोई बफर मौजूद न हो।
  2. मल्टीप्लेक्स प्लेट को हर कुएं में 150 μL PBST जोड़कर धोएं। चरण 7.1 में उल्लिखित बफर को छोड़ दें, और इस चरण को तीन बार दोहराएं। मल्टीप्लेक्स प्लेट के हर कुएं में 30 μL सीरम/एंटीजन इनक्यूबेट जोड़ें। प्रकाश के संपर्क को सीमित करने के लिए प्लेट को पन्नी के साथ कवर करें। प्लेट को प्लेट शेकर पर रखें, 1 घंटे के लिए आरटी पर कम गति पर सेट करें।

8. प्लेट को धो लें और रीड बफर जोड़ें

  1. प्लेट को उल्टा पकड़कर और घोल को बाहर निकालकर मल्टीप्लेक्स प्लेट से सीरम/एंटीजन इनक्यूबेट निकालें। सभी कुओं में 150 μL PBST जोड़ें और प्लेट को फिर से उल्टा पकड़कर और घोल को फ्लिक करके प्लेट से बफर को हटा दें। इस चरण को तीन बार दोहराएं। तीसरा धोने के पूरा होने के बाद, प्रत्येक कुएं में 150 μL रीडिंग बफर जोड़ें।
    नोट: हवा के बुलबुले प्लेट रीडर मशीन की प्लेट के परिणामों का सटीक विश्लेषण करने की क्षमता में हस्तक्षेप करते हैं और हर कीमत पर इससे बचा जाना चाहिए।

9. प्लेट पढ़ें और डेटा का विश्लेषण करें

  1. प्लेट रीडर मशीन पर तैयार प्लेट की गणना करें, प्रति सेकंड (सीपीएस) की गणना में सभी मूल्यों को पढ़ें।
  2. निम्नलिखित समीकरण के साथ, प्लेट रीडर मशीन से प्राप्त एंटीबॉडी स्तरों का उपयोग करके परख के लिए सापेक्ष सूचकांक की गणना करें:
    सूचकांक मान = [सीपीएस (नमूना) - सीपीएस (नकारात्मक मानक)] / [सीपीएस (सकारात्मक मानक) - सीपीएस (नकारात्मक मानक)]।
  3. निर्धारित करें कि स्थापित किए गए कट-ऑफ का उपयोग करके कौन से एंटीबॉडी परिणाम नकारात्मक या सकारात्मक हैं।
    नोट: परख दिन 2 में चरण 7 से 9 शामिल हैं।

Representative Results

परख परिणामों का विश्लेषण तालिका 1, तालिका 2 और तालिका 3 में दिखाया गया था। रीडिंग मान एक ही कुएं के भीतर 10 स्थानों से डेटा से आते हैं। प्रत्येक नमूने के लिए सूचकांक मूल्यों की गणना परख प्रोटोकॉल में वर्णित उनके संबंधित आंतरिक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के खिलाफ की गई थी। खराब डुप्लिकेट के उदाहरण तालिका 1 में दिखाए गए हैं और तालिका 3 में अंतिम सूचकांक गणना त्रुटि का कारण बने। किसी भी झूठे सकारात्मक या झूठे नकारात्मक परिणामों से बचने के लिए सभी कच्चे गिनती मूल्यों की जांच की जानी चाहिए।

7-मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख को टी 1 डी और 1022 आयु और लिंग के साथ 1026 नए निदान रोगियों के नमूनों के एक बड़े समूह का उपयोग करके मान्य किया गया था। 1026 टी 1 डी रोगियों के लिए 7-प्लेक्स ईसीएल परख से ऑटोएंटीबॉडी के स्तर की तुलना हमारे प्रत्येक संबंधित स्थापित एकल ईसीएल परख के स्तरों के साथ की गई थी जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है और प्रत्येक संबंधित एकल मानक आरबीए और एलिसा से जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। तालिका 4 में सूचीबद्ध सभी तीन परख विधियों (7-प्लेक्स ईसीएल, एकल ईसीएल, आरबीए या एलिसा) के लिए 1022 स्वस्थ नियंत्रणों को छोड़कर सभी ऑटोएंटीबॉडी परखों के लिए परख विशिष्टताओं को 99वें प्रतिशत पर स्थापित किया गया था। जीएडीए, आईए -2 ए, आईएए, टीपीओए, टीएचजीए, टीजीए और आईएफएन के अंतर-परख सीवी क्रमशः 6.4%, 4.5%, 9.1%, 4.9%, 5.7%, 11.3% और 5.9% हैं।

प्रत्येक परख के लिए कट-ऑफ की सीमा रेखा के आसपास 7 ऑटोएंटीबॉडी में से प्रत्येक के लिए थोड़ी संख्या में अलग-अलग नमूने पाए गए (चित्रा 2 और चित्रा 3)। ग्यारह नियंत्रण नमूने (11/1022, 1.1%) केवल 7-प्लेक्स परख में कई ऑटोएंटीबॉडी पॉजिटिव और प्रत्येक संबंधित एकल परख में नकारात्मक पाए गए। इसी तरह, यह टी 1 डी रोगियों (9/1026, 0.9%) के 9 नमूनों में हुआ। इसके अलावा, रोगी समूह में 10 उच्च सकारात्मक टीपीओए और एक टीएचजीए जो एकल ईसीएल परख और आरबीए दोनों में देखा गया था, 7-प्लेक्स परख में छूट गए थे। इन नमूनों को 7-प्लेक्स परख में सकारात्मक परिवर्तित किया गया था जब उन्हें और पतला किया गया था। सामान्य तौर पर, एकल ईसीएल परख या आरबीए में 100% सकारात्मकता को 7-प्लेक्स ईसीएल परख में कवर किया गया था, जिसमें तालिका 4 में चित्रित समान परख विशिष्टता थी।

Figure 1
चित्रा 1: मुटिप्लेक्स ईसीएल परख का चित्रण।
सीरम में ऑटोएंटीबॉडीज आरयू सल्फो-एनएचएसजीईडी एंटीजन को बायोटिनिलेटेड एंटीजन से पुल करेंगे। यह एंटीजन-एंटीबॉडी-एंटीजन-लिंकर का एक कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए एक विशिष्ट लिंकर के साथ युग्मित है। परिसरों को प्लेट पर कब्जा कर लिया जाता है और प्रत्येक विशिष्ट लिंकर के माध्यम से उनके विशिष्ट स्थानों पर रोक दिया जाता है। 7 अलग-अलग एंटीजन प्रोटीन के लिए विशेष रूप से युग्मित लिंकर संख्याओं को चित्रित किया गया है। एंटीबॉडी संकेतों का पता लगाने को इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस के साथ आरयू सल्फो-एनएचएस लेबल एंटीजन का उपयोग करके पूरा किया जाता है। यह आंकड़ा गु, वाई एट अल.13 से है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एकल ईसीएल परख और 7-प्लेक्स ईसीएल परख के बीच टी 1 डी के साथ 1026 नए शुरुआती रोगियों में 7 ऑटोएंटीबॉडी स्तरों की तुलना।
पैनल ए, बी, सी, डी, ई, एफ, और जी क्रमशः जीएडीए, आईए -2 ए, आईएए, टीजीए, टीपीओए, टीएचजीए और आईएफएन ए के लिए ऑटोएंटीबॉडी स्तरों की तुलना प्रदर्शित करते हैं। डॉटेड लाइनें प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी परख के लिए परख कट-ऑफ का प्रतिनिधित्व करती हैं। कट-ऑफ को प्रत्येक परख के लिए 1022 आयु-मिलान स्वस्थ नियंत्रणों के 99वें प्रतिशत पर सेट किया गया था (टीपीओए और टीएचजीए को छोड़कर जो 95वें प्रतिशत पर सेट किए गए थे), जैसा कि तालिका 4 में दिखाया गया है, 1022 आयु से एकल और मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख दोनों के लिए स्वस्थ नियंत्रण से मेल खाता है। लाल बंद हीरे को 7-प्लेक्स ईसीएल परख में 'झूठे' सकारात्मक के रूप में चिह्नित किया गया है, अध्ययन किए गए कोहोर्ट के <1%, और उन्हें एकल ईसीएल और आरबीए दोनों में नकारात्मक के रूप में मान्य किया गया था। लाल करीबी वर्गों को 'प्रोज़ोन' घटना के कारण 7-प्लेक्स ईसीएल परख में 'झूठे' नकारात्मक के रूप में चिह्नित किया गया है, जो मुख्य रूप से अध्ययन किए गए कोहोर्ट के <1% में टीपीओए परख में होता है। इन झूठे सकारात्मक और झूठे नकारात्मक परिणामों दोनों पर चर्चा अनुभाग में चर्चा की गई है। यह आंकड़ा गु, वाई एट अल.13 से है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आरबीए (आईएफएनए के लिए एलिसा) और 7-प्लेक्स ईसीएल परख के बीच टी 1 डी के साथ 1026 नए शुरुआती रोगियों में 7 ऑटोएंटीबॉडी स्तरों की तुलना।
पैनल ए, बी, सी, डी, ई, एफ, और जी क्रमशः जीएडीए, आईए -2 ए, आईएए, टीजीए, टीपीओए, टीएचजीए और आईएफएन ए के लिए ऑटोएंटीबॉडी स्तरों की तुलना प्रस्तुत करते हैं। डॉटेड लाइनें प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी परख के लिए परख कट-ऑफ का प्रतिनिधित्व करती हैं, आरबीए और 7-प्लेक्स ईसीएल परख दोनों के लिए समान विशिष्टता सेट, जैसा कि तालिका 4 में दिखाया गया है, 1022 आयु से स्वस्थ नियंत्रण से मेल खाता है। लाल बंद हीरे और वर्ग 7-प्लेक्स ईसीएल परख में दिखाई देने वाले 'झूठे' सकारात्मक और 'झूठे' नकारात्मक का प्रतिनिधित्व करते हैं, यही चित्र 2 में दिखाया गया है। यह आंकड़ा गु, वाई एट अल.13 से है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 2 3 4 5 6
एक 5580 5674 105 117 125 139 लिंकर-1
100 108 102 102 3956 3745 लिंकर -2
115 124 107 116 113 124 लिंकर-3
67 64 68 61 65 69 लिंकर-4
89 87 98 92 90 80 लिंकर-5
87 71 89 87 61 72 लिंकर-6
94 82 79 85 2154 2280 लिंकर -7
75 66 1628 1594 81 83 लिंकर-8
98 103 71 84 69 85 लिंकर -9
102 118 93 98 113 99 लिंकर-10
B 324 337 147 148 5426 5366 लिंकर-1
101 102 93 88 86 74 लिंकर -2
111 119 119 123 66 72 लिंकर-3
72 65 59 68 74 67 लिंकर-4
81 98 83 92 79 72 लिंकर-5
90 84 93 86 70 76 लिंकर-6
101 105 101 97 956 944 लिंकर -7
82 83 189 204 97 90 लिंकर-8
92 83 78 64 82 78 लिंकर -9
83 79 88 93 4722 4965 लिंकर-10
C 110 110 87 81 2114 2365 लिंकर-1
5526 5680 88 70 86 93 लिंकर -2
114 132 67 71 3326 3284 लिंकर-3
64 62 88 74 64 80 लिंकर-4
94 82 86 75 89 76 लिंकर-5
77 87 75 63 70 86 लिंकर-6
77 86 71 84 138 121 लिंकर -7
73 86 80 79 59 73 लिंकर-8
86 74 5064 4923 88 86 लिंकर -9
105 113 85 80 124 114 लिंकर-10
D 98 88 92 84 136 127 लिंकर-1
288 291 86 86 558 564 लिंकर -2
109 101 74 73 141 127 लिंकर-3
78 66 66 55 74 66 लिंकर-4
79 83 79 86 96 91 लिंकर-5
83 86 96 89 86 73 लिंकर-6
87 89 77 87 841 855 लिंकर -7
74 72 60 72 90 95 लिंकर-8
68 75 331 328 2460 2580 लिंकर -9
86 98 80 75 123 133 लिंकर-10
E 101 114 101 106 532 548 लिंकर-1
101 96 110 104 682 675 लिंकर -2
6015 5988 124 126 101 98 लिंकर-3
66 71 82 71 80 62 लिंकर-4
102 97 99 80 83 110 लिंकर-5
82 67 81 80 60 85 लिंकर-6
85 95 52 84 245 221 लिंकर -7
72 78 82 74 486 503 लिंकर-8
77 97 97 77 56 66 लिंकर -9
114 104 5726 5814 259 253 लिंकर-10
F 119 120 133 118 112 96 लिंकर-1
101 91 100 95 96 82 लिंकर -2
406 395 111 123 2127 101 लिंकर-3
72 60 86 72 79 83 लिंकर-4
76 85 96 99 89 103 लिंकर-5
88 78 91 83 89 95 लिंकर-6
104 97 87 102 56 66 लिंकर -7
76 77 79 93 69 75 लिंकर-8
85 71 95 100 83 71 लिंकर -9
131 131 358 364 92 86 लिंकर-10
G 90 95 85 82 105 107 लिंकर-1
99 86 77 76 1250 1174 लिंकर -2
119 123 120 118 112 108 लिंकर-3
76 83 77 80 86 76 लिंकर-4
88 86 86 93 107 92 लिंकर-5
73 73 71 82 84 75 लिंकर-6
5210 5173 72 69 76 85 लिंकर -7
80 81 79 82 100 101 लिंकर-8
96 97 89 83 65 83 लिंकर -9
98 103 86 88 1933 1979 लिंकर-10
H 114 124 81 86 299 295 लिंकर-1
107 92 69 72 4256 4388 लिंकर -2
114 123 125 129 501 536 लिंकर-3
77 70 67 64 74 62 लिंकर-4
92 110 81 84 77 71 लिंकर-5
87 79 72 76 83 81 लिंकर-6
328 341 84 80 88 97 लिंकर -7
75 84 75 90 74 83 लिंकर-8
73 79 78 76 84 70 लिंकर -9
113 120 81 76 2372 2350 लिंकर-10

तालिका 1: 7-प्लेक्स ईसीएल परख का विश्लेषण: कच्चे सीपीएस गिनती (प्लेट का बाएं आधा)। कच्चे सीपीएस गिनती एक परख प्लेट (प्लेट के बाएं आधे हिस्से) से प्राप्त की जाती है और प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट में किया जाता है। प्लेट (ए-एच) की प्रत्येक पंक्ति के नीचे, एक ही कुएं के भीतर 10 स्थानों से डेटा का प्रतिनिधित्व करने वाले रीडिंग मानों की 10 लाइनें हैं, जो चिह्नित प्रत्येक लिंकर संख्या के अनुरूप हैं। खराब डुप्लिकेट के उदाहरण ग्रे में हाइलाइट किए गए हैं, जैसा कि पंक्ति एफ-लिंकर 3-कॉलम 5 और 6 में देखा गया है।

तालिका 1A की पंक्ति तालिका 1A का स्तंभ लिंकर 1 लिंकर 2 लिंकर 3 लिंकर 7 लिंकर 8 लिंकर 9 लिंकर 10
एक 1-2 GADA PC 5627 104 120 88 71 101 110
B 1-2 GADA कम पीसी 331 102 115 103 83 88 81
C 1-2 TPOA PC 110 5603 123 82 80 80 109
D 1-2 TPOA कम पीसी 93 290 105 88 73 72 92
E 1-2 टीजीए पीसी 108 99 6002 90 75 87 109
F 1-2 टीजी कम पीसी 120 96 401 101 77 78 131
G 1-2 ThGA PC 93 93 121 5192 81 97 101
H 1-2 THGA कम पीसी 119 100 119 335 80 76 117
एक 3-4 IAA PC 111 102 112 82 1611 78 96
B 3-4 IAA कम पीसी 148 91 121 99 197 71 91
C 3-4 IFNaA PC 84 79 69 78 80 4994 83
D 3-4 IFNAA कम पीसी 88 86 74 82 66 330 78
E 3-4 IA-2A PC 104 107 125 68 78 87 5770
F 3-4 IA-2A निम्न PC 126 98 117 95 86 98 361
G 3-4 नेकां 84 77 119 71 81 86 87
H 3-4 नेकां 84 71 127 82 78 77 79
एक 5-6 नमूना 1 132 3851 119 2217 82 77 106
B 5-6 नमूना 2 5396 80 69 950 94 80 4844
C 5-6 नमूना 3 2240 90 3305 130 66 87 119
D 5-6 नमूना 4 132 561 134 848 93 2520 128
E 5-6 नमूना 5 540 679 100 233 495 61 256
F 5-6 नमूना 6 104 89 1114 61 72 77 89
G 5-6 नमूना 7 106 1212 110 81 101 74 1957
H 5-6 नमूना 8 297 4322 519 93 79 77 2361

तालिका 2: 7-प्लेक्स ईसीएल परख का विश्लेषण: तालिका 1 डेटा की व्यवस्था, जिसे 7 लिंकर के रूप में चिह्नित किया गया है। तालिका 1 के डेटा को फिर से व्यवस्थित किया गया था, जिसमें लिंकर 4 से 6 (उपयोग नहीं किया गया) हटा दिया गया था, और तालिका 1 से प्रत्येक डुप्लिकेट रीडिंग से माध्य मानों की गणना की गई थी। आंतरिक मानक उच्च और निम्न सकारात्मक नियंत्रण के मूल्य, प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी परख के अनुरूप, एक विशेष लिंकर द्वारा नियंत्रित, गहरे बोल्ड में हैं। पीसी, सकारात्मक नियंत्रण। एनसी, सामान्य नियंत्रण।

जीएडी-इंडेक्स TPOA-Index टीजीए-इंडेक्स THGA-सूचकांक IAA-Index IFNAA-Index IA-2A-Index
GADA PC 1.000 0.005 0.000 0.003 -0.006 0.003 0.004
GADA कम पीसी 0.045 0.005 -0.001 0.006 0.002 0.000 -0.001
IAA PC 0.005 1.000 0.001 0.002 -0.001 -0.001 0.004
IAA कम पीसी 0.002 0.039 -0.002 0.003 -0.005 -0.003 0.001
IA-2A PC 0.004 0.004 1.000 0.004 -0.004 0.000 0.004
IA-2A निम्न PC 0.007 0.004 0.048 0.006 -0.002 -0.002 0.008
टीजीए पीसी 0.002 0.003 0.000 1.000 0.000 0.002 0.002
टीजी कम पीसी 0.006 0.004 0.000 0.052 -0.001 -0.002 0.005
TPOA PC 0.005 0.005 -0.001 0.002 1.000 -0.002 0.001
TPOA कम पीसी 0.012 0.003 0.000 0.006 0.076 -0.003 0.001
ThGA PC 0.000 0.000 -0.008 0.001 0.000 1.000 -0.001
THGA कम पीसी 0.001 0.002 -0.008 0.002 -0.009 0.050 -0.002
IFNaA PC 0.004 0.006 0.001 0.000 -0.002 0.000 1.000
IFNAA कम पीसी 0.008 0.004 0.000 0.005 0.004 0.002 0.048
नेकां 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
नेकां 0.000 -0.001 0.001 0.002 -0.002 -0.002 -0.001
नमूना 1 0.009 0.683 0.000 0.419 0.001 -0.002 0.003
नमूना 2 0.958 0.001 -0.008 0.172 0.009 -0.001 0.837
नमूना 3 0.389 0.002 0.542 0.012 -0.009 0.000 0.006
नमूना 4 0.009 0.088 0.003 0.152 0.008 0.496 0.007
नमूना 5 0.082 0.109 -0.003 0.032 0.271 -0.005 0.030
नमूना 6 0.004 0.002 0.169 -0.002 -0.006 -0.002 0.000
नमूना 7 0.004 0.205 -0.002 0.002 0.013 -0.002 0.329
नमूना 8 0.039 0.768 0.068 0.004 -0.001 -0.002 0.400

तालिका 3: 7-प्लेक्स ईसीएल परख का विश्लेषण: सूचकांक मूल्यों के परिणाम। सभी 7 ऑटोएंटीबॉडी परखों के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सूचकांक मूल्यों की गणना परख प्रोटोकॉल में वर्णित उनके संबंधित आंतरिक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के खिलाफ की गई थी। कोई भी इंडेक्स वैल्यू जो कट-ऑफ वैल्यू से अधिक थी, उसे सकारात्मक परिणाम के रूप में परिभाषित किया गया था, जिसे डार्क बोल्ड में दिखाया गया था। नमूना 6 के टीजीए-इंडेक्स मूल्य को ग्रे में हाइलाइट किया गया था क्योंकि यह तालिका 1 में पंक्ति एफ-लिंकर 3-कॉलम 5 और 6 में दिखाए गए खराब डुप्लिकेट के कारण होने वाली त्रुटि है।

GADA IA-2A IAA .TGA TPOA THGA IFNαA*
Sens कल्पना Sens कल्पना Sens कल्पना Sens कल्पना Sens कल्पना Sens कल्पना Sens कल्पना
RBA 73.4% 98.5% 75.2% 99.0% 47.7% 99.1% 12.9% 99.0% 23.9% 95.2% 19.3% 94.7% 1.0% 99.6%
एकल ईसीएल 71.6% 99.1% 73.6% 99.3% 48.3% 99.7% 16.0% 98.9% 26.3% 94.9% 20.6% 95.1% 0.8% 99.2%
7-प्लेक्स ईसीएल 71.2% 98.9% 77.3% 98.9% 49.5% 98.9% 16.5% 98.7% 26.1% 94.7% 21.1% 94.7% 1.7% 99.1%

तालिका 4: 1026 टी 1 डी रोगियों और 1022 नियंत्रणों के बीच परख संवेदनशीलता और विशिष्टता, 7-प्लेक्स ईसीएल परख में उम्र और लिंग दोनों के लिए मेल खाती है, संबंधित एकल ईसीएल परख और आरबीए या एलिसा * की तुलना में। प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी के लिए अलग-अलग परख (आरबीए, सिंगल ईसीएल और 7-प्लेक्स ईसीएल) को 1022 आयु और लिंग मिलान स्वस्थ नियंत्रणों का उपयोग करके समान विशिष्टताओं के लिए सेट किया गया था। अध्ययन किए गए नियंत्रण समूह से विशिष्टता परिणाम टीपीओए और टीएचजीए के लिए लगभग 95% और 5 अन्य परखों के लिए 99% पर निर्धारित किया गया था। * तारांकन एलिसा के लिए आईएफएनए परख को चिह्नित करता है, जबकि अन्य आरबीए हैं।

Discussion

टाइप 1 मधुमेह के लिए कई राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय नैदानिक परीक्षणों में, सीलिएक रोग के लिए ट्रांसग्लूटामिनेज (टीजीए) के लिए आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज और ऑटोएंटीबॉडीज का पता लगाने के लिए एकल ईसीएल परख का प्रदर्शन 8,9,10,11 प्रमाणित किया गया है। इन ट्रेल्स के दौरान, इस परख ने मौजूदा 'गोल्ड' मानक आरबीए के खिलाफ मूल्यांकन किए जाने पर ऑटोएंटीजन डिटेक्शन के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता में वृद्धि की है। एकल ईसीएल परख और आरबीए 14,15,16,17 के बीच कम जोखिम वाले, कम आत्मीयता संकेतों से उच्च-आत्मीयता और उच्च जोखिम वाले आइलेट ऑटोएंटीबॉडी को भेदभाव करते समय बढ़ी हुई रोग विशिष्टता देखी जा सकती है। एकल ईसीएल परख के आधार पर, हम एक नई उच्च थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स ईसीएल ऑटोएंटीबॉडी परख पेश करते हैं, जिससे हम टी 1 डी के साथ-साथ एक ही समय में कई लागू ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए स्क्रीन कर सकें।

मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख मल्टीप्लेक्स प्लेट का उपयोग करता है, जो एक ही कुएं में 10 ऑटोएंटीबॉडी परख को जोड़ सकता है। वर्तमान अध्ययन के लिए, 7 ऑटोएंटीबॉडी परख एक साथ संयुक्त हैं। ऑटोएंटीबॉडीज में 3 आईएबी (आईएए, जीएडीए और आईए -2 ए), 2 ऑटोइम्यून थायराइड रोग ऑटोएंटीबॉडीज (टीपीओए और टीएचजीए), सीलिएक रोग ऑटोएंटीबॉडीज (टीजीए), और एपीएस -1 ऑटोएंटीबॉडीज से इंटरफेरॉन अल्फा (आईएफएन) शामिल हैं। परख तंत्र, सामान्य रूप से, एक एकल ईसीएल परख पर आधारित है जैसा कि पहले कुछसंशोधनों के साथ 9,10,12,18 प्रकाशित किया गया था। एकल ईसीएल परख से मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख का मुख्य अंतर यह है कि द्रव-चरण में गठित प्रत्येक एंटीबॉडी-एंटीजन कॉम्प्लेक्स को एक विशिष्ट लिंकर (चित्रा 1) तक सीमित किया जाता है। बायोटिन लेबल एंटीजन को स्ट्रेप्टाविडिन संयुग्मित के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, एक लिंकर जिसका उपयोग एक विशिष्ट एंटीजन-लिंकर कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए किया जाता है। एंटीबॉडी-एंटीजन प्रतिरक्षा परिसर रोगी सीरम के साथ इनक्यूबेशन के बाद बनता है और मल्टीप्लेक्स प्लेट के प्रत्येक कुएं पर विशिष्ट लिंकर सिस्टम के माध्यम से एक विशिष्ट स्थान पर कब्जा कर लिया जाता है। एक ही समय में एंटीबॉडी द्वारा कैप्चर किए गए आरयू सल्फो-एनएचएस लेबल एंटीजन इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस के साथ संकेत प्रदान करता है। प्लेट रीडर मशीन प्रत्येक कुएं में स्थित स्पॉट स्रोतों से 10 अलग-अलग संकेतों का पता लगा सकती है। प्लेटों के बीच ऑटोएंटीबॉडी परख को सुसंगत रखने के लिए और दीर्घकालिक अध्ययन करते समय, हम सुझाव देते हैं कि एक ही लिंकर का उपयोग किया जाता है।

मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख स्थापित करने से पहले, प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी के लिए एकल ईसीएल परख को क्रमशः मल्टीप्लेक्स प्लेट पर अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है, और नियमित ईसीएल प्लेट पर आरबीए और एकल ईसीएल परख दोनों के खिलाफ मान्य किया जाना चाहिए। चेकरबोर्ड परख को बढ़ाने के लिए, मल्टीप्लेक्स प्लेट पर संबंधित ऑटोएंटीबॉडी परख के लिए, एक उच्च सकारात्मक रोगी और एक नकारात्मक रोगी नमूने का उपयोग किया गया था। चेकरबोर्ड परख आयोजित किए जाने के बाद, आरयू सल्फो-एनएचएस और बायोटिन लेबल एंटीजन के लिए सबसे आदर्श सांद्रता जहां 7 ऑटोएंटीबॉडी परखों में से प्रत्येक के लिए गणना की जाती है। निम्नलिखित इन सांद्रता को दर्शाता है: जीएडी 65 के लिए 30 एनजी / एमएल और 200 एनजी / एमएल, प्रोइन्सुलिन के लिए 120 एनजी / एमएल और 120 एनजी / एमएल, आईए -2 के लिए 10 एनजी / एमएल और 42 एनजी / एमएल, टीजी के लिए 80 एनजी / एमएल और टीपीओ के लिए 8 एनजी / एमएल और टीपीओ के लिए 16 एनजी / एमएल, 31 एनजी / एमएल और टीएचजी के लिए 31 एनजी / एमएल। और आईएफएन 13 के लिए क्रमशः 12 एनजी / एमएल और12 एनजी / एमएल। चेकरबोर्ड परख से कुछ एंटीजन की सांद्रता को सभी परखों को एक साथ मिलाने के बाद वास्तविक मल्टीप्लेक्स परख में परिणामों के अनुसार और समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

जैसा कि आईएए वर्तमान मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख में शामिल है, सीरम को एंटीजन के साथ इंजेक्ट करने से पहले सीरम नमूनों का एसिड उपचार अनिवार्य है, जैसा कि पिछले अध्ययन12 में बताया गया है। आम तौर पर, जब एक मल्टीप्लेक्स परख में एक अतिरिक्त ऑटोएंटीबॉडी जोड़ा जाता है, तो परख पृष्ठभूमि प्रभावित होती है और एक स्थान से एक बहुत ही उच्च संकेत, कुएं में, क्रॉसस्टॉक के माध्यम से आस-पास के स्थानों के परिणामों को बाधित कर सकता है। इसलिए, अधिकतम सीपीएस को उच्चतम सकारात्मक नमूनों के लिए प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी के लिए 20,000 गिनती या उससे कम तक सीमित करने की आवश्यकता है। हमारे ज्ञान से, इसमें शामिल क्रॉसस्टॉक की मात्रा को कम करने के लिए, स्पॉट मैप डिजाइन करते समय कम पृष्ठभूमि वाले ऑटोएंटीबॉडीज को अलग किया जाना चाहिए, गिनती की उच्च आवृत्ति वाले स्थानों से दूर।

परीक्षण किए जा रहे अज्ञात नमूनों के लिए एक सटीक सूचकांक की गणना करने के लिए प्रत्येक परख में आंतरिक रूप से उच्च सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग किया गया था। परख की संवेदनशीलता का सटीक आकलन और निगरानी करने के लिए, परख की ऊपरी सीमा के पास सेट किए गए कम सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग किया गया था। इन मानक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों को लंबे समय तक उपयोग के लिए थोक और एलिकोट में बनाया गया था और परख के बीच स्थिरता के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे संग्रहीत किया गया था। गुणवत्ता आश्वासन उद्देश्यों के लिए, नमूने हर परख में दो बार चलाए गए थे और प्रत्येक सकारात्मक परिणाम को फिर से तैयार किया गया था और अगले दिन एक नए ईसीएल परख में नमूना चलाकर पुष्टि की गई थी। यदि पहले और दूसरे पुष्टि परख के साथ कोई असहमति थी, तो एक तीसरा परख आवश्यक था। आयोजित तीन परखों में से, दो परखों के परिणाम जो सहमत हैं (जैसे, +, + या -,-), नमूने के अंतिम परिणाम (सकारात्मक या नकारात्मक) को निर्धारित करते हैं।

पिछले दशक में, कई अध्ययन समूह बड़ी आबादी को स्क्रीन करने के लिए एक कुएं में कई ऑटोएंटीबॉडी परख को एक साथ संयोजित करने के लिए मल्टीप्लेक्स विधि का उपयोग करके एक उच्च थ्रूपुट परख की मांग कर रहे हैं। कुछ अध्ययन हैं जो मल्टीप्लेक्स ऑटोएंटीबॉडीपरीक्षण 19,20,21,22 का संचालन करने के लिए विभिन्न प्रकार की तकनीकों का उपयोग कर रहे हैं, लेकिन टी 1 डी का अध्ययन करते समय वर्तमान 'गोल्ड' मानक आरबीए के खिलाफ संवेदनशीलता और विशिष्टता में इनमें से किसी भी परख की कोई तुलना नहीं है। उपयोग किए जाने वाले इन विभिन्न प्रकार के प्लेटफार्मों को अंतर्राष्ट्रीय आइलेट ऑटोएंटीबॉडी मानकीकरण कार्यक्रम (आईएएसपी) कार्यशाला के माध्यम से या नैदानिक परीक्षणों में बड़े समूहों के परीक्षण के माध्यम से मान्य नहीं किया जाता है। जर्मनी में हाल ही में सामान्य जनसंख्या-आधारित स्क्रीनिंग में, क्रोनस द्वारा वितरित एक उच्च थ्रूपुट संयुक्त परख, 3 स्क्रीन आईसीएटीएम एलिसा, का उपयोग बचपन के टी 1 डी23 के प्रारंभिक निदान को प्राप्त करने के लिए तीन आईएबी, जीएडीए, आईए -2 ए और जेडएनटी 8 ए का पता लगाने के लिए पहली पंक्ति स्क्रीनिंग के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा रहा है। 3-स्क्रीन एलिसा परख 3 ऑटोएंटीबॉडी को मापता है या तो 3 अलग-अलग कुओं में, सीरम की एक बड़ी मात्रा का उपभोग करता है, या सभी 3 परखों को मिश्रित करने वाले एक ही कुएं में। यदि 3-स्क्रीन एलिसा परख में एक कुआं सकारात्मक है, तो कोई यह भेद करने में असमर्थ है कि तीन ऑटोएंटीबॉडी में से कौन सा मौजूद है। इस परख का सबसे बड़ा नुकसान आईएए माप को शामिल करने में असमर्थता है। एलिसा द्वारा किए गए सभी आईएए परिणाम, जैसा कि आईएएसपी कार्यशालाओं में साबित हुआ है, में स्वीकार्य संवेदनशीलताऔर विशिष्टता नहीं है। आईएए आमतौर पर दिखाई देने वाला पहला आईएबी है और छोटे बच्चों के बीच उच्च प्रसार है। आईएए के साथ आईएबी स्क्रीनिंग, बच्चों के लिए आवश्यक है और समुदाय में टी 1 डी जोखिम का आकलन करने के लिए आईएए के बिना इस स्क्रीनिंग का संचालन करना स्वीकार्य नहीं माना जाता है। इसके अलावा, कोई प्रकाशित अध्ययन या डेटा नहीं है जो क्रोनस आईएबी किट परख को अधिक टी 1 डी रोग विशिष्ट और कम जोखिम वाले आईएबी से उच्च जोखिम को भेदभाव करने में सक्षम दिखाता है। वर्तमान अध्ययन में 7-प्लेक्स ईसीएल परख, टी 1 डी13 के साथ नए निदान किए गए रोगियों के एक बड़े समूह का उपयोग करके मान्य किया गया था। वर्तमान मानक आरबीए और अच्छी तरह से स्थापित एकल ईसीएल परख की तुलना में, 7-प्लेक्स परख एक ही परख विशिष्टता (तालिका 4) के साथ 100% सकारात्मकता बनाए रखने में सक्षम है। वर्तमान में, मानक आरबीए के समानांतर 4-प्लेक्स ईसीएल परख, एक चल रहे बड़े नैदानिक परीक्षण पर लागू किया जा रहा है: ऑटोइम्यूनिटी स्क्रीनिंग फॉर किड्स (एएसके) अध्ययन। यह परीक्षण टी 1 डी और सीलिएक रोग के लिए डेनवर महानगरीय क्षेत्र की सामान्य आबादी में बच्चों को स्क्रीन करता है। एएसके अध्ययन में उपयोग किए गए मानक आरबीए की तुलना में, मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख उत्कृष्ट संवेदनशीलता और उच्च रोग विशिष्टता दिखा रहा है, जो एकल ईसीएल अध्ययन 25 का उपयोग करके हमारी पिछलीरिपोर्टों के समान है। इसके अलावा, हमारे 4-प्लेक्स ईसीएल परख ने ईसीएल और आरबीए के लिए संबंधित 4 एकल परखों की तुलना में श्रम, लागत और सीरम मात्रा में 70% की स्पष्ट कमी का प्रदर्शन किया। मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख का उपयोग करके, हम प्रत्येक को अलग-अलग संख्याओं के साथ अनुकूलित कर सकते हैं, विभिन्न ऑटोएंटीबॉडी (10 तक) का प्रतिनिधित्व करते हैं, ताकि विभिन्न ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए परीक्षण किया जा सके जो किसी विशेष नैदानिक स्थान की जरूरतों के लिए विशिष्ट हैं।

मल्टीप्लेक्स प्लेट का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख के लिए वर्तमान अध्ययन में कुछ सीमाएं देखी गई हैं। एंटीजन के साथ इनक्यूबेट किए गए सीरम के अंतिम कमजोर पड़ने को हर एक ऑटोएंटीबॉडी परख के लिए सबसे इष्टतम स्थिति उत्पन्न करने के लिए समायोजित नहीं किया जा सकता है जो एक ही कुएं में संयुक्त होता है। टी 1 डी रोगियों से नौ नमूने (9/1026), विशेष ऑटोएंटीबॉडी के लिए गलत नकारात्मक परिणाम पाए गए। 7-प्लेक्स ईसीएल परख में टीपीओए के लिए 7 और टीएचजीए के लिए 2 झूठे नकारात्मक थे, लेकिन एकल ईसीएल परख और आरबीए (चित्रा 2 और 3) दोनों में उच्च सकारात्मक परिणाम प्रदर्शित किए गए थे। सभी 9 नमूनों को और कमजोर करने के बाद, वे मल्टीप्लेक्स प्लेट पर सकारात्मक हो गए। यह परिणाम इसके कारण होता है, जिसे हम 'प्रोज़ोन' घटना के रूप में वर्णित करते हैं। यह घटना नमूने को गलत नकारात्मक परिणाम दिखाने का कारण बनती है क्योंकि उच्च एंटीबॉडी टिटर्स एंटीजन-एंटीबॉडी लैटिस के गठन को प्रभावित कर रहे हैं। मल्टीप्लेक्स परख स्थापित करते समय, संयुक्त ऑटोएंटीबॉडी में से प्रत्येक के लिए बहुत उच्च टिटर्स वाले नमूनों को एंटीजन इनक्यूबेशन के लिए सीरम के वैकल्पिक कमजोर पड़ने की पहचान करने के लिए पूर्व-परीक्षण चलाने की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, समान अनुकूलित स्थितियों वाले ऑटोएंटीबॉडी परख को एक संयुक्त परख बनाने के लिए चुना जाना चाहिए जिसमें से प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी के लिए सर्वोत्तम परख संवेदनशीलता और विशिष्टता प्राप्त की जाती है। वर्तमान अध्ययन में, स्वस्थ सामान्य नियंत्रण से 7 नमूने (7/1022), 7-प्लेक्स परख में कई ऑटोएंटीबॉडी के लिए गलत सकारात्मक परिणाम सामने आए, लेकिन एक एकल ईसीएल परख और आरबीए (चित्रा 2 और 3) चलाने के बाद ये ऑटोएंटीबॉडी दोनों परखों में नकारात्मक पाए गए। नमूनों के इन छोटे उप-समूह के लिए मल्टीप्लेक्स प्लेट पर होने वाले इन झूठे सकारात्मक परिणामों के पीछे के कारण वर्तमान में अज्ञात हैं। मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख के वर्तमान आवेदन के लिए, सभी सकारात्मक नमूनों को सकारात्मकता की पुष्टि करने के लिए उनके संबंधित एकल ईसीएल परख के साथ दोहराया जाता है, जो मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख से इस झूठी सकारात्मक त्रुटि को हटा देता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान डीके 32083, जेडीआरएफ अनुदान 2-एसआरए-2015-51-क्यू-आर और 2-एसआरए-2018-533-एस-बी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 °C refrigerator
–80 °C and -20 °C freezers
96-well Plate Shaker Wallac - Delfi
96-well round bottom plate Fisher 8408220
Acetic acid solution Fisher
Aluminum foil
Antigen proteins
Human GAD65 full length protein Diamyd
Human ThG full length protein BioMart
Human TPO full length protein BioMart
IA-2 intracellular domain protein BioMart
IFN-α protein Abcam
Proinsulin protein AmideBio
tTG protein DiaRect
Biotin Sigma
Bottle-Top 500 mL , Filter Units Fisher 0974064A or B
Bovine Serum Albumin Sigma A-7906
Distilled deionized (DD) water
HCl Fisher
Ice maker
Ice trays
MSD Sector Perkin-Elmer
Multi-channel pipette
NaOH
Paper tower
PBS
pH meter
Pipette-Aid
Pipettes/tips
Ru Sulfo-NHS MSD (R91AN)
Trizma Base Fisher BP152-5
Tween 20 Sigma P-1379
Uplex Development Kit MSD
96-well UPlex plate MSD
Blocker A MSD R93AA
Linker-Streptavidin MSD
Read buffer MSD R92TC
Stop Solution MSD
Vortex mixer
ZeBa Column Pierce 89892

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  4. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  5. Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
  6. Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
  7. de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
  8. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  9. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  10. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  11. Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
  12. Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).
  13. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  14. Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  15. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  16. Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
  17. Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
  18. Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).
  19. Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
  20. Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
  21. Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
  22. Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
  23. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  24. Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
  25. Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).

Tags

चिकित्सा अंक 159 इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस परख मल्टीप्लेक्स ऑटोएंटीबॉडी परख टाइप 1 मधुमेह ऑटोइम्यून बीमारी स्क्रीनिंग भविष्यवाणी
टाइप 1 मधुमेह और एकाधिक ऑटोइम्यून रोगों के लिए एक उच्च-थ्रूपुट इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस 7-प्लेक्स परख एक साथ स्क्रीनिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H.,… More

Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases. J. Vis. Exp. (159), e61160, doi:10.3791/61160 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter