Summary
We modelleren een eenvoudige multiplexed ECL-test die 7 autoantilichaamtests samen combineert. De test is in staat om tegelijkertijd te screenen op T1D en meerdere andere auto-immuunziekten, waaronder coeliakie, auto-immuun schildklierziekte en auto-immuun polyglandulair syndroom 1.
Abstract
Eilandjes autoantilichamen (IAbs) worden veel gebruikt bij de diagnose en voorspelling van type 1 diabetes (T1D). Vier belangrijke IAbs voor insuline (IAA), glutamaat decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigeen-2 (IA-2A) en zinktransporter-8 (ZnT8A) zijn even belangrijk bij het voorspellen van ziekten. Momenteel ontwikkelt tot 40% van de patiënten met de diagnose T1D andere auto-immuunziekten. Helaas zijn de huidige screeningmethoden met behulp van een enkel autoantilichaam voor meting bewerkelijk en inefficiënt voor grootschalige screeningstudies. We hebben onlangs een eenvoudige multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay ontwikkeld om deze huidige problemen aan te pakken. De test combineert alle 7 autoantilichaamtests in één put. Elke put bevat drie IAbs (IAA, GADA en IA-2A), auto-antilichamen tegen schildklierperoxidase (TPOA) en schildklierglobuline (ThGA) om auto-immuun schildklierziekte te detecteren, auto-antilichamen tegen weefseltransglutaminase (TGA) voor coeliakie en auto-antilichamen tegen interferon alfa (IFNαA) voor auto-immuun polyglandulair syndroom-1 (APS-1); die allemaal tegelijkertijd screenen op T1D en andere relevante auto-immuunziekten. De multiplex ECL-test is gebaseerd op het enkele ECL-testplatform, maar gebruikt in plaats daarvan de multiplexplaat die meerdere autoantilichaamtests, tot 10, combineert in een enkele put. Het belangrijkste verschil met de enkele ECL-test is dat elk antilichaam-antigeencomplex gevormd in de vloeistoffase wordt vastgehouden op een specifieke plek op elke put via een linkersysteem op de multiplexplaat. De 7-Plex ECL-test, in de huidige studie, wordt gevalideerd tegen standaard radiobindende assays (RBA) en enkele ECL-assays, met behulp van een groot cohort van nieuw gediagnosticeerde T1D-patiënten en op leeftijd afgestemde gezonde controles, wat resulteert in uitstekende assaygevoeligheid en specificiteit.
Introduction
Type 1 diabetes (T1D) is een ernstige chronische ziekte die het meest voorkomt in de kindertijd. Momenteel hebben ongeveer 1,4 miljoen mensen de T1D in de Verenigde Staten; opvallend is dat de incidentie van T1D wereldwijd gestaag toeneemt met 3-5% per jaar en in de afgelopen twee decennia is verdubbeld, vooral bij jonge kinderen 1,2. Eilandjesautoantilichamen (IAbs) in de bloedcirculatie zijn op dit moment de meest betrouwbare biomarker. De IAbs kunnen verschijnen jaren voordat klinische T1D zich ontwikkelt3. Momenteel worden vier belangrijke IAbs veel gebruikt bij T1D-diagnose en risicoscreening, waaronder auto-antilichamen tegen insuline (IAZ), glutamaatdecarboxylase-65 (GADA), insulinoomantigeen-2 (IA-2A) en zinktransporter-8 (ZnT8A). Deze vier IAbs zijn even belangrijk bij het voorspellen van de ontwikkeling van T1D. De classificatie van T1D is onlangs opnieuw gedefinieerd als de aanwezigheid van ≥2 van elke 4 IAbs met een normaal glucosemetabolisme als het ziektestadium 14.
In de Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) werd onthuld dat een op de vier kinderen met een risico op T1D waarschijnlijk zou evolueren naar eilandjes-, coeliakie-, schildklier- of reumatoïde auto-immuniteit en nog opvallender, ongeveer 40% van de patiënten die zijn gediagnosticeerd met T1D ontwikkelen uiteindelijk een extra auto-immuunziekte 5,6,7 . Identificatie van auto-antilichamen zijn essentieel voor de voorspelling en diagnose van deze auto-immuunziekten en moeten betere klinische zorg voor patiënten bieden. Er is op dit moment geen gemakkelijke en goedkope manier om te screenen op deze meerdere auto-immuunziekten. De huidige screeningmethoden met behulp van standaard radiobindingstest (RBA), met een enkele autoantilichaammeting, zijn bewerkelijk en inefficiënt voor een grootschalige screening.
Hier zullen we de nieuw ontwikkelde eenvoudige multiplexed ECL-test beschrijven, die we hebben geverifieerd met behulp van een enkel ECL-testplatform 8,9,10,11. De multiplex ECL-test combineert 7 autoantilichaamtests in een enkele put, met slechts 15 μL serum, en is in staat om tegelijkertijd te screenen op T1D en meerdere relevante auto-immuunziekten, waaronder coeliakie, auto-immuun schildklierziekte en APS-1. Een ZnT8A ECL-test was op dat moment nog niet ontwikkeld en was niet opgenomen in de multiplexed assay. De multiplex ECL-test biedt een uitstekend hulpmiddel voor een hoge doorvoer in algemene bevolkingsonderzoeken voor T1D en meerdere auto-immuunziekten.
Protocol
Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Buffervoorbereiding
- Maak de labelingbuffer (2x PBS, pH 7,9). Gebruik 400 ml gedestilleerd gedeïoniseerd (DD) water en voeg 100 ml 10x PBS toe. Om de pH van de oplossing aan te passen, voegt u NaOH toe totdat deze 7,9 bereikt.
- Maak 3 mM biotine door 1 mg biotine op te lossen in 588 μL labelingbuffer die eerder is gemaakt. Maak 3 mM Ru Sulfo-NHS door 150 nmol Ru Sulfo-NHS op te lossen in 50 μL etiketteringsbuffer.
- Maak de antigeenbuffer (1% BSA) door 500 ml 1x PBS te nemen en 5 g runderserumalbumine (BSA) aan de oplossing toe te voegen. Bereid 0,5 M azijnzuuroplossing. Bereid 1 M Tris-HCl buffer voor met Trizma Base en stel de pH in op 9,0.
- Neem voor de coatingbuffer (3% Blocker A) 500 ml 1x PBS en voeg 15 g blocker A toe. Bereid de wasbuffer (0,05% Tween 20, PBST) voor door 5000 ml 1x PBS te mengen met 2,5 ml Tween 20. Creëer leesbuffer (2x Leesbuffer T met oppervlakteactieve stof) door 500 ml DD-water en 500 ml 4x leesbuffer T met oppervlakteactieve stof toe te voegen.
OPMERKING: Om de consistentie tussen de testen te behouden, is het belangrijk dat zowel de biotine- als de Ru Sulfo-NHS-oplossingen vlak voor de etiketteringsprocedure worden gemaakt en niet worden gemaakt en opgeslagen voor toekomstig gebruik.
2. Elk antigeeneiwit afzonderlijk labelen met biotine en Ru Sulfo-NHS
OPMERKING: Gebruik een antigeeneiwitconcentratie van ≥0,5 mg / ml om een effectievere etiketteringsreactie te hebben.
- Bereken het molaire aantal van elk antigeeneiwit en de molaire aantallen van de biotine en Ru Sulfo-NHS. Voeg een juiste hoeveelheid biotine of Ru Sulfo-NHS toe aan antigeeneiwit voor etiketteringsreactie volgens de molaire verhouding van antigeeneiwit tot biotine of Ru Sulfo-NHS.
- Gebruik voor het antigeen dat het kleinere molecuulgewicht heeft (≤10 kDa), zoals proinsuline-eiwit, een molaire verhouding van 1:5 (antigeen: biotine en Ru Sulfo-NHS). Gebruik voor het antigeen dat het grotere molecuulgewicht heeft (>50 kDa), zoals GAD-eiwit, een molaire verhouding van 1:20. Gebruik voor het antigeen met een middelmatig molecuulgewicht (10-50 kDa) een molaire verhouding aangepast tussen 1:5-1:20.
- Voor zowel de biotine als De Ru Sulfo-NHS, deel elk antigeengewicht door hun overeenkomstige molecuulgewichten om het antigeen molaire getal voor elk te krijgen. Deel het molaire getal door de concentratie om het volume voor biotine te krijgen. Herhaal dit voor Ru Sulfo-NHS.
- Meng het antigeeneiwit met biotine met behulp van de juiste molaire verhouding, bepaald in stap 2.2. Doe dan hetzelfde voor Ru Sulfo-NHS.
OPMERKING: Voor de efficiëntie van de etiketteringsreactie moeten alle reducerende chemicaliën zoals Tris of glycine in het buffersysteem worden vervangen door 2x PBS-buffer, pH 7,9 door de maatspinkolom. De etiketteringsprotocollen voor biotine en Ru Sulfo-NHS zijn identiek. - Bedek de reactiebuizen met aluminiumfolie en incubeer ze bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur. De reden dat de reactiebuizen met folie worden bedekt, is omdat zowel biotine als Ru Sulfo-NHS-reagentia lichtgevoelig zijn.
- Prime de 2 ml of 5 ml spinkolom terwijl de reactiebuizen broeden (de grootte van de spinkolom wordt bepaald door het volume dat op de kolom wordt geüpload). Vul de spinkolom met 2x PBS-buffer en centrifugeer deze vervolgens op 1.000 x g gedurende 2 minuten per keer, voor een totaal van drie keer.
- Stop de etiketteringsreactie nadat de reactiebuizen klaar zijn met incuberen. Om de reactie te stoppen, zuivert u het gelabelde antigeeneiwit door het eenmaal door de spinkolom te laten gaan. Centrifugeer vervolgens de kolom op 1.000 x g gedurende 2 min.
- Bereken de totale gelabelde antigeenconcentratie door de hoeveelheid aanwezig antigeeneiwit te delen door het uiteindelijke volume. Aliquot 50 μL van het gezuiverde gelabelde antigeeneiwit per buis en bewaar de aliquots bij -80 °C voor langdurig gebruik.
OPMERKING: Het is belangrijk om te weten dat voor elke keer dat de spinkolom het antigeeneiwit passeert, er ongeveer een retentiepercentage van 90-95% zal zijn.
3. Bepaal de beste concentratie en verhoudingen voor de twee gelabelde antigenen voor de test (dambordtest)
OPMERKING: Aangezien de ECL-IAA-test in deze 7-Plex-test een zure behandeling van serummonsters vereist, moet de dambordtest voor elk antigeen deze stap doorlopen voordat deze wordt geïncubeerd met het gelabelde antigeenmengsel.
- Pas de dambordtest voor elk antigeen afzonderlijk toe voordat u de multiplextest uitvoert. In stappen 3.2-3.6 wordt GAD65 als voorbeeld gebruikt.
- Bereken verdunning van gelabeld GAD65-eiwit. De aanbevolen beoogde concentratie van de eerste mengseloplossing van gebiotinyleerd GAD65 is 2000 ng /ml en Ru Sulfo-NHS met het label GAD65 is 1000 ng / ml. Als de concentratie van zowel gebiotinyleerd als Ru Sulfo-NHS gelabeld GAD65 in voorraadoplossing 1,0 μg / μL is, is het volume dat nodig is voor gebiotinyleerd GAD65 in 560 μL werkoplossing 1,12 μL en het volume dat nodig is voor Ru Sulfo-NHS gelabeld GAD65 in 700 μL werkoplossing 0,7 μL.
- Meng 1,12 μL gebiotinyleerd GAD65-eiwit met 240 μL streptavidin-geconjugeerde linker 1 in één buis en 160 μL 1% BSA. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg 160 μL stopoplossing toe aan de buis en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende nog eens 30 minuten.
- Maak een seriële verdunning. Neem 280 μL van het mengsel in een nieuwe buis en voeg 280 μL stopoplossing toe om een 1:2 verdunning te maken. Bereid verschillende nieuwe buizen voor. Herhaal deze stap om een horizontale seriële verdunning uit te voeren voor biotine met het label GAD65-antigeen (zie de vorige publicatie12).
- Meng 0,7 μL Ru Sulfo-NHS gelabeld GAD65 (1 μg/μL) eiwit met 700 μL stopoplossing. Neem vervolgens 350 μL van het mengsel in een nieuwe buis en voeg 350 μL stopoplossing toe om een 1:2 verdunning te maken. Bereid verschillende nieuwe buizen voor, herhaal deze stap om een verticale seriële verdunning uit te voeren voor Ru Sulfo-NHS met het label GAD65-antigeen.
- Bereid twee serummonsters voor, één monster zeer positief voor GADA en één monster negatief voor GADA, elk met een volume van 0,75 ml. Aliquot 15 μL positief serum in elk putje op de linkerhelft van de 96-well PCR-plaat. Aliquot 15 μL negatief serum in elk putje op de rechterhelft van de 96-well PCR-plaat.
- Voeg 18 μL 0,5 M azijnzuur toe aan elk putje en meng. Incubeer gedurende 45 minuten bij RT. Bereid een nieuwe 96-well PCR-plaat voor. Voeg 17,5 μL van het biotine gelabelde antigeen en 17,5 μL van het Ru Sulfo-NHS gelabelde antigeen toe aan elke put volgens de seriële verdunningen (zie de vorige publicatie12).
- Ga verder met de rest van de teststappen die zijn beschreven in stap 5.2 tot en met 9.1.
- Bepaal de signaalverhouding van de hoogpositieve monsters ten opzichte van de overeenkomstige negatieve monstersignalen. Selecteer de beste concentratie voor het biotine-gelabelde antigeen en het Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigeen door het punt te identificeren dat de hoogste of bijna de hoogste verhouding van positief tot negatief signaal heeft. Houd bij deze verhoudingsberekening rekening met het lage achtergrondsignaal dat wordt verkregen uit de negatieve monsters.
OPMERKING: De optimale concentraties van Ru Sulfo-NHS en biotine gelabelde antigeeneiwitten uit dambordtests worden hieronder weergegeven: 30 ng / ml en 200 ng / ml voor GAD65, 120 ng / ml en 120 ng / ml voor pro-insuline, 10 ng / ml en 42 ng / ml voor IA-2, 80 ng / ml en 80 ng / ml voor TG, 8 ng / ml en 16 ng / ml voor TPO, 31 ng/ml en 31 ng/ml voor ThG, en 12 ng/ml en 12 ng/ml voor IFNα.
4. Maak de gemengde linker-gekoppelde antigeenoplossing
- Selecteer de optimale concentratie voor elk antigeen op basis van de dambordtest. Verdun de biotine en Ru Sulfo-NHS gelabeld antigeen tot de rationele werkconcentratie.
- Bind verschillende linkers aan elk van de uniek gebiotinyleerde antigeeneiwitten. Meng voor een 96-wells plaattest 4 μL gebiotinyleerd GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuline, IFN-α en IA-2 eiwit met 240 μL streptavidin-geconjugeerde linker 1, 2, 3, 4, 8, 9 en 10 in een aparte buis (figuur 1). Voeg vervolgens 156 μL PBS/1% BSA per buis toe. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Voeg 160 μL stopoplossing toe aan elke buis en incubeer ze bij kamertemperatuur gedurende nog eens 30 minuten. Neem 400 μL linker-gekoppeld antigeen uit elke buis en combineer alle 7 antigenen samen. Voeg 1,2 ml stopoplossing toe en voeg vervolgens 4 μL Ru Sulfo-NHS met het label GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuline, IFN-α en IA-2-antigeen toe aan het mengsel. Nu is de antigeenoplossing klaar om te worden gebruikt in de test.
5. Incubeer serummonsters met het gelabelde antigeen
OPMERKING: Aangezien de ECL-IAA-test in deze 7-Plex-test een zure behandeling van serummonsters vereist, vereist elk serum de zuurbehandelingsstap voordat het wordt geïncubeerd met een gelabeld antigeenmengsel voor deze 7-Plex-test.
- Aliquot 15 μL serum per putje voor een 96-well PCR plaat. Voeg 18 μL 0,5 M azijnzuur toe aan elk putje en meng. Incubeer gedurende 45 minuten bij RT. Bereid een nieuwe 96-well PCR-plaat en aliquot 35 μL antigeenoplossing in elk putje.
- Terwijl de plaat nog steeds broedt, voegt u 13 μL 1 M Tris pH 9,0-buffer toe aan elke put in de antigeenplaat. Voeg buffer toe aan de zijkant van elke put om het mengen van Tris-buffer en antigeen te beperken. Nadat de incubatie is voltooid, neemt u 25 μL van het met zuur behandelde serum en pipetteert u het onmiddellijk in elke put op de antigeenplaat. Roer de oplossing en bedek de plaat met PCR-afdichtingsfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.
- Leg bij RT de plaat op een shaker, ingesteld op een lage snelheid, gedurende 1 uur. Bewaar daarna de plaat op 4 °C en laat de plaat 18-24 uur incuberen.
6. Bereid de multiplexplaat voor
- Neem een multiplexplaat uit de 4 °C koelkast en laat de plaat op RT komen. Zodra de multiplexplaat op RT is, voegt u 150 μL van 3% Blocker A toe aan elke put. Bedek de multiplexplaat met afdichtingsfolie. Incubeer de plaat een nacht in een koelkast van 4 °C.
OPMERKING: Assay Dag 1 omvat stappen 4 tot en met 6.
7. Breng serum/antigeen incubeert in de multiplexplaat
- Leg de volgende dag papieren handdoeken op tafel en haal het broedende multiplexbord uit de koelkast. Leeg alle buffer uit de plaat. Om dit te doen, draait u het bord ondersteboven en dept u het op de voorbereide papieren handdoeken totdat er geen buffer aanwezig is in een van de putten.
- Was de multiplexplaat door 150 μL PBST in elke put toe te voegen. Gooi de buffer weg, zoals vermeld in stap 7.1., en herhaal deze stap drie keer. Voeg 30 μL serum/antigeen incubeert toe aan elke put in de multiplexplaat. Bedek de plaat met folie om de blootstelling aan licht te beperken. Plaats de plaat op een platenschudder, ingesteld op een lage snelheid, op RT gedurende 1 uur.
8. Was de plaat en voeg leesbuffer toe
- Verwijder de serum/antigeen incubeert uit de multiplexplaat door de plaat ondersteboven te houden en de oplossing eruit te vegen. Voeg 150 μL PBST toe aan alle putjes en verwijder de buffer van de plaat door de plaat opnieuw ondersteboven te houden en de oplossing eruit te vegen. Herhaal deze stap drie keer. Nadat de derde wasbeurt is voltooid, voegt u 150 μL leesbuffer toe aan elke put.
OPMERKING: Luchtbellen interfereren met het vermogen van de plaatlezermachine om de resultaten van de plaat nauwkeurig te analyseren en moeten ten koste van alles worden vermeden.
9. Lees de plaat en analyseer gegevens
- Tel de voorbereide plaat op de plaatlezermachine en lees alle waarden in tellingen per seconde (CPS).
- Bereken de relatieve index voor de test met behulp van de antilichaamniveaus die zijn verkregen uit de plaatlezermachine, met de volgende vergelijking:
Indexwaarde = [CPS (steekproef) - CPS (negatieve standaard)] / [CPS (positieve standaard) - CPS (negatieve standaard)]. - Bepaal welke antilichaamresultaten negatief of positief zijn met behulp van de cut-offs die zijn vastgesteld.
OPMERKING: Assay Day 2 omvat stap 7 tot en met 9.
Representative Results
Analyse van de testresultaten werd weergegeven in tabel 1, tabel 2 en tabel 3. Leeswaarden komen uit de gegevens van de 10 plekken binnen dezelfde put. De indexwaarden voor elk monster werden berekend op basis van de overeenkomstige interne positieve en negatieve controles zoals beschreven in het testprotocol. Voorbeelden van slechte duplicaten zijn weergegeven in tabel 1 en veroorzaakten de uiteindelijke indexberekeningsfout in tabel 3. Alle ruwe telwaarden moeten worden gecontroleerd om vals-positieve of fout-negatieve resultaten te voorkomen.
De 7-multiplexed ECL-test werd gevalideerd met behulp van een groot cohort monsters van 1026 nieuw gediagnosticeerde patiënten met T1D en 1022 leeftijd en geslacht gematchte gezonde controlepersonen. De niveaus van auto-antilichamen uit 7-Plex ECL-assay voor 1026 T1D-patiënten werden vergeleken met de niveaus van elk van onze overeenkomstige vastgestelde enkelvoudige ECL-assays zoals weergegeven in Figuur 2 en van elke overeenkomstige enkelvoudige standaard RBA en ELISA zoals weergegeven in Figuur 3. De assay specificiteiten werden identiek opgezet op 99e percentielen voor alle autoantilichaam assays behalve voor schildklier autoantilichamen (waar het 95e percentiel werd gebruikt), van 1022 gezonde controles voor alle drie de testmethoden (7-Plex ECL, single ECL, RBA of ELISA) zoals vermeld in tabel 4. De intertest-cv's van GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA en IFNαA zijn respectievelijk 6,4%, 4,5%, 9,1%, 4,9%, 5,7%, 11,3% en 5,9%.
Een klein aantal discordante monsters voor elk van de 7 auto-antilichamen werd gevonden rond de grens van cut-offs voor elke test (figuur 2 en figuur 3). Elf controlemonsters (11/1022, 1,1%) werden alleen in de 7-Plex-test positief gevonden en negatief in elke overeenkomstige enkele test. Evenzo gebeurde het in 9 monsters van de T1D-patiënten (9/1026, 0,9%). Bovendien werden 10 hoogpositieve TPOA en één ThGA in patiëntencohort die werden gezien in zowel de enkele ECL-assay als de RBA gemist in de 7-Plex-test. Deze monsters werden positief omgezet in de 7-Plex-test toen ze verder werden verdund. Over het algemeen werd 100% van de positiviteit in een enkele ECL-assay of RBA behandeld in de 7-Plex ECL-test, met dezelfde assay-specificiteit als geïllustreerd in tabel 4.
Figuur 1: Illustratie van de Mutiplex ECL-test.
Auto-antilichamen in serum zullen het Ru Sulfo-NHSged-antigeen overbruggen naar het gebiotinyleerde antigeen. Dit wordt gekoppeld aan een specifieke linker om een complex van antigeen-antilichaam-antigeen-linker te vormen. De complexen worden op de plaat gevangen en worden via elke specifieke linker op hun specifieke plekken vastgehouden. De specifiek gekoppelde linkergetallen, voor de 7 verschillende antigeeneiwitten, worden geïllustreerd. Detectie van antilichaamsignalen wordt bereikt met behulp van Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigenen met elektrochemiluminescentie. De figuur is van Gu, Y. et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van 7 autoantilichaamspiegels bij 1026 nieuwe patiënten met T1D tussen de enkele ECL-test en de 7-Plex ECL-test.
Panelen a, b, c, d, e, f en g geven vergelijkingen weer van autoantilichaamniveaus voor respectievelijk GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA en IFNαA. De stippellijnen vertegenwoordigen de assay cut-offs voor elke autoantilichaam assay. De cut-offs werden ingesteld op het99e percentiel van 1022 leeftijd-gematchte gezonde controles voor elke test (behalve voor TPOA en ThGA die waren ingesteld op het95e percentiel), zoals weergegeven in tabel 4, vanaf 1022 leeftijd overeengekomen gezonde controles voor zowel single als multiplex ECL-assays. Rode gesloten diamanten worden gemarkeerd als 'valse' positieven in de 7-Plex ECL-test, < 1% van het onderzochte cohort, en ze werden gevalideerd als negatief in zowel enkele ECL als RBA. Rode nauwe vierkanten worden gemarkeerd als 'valse' negatieven in de 7-Plex ECL-test veroorzaakt door het fenomeen 'prozone', voornamelijk voorkomend in de TPOA-test in <1% van het onderzochte cohort. Beide vals-positieve als vals-negatieve uitkomsten worden besproken in de discussiesectie. De figuur is van Gu, Y. et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van 7 autoantilichaamspiegels bij 1026 nieuwe patiënten met T1D tussen de RBA (ELISA voor IFNαA) en de 7-Plex ECL-test.
Panelen a, b, c, d, e, f en g presenteren vergelijkingen van autoantilichaamniveaus voor respectievelijk GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA en IFNαA. De stippellijnen vertegenwoordigen de assay cut-offs voor elke autoantilichaam assay, dezelfde specificiteit set voor zowel RBA als de 7-Plex ECL assay, zoals weergegeven in Tabel 4, vanaf 1022 leeftijd gematchte gezonde controles. Rode gesloten diamanten en vierkanten vertegenwoordigen 'valse' positieven en 'valse' negatieven die voorkomen in de 7-Plex ECL-test, hetzelfde wordt weergegeven in figuur 2. De figuur is van Gu, Y. et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
| Een | 5580 | 5674 | 105 | 117 | 125 | 139 | Linker-1 |
| 100 | 108 | 102 | 102 | 3956 | 3745 | Linker-2 | |
| 115 | 124 | 107 | 116 | 113 | 124 | linker-3 | |
| 67 | 64 | 68 | 61 | 65 | 69 | Linker-4 | |
| 89 | 87 | 98 | 92 | 90 | 80 | linker-5 | |
| 87 | 71 | 89 | 87 | 61 | 72 | Linker-6 | |
| 94 | 82 | 79 | 85 | 2154 | 2280 | Linker-7 | |
| 75 | 66 | 1628 | 1594 | 81 | 83 | Linker-8 | |
| 98 | 103 | 71 | 84 | 69 | 85 | linker-9 | |
| 102 | 118 | 93 | 98 | 113 | 99 | linker-10 | |
| B | 324 | 337 | 147 | 148 | 5426 | 5366 | Linker-1 |
| 101 | 102 | 93 | 88 | 86 | 74 | Linker-2 | |
| 111 | 119 | 119 | 123 | 66 | 72 | linker-3 | |
| 72 | 65 | 59 | 68 | 74 | 67 | Linker-4 | |
| 81 | 98 | 83 | 92 | 79 | 72 | linker-5 | |
| 90 | 84 | 93 | 86 | 70 | 76 | Linker-6 | |
| 101 | 105 | 101 | 97 | 956 | 944 | Linker-7 | |
| 82 | 83 | 189 | 204 | 97 | 90 | Linker-8 | |
| 92 | 83 | 78 | 64 | 82 | 78 | linker-9 | |
| 83 | 79 | 88 | 93 | 4722 | 4965 | linker-10 | |
| C | 110 | 110 | 87 | 81 | 2114 | 2365 | Linker-1 |
| 5526 | 5680 | 88 | 70 | 86 | 93 | Linker-2 | |
| 114 | 132 | 67 | 71 | 3326 | 3284 | linker-3 | |
| 64 | 62 | 88 | 74 | 64 | 80 | Linker-4 | |
| 94 | 82 | 86 | 75 | 89 | 76 | linker-5 | |
| 77 | 87 | 75 | 63 | 70 | 86 | Linker-6 | |
| 77 | 86 | 71 | 84 | 138 | 121 | Linker-7 | |
| 73 | 86 | 80 | 79 | 59 | 73 | Linker-8 | |
| 86 | 74 | 5064 | 4923 | 88 | 86 | linker-9 | |
| 105 | 113 | 85 | 80 | 124 | 114 | linker-10 | |
| D | 98 | 88 | 92 | 84 | 136 | 127 | Linker-1 |
| 288 | 291 | 86 | 86 | 558 | 564 | Linker-2 | |
| 109 | 101 | 74 | 73 | 141 | 127 | linker-3 | |
| 78 | 66 | 66 | 55 | 74 | 66 | Linker-4 | |
| 79 | 83 | 79 | 86 | 96 | 91 | linker-5 | |
| 83 | 86 | 96 | 89 | 86 | 73 | Linker-6 | |
| 87 | 89 | 77 | 87 | 841 | 855 | Linker-7 | |
| 74 | 72 | 60 | 72 | 90 | 95 | Linker-8 | |
| 68 | 75 | 331 | 328 | 2460 | 2580 | linker-9 | |
| 86 | 98 | 80 | 75 | 123 | 133 | linker-10 | |
| E | 101 | 114 | 101 | 106 | 532 | 548 | Linker-1 |
| 101 | 96 | 110 | 104 | 682 | 675 | Linker-2 | |
| 6015 | 5988 | 124 | 126 | 101 | 98 | linker-3 | |
| 66 | 71 | 82 | 71 | 80 | 62 | Linker-4 | |
| 102 | 97 | 99 | 80 | 83 | 110 | linker-5 | |
| 82 | 67 | 81 | 80 | 60 | 85 | Linker-6 | |
| 85 | 95 | 52 | 84 | 245 | 221 | Linker-7 | |
| 72 | 78 | 82 | 74 | 486 | 503 | Linker-8 | |
| 77 | 97 | 97 | 77 | 56 | 66 | linker-9 | |
| 114 | 104 | 5726 | 5814 | 259 | 253 | linker-10 | |
| F | 119 | 120 | 133 | 118 | 112 | 96 | Linker-1 |
| 101 | 91 | 100 | 95 | 96 | 82 | Linker-2 | |
| 406 | 395 | 111 | 123 | 2127 | 101 | linker-3 | |
| 72 | 60 | 86 | 72 | 79 | 83 | Linker-4 | |
| 76 | 85 | 96 | 99 | 89 | 103 | linker-5 | |
| 88 | 78 | 91 | 83 | 89 | 95 | Linker-6 | |
| 104 | 97 | 87 | 102 | 56 | 66 | Linker-7 | |
| 76 | 77 | 79 | 93 | 69 | 75 | Linker-8 | |
| 85 | 71 | 95 | 100 | 83 | 71 | linker-9 | |
| 131 | 131 | 358 | 364 | 92 | 86 | linker-10 | |
| G | 90 | 95 | 85 | 82 | 105 | 107 | Linker-1 |
| 99 | 86 | 77 | 76 | 1250 | 1174 | Linker-2 | |
| 119 | 123 | 120 | 118 | 112 | 108 | linker-3 | |
| 76 | 83 | 77 | 80 | 86 | 76 | Linker-4 | |
| 88 | 86 | 86 | 93 | 107 | 92 | linker-5 | |
| 73 | 73 | 71 | 82 | 84 | 75 | Linker-6 | |
| 5210 | 5173 | 72 | 69 | 76 | 85 | Linker-7 | |
| 80 | 81 | 79 | 82 | 100 | 101 | Linker-8 | |
| 96 | 97 | 89 | 83 | 65 | 83 | linker-9 | |
| 98 | 103 | 86 | 88 | 1933 | 1979 | linker-10 | |
| H | 114 | 124 | 81 | 86 | 299 | 295 | Linker-1 |
| 107 | 92 | 69 | 72 | 4256 | 4388 | Linker-2 | |
| 114 | 123 | 125 | 129 | 501 | 536 | linker-3 | |
| 77 | 70 | 67 | 64 | 74 | 62 | Linker-4 | |
| 92 | 110 | 81 | 84 | 77 | 71 | linker-5 | |
| 87 | 79 | 72 | 76 | 83 | 81 | Linker-6 | |
| 328 | 341 | 84 | 80 | 88 | 97 | Linker-7 | |
| 75 | 84 | 75 | 90 | 74 | 83 | Linker-8 | |
| 73 | 79 | 78 | 76 | 84 | 70 | linker-9 | |
| 113 | 120 | 81 | 76 | 2372 | 2350 | linker-10 | |
Tabel 1: Analyse van 7-plex ECL-assay: ruwe CPS-tellingen (linkerhelft van de plaat). Ruwe CPS-tellingen worden verkregen uit een testplaat (de linkerhelft van de plaat) en elk monster wordt in tweevoud uitgevoerd. Onder elke rij van de plaat (A-H) bevinden zich 10 regels leeswaarden die de gegevens van de 10 plekken in dezelfde put vertegenwoordigen, overeenkomend met elk linkernummer zoals gemarkeerd. Voorbeelden van slechte duplicaten worden grijs gemarkeerd, zoals te zien is in rij F-linker 3-kolommen 5 en 6.
| Rij van tabel 1A | Kolom van tabel 1A | LINKER 1 | LINKER 2 | LINKER 3 | LINKER 7 | LINKER 8 | LINKER 9 | LINKER 10 | |
| Een | 1-2 | GADA PC | 5627 | 104 | 120 | 88 | 71 | 101 | 110 |
| B | 1-2 | GADA Lage PC | 331 | 102 | 115 | 103 | 83 | 88 | 81 |
| C | 1-2 | TPOA PC | 110 | 5603 | 123 | 82 | 80 | 80 | 109 |
| D | 1-2 | TPOA Lage PC | 93 | 290 | 105 | 88 | 73 | 72 | 92 |
| E | 1-2 | TGA PC | 108 | 99 | 6002 | 90 | 75 | 87 | 109 |
| F | 1-2 | TG Lage PC | 120 | 96 | 401 | 101 | 77 | 78 | 131 |
| G | 1-2 | ThGA PC | 93 | 93 | 121 | 5192 | 81 | 97 | 101 |
| H | 1-2 | ThGA Lage PC | 119 | 100 | 119 | 335 | 80 | 76 | 117 |
| Een | 3-4 | IAA-pc | 111 | 102 | 112 | 82 | 1611 | 78 | 96 |
| B | 3-4 | IAA Lage PC | 148 | 91 | 121 | 99 | 197 | 71 | 91 |
| C | 3-4 | IFNaA PC | 84 | 79 | 69 | 78 | 80 | 4994 | 83 |
| D | 3-4 | IFNaA Lage PC | 88 | 86 | 74 | 82 | 66 | 330 | 78 |
| E | 3-4 | IA-2A PC | 104 | 107 | 125 | 68 | 78 | 87 | 5770 |
| F | 3-4 | IA-2A Lage PC | 126 | 98 | 117 | 95 | 86 | 98 | 361 |
| G | 3-4 | NC | 84 | 77 | 119 | 71 | 81 | 86 | 87 |
| H | 3-4 | NC | 84 | 71 | 127 | 82 | 78 | 77 | 79 |
| Een | 5-6 | voorbeeld1 | 132 | 3851 | 119 | 2217 | 82 | 77 | 106 |
| B | 5-6 | voorbeeld2 | 5396 | 80 | 69 | 950 | 94 | 80 | 4844 |
| C | 5-6 | voorbeeld3 | 2240 | 90 | 3305 | 130 | 66 | 87 | 119 |
| D | 5-6 | voorbeeld4 | 132 | 561 | 134 | 848 | 93 | 2520 | 128 |
| E | 5-6 | voorbeeld5 | 540 | 679 | 100 | 233 | 495 | 61 | 256 |
| F | 5-6 | voorbeeld6 | 104 | 89 | 1114 | 61 | 72 | 77 | 89 |
| G | 5-6 | voorbeeld7 | 106 | 1212 | 110 | 81 | 101 | 74 | 1957 |
| H | 5-6 | voorbeeld8 | 297 | 4322 | 519 | 93 | 79 | 77 | 2361 |
Tabel 2: Analyse van 7-plex ECL-assay: rangschikking van de tabel 1-gegevens, gemarkeerd als 7 linkers. De gegevens uit tabel 1 werden herschikt, waarbij linkers 4 tot en met 6 (niet gebruikt) werden verwijderd, en gemiddelde waarden werden berekend uit elke dubbele meting uit tabel 1. De waarden van de interne standaard hoge en lage positieve controles, overeenkomend met elke autoantilichaam assay, beperkt door een bepaalde linker, zijn in het donker vetgedrukt. PC, positieve controle. NC, normale controle.
| GAD-Index | TPOA-index | TGA-Index | ThGA-Index | IAA-Index | IFNaA-index | IA-2A-index | |
| GADA PC | 1.000 | 0.005 | 0.000 | 0.003 | -0.006 | 0.003 | 0.004 |
| GADA Lage PC | 0.045 | 0.005 | -0.001 | 0.006 | 0.002 | 0.000 | -0.001 |
| IAA-pc | 0.005 | 1.000 | 0.001 | 0.002 | -0.001 | -0.001 | 0.004 |
| IAA Lage PC | 0.002 | 0.039 | -0.002 | 0.003 | -0.005 | -0.003 | 0.001 |
| IA-2A PC | 0.004 | 0.004 | 1.000 | 0.004 | -0.004 | 0.000 | 0.004 |
| IA-2A Lage PC | 0.007 | 0.004 | 0.048 | 0.006 | -0.002 | -0.002 | 0.008 |
| TGA PC | 0.002 | 0.003 | 0.000 | 1.000 | 0.000 | 0.002 | 0.002 |
| TG Lage PC | 0.006 | 0.004 | 0.000 | 0.052 | -0.001 | -0.002 | 0.005 |
| TPOA PC | 0.005 | 0.005 | -0.001 | 0.002 | 1.000 | -0.002 | 0.001 |
| TPOA Lage PC | 0.012 | 0.003 | 0.000 | 0.006 | 0.076 | -0.003 | 0.001 |
| ThGA PC | 0.000 | 0.000 | -0.008 | 0.001 | 0.000 | 1.000 | -0.001 |
| ThGA Lage PC | 0.001 | 0.002 | -0.008 | 0.002 | -0.009 | 0.050 | -0.002 |
| IFNaA PC | 0.004 | 0.006 | 0.001 | 0.000 | -0.002 | 0.000 | 1.000 |
| IFNaA Lage PC | 0.008 | 0.004 | 0.000 | 0.005 | 0.004 | 0.002 | 0.048 |
| NC | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| NC | 0.000 | -0.001 | 0.001 | 0.002 | -0.002 | -0.002 | -0.001 |
| voorbeeld1 | 0.009 | 0.683 | 0.000 | 0.419 | 0.001 | -0.002 | 0.003 |
| voorbeeld2 | 0.958 | 0.001 | -0.008 | 0.172 | 0.009 | -0.001 | 0.837 |
| voorbeeld3 | 0.389 | 0.002 | 0.542 | 0.012 | -0.009 | 0.000 | 0.006 |
| voorbeeld4 | 0.009 | 0.088 | 0.003 | 0.152 | 0.008 | 0.496 | 0.007 |
| voorbeeld5 | 0.082 | 0.109 | -0.003 | 0.032 | 0.271 | -0.005 | 0.030 |
| voorbeeld6 | 0.004 | 0.002 | 0.169 | -0.002 | -0.006 | -0.002 | 0.000 |
| voorbeeld7 | 0.004 | 0.205 | -0.002 | 0.002 | 0.013 | -0.002 | 0.329 |
| voorbeeld8 | 0.039 | 0.768 | 0.068 | 0.004 | -0.001 | -0.002 | 0.400 |
Tabel 3: Analyse van 7-plex ECL-assay: resultaten van indexwaarden. Indexwaarden voor elk monster voor alle 7 autoantilichaamtests werden berekend op basis van hun overeenkomstige interne positieve en negatieve controles zoals beschreven in het testprotocol. Elke indexwaarde die groter was dan de afkapwaarde werd gedefinieerd als een positief resultaat, vetgedrukt weergegeven. De TGA-indexwaarde van sample6 werd grijs gemarkeerd omdat het een fout is die wordt veroorzaakt door slechte duplicaten in rij F-linker 3-kolommen 5 en 6 in tabel 1.
| Gada | IA-2A | IAA | .TGA | TPOA | ThGA | IFNαA* | ||||||||
| Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | Sens | Spec | |
| RBA | 73.4% | 98.5% | 75.2% | 99.0% | 47.7% | 99.1% | 12.9% | 99.0% | 23.9% | 95.2% | 19.3% | 94.7% | 1.0% | 99.6% |
| Enkele ECL | 71.6% | 99.1% | 73.6% | 99.3% | 48.3% | 99.7% | 16.0% | 98.9% | 26.3% | 94.9% | 20.6% | 95.1% | 0.8% | 99.2% |
| 7-Plex ECL | 71.2% | 98.9% | 77.3% | 98.9% | 49.5% | 98.9% | 16.5% | 98.7% | 26.1% | 94.7% | 21.1% | 94.7% | 1.7% | 99.1% |
Tabel 4: Testgevoeligheid en specificiteit bij 1026 T1D-patiënten en 1022 controles, gematcht voor zowel leeftijd als geslacht, in een 7-plex ECL-test, vergeleken met de overeenkomstige enkele ECL-test en RBA of ELISA *. Verschillendetesten (RBA, single ECL en 7-Plex ECL) voor elk autoantilichaam werden ingesteld op vergelijkbare specificiteiten met behulp van de 1022 leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles. De specificiteitsuitkomst van het onderzochte controlecohort werd vastgesteld op ongeveer 95% voor TPOA en ThGA en op 99% voor de 5 andere testen. *Asterisk markeert de IFNαA-test voor ELISA, terwijl andere RBA zijn.
Discussion
In tal van nationale en internationale klinische onderzoeken naar diabetes type 1 is de prestatie van de enkele ECL-test om eilandjesautoantilichamen en autoantilichamen voor transglutaminase (TGA) voor coeliakie te detecteren, onderbouwd 8,9,10,11. Gedurende deze paden heeft deze test de gevoeligheid en specificiteit voor autoantigeendetectie verhoogd wanneer deze wordt beoordeeld aan de hand van de bestaande 'gouden' standaard RBA. De verhoogde ziektespecificiteit kan worden bekeken bij het onderscheiden van auto-antilichamen met een hoge affiniteit en een hoog risico op eilandjes van signalen met een laag risico en een lage affiniteit, tussen de enkele ECL-test en de RBA 14,15,16,17. Voortbouwend op de enkele ECL-test, stellen we een nieuwe high throughput multiplexed ECL autoantilichaam assay voor, om ons in staat te stellen tegelijkertijd te screenen op T1D en verschillende toepasselijke auto-immuunziekten.
De multiplex ECL-test maakt gebruik van de multiplexplaat, die tot 10 autoantilichaamtests in één enkele put kan combineren. Voor deze studie worden 7 autoantilichaam assays gecombineerd. De auto-antilichamen bestaan uit 3 IAbs (IAA, GADA en IA-2A), 2 auto-immuun schildklierziekte autoantilichamen (TPOA en ThGA), coeliakie auto-antilichamen (TGA) en APS-1 autoantilichamen voor interferon alfa (IFNαA). Het testmechanisme is over het algemeen gebaseerd op een enkele ECL-test zoals eerder gepubliceerd 9,10,12,18 met enkele wijzigingen. Het belangrijkste verschil van een multiplex ECL-test met een enkele ECL-test is dat elk antilichaam-antigeencomplex dat in de vloeistoffase wordt gevormd, wordt beperkt tot een specifieke linker (figuur 1). Het biotine gelabeld antigeen wordt geïncubeerd met de Streptavidin geconjugeerd, een linker die wordt gebruikt om een specifiek antigeen-linkercomplex te vormen. Antilichaam-antigeen immuuncomplex vormt zich na incubatie met patiëntenserum en wordt op een specifieke plek gevangen via het specifieke linkersysteem op elk putje van de multiplexplaat. Ru Sulfo-NHS gelabeld antigeen gevangen door antilichamen op hetzelfde moment levert het signaal met elektrochemiluminescentie. De plaatlezermachine kan tot 10 verschillende signalen detecteren van de spotbronnen in elke put. Om autoantilichaamtests consistent te houden tussen platen en tijdens het uitvoeren van langetermijnstudies, stellen we voor dat dezelfde linker wordt gebruikt.
Alvorens een multiplex ECL-test op te zetten, moeten enkele ECL-assays voor elk autoantilichaam worden geoptimaliseerd op respectievelijk een multiplexplaat en gevalideerd tegen zowel RBA- als enkele ECL-assays op een gewone ECL-plaat. Om de dambordtest te verbeteren, werden voor de gerelateerde autoantilichaamtest op de multiplexplaat een hoogpositieve patiënt en een negatief patiëntenmonster gebruikt. Nadat de dambordtest was uitgevoerd, werden de meest ideale concentraties voor Ru Sulfo-NHS en biotine gelabeld antigeen berekend voor elk van de 7 autoantilichaamtests. Het volgende toont deze concentraties: 30 ng/ml en 200 ng/ml voor GAD65, 120 ng/ml en 120 ng/ml voor proinsuline, 10 ng/ml en 42 ng/ml voor IA-2, 80 ng/ml en 80 ng/ml voor TG, 8 ng/ml en 16 ng/ml voor TPO, 31 ng/ml en 31 ng/ml voor thg, en respectievelijk 12 ng/ml en 12 ng/ml voor IFNα13. De concentraties van sommige antigenen uit de dambordtest moeten mogelijk verder worden aangepast aan de uitkomsten in de werkelijke multiplextest na het combineren van alle assays samen.
Aangezien IAZ is opgenomen in de huidige multiplex ECL-test, is zuurbehandeling van serummonsters verplicht voordat het serum met antigeen wordt geïncubeerd, zoals gerapporteerd in de vorige studie12. Over het algemeen, wanneer een extra autoantilichaam wordt toegevoegd aan een multiplextest, wordt de achtergrond van de test beïnvloed en kan een extreem hoog signaal van één plek, in de put, de resultaten van nabijgelegen vlekken via overspraak belemmeren. Daarom moet de maximale CPS worden beperkt tot 20.000 tellingen voor elk autoantilichaam, of lager, voor de hoogste positieve monsters. Voor zover wij weten, om de hoeveelheid overspraak te verminderen, moeten auto-antilichamen met een lagere achtergrond bij het ontwerpen van de spotkaart worden gescheiden van vlekken met een hogere frequentie van tellingen.
Hoge positieve en negatieve controles werden intern in elke test gebruikt om een nauwkeurige index te berekenen voor de onbekende monsters die werden getest. Om de gevoeligheid van de test nauwkeurig te beoordelen en te controleren, werden lage positieve controles gebruikt, ingesteld in de buurt van de bovengrens van de test. Deze standaard positieve en negatieve controles zijn gemaakt in bulk en aliquot voor langdurig gebruik en opgeslagen bij -20 °C of lager, voor consistentie tussen de testen. Voor kwaliteitsborgingsdoeleinden werden monsters twee keer uitgevoerd in elke test en elk positief resultaat werd gereran en bevestigd door het monster de volgende dag in een nieuwe ECL-test uit te voeren. Als er enige onenigheid was met de eerste en tweede bevestigende test, was een derde test noodzakelijk. Van de drie uitgevoerde testen bepaalden de resultaten van de twee assays die overeenkomen (bijv. +, + of -,-), het eindresultaat (positief of negatief) van het monster.
In het afgelopen decennium zijn veel studiegroepen op zoek naar een test met hoge doorvoer met behulp van de multiplexmethode om meerdere autoantilichaamtests samen te voegen tot één put om grote populaties te screenen. Er zijn een paar studies die verschillende soorten technologieën gebruiken om multiplex autoantilichaam assays uit te voeren 19,20,21,22, maar er is geen vergelijking voor een van deze assays in gevoeligheid en specificiteit met de huidige 'gouden' standaard RBA, bij het bestuderen van T1D. Deze verschillende soorten platforms die worden gebruikt, worden niet gevalideerd door de internationale Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) -workshop of door het testen van grote cohorten in klinische onderzoeken. In een recente algemene bevolkingsonderzoek in Duitsland wordt een gecombineerde test met hoge doorvoer, 3 Screen ICATM ELISA gedistribueerd door Kronus, gebruikt als een hulpmiddel voor eerstelijnsscreening om drie IAbs, GADA, IA-2A en ZnT8A, te detecteren om een vroege diagnose van T1D23 bij kinderen te bereiken. De ELISA-test met 3 schermen meet 3 auto-antilichamen, hetzij in 3 gescheiden putten, waarbij een groot volume serum wordt geconsumeerd, hetzij in een enkele put met alle 3 de testen gemengd. Als één put in de 3-Screen ELISA-test positief is, is men niet in staat om te onderscheiden welke van de drie auto-antilichamen aanwezig zijn. Het grootste nadeel van deze test is het onvermogen om IAA-metingen op te nemen. Alle IAA-resultaten uitgevoerd door ELISA, zoals bewezen in IASP-workshops, hebben geen acceptabele gevoeligheid en specificiteit24. IAZ is meestal de eerste IAb die verschijnt en heeft een hoge prevalentie bij jonge kinderen. IAb-screening, met IAA, is noodzakelijk voor kinderen en het wordt niet acceptabel geacht om deze screening zonder IAA uit te voeren om het T1D-risico in de gemeenschap te beoordelen. Bovendien zijn er geen gepubliceerde studies of gegevens waaruit blijkt dat de Kronus IAb-kittest meer T1D-ziektespecifiek is en in staat is om IAbs met een hoog risico te onderscheiden van IAbs met een laag risico. De 7-Plex ECL-test, in de huidige studie, werd gevalideerd met behulp van een groot cohort van nieuw gediagnosticeerde patiënten met T1D13. Vergeleken met de huidige standaard RBA en gevestigde single ECL-test, is de 7-Plex-test in staat om 100% positiviteit te behouden met dezelfde assay-specificiteit (tabel 4). Momenteel wordt de 4-Plex ECL-test, parallel aan de standaard RBA, toegepast op een lopende grote klinische studie: Autoimmunity Screening for Kids (ASK) -studie. Deze proef screent kinderen in de algemene bevolking, van het grootstedelijk gebied van Denver, op T1D en coeliakie. Vergeleken met de standaard RBA die in de ASK-studie werd gebruikt, vertoont de multiplex ECL-test een uitstekende gevoeligheid en een hogere ziektespecificiteit, identiek aan onze eerdere rapporten met behulp van de enkele ECL-studie25. Bovendien toonde onze 4-Plex ECL-test een uitgesproken vermindering van arbeid, kosten en serumvolume met 70%, vergeleken met de overeenkomstige 4 enkele assays voor ECL en RBA. Met behulp van de gemultiplexte ECL-test kunnen we elke put aanpassen met verschillende nummers, die verschillende auto-antilichamen vertegenwoordigen (tot 10), om te testen op verschillende auto-immuunziekten die specifiek zijn voor de behoeften van een bepaalde klinische locatie.
Er zijn enkele beperkingen waargenomen, aangetoond in de huidige studie, voor een multiplexed ECL-test met behulp van de multiplexplaat. De uiteindelijke verdunning van serum, geïncubeerd met antigeen, kan niet worden aangepast om de meest optimale omstandigheden te verkrijgen voor elke afzonderlijke autoantilichaamtest die in één put wordt gecombineerd. Negen monsters (9/1026), van T1D-patiënten, bleken een vals negatief resultaat te hebben voor bepaalde auto-antilichamen. 7 van de fout-negatieven waren voor TPOA en 2 waren voor ThGA, in de 7-Plex ECL-test, maar hoge positieve resultaten werden getoond in zowel de enkele ECL-test als de RBA (figuur 2 & 3). Na verdere verdunning van alle 9 monsters werden ze positief op de multiplexplaat. Dit resultaat wordt veroorzaakt door, wat wij omschrijven als het fenomeen 'prozone'. Dit fenomeen zorgt ervoor dat het monster een vals negatief resultaat vertoont omdat de hoge antilichaamtiters de vorming van antigeen-antilichaamroosters beïnvloeden. Bij het opzetten van een multiplextest worden monsters met zeer hoge titers, voor elk van de gecombineerde auto-antilichamen, aanbevolen om pre-tests uit te voeren om de optionele verdunning van serum voor antigeen incubatie te identificeren. Als alternatief moeten autoantilichaamtests met vergelijkbare geoptimaliseerde omstandigheden worden geselecteerd om een gecombineerde test te vormen waaruit de beste testgevoeligheid en specificiteit wordt bereikt voor elk autoantilichaam. In de huidige studie resulteerden 7 monsters (7/1022), van gezonde normale controles, in valse positieven voor meerdere auto-antilichamen in de 7-Plex-test, maar na het uitvoeren van een enkele ECL-test en RBA (figuur 2 & 3) bleken deze auto-antilichamen negatief te zijn in beide assays. De redenen achter deze vals-positieve resultaten op de multiplexplaat, voor deze kleine subset van monsters, zijn momenteel onbekend. Voor de huidige toepassing van de multiplex ECL-test worden alle positieve monsters herhaald met hun overeenkomstige enkele ECL-test om positiviteit te bevestigen, waardoor deze fout-positieve fout uit de multiplex ECL-test wordt verwijderd.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie DK32083, JDRF Grants 2-SRA-2015-51-Q-R en 2-SRA-2018-533-S-B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 °C refrigerator | |||
| –80 °C and -20 °C freezers | |||
| 96-well Plate Shaker | Wallac - Delfi | ||
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Acetic acid solution | Fisher | ||
| Aluminum foil | |||
| Antigen proteins | |||
| Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
| Human ThG full length protein | BioMart | ||
| Human TPO full length protein | BioMart | ||
| IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
| IFN-α protein | Abcam | ||
| Proinsulin protein | AmideBio | ||
| tTG protein | DiaRect | ||
| Biotin | Sigma | ||
| Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| Distilled deionized (DD) water | |||
| HCl | Fisher | ||
| Ice maker | |||
| Ice trays | |||
| MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
| Multi-channel pipette | |||
| NaOH | |||
| Paper tower | |||
| PBS | |||
| pH meter | |||
| Pipette-Aid | |||
| Pipettes/tips | |||
| Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| Uplex Development Kit | MSD | ||
| 96-well UPlex plate | MSD | ||
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Linker-Streptavidin | MSD | ||
| Read buffer | MSD | R92TC | |
| Stop Solution | MSD | ||
| Vortex mixer | |||
| ZeBa Column | Pierce | 89892 |
References
- Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).
- Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W.
- Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Barker, J. M., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., et al. Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).
- Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Journal of Clinical & Cellular Immunology. 8 (6), (2017).
- Gu, Y., et al. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).
- Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
- Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
- Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
- Fouts, A., et al. Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects. Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).
- Sosenko, J. M., et al. The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies. Diabetes Technology & Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).
- Zhao, Z., et al. Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).
- Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes. Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).
- Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP). American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).
- Yim, S. W., et al. Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays. Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).
- Bale, S. S., et al. A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes. Technology. 02 (03), 200-205 (2014).
- Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
- Schlosser, M., et al. Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).
- Zhao, Z., et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).
