Summary
Vi modellerar en enkel multiplexerad ECL-analys som kombinerar 7 autoantikroppsanalyser tillsammans. Analysen kan screena för T1D och flera andra autoimmuna sjukdomar samtidigt, inklusive celiaki, autoimmun sköldkörtelsjukdom och autoimmunt polyglandulärt syndrom 1.
Abstract
Ö-autoantikroppar (IAbs) används ofta vid diagnos och förutsägelse av typ 1-diabetes (T1D). Fyra stora IAb till insulin (IAA), glutamatdekarboxylas-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) och zinktransportör-8 (ZnT8A) är lika viktiga för sjukdomsförutsägelse. För närvarande fortsätter upp till 40% av patienterna som diagnostiserats med T1D att utveckla andra autoimmuna störningar. Tyvärr är nuvarande screeningmetoder som använder en enda autoantikropp för mätning mödosamma och ineffektiva för storskaliga screeningstudier. Vi utvecklade nyligen en enkel multiplexerad elektrokemiluminescensanalys (ECL) för att ta itu med dessa aktuella problem. Analysen kombinerar alla 7 autoantikroppstester i en brunn. Varje brunn innehåller tre IAbs (IAA, GADA och IA-2A), autoantikroppar mot sköldkörtelperoxidas (TPOA) och sköldkörtelglobulin (ThGA) för att upptäcka autoimmun sköldkörtelsjukdom, autoantikroppar mot vävnadstransglutaminas (TGA) för celiaki och autoantikroppar mot interferon alfa (IFNαA) för autoimmunt polyglandulärt syndrom-1 (APS-1); som alla screenar för T1D och andra relevanta autoimmuna sjukdomar, samtidigt. Multiplex ECL-analysen är baserad på den enda ECL-analysplattformen, men använder istället multiplexplattan som kombinerar flera autoantikroppsanalyser, upp till 10, i en enda brunn. Huvudskillnaden från den enda ECL-analysen är att varje antikroppsantigenkomplex som bildas i vätskefasen är fasthållet på en specifik plats på varje brunn genom ett länksystem på multiplexplattan. 7-Plex ECL-analysen, i den aktuella studien, valideras mot standard radiobindande analyser (RBA) och enstaka ECL-analyser, med hjälp av en stor kohort av nydiagnostiserade T1D-patienter och åldersmatchade friska kontroller, vilket resulterar i utmärkt analyskänslighet och specificitet.
Introduction
Typ 1-diabetes (T1D) är en allvarlig kronisk sjukdom som är vanligast vid barndomen. För närvarande har cirka 1.4 miljoner människor T1D i USA; Slående är att förekomsten av T1D stadigt ökar med 3-5% varje år över hela världen och har fördubblats under de senaste två decennierna, särskilt hos små barn 1,2. Islet autoantikroppar (IAbs) i blodcirkulationen är den mest tillförlitliga biomarkören för närvarande. IAbs kan förekomma år innan klinisk T1D utvecklar3. För närvarande används fyra stora IAbs i stor utsträckning vid T1D-diagnos och riskscreening inklusive autoantikroppar mot insulin (IAA), glutamatdekarboxylas-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) och zinktransportör-8 (ZnT8A). Dessa fyra IAbs är lika viktiga för att förutsäga T1D-utveckling. Klassificeringen av T1D har nyligen omdefinierats som förekomsten av ≥2 av alla 4 IAb med normal glukosmetabolism som sjukdomsstadium 14.
I Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) avslöjades att ett av fyra barn i riskzonen för T1D sannolikt skulle utvecklas till ö-, celiaki-, sköldkörtel- eller reumatoid autoimmunitet och mer slående, cirka 40% av patienterna som har diagnostiserats med T1D utvecklar så småningom ett ytterligare autoimmunt tillstånd 5,6,7 . Identifiering av autoantikroppar är avgörande för förutsägelse och diagnos av dessa autoimmuna sjukdomar och bör ge bättre klinisk vård för patienter. Det finns för närvarande inget enkelt och billigt sätt att screena för dessa flera autoimmuna tillstånd. Nuvarande screeningmetoder med hjälp av standard radiobindande analys (RBA), med en enda autoantikroppsmätning, är mödosamma och ineffektiva för en storskalig screening.
Här kommer vi att beskriva den nyutvecklade enkla multiplexerade ECL-analysen, som vi har autentiserat med en enda ECL-analysplattform 8,9,10,11. Multiplex ECL-analysen kombinerar 7 autoantikroppstester i en enda brunn, med endast 15 μL serum, och kan screena för T1D och flera relevanta autoimmuna sjukdomar samtidigt inklusive celiaki, autoimmun sköldkörtelsjukdom och APS-1. En ZnT8A ECL-analys hade inte utvecklats vid den tiden och ingick inte i den multiplexerade analysen. Multiplex ECL-analysen ger ett utmärkt verktyg för hög genomströmning i allmän befolkningsscreening för T1D och flera autoimmuna sjukdomar.
Protocol
Forskningsprotokollet godkändes av Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Buffertberedning
- Gör märkningsbufferten (2x PBS, pH 7,9). Använd 400 ml destillerat avjoniserat (DD) vatten och tillsätt 100 ml 10x PBS. För att justera lösningens pH, tillsätt NaOH tills den når 7,9.
- Skapa 3 mM biotin genom att lösa upp 1 mg biotin i 588 μL märkningsbuffert som tidigare skapats. Gör 3 mM Ru Sulfo-NHS genom att lösa upp 150 nmol Ru Sulfo-NHS i 50 μL märkningsbuffert.
- Gör antigenbufferten (1% BSA) genom att ta 500 ml 1x PBS och tillsätta 5 g bovint serumalbumin (BSA) till lösningen. Förbered 0,5 M ättiksyralösning. Förbered 1 M Tris-HCl-buffert med Trizma Base och justera pH-värdet till 9,0.
- För beläggningsbufferten (3% blockerare A), ta 500 ml 1x PBS och tillsätt 15 g blockerare A. Förbered tvättbufferten (0,05 % Tween 20, PBST) genom att blanda 5000 ml 1x PBS med 2,5 ml tween 20. Skapa läsbuffert (2x läsbuffert T med ytaktivt medel) genom att tillsätta 500 ml DD-vatten och 500 ml 4x läsbuffert T med ytaktivt medel.
OBS: För att hålla konsistensen mellan analyser är det viktigt att både biotin- och Ru Sulfo-NHS-lösningarna skapas strax före märkningsproceduren och inte skapas och lagras för framtida bruk.
2. Märkning av varje antigenprotein med biotin och Ru Sulfo-NHS separat
OBS: För att få en mer effektiv märkningsreaktion, använd en antigenproteinkoncentration på ≥0,5 mg / ml.
- Beräkna det molära antalet för varje antigenprotein och molantalet för biotin och Ru Sulfo-NHS. Tillsätt en korrekt mängd biotin eller Ru Sulfo-NHS till antigenprotein för märkningsreaktion enligt det molära förhållandet mellan antigenprotein och biotin eller Ru Sulfo-NHS.
- För antigenet som har den mindre molekylvikten (≤10 kDa), såsom proinsulinprotein, använd ett molärt förhållande på 1:5 (antigen: biotin och Ru Sulfo-NHS). För antigenet som har den större molekylvikten (>50 kDa), såsom GAD-protein, använd ett molförhållande på 1:20. För antigenet som har en medelmolekylvikt (10-50 kDa), använd ett molförhållande justerat mellan 1: 5-1: 20.
- För både biotin och Ru Sulfo-NHS, dela varje antigenvikt med motsvarande molekylvikter för att få antigenmoltalet för var och en. Dela det molära numret med koncentrationen för att få volymen för biotin. Upprepa detta för Ru Sulfo-NHS.
- Blanda antigenproteinet med biotin med rätt molförhållande, bestämt i steg 2.2. Gör sedan samma sak för Ru Sulfo-NHS.
OBS: För effektivitet i märkningsreaktionen måste alla reducerande kemikalier som Tris eller glycin i buffertsystemet bytas ut till 2x PBS-buffert, pH 7,9 av storleksspinnkolonnen. Märkningsprotokollen för biotin och Ru Sulfo-NHS är identiska. - Täck reaktionsrören med aluminiumfolie och inkubera dem vid rumstemperatur (RT) i 1 timme. Anledningen till att täcka reaktionsrören med folie är att både biotin och Ru Sulfo-NHS-reagenser är ljuskänsliga.
- Prima 2 ml eller 5 ml spinnkolonn medan reaktionsrören inkuberar (storleken på spinnkolonnen bestäms av volymen som laddas upp till kolonnen). Fyll spinnkolonnen med 2x PBS-buffert och centrifugera den sedan vid 1 000 x g i 2 min varje gång, totalt tre gånger.
- Stoppa märkningsreaktionen efter att reaktionsrören har inkuberats. För att stoppa reaktionen, rena det märkta antigenproteinet genom att leda det genom spinnkolonnen en gång. Centrifugera sedan kolonnen vid 1 000 x g i 2 minuter.
- Beräkna den totala märkta antigenkoncentrationen genom att dividera mängden antigenprotein närvarande med den slutliga volymen. Alikvot 50 μL av det renade märkta antigenproteinet per rör och lagra alikvoterna vid -80 °C för långvarig användning.
OBS: Det är viktigt att vara medveten om att för varje gång spinnkolonnen passerar antigenproteinet igenom kommer det att finnas cirka 90-95% retentionshastighet.
3. Definiera den bästa koncentrationen och förhållandena för de två märkta antigenerna för analysen (schackbrädesanalys)
OBS: Eftersom ECL-IAA-analysen i denna 7-Plex-analys kräver syrabehandling av serumprover, måste schackbrädets analys för varje antigen gå igenom detta steg innan den inkuberas med den märkta antigenblandningen.
- Applicera schackbrädesanalysen för varje antigen separat innan du kör multiplexanalysen. Steg 3.2-3.6 använder GAD65 som exempel.
- Beräkna utspädning av märkt GAD65-protein. Den rekommenderade riktade koncentrationen av den första blandningslösningen av biotinylerad GAD65 är 2000 ng / ml och Ru Sulfo-NHS-märkt GAD65 är 1000 ng / ml. Om koncentrationen av både biotinylerad och Ru Sulfo-NHS-märkt GAD65 i stamlösning är 1,0 μg / μl, kommer volymen som behövs för biotinylerad GAD65 i 560 μL arbetslösning att vara 1,12 μL och volymen som behövs för Ru Sulfo-NHS-märkt GAD65 i 700 μL arbetslösning kommer att vara 0,7 μL.
- Blanda 1,12 μl biotinylerat GAD65-protein med 240 μl streptavidinkonjugerad linker 1 i ett rör och 160 μl 1% BSA. Inkubera blandningen vid rumstemperatur i 30 min. Tillsätt 160 μl stopplösning till röret och inkubera blandningen vid rumstemperatur i ytterligare 30 minuter.
- Gör en seriell utspädning. Ta 280 μl av blandningen till ett nytt rör och tillsätt 280 μl stopplösning för att göra en utspädning på 1:2. Förbered flera nya rör. Upprepa detta steg för att köra en horisontell seriell utspädning för biotinmärkt GAD65-antigen (se föregående publikation12).
- Blanda 0,7 μl Ru Sulfo-NHS-märkt GAD65 (1 μg/μl) protein med 700 μl stopplösning. Ta sedan 350 μl av blandningen till ett nytt rör och tillsätt 350 μl stopplösning för att göra en 1:2 utspädning. Förbered flera nya rör, upprepa detta steg för att köra en vertikal seriell utspädning för Ru Sulfo-NHS-märkt GAD65-antigen.
- Bered två serumprover, ett prov som är mycket positivt för GADA och ett prov som är negativt för GADA, som vart och ett har en volym på 0,75 ml. Alikvot 15 μL positivt serum i varje brunn på den vänstra halvan av PCR-plattan med 96 brunnar. Alikvot 15 μL negativt serum i varje brunn på den högra halvan av PCR-plattan med 96 brunnar.
- Tillsätt 18 μl 0,5 M ättiksyra i varje brunn och blanda. Inkubera i 45 minuter vid RT. Förbered en ny PCR-platta med 96 brunnar. Tillsätt 17,5 μL av det biotinmärkta antigenet och 17,5 μL av det Ru Sulfo-NHS-märkta antigenet i varje brunn enligt serieutspädningarna (se föregående publikation12).
- Fortsätt med resten av analysstegen som beskrivs i steg 5.2 till 9.1.
- Bestäm signalförhållandet från de högpositiva proverna mot motsvarande negativa provsignaler. Välj den bästa koncentrationen för det Biotin-märkta antigenet och det Ru Sulfo-NHS-märkta antigenet genom att identifiera den punkt som har det högsta eller nära det högsta förhållandet mellan positiv och negativ signal. I denna förhållandeberäkning, överväga den låga bakgrundssignalen som erhållits från de negativa proverna.
OBS: De optimala koncentrationerna av Ru Sulfo-NHS och biotinmärkta antigenproteiner från schackbrädeanalyser visas nedan: 30 ng / ml och 200 ng / ml för GAD65, 120 ng / ml och 120 ng / ml för proinsulin, 10 ng / ml och 42 ng / ml för IA-2, 80 ng / ml och 80 ng / ml för TG, 8 ng / ml och 16 ng / ml för TPO, 31 ng/ml och 31 ng/ml för ThG och 12 ng/ml och 12 ng/ml för IFNα.
4. Skapa den blandade länkkopplade antigenlösningen
- Välj den optimala koncentrationen för varje antigen baserat på schackbrädesanalysen. Späd biotinet och Ru Sulfo-NHS-märkt antigen till den rationella arbetskoncentrationen.
- Bind olika länkar till vart och ett av de unikt biotinylerade antigenproteinerna. För en 96-brunns plattanalys, blanda 4 μL biotinylerad GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulin, IFN-α och IA-2-protein med 240 μL streptavidinkonjugerad linker 1, 2, 3, 4, 8, 9 och 10 i separat rör (figur 1). Tillsätt sedan 156 μl PBS/1% BSA per rör. Inkubera blandningen vid rumstemperatur i 30 min.
- Tillsätt 160 μl stopplösning i varje rör och inkubera dem vid rumstemperatur i ytterligare 30 minuter. Ta 400 μL linker-kopplat antigen från varje rör och kombinera alla 7 antigener tillsammans. Tillsätt 1,2 ml stopplösning och tillsätt sedan 4 μL Ru Sulfo-NHS-märkt GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulin, IFN-α och IA-2-antigen till blandningen. Nu är antigenlösningen redo att användas i analysen.
5. Inkubera serumprover med det märkta antigenet
OBS: Eftersom ECL-IAA-analysen i denna 7-Plex-analys kräver syrabehandling av serumprover, kräver varje serum syrabehandlingssteget innan det inkuberas med märkt antigenblandning för denna 7-Plex-analys.
- Alikvot 15 μL serum per brunn för en PCR-platta med 96 brunnar. Tillsätt 18 μl 0,5 M ättiksyra i varje brunn och blanda. Inkubera i 45 minuter vid RT. Bered en ny PCR-platta med 96 brunnar och alikvotera 35 μl antigenlösning i varje brunn.
- Medan plattan fortfarande ruvar, tillsätt 13 μL 1 M Tris pH 9,0 buffert till varje brunn i antigenplattan. Tillsätt buffert på sidan av varje brunn för att begränsa blandningen av Tris-buffert och antigen. När inkubationen är klar, ta 25 μL av det syrabehandlade serumet och pipettera det omedelbart i varje brunn på antigenplattan. Agitera lösningen och täck plattan med PCR-tätningsfolie för att undvika ljusexponering.
- Vid RT, sätt plattan på en shaker, inställd på låg hastighet, i 1 h. Förvara sedan plattan vid 4 °C och låt plattan inkubera i 18-24 timmar.
6. Förbered multiplexplattan
- Ta en multiplexplatta från kylskåpet på 4 °C och låt plattan komma till RT. När multiplexplattan är vid RT, tillsätt 150 μL 3% Blocker A till varje brunn. Täck multiplexplattan med tätningsfolie. Inkubera plattan i kylskåp på 4 °C över natten.
OBS: Analysdag 1 inkluderar steg 4 till 6.
7. Överför serum/antigeninkubat till multiplexplattan
- Följande dag, placera pappershanddukar på bordet och ta den inkuberande multiplexplattan från kylskåpet. Töm all buffert ur plattan. För att göra detta, vänd plattan upp och ner och klappa den på de förberedda pappershanddukarna tills det inte finns någon buffert i någon av brunnarna.
- Tvätta multiplexplattan genom att tillsätta 150 μL PBST i varje brunn. Kassera bufferten, som nämns i steg 7.1., och upprepa detta steg tre gånger. Tillsätt 30 μL serum/antigeninkubat i varje brunn i multiplexplattan. Täck plattan med folie för att begränsa dess exponering för ljus. Placera plattan på en plattskakare, inställd på låg hastighet, vid RT i 1 timme.
8. Tvätta plattan och tillsätt läsbuffert
- Ta bort serum/antigeninkubationerna från multiplexplattan genom att hålla plattan upp och ner och snärta ut lösningen. Tillsätt 150 μL PBST i alla brunnar och ta bort bufferten från plattan genom att återigen hålla plattan upp och ner och snärta ut lösningen. Upprepa detta steg tre gånger. När den tredje tvätten är klar, tillsätt 150 μL läsbuffert i varje brunn.
OBS: Luftbubblor stör plattläsarmaskinens förmåga att noggrant analysera plattans resultat och bör undvikas till varje pris.
9. Läs plattan och analysera data
- Räkna den förberedda plattan på plattläsarmaskinen och läs alla värden i antal per sekund (CPS).
- Beräkna det relativa indexet för analysen med hjälp av antikroppsnivåerna som erhållits från plattläsarmaskinen med följande ekvation:
Indexvärde = [CPS (prov) - CPS (negativ standard)] / [CPS (positiv standard) - CPS (negativ standard)]. - Bestäm vilka antikroppsresultat som är negativa eller positiva med hjälp av de avgränsningar som har fastställts.
OBS: Analysdag 2 innehåller steg 7 till 9.
Representative Results
Analys av analysresultat visades i tabell 1, tabell 2 och tabell 3. Läsvärdena kommer från data från de 10 platserna i samma brunn. Indexvärdena för varje prov beräknades mot motsvarande interna positiva och negativa kontroller enligt beskrivningen i analysprotokollet. Exempel på dåliga dubbletter visas i tabell 1 och orsakade det slutliga indexberäkningsfelet i tabell 3. Alla råräkningsvärden måste kontrolleras för att undvika falskt positiva eller falska negativa resultat.
Den 7-multiplexerade ECL-analysen validerades med hjälp av en stor kohort av prover från 1026 nydiagnostiserade patienter med T1D och 1022 ålders- och könsmatchade friska kontrollpersoner. Nivåerna av autoantikroppar från 7-Plex ECL-analys för 1026 T1D-patienter jämfördes med nivåerna från var och en av våra motsvarande etablerade enskilda ECL-analyser som visas i figur 2 och från varje motsvarande enskild standard RBA och ELISA som visas i figur 3. Analysspecificiteterna fastställdes identiska vid 99:e percentilen för alla autoantikroppsanalyser utom för sköldkörtelautoantikroppar (där den 95:e percentilen användes), av 1022 friska kontroller för alla tre analysmetoderna (7-Plex ECL, single ECL, RBA eller ELISA) enligt tabell 4. De inter-assay CV: erna för GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA och IFNαA är 6,4%, 4,5%, 9,1%, 4,9%, 5,7%, 11,3% respektive 5,9%.
Ett litet antal disharmoniska prover för var och en av de 7 autoantikropparna hittades runt gränsen för avskärningar för varje analys (figur 2 och figur 3). Elva kontrollprover (11/1022, 1,1%) hittades flera autoantikroppspositiva endast i 7-Plex-analysen och negativa i varje motsvarande enda analys. På samma sätt hände det i 9 prover av T1D-patienterna (9/1026, 0,9%). Dessutom missades 10 högpositiva TPOA och en ThGA i patientkohorten som sågs i både den enda ECL-analysen och RBA i 7-Plex-analysen. Dessa prover omvandlades positivt i 7-Plex-analysen när de späddes ut ytterligare. I allmänhet täcktes 100 % av positiviteten i single ECL-analys eller RBA i 7-Plex ECL-analysen, med samma analysspecificitet som illustreras i tabell 4.
Figur 1: Illustration av Mutiplex ECL-analysen.
Autoantikroppar i serum kommer att överbrygga Ru Sulfo-NHSged-antigenet till det biotinylerade antigenet. Detta kombineras med en specifik länkare för att bilda ett komplex av antigen-antikropp-antigen-linker. Komplexen fångas på plattan och hålls fast vid sina specifika fläckar genom varje specifik länkare. De specifikt kopplade länknumren, för de 7 olika antigenproteinerna, illustreras. Detektion av antikroppssignaler åstadkoms med hjälp av Ru Sulfo-NHS-märkta antigener med elektrokemiluminescens. Figuren är från Gu, Y. et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförelse av 7 autoantikroppsnivåer hos 1026 nydebuterade patienter med T1D mellan den enda ECL-analysen och 7-Plex ECL-analysen.
Panelerna a, b, c, d, e, f och g visar jämförelser av autoantikroppsnivåer för GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA respektive IFNαA. De streckade linjerna representerar analysavgränsningarna för varje autoantikroppsanalys. Brytpunkterna sattes till den 99:e percentilen av 1022 åldersmatchade friska kontroller för varje analys (förutom TPOA och ThGA som var inställda på den 95:e percentilen), som visas i tabell 4, från 1022 åldersmatchade friska kontroller för både enstaka och multiplexa ECL-analyser. Röda slutna diamanter markeras som "falska" positiva i 7-Plex ECL-analysen, <1% av den studerade kohorten, och de validerades som negativa i både enstaka ECL och RBA. Röda nära rutor markeras som "falska" negativ i 7-Plex ECL-analysen orsakad av fenomenet "prozon", som huvudsakligen förekommer i TPOA-analysen i <1% av den studerade kohorten. Båda dessa falska positiva och falska negativa resultat diskuteras i diskussionsavsnittet. Figuren är från Gu, Y. et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av 7 autoantikroppsnivåer hos 1026 nydebuterade patienter med T1D mellan RBA (ELISA för IFNαA) och 7-Plex ECL-analysen.
Panelerna a, b, c, d, e, f och g presenterar jämförelser av autoantikroppsnivåer för GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA respektive IFNαA. De streckade linjerna representerar analysavgränsningarna för varje autoantikroppsanalys, samma specificitetsuppsättning för både RBA och 7-Plex ECL-analysen, som visas i tabell 4, från 1022 åldersmatchade friska kontroller. Röda slutna diamanter och rutor representerar "falska" positiva och "falska" negativa som visas i 7-Plex ECL-analysen, detsamma visas i figur 2. Figuren är från Gu, Y. et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| A | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | länkare-1 |
| 100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | länkare-2 | |
| 115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | länkare-3 | |
| 67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | länkare-4 | |
| 89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | länkare-5 | |
| 87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | länkare-6 | |
| 94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | länkare-7 | |
| 75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | länkare-8 | |
| 98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | länkare-9 | |
| 102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | länkare-10 | |
| B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | länkare-1 |
| 101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | länkare-2 | |
| 111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | länkare-3 | |
| 72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | länkare-4 | |
| 81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | länkare-5 | |
| 90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | länkare-6 | |
| 101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | länkare-7 | |
| 82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | länkare-8 | |
| 92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | länkare-9 | |
| 83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | länkare-10 | |
| C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | länkare-1 |
| 5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | länkare-2 | |
| 114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | länkare-3 | |
| 64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | länkare-4 | |
| 94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | länkare-5 | |
| 77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | länkare-6 | |
| 77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | länkare-7 | |
| 73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | länkare-8 | |
| 86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | länkare-9 | |
| 105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | länkare-10 | |
| D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | länkare-1 |
| 288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | länkare-2 | |
| 109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | länkare-3 | |
| 78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | länkare-4 | |
| 79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | länkare-5 | |
| 83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | länkare-6 | |
| 87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | länkare-7 | |
| 74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | länkare-8 | |
| 68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | länkare-9 | |
| 86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | länkare-10 | |
| E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | länkare-1 |
| 101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | länkare-2 | |
| 6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | länkare-3 | |
| 66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | länkare-4 | |
| 102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | länkare-5 | |
| 82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | länkare-6 | |
| 85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | länkare-7 | |
| 72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | länkare-8 | |
| 77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | länkare-9 | |
| 114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | länkare-10 | |
| F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | länkare-1 |
| 101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | länkare-2 | |
| 406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | länkare-3 | |
| 72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | länkare-4 | |
| 76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | länkare-5 | |
| 88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | länkare-6 | |
| 104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | länkare-7 | |
| 76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | länkare-8 | |
| 85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | länkare-9 | |
| 131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | länkare-10 | |
| G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | länkare-1 |
| 99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | länkare-2 | |
| 119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | länkare-3 | |
| 76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | länkare-4 | |
| 88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | länkare-5 | |
| 73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | länkare-6 | |
| 5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | länkare-7 | |
| 80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | länkare-8 | |
| 96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | länkare-9 | |
| 98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | länkare-10 | |
| H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | länkare-1 |
| 107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | länkare-2 | |
| 114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | länkare-3 | |
| 77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | länkare-4 | |
| 92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | länkare-5 | |
| 87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | länkare-6 | |
| 328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | länkare-7 | |
| 75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | länkare-8 | |
| 73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | länkare-9 | |
| 113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | länkare-10 | |
Tabell 1: Analys av 7-plex ECL-analys: rå CPS-antal (vänster halva av plattan). Rå CPS-räkning förvärvas från en analysplatta (den vänstra halvan av plattan) och varje prov utförs i två exemplar. Under varje rad på plattan (A-H) finns det 10 rader med läsvärden som representerar data från de 10 platserna inom samma brunn, vilket motsvarar varje länknummer som markerat. Exempel på dåliga dubbletter markeras med grått, vilket framgår av rad F-linker 3-kolumnerna 5 och 6.
| Rad i tabell 1A | Kolumn i tabell 1A | länkare 1 | länkare 2 | länkare 3 | länkare 7 | länkare 8 | länkare 9 | länkare 10 | |
| A | 1-2 | GADA-dator | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
| B | 1-2 | GADA låg dator | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
| C | 1-2 | TPOA-dator | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
| D | 1-2 | TPOA låg dator | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
| E | 1-2 | TGA-dator | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
| F | 1-2 | TG låg PC | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
| G | 1-2 | ThGA PC | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
| H | 1-2 | ThGA låg PC | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
| A | 3-4 | IAA-dator | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
| B | 3-4 | IAA låg dator | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
| C | 3-4 | IFNaA-dator | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
| D | 3-4 | IFNaA låg dator | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
| E | 3-4 | IA-2A-dator | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
| F | 3-4 | IA-2A låg dator | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
| G | 3-4 | NC | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
| H | 3-4 | NC | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
| A | 5-6 | prov1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
| B | 5-6 | prov 2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
| C | 5-6 | prov3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
| D | 5-6 | prov4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
| E | 5-6 | prov5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
| F | 5-6 | prov6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
| G | 5-6 | prov7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
| H | 5-6 | prov8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
Tabell 2: Analys av 7-plex ECL-analys: arrangemang av tabell 1-data, markerade som 7 länkare. Data från tabell 1 ordnades om, med länkarna 4 till 6 (används inte) raderade, och medelvärden beräknades från varje dubblettavläsning från tabell 1. Värdena för den interna standarden höga och låga positiva kontroller, som motsvarar varje autoantikroppsanalys, begränsad av en viss länkare, är i mörk fetstil. PC, positiv kontroll. NC, normal kontroll.
| GAD-index | TPOA-index | TGA-Index | ThGA-index | IAA-index | IFNaA-index | IA-2A-index | |
| GADA-dator | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
| GADA låg dator | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
| IAA-dator | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
| IAA låg dator | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
| IA-2A-dator | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
| IA-2A låg dator | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
| TGA-dator | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
| TG låg PC | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
| TPOA-dator | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
| TPOA låg dator | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
| ThGA PC | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
| ThGA låg PC | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
| IFNaA-dator | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
| IFNaA låg dator | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
| NC | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| NC | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
| prov1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
| prov 2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
| prov3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
| prov4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
| prov5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
| prov6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
| prov7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
| prov8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
Tabell 3: Analys av 7-plex ECL-analys: resultat av indexvärden. Indexvärdena för varje prov för alla 7 autoantikroppsanalyser beräknades mot motsvarande interna positiva och negativa kontroller enligt beskrivningen i analysprotokollet. Alla indexvärden som var större än brytvärdet definierades som ett positivt resultat, som visas i mörk fetstil. TGA-indexvärdet för sample6 markerades med grått eftersom det är ett fel som orsakas av dåliga dubbletter som visas i rad F-linker 3-kolumnerna 5 och 6 i tabell 1.
| GADA | IA-2A | IAA | .TGA | TPOA | ThGA | IFNαA* | ||||||||
| Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | |
| RBA | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
| Gemensam europeisk referensgrad | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
| 7-Plex ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
Tabell 4: Analyskänslighet och specificitet bland 1026 T1D-patienter och 1022 kontroller, matchade för både ålder och kön, i en 7-plex ECL-analys, jämfört med motsvarande enda ECL-analys och RBA eller ELISA*. Three olika analyser (RBA, single ECL och 7-Plex ECL) för varje autoantikropp ställdes in på liknande specificiteter med hjälp av 1022 ålders- och könsmatchade friska kontroller. Specificitetsresultatet från den studerade kontrollkohorten sattes till cirka 95% för TPOA och ThGA och till 99% för de 5 andra analyserna. *Asterisk markerar IFNαA-analysen för ELISA, medan andra är RBA.
Discussion
I många nationella och internationella kliniska prövningar för typ 1-diabetes har prestandan hos den enda ECL-analysen för att upptäcka ö-autoantikroppar och autoantikroppar mot transglutaminas (TGA) för celiakistyrkts 8,9,10,11. Under dessa spår har denna analys ökat känsligheten och specificiteten för autoantigendetektering när den bedöms mot den befintliga "guld" -standarden RBA. Den förbättrade sjukdomsspecificiteten kan ses när man diskriminerar autoantikroppar med hög affinitet och hög risk från lågrisksignaler med låg affinitets, mellan den enda ECL-analysen och RBA14,15,16,17. Baserat på den enda ECL-analysen utgör vi en ny multiplexerad ECL-autoantikroppsanalys med hög genomströmning för att göra det möjligt för oss att screena för T1D samt flera tillämpliga autoimmuna sjukdomar samtidigt.
Multiplex ECL-analysen använder multiplexplattan, som kan kombinera upp till 10 autoantikroppsanalyser i en enda brunn. För den aktuella studien kombineras 7 autoantikroppsanalyser tillsammans. Autoantikropparna består av 3 IAbs (IAA, GADA och IA-2A), 2 autoimmuna autoantikroppar mot sköldkörtelsjukdom (TPOA och ThGA), autoantikroppar mot celiaki (TGA) och APS-1 autoantikroppar mot interferon alfa (IFNαA). Analysmekanismen är i allmänhet baserad på en enda ECL-analys som tidigare publicerats 9,10,12,18 med vissa modifieringar. Huvudskillnaden för en multiplex ECL-analys från en enda ECL-analys är att varje antikroppsantigenkomplex som bildas i vätskefasen är fasthållet till en specifik länkare (figur 1). Det biotinmärkta antigenet inkuberas med Streptavidin-konjugerat, en länkare som används för att bilda ett specifikt antigen-linker-komplex. Antikroppsantigenimmunkomplex bildas efter inkubation med patientserum och fångas upp på en specifik plats genom det specifika länksystemet på varje brunn i multiplexplattan. Ru Sulfo-NHS-märkt antigen fångat av antikroppar samtidigt ger signalen elektrokemiluminescens. Plattläsarmaskinen kan detektera upp till 10 olika signaler från punktkällorna i varje brunn. För att hålla autoantikroppsanalyser konsekventa mellan plattorna och vid långtidsstudier föreslår vi att samma länkare används.
Innan du ställer in en multiplex ECL-analys måste enstaka ECL-analyser för varje autoantikropp optimeras på en multiplexplatta respektive valideras mot både RBA- och enstaka ECL-analyser på en vanlig ECL-platta. För att förbättra schackbrädesanalysen, till den relaterade autoantikroppsanalysen på multiplexplattan, användes en högpositiv patient och ett negativt patientprov. Efter att schackbrädets analys genomfördes beräknades de mest idealiska koncentrationerna för Ru Sulfo-NHS och biotinmärkt antigen för var och en av de 7 autoantikroppsanalyserna. Följande visar dessa koncentrationer: 30 ng/ml och 200 ng/ml för GAD65, 120 ng/ml och 120 ng/ml för proinsulin, 10 ng/ml och 42 ng/ml för IA-2, 80 ng/ml och 80 ng/ml för TG, 8 ng/ml och 16 ng/ml för TPO, 31 ng/ml och 31 ng/ml för ThG, och 12 ng/ml respektive 12 ng/ml för IFNα13. Koncentrationerna av vissa av antigenerna från kontrollplansanalysen kan behöva justeras ytterligare beroende på resultaten i den faktiska multiplexanalysen efter att alla analyser har kombinerats tillsammans.
Eftersom IAA ingår i den nuvarande multiplexa ECL-analysen är syrabehandling av serumprover obligatorisk innan serumet inkuberas med antigen, vilket rapporterades i den tidigare studien12. I allmänhet, när en extra autoantikropp läggs till i en multiplexanalys, påverkas analysbakgrunden och en extremt hög signal från en plats, i brunnen, kan hindra resultaten av närliggande fläckar via överhörning. Därför måste den maximala CPS begränsas till 20 000 räkningar för varje autoantikropp, eller lägre, för de högsta positiva proverna. Från vår kunskap, för att minska mängden överhörning som är inblandad, bör autoantikroppar som har en lägre bakgrund separeras, när man utformar spotkartan, långt ifrån fläckar med högre frekvens av räkningar.
Höga positiva och negativa kontroller användes internt i varje analys för att beräkna ett exakt index för de okända prover som testades. För att noggrant bedöma och övervaka analysens känslighet användes låga positiva kontroller, inställda nära analysens övre gräns. Dessa positiva och negativa standardkontroller skapades i bulk och alikvot för långvarig användning och lagrades vid -20 °C eller lägre, för överensstämmelse mellan analyserna. För kvalitetssäkringsändamål kördes prover två gånger i varje analys och varje positivt resultat reran och bekräftades genom att köra provet i en ny ECL-analys nästa dag. Om det fanns någon oenighet med den första och andra bekräftande analysen var en tredje analys nödvändig. Av de tre genomförda analyserna bestämde resultaten av de två analyserna som överensstämmer (t.ex. +, + eller -,-) det slutliga resultatet (positivt eller negativt) av provet.
Under det senaste decenniet söker många studiegrupper en analys med hög genomströmning med hjälp av multiplexmetoden för att kombinera flera autoantikroppsanalyser tillsammans till en brunn för att screena stora populationer. Det finns några studier som använder olika typer av tekniker för att genomföra multiplex autoantikroppsanalyser 19,20,21,22, men det finns ingen jämförelse för någon av dessa analyser i känslighet och specificitet mot den nuvarande "guld" -standarden RBA, när man studerar T1D. Dessa olika typer av plattformar som används valideras inte genom den internationella IASP-workshopen (Islet Autoantibody Standardization Program) eller genom att testa stora kohorter i kliniska prövningar. I en nyligen genomförd allmän befolkningsbaserad screening i Tyskland används en kombinerad analys med hög genomströmning, 3 Screen ICATM ELISA distribuerad av Kronus, som ett verktyg för första linjens screening för att upptäcka tre IAbs, GADA, IA-2A och ZnT8A, för att uppnå tidig diagnos av barndomens T1D23. 3-Screen ELISA-analysen mäter 3 autoantikroppar antingen i 3 separerade brunnar, konsumerar en stor volym serum eller i en enda brunn med alla 3 analyser blandade. Om en brunn i 3-Screen ELISA-analysen är positiv kan man inte skilja vilken av tre autoantikroppar som finns. Den största nackdelen med denna analys är dess oförmåga att inkludera IAA-mätning. Alla IAA-resultat som utförs av ELISA, vilket bevisats i IASP-workshops, har inte en acceptabel känslighet och specificitet24. IAA är vanligtvis den första IAb som visas och har en hög prevalens bland små barn. IAb-screening, med IAA, är nödvändig för barn och det anses inte acceptabelt att genomföra denna screening utan IAA för att bedöma T1D-risken i samhället. Dessutom finns det inga publicerade studier eller data som visar att Kronus IAb-kitanalysen är mer T1D-sjukdomsspecifik och kan skilja hög risk från lågrisk-IAbs. 7-Plex ECL-analysen, i den aktuella studien, validerades med hjälp av en stor kohort av nydiagnostiserade patienter med T1D13. Jämfört med den nuvarande standard RBA och väletablerade enda ECL-analys kan 7-Plex-analysen behålla 100% positivitet med samma analysspecificitet (tabell 4). För närvarande tillämpas 4-Plex ECL-analysen, parallellt med standard RBA, på en pågående stor klinisk prövning: Autoimmunity Screening for Kids (ASK) -studie. Denna studie visar barn i den allmänna befolkningen, i Denver storstadsområde, för T1D och celiaki. Jämfört med standard RBA som används i ASK-studien visar multiplex ECL-analysen utmärkt känslighet och en högre sjukdomsspecificitet, identisk med våra tidigare rapporter med den enda ECL-studien25. Dessutom visade vår 4-Plex ECL-analys en uttalad minskning av arbets-, kostnads- och serumvolymen med 70%, jämfört med motsvarande 4 enskilda analyser för ECL och RBA. Med hjälp av den multiplexerade ECL-analysen kan vi anpassa varje brunn med olika siffror, som representerar olika autoantikroppar (upp till 10), för att testa för olika autoimmuna sjukdomar som är specifika för behoven på en viss klinisk plats.
Det finns vissa begränsningar observerade, som visas i den aktuella studien, för en multiplexerad ECL-analys med multiplexplattan. Den slutliga utspädningen av serum, inkuberad med antigen, kan inte justeras för att ge de mest optimala förhållandena för varje enskild autoantikroppsanalys som kombineras i en enda brunn. Nio prover (9/1026), från T1D-patienter, observerades ha ett falskt negativt resultat för vissa autoantikroppar. 7 av de falska negativa var för TPOA och 2 var för ThGA, i 7-Plex ECL-analysen, men höga positiva resultat uppvisades i både den enda ECL-analysen och RBA (figur 2 & 3). Efter ytterligare utspädning av alla 9 prover blev de positiva på multiplexplattan. Detta resultat orsakas av, vad vi beskriver som "prozon" -fenomenet. Detta fenomen gör att provet visar ett falskt negativt resultat eftersom de höga antikroppstitrarna påverkar bildandet av antigen-antikroppsgitter. Vid upprättandet av en multiplexanalys rekommenderas prover med mycket höga titrar, för var och en av de kombinerade autoantikropparna, att låta förtester köras för att identifiera den valfria utspädningen av serum för antigeninkubation. Alternativt bör autoantikroppsanalyser med liknande optimerade förhållanden väljas för att bilda en kombinerad analys från vilken den bästa analyskänsligheten och specificiteten uppnås för varje autoantikropp. I den aktuella studien resulterade 7 prover (7/1022), från friska normala kontroller, i falska positiva resultat för flera autoantikroppar i 7-Plex-analysen, men efter att ha kört en enda ECL-analys och RBA (figur 2 & 3) befanns dessa autoantikroppar vara negativa i båda analyserna. Orsakerna bakom dessa falskt positiva resultat som förekommer på multiplexplattan, för dessa små delmängder av prover, är för närvarande okända. För den nuvarande tillämpningen av multiplex ECL-analysen upprepas alla positiva prover med motsvarande enda ECL-analys för att bekräfta positivitet, vilket tar bort detta falska positiva fel från multiplex ECL-analysen.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag DK32083, JDRF-bidrag 2-SRA-2015-51-Q-R och 2-SRA-2018-533-S-B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 °C refrigerator | |||
| –80 °C and -20 °C freezers | |||
| 96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Acetic acid solution | Fisher | ||
| Aluminum foil | |||
| Antigen proteins | |||
| Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
| Human ThG full length protein | BioMart | ||
| Human TPO full length protein | BioMart | ||
| IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
| IFN-α protein | Abcam | ||
| Proinsulin protein | AmideBio | ||
| tTG protein | DiaRect | ||
| Biotin | Sigma | ||
| Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| Distilled deionized (DD) water | |||
| HCl | Fisher | ||
| Ice maker | |||
| Ice trays | |||
| MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
| Multi-channel pipette | |||
| NaOH | |||
| Paper tower | |||
| PBS | |||
| pH meter | |||
| Pipette-Aid | |||
| Pipettes/tips | |||
| Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| Uplex Development Kit | MSD | ||
| 96-well UPlex plate | MSD | ||
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Linker-Streptavidin | MSD | ||
| Read buffer | MSD | R92TC | |
| Stop Solution | MSD | ||
| Vortex mixer | |||
| ZeBa Column | Pierce | 89892 |
References
- Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
- Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
- Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
- Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).
- Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
- Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
- Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
- Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
- Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
- Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).
- Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
- Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
- Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
- Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
- Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
- Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
- Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).
