Summary
呈现是将人类和动物心室心肌细胞与振动切切心肌切片分离的协议。耐钙细胞（高达200个细胞/毫克）的高产量可以从少量组织（<50毫克）中获得。该协议适用于暴露于冷缺血的心肌，长达36小时。
Abstract
将心室心肌细胞与动物和人类心脏分离是心脏研究的基本方法。动物心肌细胞通常通过冠状动脉灌注与消化酶分离。然而，分离人类心肌细胞是具有挑战性的，因为人类心肌标本通常不允许冠状动脉灌注，而替代的分离方案导致活细胞产量低。此外，人类心肌标本是罕见的，只有定期在机构与现场心脏手术。这妨碍了从动物到人类心肌细胞的发现翻译。这里描述的是一个可靠的协议，能够有效地分离心室菌体与人类和动物的心肌。为了增加表面体积比，同时尽量减少细胞损伤，心肌组织切片300 μm厚由具有振动器的心肌标本生成。然后用蛋白酶和胶原酶消化组织切片。鼠菌通过流动细胞测量细胞计数建立协议并量化可行、耐钙的菌细胞的产量。与常用组织块法的比较显示，棒状心肌细胞的产量显著提高（41.5 ± 11.9 与 7.89 = 3.6%，p < 0.05）。该协议被转化为失败和非失败的人类心肌，其产量与大鼠心肌相似，同样明显高于组织块法（45.0 × 15.0 vs. 6.87 = 5.23细胞/毫克，p < 0.05）。值得注意的是，通过提出的协议，有可能从少量组织（<50毫克）中分离出合理数量的可行人类心肌细胞（9~200个细胞/毫克）。因此，该方法适用于来自人类和动物心脏的健康和失败的心肌。此外，在冷心肺溶液中，从储存长达36小时、长达36小时人体组织标本中分离出兴奋和收缩的菌细胞，使该方法对于无需现场心脏手术的机构实验室特别有用。
Introduction
一项开创性技术，为心肌细胞生理学的重要见解铺平了道路，是将活的心室心肌细胞与完整的心脏1隔离。分离的心肌细胞可用于研究正常的细胞结构和功能，或体内实验的后果;例如，评估心脏疾病动物模型中细胞电生理学或激发-收缩耦合的变化。此外，分离的心肌细胞可用于细胞培养、药理干预、基因转移、组织工程和许多其他应用。因此，有效的心肌细胞分离方法对基础和转化心脏研究具有根本价值。
来自小型哺乳动物（如啮齿动物）和大型哺乳动物（如猪或狗）的心肌细胞通常通过心脏的冠状动脉灌注与含有粗胶原蛋白酶和/或蛋白酶的溶液分离。这被描述为心肌细胞分离的"黄金标准"方法，导致高达70%的活细胞2。这种方法也用于人类心脏，导致,可接受的心肌细胞产生3，4，5。,45然而，由于冠状动脉灌注只有在有完整的心脏或含有冠状动脉分支的大心肌楔子可用的情况下才可行，因此大多数人类心脏标本不适合这种方法，因为它们体积小，缺乏适当的血管。因此，人类心肌细胞的分离是具有挑战性的。
人类心肌标本主要由大小可变的组织块（约0.5 x 0.5 x 0.5厘米至2×2×2厘米）组成，通过内氧心肌活检获得6，隔膜心肌切除术7，VAD植入8，或从外植心脏9。心肌细胞分离最常见的程序从用剪刀或手术刀切碎组织开始。然后，细胞到细胞的接触被浸入无钙或低钙缓冲液中破坏。随后是多个消化步骤与粗酶提取物或纯化酶，如蛋白酶（如蛋白酶），胶原酶，红霉素酶，或弹性酶，导致细胞外基质的解体和心肌细胞的解放。在最后的关键步骤中，生理钙浓度必须仔细恢复，否则细胞损伤可能发生由于钙悖论10，11，12。,11,12这种隔离方法很方便，但通常效率低下。例如，一项研究发现，需要近1克心肌组织才能获得足够数量的心肌细胞，适合随后的实验13。产量低的一个可能原因是比较苛刻的切碎组织的方法。这可能特别损害位于块边缘的心肌细胞，尽管这些肌细胞最有可能通过酶消化释放。
可能影响从人体标本获得的细胞的分离效率和质量的另一个方面是组织缺血的持续时间。大多数协议都提到实验室的运输时间短是取得良好结果的先决条件。这限制了人类心室心肌细胞的研究，而实验室有附近的心脏手术设施。总之，这些限制妨碍了人类心肌细胞动物模型的重要发现验证。因此，改进的分离方案，允许从少量组织中产生高心肌细胞，最好在延长运输时间后不会造成严重伤害。
这里描述的是一个隔离协议，基于酶消化的薄心肌组织切片产生的振动体14，15。14,我们证明，与用剪刀切碎的组织块分离组织切片的效率要高得多。所述方法不仅允许从少量心肌组织中高产量的活人心肌细胞，而且适用于在冷心肺溶液中储存或运输的标本，时间长达36小时。
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Protocol
所有大鼠实验都得到德国巴伐利亚州米特尔弗兰肯动物护理和使用委员会的批准。埃尔兰根-纽伦堡大学和鲁尔-波鸿大学机构审查委员会批准了人体心脏组织样本的收集和使用。根据《赫尔辛基宣言》准则进行了研究。患者在组织采集前给予书面知情同意。
雌性威斯塔大鼠（150–200克）通过注射100毫克/千克的硫化钠进行麻醉，通过宫颈脱位安乐死，然后进行胸腔切除术和心脏切除。在植入机械辅助装置期间，从左心室腹膜核心采集人体心脏组织样本，从隔膜乳房切除术，从法洛特矫正手术的四部曲中，或从切除心脏的自由左心室壁采集。以下协议描述了与人体心室组织的分离。大鼠心肌细胞的分离是相应的，但使用不同的酶（见材料表）。图 1 中显示了协议的原理图工作流。
1. 缓冲液、溶液和酶的制备
- 准备表 1 中列出的 缓冲区和解决方案。
- 将溶液 1、2、3 和经过修改的 Tyrode 溶液加热到 37°C。 将切割溶液存放在4°C，直到使用。
注：对于 1~2 个心肌切片，在一个 35 mm 组织培养皿中分离所需的溶液 1、2 和 3 总共需要约 15 mL、8 mL 和 5 mL 溶液。相应地扩大，在多个菜肴中同时分离菌细胞。切割溶液可以冷冻并保持在-20°C几个月。 - 重1毫克蛋白酶XXIV（ 见材料表）到预冷15mL离心管中，储存在冰上直到使用。这是用于处理一个样本。相应地增加金额。不要混合蛋白酶和胶原酶。
- 重量8毫克胶原酶CLSI（ 见材料表）到预冷15mL离心管和储存在冰上，直到使用。这是用于处理一个样本。相应地增加金额。不要混合蛋白酶和胶原酶。
注意：戴面罩或在烟罩下工作，避免吸入酶粉。
注：酶活性可能因不同地段而异。因此，最佳浓度可能不同，应与每新购买的酶16确定。
2. 心肌组织的储存和运输
- 储存和运输人体心脏样品在冷却，4°C切割溶液（表1）。
- 使用相同的溶液进行进一步的组织处理和振动切片。
注：活检和手术心脏样本应立即转移到4°C的切割溶液中，然后在4°C下储存或运输，最长36小时，然后再应用本协议。
3. 组织加工和切片
注：组织切片协议遵循费舍尔等人15。
- 组织块的修剪
注意：人体心脏组织具有潜在的传染性。始终使用防护服，并遵守您机构的安全规定。小心处理用过的刀片，并丢弃在安全容器中。- 将试样放入充满 20 mL 冷切溶液的 100 mm 组织培养盘中，并放在冷却的 4 °C 板上。
- 用手术刀去除多余的纤维组织和脂肪。在进行跨膜标本的情况下，去除内膜附近的特拉贝库莱和组织层。
注：纤维组织僵硬，显示为白色。脂肪通常是软的，显示为白色到黄色。与史诗层的心肌相比，可以从其松散的组织组成和不对齐的纤维方向中识别出特拉贝库拉和心内组织层 - 为了获得最佳的振动器处理，用较大组织标本的手术刀切割约 8 mm x 8 mm x 8 mm 的矩形组织块。对于较小的活检跳过此步骤，并移动到阿加罗斯嵌入。
- 将心脏组织嵌入低熔点糖中
- 在玻璃烧杯中10 mL的切割溶液中煮沸400毫克低熔点阿加糖。
注意：戴上手套和安全眼镜，避免烧伤。仅使用防热磨损处理热玻璃器皿。 - 用热、溶解的阿加罗斯凝胶填充 10 mL 注射器。密封注射器，让糖在 37 °C 水浴中平衡至少 15 分钟。
- 使用钳子将修剪过的心脏标本或活检放入干净的 35 mm 组织培养盘中，将 epicardium 朝下，用无菌拭子去除多余的液体。
- 通过清空注射器将平衡的糖（步骤 3.2.2）倒在组织上。用钳子固定组织，防止其运动，同时浇注糖。确保组织完全浸入糖中。
- 立即将盘子放在冰上，让阿加罗斯凝固10分钟。
- 在玻璃烧杯中10 mL的切割溶液中煮沸400毫克低熔点阿加糖。
- 切片心肌
- 将新的剃须刀刀片安装到振动器的刀片支架上，并尽可能通过调整刀片的 z 偏转来校准振动器。
注：此协议使用带红外辅助校准装置的振动器，以最小的 z 偏转（测量偏转 <0.1 μm）将刀片对齐在水平位置。 - 使用手术刀切除适合振动器的试样支架的黄玫瑰组织块。为确保稳定性，请确保组织仍充分浸入红糖（加糖边缘 = 8 mm）。
- 用薄薄的一层氰酸酯胶水和温和的压力将藻糖块固定到试样支架上。
- 将带组织的试样支架放入振动池中。用切割溶液填充浴缸，在整个加工过程中用碎冰保持 4~6 °C，并加注振动器的外部冷却罐。
- 生成 300 μm 厚的切片，推进速度为 ±0.1 mm/s，振荡频率为 80 Hz，横向振幅为 1.5 mm，刀片角度为 15°。处理切片时，握住糖，而不是组织本身，以避免组织损伤。如有必要，将切片存放在切割溶液中，温度为 4°C，最长为 2 小时。
注：心肌细胞与史诗平行。因此，重要的是要与史诗平行切割，以避免过多的菌细胞损伤。建议丢弃前 1+3 个切片，因为隔离时应只使用均匀的恒定厚度切片。然而，对于小组织活检，只丢弃第一片。 - 在标准光学显微镜下以 40-100 倍的放大倍率检查心肌细胞对齐。
- 将新的剃须刀刀片安装到振动器的刀片支架上，并尽可能通过调整刀片的 z 偏转来校准振动器。
4. 组织消化
- 将加热板放在实验室摇床上，加热至37°C。 以 65 rpm 转速启动实验室摇床。
- 将蛋白酶（在步骤1.3中）溶解在溶液1的2mL（步骤1.1和1.2）中，并在37°C下孵育，直到使用。不要混合蛋白酶和胶原酶。
- 溶解胶原酶（在步骤1.4中准备）在溶液1的2mL（步骤1.1和1.2）中，并在37°C孵育，直到使用。不要混合蛋白酶和胶原酶。
注意：佩戴防护眼镜和手套，因为溶解的酶会导致皮肤和眼睛受伤。 - 将氯化钙 （CaCl2）添加到含有胶原酶的溶液中（在步骤 4.3 中制备），最终浓度为 5 μM。
- 使用钳子将组织切片从振动池转移到一个干净的 60 mm 组织培养盘中，该培养盘充满 5 mL 的预冷切液（步骤 1.1 和 1.2），并保持在冰上。
- 小心地用刀片或钳子从心肌组织中取出糖。
注：避免心肌切片的过度张力和剪切应力，因为它们会损害心肌细胞。 - 要进行初始洗涤，请将干净的 35 mm 组织培养盘放在加热板上，并用 2 mL 的预预热 （37 °C） 溶液 1 填充。将1~2个心肌切片转移到用钳子准备的菜中。用 1 mL 移液器吸出溶液，并执行 2 倍的洗涤步骤以去除切割溶液的残留物。
注：不要吸气心脏切片。溶液和切片应保持在搅拌热板上 35°C 的恒定温度。如有必要，调整热板温度。 - 从培养皿中去除溶液1，加入2 mL的蛋白酶溶液（步骤4.2）。在 65 rpm 的加热板上孵育 12 分钟。
- 用 2 mL 预预热溶液 1 （37 °C） 洗涤 2x。
- 从菜中去除溶液1，加入2 mL的胶原酶溶液（步骤4.3和4.4）。在 65 rpm 转速下在热板上孵育至少 30 分钟。
- 将盘子放在光学显微镜下，在30、35、40分钟等位置检查有无免费的个体菌质。快速工作，避免解决方案出现严重冷却。
注：所需的消化时间可能因组织组成和纤维化程度而异。一旦组织变得明显柔软，轻轻拉扯时容易分离，就达到了最佳的消化时间。如果有足够的组织可用，几个切片可以同时消化不同的消化时间。 - 当组织被消化，单个菌细胞可见（步骤4.11），用2 mL的预战溶液2（37°C）洗涤2x，并再次用2 mL填充。
5. 组织分离
- 小心地将纤维拉开，将消化的组织切片与钳子分离。
- 使用一次使用巴氏移液器（开口直径 >2 mm）小心多次移液器。
注：使用钳子和移液可以诱发机械应力，并导致心肌细胞损伤。然而，这是细胞分离的关键步骤。使用精细钳子尽量减少细胞损伤，并小心地将切片分离成更小的切片。 - 在光显微镜下检查释放杆状心肌细胞。
6. 生理钙浓度的再引入
- 在加热板上以35°C搅拌时，缓慢地将钙浓度从5μM提高至1.5 mM。使用 10 mM 和 100 mM CaCl2 库存 解决方案。推荐步骤：20、40、80、100、150、200、400、800、1200、1500 μM。让细胞在每步之间5分钟的孵化间隔内适应钙水平的增加。
- 用钳子小心地去除未消化的组织块，或通过尼龙网过滤细胞悬浮液，在钙增加结束时，孔径为 180 μm。
7. 去除机械脱钩剂
- 停止搅拌，用 1，000 μL 移液器慢慢从顶部取出三分之一溶液 （±700 μL）。避免心肌细胞的吸入。
注：如果去除未消化的组织，心肌细胞将积聚在培养皿的中心，从而促进无细胞溶液的吸附。如果没有，将细胞溶液转移到15 mL离心管中，让细胞在35°C下沉淀10分钟，然后吸走700μL的上流液并丢弃，重新悬浮细胞，将其转移回35毫米组织培养皿，然后继续执行步骤7.2。 - 将700μL溶液3加入细胞，在热板上恢复搅拌并孵育10分钟。
- 重复步骤 7.1 和 7.2。
- 将溶液转移到 15 mL 离心管中，让心肌细胞在室温下至少沉淀 10 分钟，在 50 x g 下旋转最多 30 分钟，或在 50 x g 下旋转 1 分钟。完全删除上流水，并在修改后的 Tyrode 解决方案或所需的实验缓冲区中重新暂停。
注意：心肌细胞可以在经过改良的Tyrode溶液中储存几个小时（表1），在37°C和5%CO2 使用前。 - 使用标准光学显微镜以 40 倍和 200 倍的放大倍率验证电池质量。
注：大约30~50%的心细胞应该是棒状的，光滑无膜的出血，并显示清晰的交叉条纹。只有5~10%的活细胞应该表现出自发收缩。
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Representative Results
为了验证分离效率，该协议与大鼠心肌并一起使用，结果可行的菌细胞数量与通过冠状动脉灌注和从小组织块分离获得的数量进行比较（块分离， 图2).块分离和分离组织切片从相同的心脏执行。然而，对于通过冠状动脉灌注的隔离，使用了整个心脏。冠状灌注主要产生棒状和交叉条纹心肌细胞。与心肌切片分离，观察到的棒状细胞比例较低，但总数仍然很高。相比之下，从组织块分离后，只回收了很少的棒状细胞（图2A).流细胞学用于定量比较结果。由于心肌细胞的尺寸和交叉条纹相对较大，因此通常显示前向和侧散射值都很大。这些特性用于计算带流量细胞测量细胞分析仪的棒状肌细胞，应用一个简单的浇注方案，从超合同和圆形心肌细胞中区分棒状。(补充图 1).代表性点图在 图2B.统计分析表明，心肌细胞门CM1中从切片分离的计数明显高于组织块（41.5 = 11.9与7.89 = 3.6%;n = 3分离;p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (图2C).因此，从组织切片分离心肌细胞没有达到冠状动脉灌注获得的产量，但导致棒状肌细胞的数量比从组织块分离的数量要大得多，为随后的实验提供足够的细胞。除细胞计数外，还量化了大鼠心肌细胞的结构参数。在通过灌注或组织切片分离的细胞中，细胞长度、细胞宽度和沙康勒长度没有不同（长度 = 110.0 = 5.4 μm vs. 99.4 = 3.2 μm，p = 0.05;宽度 = 33.9 = 1.9 μm 与 30.6 = 1.2 μm， p = 0.05， 分别用于 n = 19 和 n = 21 个细胞; 沙康长度 = 1.62 = 0.04 μm 相对 1.68 = 0.04 μm， p = 0.28， n = 24 和 n = 23 个细胞（补充图 2A+C).使用受电场刺激的 Fluo-4 加载的菌体17 还评估了功能参数（补充图 2D–F).平均激活时间 （27.5 = 1.5 vs. 23.6 = 2.5 ms， n = 100 vs. n = 31 细胞; 灌注与切片， p = 0.05） （补充图 2D）和相对缩短（12.2 = 1.1 vs. 11.3 = 2.5%，n = 42 vs. n = 7 细胞，灌注与切片，p = 0.05） （补充图 2F） 对刺激有反应的心肌细胞在两组之间没有显著差异。钙瞬态振幅（最大正常化钙2°， F/F0) (补充图 2E） 与通过灌注分离的心肌细胞相比，从切片中分离出的心肌细胞略有增加（4.9 = 0.2 vs. 5.7 = 0.3，n = 104 vs. n = 25 细胞，灌注与切片，p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (补充图 2G).为了在培养后评估细胞质量，确定了细胞培养48小时后因电场刺激而收缩的菌细胞比例17.两组反应细胞的分量减少了大约一半（41.9 = 3.6% 与 31.5 = 2.3%， 灌注与切片，p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (补充图 2H).
接下来，该协议被应用于人类心肌。从组织切片获得的杆状和可行的分离人类心室心肌细胞的数量与从同一心肌标本的组织块获得的数量成对比较（图3）。我们发现，从心肌切片分离产生很大比例的棒状和只有一小部分圆形心肌细胞（图3A）。我们计算了来自宽场图像的杆状菌，并按用于隔离的组织湿重来使它们的数量正常化。定量显示，与心肌切片分离导致的棒状真菌细胞数量明显高于从组织块分离（45.0 × 15.0 vs. 6.87 = 5.23细胞/毫克，n = 7 隔离，p < 0.05，配对双尾 t 测试） （图 3B）。此外，用MTT可行性测定14评估了生存能力，使光度法曼的吸收标准化为细胞中酸盐的蛋白质总量。光度定量确认，从心肌切片分离后，心肌细胞的生存能力要高得多（4.76 ± 0.47 vs. 1.09 = 0.18 AU，n = 3 隔离，p < 0.05，配对双尾 t 测试） （图 3C）。
该方法共应用于30颗人心中的心肌标本，运输时间长达36小时。从30个样本中，有23个获得用于后续实验（另见补充表1）。补充图 3 中显示了一个不成功的实验示例（即每盘 <100个细胞）。在这里，大多数细胞不能容忍高细胞外钙和超合同。我们评估了14个分离物中菌细胞的收缩性，在两种情况下，细胞对电刺激没有反应。请注意，该技术不仅仅适用于从成人心脏获得的大型标本，还与从儿童心脏获得的小活检（只有40毫克）（补充图4）。
为了证明与所述方案分离的人体细胞可以进行结构分析，根据最近用大鼠菌体17中描述的 染色方法，它们染色于α-actin、EC耦合蛋白L型钙通道（LTCC）和Ryanodine受体（RyR），以及细胞膜和核。Alpha-actinin 染色在休息的心肌细胞中揭示了一个密集的、规律的 z 线模式和平均沙康长度 1.92 ± 0.06 μm （n = 4， 图 4A）.LTCC 和 RyR 显示了清晰的聚类，并如预期的那样在细胞膜和 t-tubule 附近结块（图 4B）。
电位染料氟伏特18和钙敏感染料氟-4 17用于证明与所述方案分离的人类心肌细胞是兴奋的，可用于细胞电生理学或激发-收缩耦合的研究（图5）。对动作电位（AP）形状和持续时间进行了分析（图5A，B）。B50% 和 90% AP 持续时间的值（APD50：400.6 = 41.1 ms， APD90： 748.9 = 56.6 ms， n = 10 个细胞）在其他人报告的区间内，即来自失败人类心脏的心室心肌细胞4，6，7，9 。Fluo4加载细胞的共声线扫描记录的钙瞬变（图5C，D）显示刺激后明显的D上升冲程和可接受的信噪比。钙瞬态振幅（最大 F/F0）为 2.9 × 0.5 （n = 31 个细胞）。在示例中，从下细胞边界的偏转中可以看到通过收缩缩短的心肌细胞，其均值为 4.6 ± 0.8%（n = 31 个细胞）。
图1：人体心脏组织切片分离协议的工作流程。来自人类肌膜的组织块或活检（左上）嵌入在低熔点气糖中，300 μm 厚的切片由振动器的振荡叶片生成（顶部中间）。切片被转移到培养皿中，然后从周围的阿加罗斯（右上）中去除。组织消化在 +35 °C 和 65 rpm 的加热和搅拌板（中，左）上进行，包括：（步骤 4.8） 在名义上无钙溶液中孵育，辅以蛋白酶，（步骤 4.10） 用胶原酶消化细胞外基质，（步骤 5） 分离和释放单个心肌细胞与钳子和移液。（步骤 6）细胞外钙浓度从5 μM缓慢上升至1.5 mM，间隔为5分钟（步骤7）逐步去除机械不组酮2，3-丁酮单体（BDM）。杆形和交叉条纹的人类心肌细胞被检索。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：心肌细胞产生心肌切片、灌注和块状隔离。（A） 通过冠状动脉灌注（灌注）、振动切组织（心肌切片）或从切碎的组织（组织块）分离的老鼠心肌细胞的代表性光显微图。（B） 分别从心肌细胞分离图中绘制出具有代表性的流细胞学点 图， 描述在 A 中。侧散射面积（SSC-面积）和向前散射面积（FSC-面积）分别用作细胞粒度和大小的指标。心肌细胞的门CM1的浇注方案由黑线指示，各分数占总计数百分比。（C） 均值 = 通过流量细胞计量分析评估的心肌细胞 （CM1） 分数的标准误差，如 B 中所述，每组 n = 3 个细胞隔离。从心肌切片和组织块的分离是在同一心脏（配对双尾 t 测试）进行的。通过灌注进行隔离，从不同动物的整个心脏进行，并比较了未配对的双尾t测试。*p < 0.05，经过多次比较校正。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：从心肌切片和切碎的组织块分离后，人类心肌细胞的产量和生存能力的比较。（A） 与组织切片分离后，耐钙人体心室心肌细胞的代表性图像。棒形和条纹心肌细胞占主导地位（黑色箭头），只有几个圆形和超合同细胞（白色箭头）。（B） 平行分离的耐钙杆状菌细胞的定量，无论是从心肌切片还是从宽场显微图中计数的组织块中，到输入物质的湿重（以毫克为单位），从n = 7成对分离。（C） MTT测定后，通过对蛋白山染料吸收度进行光度测量，对心肌细胞的生存能力进行定量测量。吸收被规范化为总蛋白质量，由BBCA测定从n= 3成对分离评估。*p < 0.05， **p < 0.01 （配对双尾 t 检验）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：分离后人类心肌细胞的微观结构表征。（A） 具有 4°、6-二-苯胺多（DAPI、蓝色）的α-黑色素（绿色）和核污渍免疫后共体显微图像。沙康长度为1.92±0.06μm（n = 4个菌细胞），通过分析四分之一光谱确定。（B） 代表人类心室心肌细胞共免疫的共和显微图像，用于L型钙通道（LTCC）和心脏瑞安碘受体（RyR）。还显示了RyR和LTCC（叠加）的覆盖，以及细胞外基质与小麦胚芽凝血素（WGA，品红色）的染色。核沾了DAPI（蓝色）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：人体心室菌体中作用潜力和细胞内钙瞬变。（A） 含有电位染料氟伏（绿色，488 nm激发波长）的分离人类心肌细胞的二维共合图像。红色框表示在电场刺激期间以 0.5 Hz 快速线扫描测量的 t 管管系统元素。 （B） 平均和基线均化荧光 （F/F0），该电管系统由共合成像获得的五个连续作用电位，如A 中所述。（C） 沿纵向细胞轴加载钙敏感染料 Fluo-4 AM（488 nm 激发波长）的分离人类心肌细胞的线扫描图像。荧光强度以灰色值 [AU] 显示，蓝点表示每个像素沿扫描线的最大荧光强度 （dF/dt 最大值）max的上升。采样速率为 529 Hz. （D） 钙瞬态，通过沿扫描线从 C 中的图像和在刺激前的基线值（F/F0）平均每个像素的荧光获得。所有实验都是在室温下进行的。请单击此处查看此图的较大版本。
| 名字 | mmol/L 中的成分 | 补充 | Ph | 所需体积（以 mL 表示） |
| 解决方案 1 | 20 KCl， 10 KH2PO4， 10 MgCl2， 10 葡萄糖 ， 70 谷氨酸 ， 20 陶林 ， 10 β-羟基丁酸酸盐， 30 BDM | 2毫克/毫升牛血清白蛋白 | 7.3 与 KOH | 300 |
| 解决方案 2 | 20 KCl， 10 KH2PO4， 10 MgCl2， 10 葡萄糖 ， 70 谷氨酸 ， 20 陶林 ， 10 β-羟基丁酸酸盐， 0.005 CaCl2， 30 BDM | 10毫克/毫升牛血清白蛋白 | 7.3 与 KOH | 300 |
| 解决方案 3 | 20 KCl， 10 KH2PO4， 10 MgCl2， 10 葡萄糖 ， 70 谷氨酸 ， 20 陶林 ， 10 β-羟基丁酸酸盐， 1.5 CaCl2 | 10毫克/毫升牛血清白蛋白 | 7.3 与 KOH | 300 |
| 修改了泰洛德的解决方案 | 130 NaCl， 0.4 NaH2PO4， 5.8 NaHCO3， 5.4 KCl ， 0.5 MgCl2， 1.5 CaCl2， 25 HEPES ， 22 葡萄糖 | 2毫克/毫升牛血清白蛋白 | 7.3 与 NaOH 在 5 % CO2 | 100 |
| 切割解决方案 | 138 NaCl， 0.33 NaH2PO4， 5.4 KCl ， 2 MgCl2， 0.5 CaCl2， 10 HEPES ， 10 葡萄糖， 30 BDM | 7.3 与 Naoh | 500 |
表1：缓冲区和解决方案。 所需缓冲区和解决方案的组成。
补充图1：心肌细胞（CM1）浇注方案的验证。 来自流式细胞学的点图，测量向前和侧散射区域（FSC-A，SSC-A），指示从灌注分离的大鼠心肌细胞中检测到的细胞的大小和粒度，以及从相同制剂孵育心细胞，在37°C下在37°C的改良Tyrode溶液中含有100 mM钙（钙过量）。高细胞外钙会导致棒状心肌细胞的超结膜和四舍五入，导致细胞减少（87.6% 对 6.00%）在定义的门 （CM1） 中。 请点击这里下载此图。
补充图2：通过灌注或切片分离的肌细胞特性。 细胞长度 （A） 和细胞宽度 （B） 由通过灌注分离后直接固定的大鼠心肌细胞或通过显微镜（n = 19 和 n = 21 细胞）从心肌细胞中确定。在用α-actin和 Fourier 分析（n = 24 和 n = 23 细胞）进行免疫后，从微观图像中确定沙康长度 （ C ） 。平均激活时间 （D）， 最大 F/F0 （E） 和相对缩短 （F） 评估从 Fluo-4 加载心肌细胞通过灌注或从心肌切片分离和响应电刺激 （n = 100/31 肌细胞在 D， n = 104/25 肌细胞在 E 和 n = 42/7 细胞在 F）.在电刺激下收缩的棒状心肌细胞（G）的分数，通过计算在标准光显微镜中以200倍放大率计算10个视场的杆状细胞和收缩细胞的总数进行评估，用于灌注和切片分离（n = 452/276细胞）。（H） 分析在G中执行，但在48小时培养后（n = 371/329细胞， 分别）。 请点击这里下载此图。
补充图3：人类心肌细胞分离，产量低。 具有代表性的激光显微镜图像，从分离与主要超合同（蓝色）或圆形细胞（黑色）和只有很少的棒形和条纹细胞（白色） 隔离。 请点击这里下载此图。
补充图4：心肌细胞与婴儿心脏活检分离。 （A） 在婴儿法罗特四部曲的矫正手术中获得的内皮活检（湿重约40毫克）图像。（B） 心肌切片来自 A 中显示的 组织，嵌入在红糖中。（C） 从心肌切片分离出的心肌细胞，如 B所示。 请点击这里下载此图。
补充表1：人类患者数据。 提供了本研究中包括的人类患者的样本数列表。样本按手术类型、年龄、疾病病因和运输时间进行分类，样本总数和成功的菌细胞分离数量。 请点击这里下载此表。
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Discussion
虽然活体心肌细胞的分离是在40多年前建立的，并且仍然是许多心脏研究实验方法的先决条件，但它仍然是一个难以预测的结果的技术。心肌细胞通过输注冠状动脉与酶溶液进行分离，通常用于小动物的心脏，并产生大量可行的细胞。然而，这需要一个相对复杂的系统和专门知识。此外，由于人体组织样本体积小或没有冠状动脉分支，因此不适合使用这种方法，这使得人类心肌细胞分离的新方法变得不可取。此处描述的协议基于细心组织切片的创伤生成，然后进行酶消化。它可以应用于动物心脏和人类心肌的心肌标本，如左心室辅助装置植入的脂肪核，隔膜肌切除术的内皮心肌活检，或外植心脏（见补充表1），并可靠地产生足够数量的可行，耐钙的心肌细胞，可用于后续实验，如心肌细胞培养17。
与切碎的组织块不同，振动切组织切片中菌细胞产量高于切碎组织块的一个主要原因是切片期间菌细胞损伤程度较低。当无法进行冠状动脉灌注时，需要切片或切碎组织标本，以增加消化酶的接触面。切片尺寸约为 8 mm x 8 mm x 0.3 mm，由于表面体积比相对较大（±7 mm-1），因此可以良好接触酶。使用剪刀，通过将试样切成大约 1 mm x1mm x 1 mm 的小片，可以实现类似的表面体积比 （±6 mm -1）。虽然在酶消化之前切片和切碎的块中的菌细胞损伤没有量化，但在振动器上切片可能会显著减少损伤，因为它能够温和地切割纤维方向。事实上，据估计，在振动切切片中，只有不到5%的菌细胞在19日受损。结果表明，人类心肌细胞可以非常有效地与所提供的协议分离，与组织块相比，可存活细胞的比例要高得多。这是按照一个协议，使用片从心房组织20。我们的方法每毫克组织产生多达200个耐钙心室菌，并提供在隔离前储存或运输心脏组织36小时的可能性。这使得协议适用于无需现场心脏手术的实验室，从而扩展了协作的可能性。
协议中的关键步骤是正确处理在振动器上切片的心肌及其消化，以及钙重新引入和洗净 BDM 的最后步骤。与其他方法19，21,21相比，心脏组织嵌入在低熔化温度的红玫瑰中，以避免在切片过程14，15期间运动。这是必要的稳定组织块和产生均匀的切片。嵌入组织时，糖量仍应为液体，但温度不应超过37~38°C，以避免因体温过高而造成细胞损伤。相反，如果糖太冷（<35°C），它不很好地结合组织块，并可能在切片过程中破裂。为了测试振动组处理后菌细胞的生存能力，建议进行,简单的MTT测定，通过光显微镜快速评估细胞的生存能力，并通过光度分析进行定量测量。心肌细胞损伤也可能发生在细胞外钙的重新引入后，在无钙溶液23，24的孵育期。这种钙悖论现象在孤立的细胞可以通过缓慢，逐步增加钙水平，使心肌细胞适应。在 35°C 的连续搅拌过程中，应小心执行此步骤，间隔为 5 分钟。轻度体温过低（21°C）在重新引入期间增加了大鼠心肌细胞的钙耐受性，这是根据先前的报告25。然而，人类心肌细胞在35°C或21°C时钙耐受性没有显著差异。 在钙的切割、消化和重新引入过程中使用BDM可防止菌细胞收缩和细胞能量消耗以及过度协调，因此具有保护作用。然而，对于后续评估心脏收缩性或激发-收缩耦合的实验，BDM需要去除26。采用渐进式洗涤，以尽量减少自发的超对动。BDM可以省略，但这将显著增加超合同的菌细胞的数量，如前面的实验和研究6中观察到的。
所述协议使用含有高钾和仅含有钠痕迹的溶液进行消化。该解决方案提供最高产量的杆形，交叉条纹心肌细胞。然而，对于酶消化，它要求更高的浓度胶原酶（4毫克/mL）相比，消化在正常的Tyrode的解决方案（1.5毫克/mL）。高细胞外钠可能导致细胞内钠超负荷，加剧钙悖论的负面影响，从而降低细胞产量27。因此，建议使用高钾和低钠溶液。心肌细胞,分离方案3、28中经常使用高细胞外镁浓度，并已被证明可减少缺血-再灌注损伤29，30，,30并在长期冷缺血2831后改善心脏功能。因此，此处应用的解决方案还含有高浓度的镁 （10 mM）。然而，表明高镁浓度32可降低兴奋性、收缩力和传导速度。虽然这些影响被证明是可逆的，但不能排除对孤立的心肌细胞的影响。因此，在生理浓度（1~2 mM）下使用镁，可能导致整体细胞产量降低，但可提高兴奋性。
最佳消化时间是变化的，因为细胞外基质或纤维化的数量在人类失败的肌钛中可能有很大差异。如果组织在分离时仍然牢固地连接，只释放很少可行的菌细胞，增加5分钟的消化时间，并定期检查自由的菌细胞和切片的质地建议。如果组织在长时间后仍未消化（>45分钟），建议在1mg/mL的步骤中增加胶原酶的浓度，或测试不同的酶批次16。这项工作中呈现的各自值可以作为心肌细胞强健分离的底例，但考虑到酶活性和组织结构的变异性，每个实验室可以完善最佳产量和生存能力的条件。该方法的优点是，由于所需的组织数量少，而且小批量工作流程简单，可以并行进行多项测试。因此，可以快速实现最佳协议。
高品质的心肌切片的生成需要高精度的振动器。需要高精度组织切片机或振动器是该方法的一个可能缺点，因为它不容易在每个实验室都提供。用于这项研究的设备被更详细地描述在其他地方14，15。,15不同的设备已经成功地用于产生心肌切片的其他,组33，34，35。,3435因此，如果能够满足前进速度、叶片振幅和振荡频率的设置，并且有 z-偏转低于 0.1 μm 的水平刀片方向，则与其他振动器一起进行成功的切片和隔离是可行的。此外，组织切片是精心制作的，显著延长了协议的持续时间（约1~2小时）。使用BDM作为机械脱钩剂有保护作用，通过减少细胞能量暴露，缺血损伤，和超对联26，36，37。26,36,37虽然BDM的负益智作用被证明在洗出38，39,39后迅速可逆，但不清楚BDM是否可能对心肌细胞功能40有未知的后果。研究表明，在组织储存时间长达36小时后，可以以高产量分离细胞，并且用这种方法17分离后，人类心肌细胞可以培养长达三天。我们没有注意到具有短存储时间和长存储时间的菌细胞之间的功能或结构差异。然而，没有系统地评估这一点。另一方面，对于整个兔子心脏，它表明，新鲜心脏和心脏暴露在含有30 mM BDM的细胞外溶液中冷缺血的心脏之间的功能差异可以忽略不计，在这种情况下，情况可能也是如此。
提出的方案为各种分离心室心肌细胞的实验提供了坚实的基础，对于人类心肌标本的研究尤其有价值。对于一些适应，分离其他心脏细胞，如成纤维细胞或内皮细胞似乎也是可能的41。因为它只需要少量的组织，可以从其他实验室的冷库溶液中运出，因此，该协议的应用可能会减少牺牲的实验室动物的数量。事实上，该协议已经成功地应用于兔子和猪的心脏组织。此外，随着长期培养心肌组织,切片的实验增加21、33、42，并不断改进，以提供最佳的培养条件21,334215,15、43、44，该方法在切片培养后可方便应用。43,44因此，单细胞分离从培养的肌核素可能有助于表征体外药理学或物理干预后心肌细胞的变化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢来自慕尼黑LMU实验医学中心沃尔特-布伦德尔中心的安德烈亚斯·登多弗在切片协议方面的帮助。为了提供人类心肌组织样本，我们要感谢来自埃尔兰根大学医院心脏外科部的加扎利·米纳巴里和克里斯蒂安·海姆、埃兰根大学医院埃里希和汉娜·克莱斯曼研究所的亨德里克·米尔廷、鲁尔-波鸿大学和埃尔兰根大学医院儿科心脏病学系的穆汉纳·阿尔卡萨尔。为了支持流式细胞学，我们要感谢西蒙·维尔克尔和来自翻译研究中心（TRC），埃尔兰根大学医院的同事。我们还要感谢来自埃尔兰根细胞和分子生理学研究所的洛伦茨·麦卡戈和席琳·格雷宁格提供出色的技术支持。
这项工作得到了德国心血管研究中心、埃尔兰根-纽伦堡大学医院临床跨学科中心（IZKF）和埃尔兰根-纽伦堡大学的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
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