Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av mänskliga Ventrikulära kardiomyocyter från Vibratome-Cut Myokardial Skivor

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Presenteras är ett protokoll för isolering av mänskliga och animaliska Ventrikulärt kardiomyocyter från vibratome-cut hjärtinfarkt skivor. Höga utbyten av kalciumtoleranta celler (upp till 200 celler/mg) kan erhållas från små mängder vävnad (<50 mg). Protokollet är tillämpligt på myokardium som utsätts för kallischemi i upp till 36 h.

Abstract

Isoleringen av ventrikulära hjärt myocyter från djur och mänskliga hjärtan är en grundläggande metod i hjärtforskning. Animal kardiomyocyter är vanligen isolerade av koronar perfusion med matsmältningsenzymer. Att isolera mänskliga kardiomyocyter är dock utmanande eftersom mänskliga hjärtinfarkt exemplar vanligtvis inte tillåter för koronar perfusion, och alternativa isolering protokoll resultera i dålig avkastning av livskraftiga celler. Dessutom är mänskliga hjärtinfarkt exemplar sällsynta och endast regelbundet tillgängliga på institutioner med på plats hjärtkirurgi. Detta hämmar översättningen av resultaten från djur till mänskliga kardiomyocyter. Beskrivs här är ett tillförlitligt protokoll som möjliggör effektiv isolering av ventrikulära myocyter från människors och djurs myokardium. För att öka förhållandet mellan ytan och volym och samtidigt minimera cellskador genereras myokardvävnadsskivor 300 μm tjocka från myokardexemem med en vibratom. Vävnadsskivor rötas sedan med proteas och kollagenas. Råttan hjärtmuskel användes för att fastställa protokollet och kvantifiera avkastningen av livskraftiga, kalcium-toleranta myocyter genom flöde-cytometric cell räkna. Jämförelse med den vanligen använda vävnad-chunk metoden visade betydligt högre avkastning av stavformade kardiomyocyter (41,5 ± 11,9 vs 7,89 ± 3,6%, p < 0,05). Protokollet översattes till sviktande och icke-sviktande humant hjärtmuskelium, där avkastningen var liknande som i råtta myokardium och, återigen, markant högre än med vävnad-chunk metoden (45,0 ± 15,0 vs 6,87 ± 5,23 celler/mg, p < 0,05). Noterbart, med det presenterade protokollet är det möjligt att isolera rimligt antal livskraftiga mänskliga kardiomyocyter (9–200 celler/mg) från minimala mängder vävnad (<50 mg). Således är metoden tillämplig på friska och sviktande myokardium från både mänskliga och djuriska hjärtan. Vidare är det möjligt att isolera retbara och kontraktila myocyter från mänskliga vävnadsprover som lagras i upp till 36 h i kall kardioplegisk lösning, vilket gör metoden särskilt användbar för laboratorier vid institutioner utan hjärtkirurgi på plats.

Introduction

En banbrytande teknik som har banat väg för viktiga insikter i kardiomyocyte fysiologi är isoleringen av levande ventrikulära kardiomyocyter från intakta hjärtan1. Isolerade kardiomyocyter kan användas för att studera normal cellulär struktur och funktion, eller konsekvenserna av in vivo experiment; till exempel att bedöma förändringar i cellulär elektrofysiologi eller excitation-kontraktionskoppling i djurmodeller av hjärtsjukdom. Dessutom, isolerade kardiomyocyter kan användas för cellodling, farmakologiska insatser, genöverföring, vävnadsteknik, och många andra tillämpningar. Därför är effektiva metoder för kardiomyocyteisolering av grundläggande värde för grundläggande och translationell hjärtforskning.

Kardiomyocyter från små däggdjur, såsom gnagare, och från större däggdjur, såsom svin eller hundar, är ofta isolerade genom koronarperfusion av hjärtat med lösningar som innehåller råkollagen och/eller proteaser. Detta har beskrivits som "guldmyntfoten" metod för kardiomyocyte isolering, vilket resulterar i avkastning på upp till 70% av livskraftiga celler2. Tillvägagångssättet har också använts med mänskliga hjärtan, vilket resulterar i acceptabla kardiomyocyteavkastning 3,4,5. Men eftersom koronar perfusion är endast genomförbart om intakt hjärta eller en stor hjärtinfarkt kil som innehåller en födans gatan gren är tillgängliga, de flesta mänskliga hjärt exemplar är inte lämpade för detta tillvägagångssätt på grund av deras ringa storlek och en brist på lämpliga vasculature. Därför är isoleringen av mänskliga kardiomyocyter utmanande.

Mänskliga myokardprover består mestadels av vävnadsbitar av variabel storlek (ungefär 0,5 x 0,5 x 0,5 cm till 2 x 2 x 2 cm), som erhålls genom endomyocardial biopsier6, septal myectomies7, VAD implantationer8, eller från explanterade hjärtan9. De vanligaste procedurerna för kardiomyocyteisolering börjar med att hacka vävnaden med hjälp av sax eller en skalpell. Cell-till-cell kontakter störs sedan genom nedsänkning i kalcium-fri eller låg kalcium buffertar. Detta följs av flera matsmältningssteg med rå enzym extrakt eller renat enzymer som proteaser (t.ex., trypsin), kollagenas, hyaluronidas, eller elastase, vilket resulterar i en sönderfall av extracellulära matris och befrielse av kardiomyocyter. I ett sista, kritiskt steg, en fysiologisk kalciumkoncentration måste noggrant återställas, eller cellulära skador kan uppstå på grund av kalcium-paradox10,11,12. Denna isolering strategi är bekvämt men oftast ineffektivt. Till exempel fann en studie att nästan 1 g myokardvävnad krävdes för att få ett tillräckligt antal kardiomyocyter som lämpar sig för efterföljande experiment13. En möjlig orsak till låga avkastningar är den relativt hårda metoden att malet vävnaden. Detta kan särskilt skada kardiomyocyter ligger vid bit kanter även om dessa myocyter är mest sannolikt att släppas av enzymatisk matsmältning.

En annan aspekt som kan påverka isolering effektivitet och kvalitet av celler som erhållits från mänskliga exemplar är varaktigheten av vävnad ischemi. De flesta protokoll nämner korta transporttider till laboratoriet som en förutsättning för goda resultat. Detta begränsar studiet av mänskliga ventrikulära kardiomyocyter till laboratorier med närliggande hjärtkirurgi anläggningar. Tillsammans hämmar dessa restriktioner verifieringen av viktiga fynd från djurmodeller i humana kardiomyocyter. Förbättrad isolering protokoll som möjliggör hög kardiomyocyte avkastning från små mängder vävnad, helst utan allvarliga skador efter utökade transporttider, är därför önskvärt.

Beskrivs här är en isolering protokoll som bygger på den enzymatiska matsmältningen av tunna myokardvävnad skivor som genereras med en vibratom14,15. Vi visar att isolering från vävnad skivor är mycket effektivare än från vävnad bitar malet med sax. Den beskrivna metoden möjliggör inte bara hög avkastning av livskraftiga humana kardiomyocyter från små mängder av myokardvävnad utan är också tillämplig på exemplar som lagras eller transporteras i kall kardioplegiclösning i upp till 36 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment med råttor godkändes av Djurvårds- och användningskommittén Mittelfranken, Bayern, Tyskland. Insamling och användning av mänskliga hjärtvävnadsprover godkändes av de institutionella granskningsnämnderna vid universitetet i Erlangen-Nürnberg och Ruhr-universitetet Bochum. Studier genomfördes enligt Helsingforsdeklarationens riktlinjer. Patienterna gav sitt skriftliga informerade samtycke före vävnadsinsamlingen.

Kvinnliga Wistar råttor (150 –200 g) erhölls kommersiellt, sövda genom att injicera 100 mg/kg av tiopental-natrium intraperitoneally, och avlivas genom livmoderhalscancer störning följt av thoracotomy och retasi av hjärtat. Mänskliga hjärt vävnad prover samlades in från vänster-ventrikulärt kärna under implantation av mekaniska assist enheter, från septal myectomy, från tetralog av Fallot korrigerande kirurgi, eller från den fria vänster-ventrikulärt väggen av explanted hjärtan. Följande protokoll beskriver isoleringen från mänskliga Ventrikulärt vävnad. Isoleringen av råttkardiomyocyter utfördes i enlighet med detta, men med olika enzymer (se Table of Materials). Ett schematiskt arbetsflöde av protokollet illustreras i bild 1.

1. Beredning av buffertar, lösningar, och enzymer

  1. Förbereda buffertar och lösningar enligt listan i tabell 1.
  2. Värm upp lösningarna 1, 2, 3 och den modifierade Tyrode's lösning till 37 °C. Förvara skärlösningen vid 4 °C tills användning.
    OBS: För 1–2 myokardiskivor krävs totalt cirka 15 mL, 8 mL och 5 mL av lösningarna 1, 2, och 3 för isoleringen i en 35 mm vävnadsodlingsskål. Skala upp därefter för samtidiga myocyteisoler i flera rätter. Skärlösningen kan frysas och hållas vid -20 °C i flera månader.
  3. Väg in 1 mg proteinas XXIV (se Tabell of Materials) i ett prechilled 15 mL centrifugrör och förvara på is tills användning. Detta är för bearbetning av ett prov. Skala upp beloppet i enlighet med detta. Blanda inte proteinasen och kollagenasen.
  4. Väg in 8 mg kollagenas CLSI (se Tabell över material) i ett prechilled 15 mL centrifugrör och förvara på is tills användning. Detta är för bearbetning av ett prov. Skala upp beloppet i enlighet med detta. Blanda inte proteinasen och kollagenasen.
    FÖRSIKTIGHET: Använd ansiktsmask eller arbeta under en draghuv för att undvika inandning av enzympulver.
    OBS: Enzymaktiviteten kan variera i olika partier. Därför kan den optimala koncentrationen skilja sig åt och bör bestämmas med varje nyköpt enzym16.

2. Lagring och transport av myokardvävnad

  1. Förvara och transportera humana hjärtprover i kyld, 4 °C skärlösning (Tabell 1).
  2. Använd samma lösning för vidare vävnadsbearbetning och vibratomslicing.
    OBS: Biopsier och kirurgiska hjärtprover bör omedelbart överföras till skärlösningen vid 4 °C och kan sedan förvaras eller transporteras vid 4 °C i högst 36 h innan detta protokoll tillämpas.

3. Bearbetning och skivning av vävnaden

OBS: Protokollet för vävnadsslicering följer Fischer et al.15.

  1. Trimning av vävnadsblocket
    FÖRSIKTIGHET: Mänsklig hjärtvävnad är potentiellt smittsam. Använd alltid skyddsslitage och följ säkerhetsföreskrifter för din institution. Hantera använda blad noggrant och kassera i säkerhetsbehållare.
    1. Placera preparatet i en 100 mm vävnadsodlingsskål fylld med 20 mL kallskärande lösning och förvara på en kyld, 4 °C-platta.
    2. Ta bort överflödig fibrotisk vävnad och epistär fett med en skalpell. Vid transmuralprov avlägsna trabekulae och vävnadsskikt nära endokardiet.
      OBS: Fibrotisk vävnad är stel och verkar vit. Fett är vanligtvis mjuk och verkar vitt till gult. Trabeculae och endocardial vävnad lager kan identifieras från deras lös vävnad sammansättning och en alliansfri fiber orientering jämfört med myokardium av de episkasardiella skikten
    3. För optimal vibratombearbetning, skär rektangulära vävnadsblock på cirka 8 mm x 8 mm x 8 mm med en skalpell från ett större vävnadsprov. För mindre biopsier hoppa över detta steg och flytta till agaros inbäddning.
  2. Inbäddning av hjärtvävnad i lågsmältnings-punkt-agarose
    1. Koka 400 mg lågsmältpunkt uppstod i 10 ml skärlösning i en glasbägare.
      FÖRSIKTIGHET: Använd handskar och skyddsglasögon för att undvika brännskador. Hantera endast varma glasvaror med värmeskyddsslitage.
    2. Fyll en 10 mL spruta med den heta, upplösta agarosgelen. Förslut sprutan och låt agargen ekviloverka i ett 37 °C vattenbad i minst 15 min.
    3. Använd tåtor för att placera det trimmade hjärtprovet eller biopsi i en ren 35 mm vävnadskulturskål med epipiumet vänt nedåt och avlägsna överflödig vätska med en steril svabb.
    4. Häll den ekvilovilliga agarosen (steg 3.2.2) över vävnaden genom att tömma sprutan. Säkra vävnaden mot rörelse med tes medan du häller agaros. Se till att vävnaden är helt nedsänkt i agaros.
    5. Omedelbart placera skålen på is och låt agaros stelna i 10 min.
  3. Skivning av myokardiet
    1. Montera ett nytt rakblad till vibratomens bladhållare och kalibrera vibratomen genom att om möjligt justera bladets z-avböjning.
      OBS: Detta protokoll använder en vibratom med en infraröd-assisterad kalibreringsanordning för att rikta in bladet i horisontellt läge med minimal z-avböjning (uppmätt avböjning <0,1 μm).
    2. Använd en skalpell för att punktskattebelägga ett agaros-vävnadsblock som passar provhållaren av vibratomen. För att säkerställa stabilitet, se till att vävnaden fortfarande är tillräckligt nedsänkt i agaros (agarosmarginaler ≥ 8 mm).
    3. Fixera agarosblocket på preparathållaren med ett tunt lager cyanoakrylatlim och skonsamt tryck.
    4. Placera preparathållaren med vävnaden i vibratombadet. Fyll badet med skärlösning och håll vid 4–6 °C under hela bearbetningen med krossad is, fylld i vibratomens yttre kyltank.
    5. Generera 300 μm tjocka skivor med en framåtsythastighet på ≤0,1 mm/s, en oscillerande frekvens på 80 Hz, en lateral amplitud på 1,5 mm, och en bladvinkel på 15°. När du hanterar skivorna, håll agaros i stället för själva vävnaden för att undvika vävnadsskador. Förvara skivorna i skärlösningen vid 4 °C i högst 2 h, om det behövs.
      OBS: Kardiomyocyter är orienterade parallellt med det episkaardium. Därför är det viktigt att skära parallellt med det episkaardium för att undvika överdriven myocyteskada. Det rekommenderas att kassera de första 1–3 skivorna, eftersom endast enhetliga skivor av konstant tjocklek ska användas för isoleringen. För små vävnadsbiopsier, dock bara kasta den första skivan.
    6. Kontrollera kardiomycyt inriktning under en standard ljus mikroskop med en förstoring av 40-100x.

4. Vävnadsspjälting

  1. Placera värmeplattan på labbskakören och värm den till 37 °C. Starta labbskaknare på 65 varv/min.
  2. Lös upp proteinasen (framställd i steg 1.3) i 2 mL lösning 1 (steg 1.1 och 1.2) och inkubera vid 37 °C tills användning. Blanda inte proteinasen och kollagenasen.
  3. Lös upp kollagenasen (framställd i steg 1.4) i 2 mL av lösning 1 (steg 1.1 och 1.2) och inkubera vid 37 °C tills användning. Blanda inte proteinasen och kollagenasen.
    FÖRSIKTIGHET: Använd skyddsglasögon och handskar, eftersom upplösta enzymer kan orsaka hud- och ögonskador.
  4. Tillsätt kalciumklorid (CaCl2) till kollagenasen som innehåller lösning (framställd i steg 4.3) till en slutlig koncentration av 5 μM.
  5. Använd forceps för att överföra en vävnadsskiva från vibratombadet till en ren 60 mm vävnadskulturskål fylld med 5 mL förslipningslösning (steg 1.1 och 1.2) och håll dig på is.
  6. Ta försiktigt bort agarosen från myokardvävnaden med blad eller toftor.
    OBS: Undvik överspänning och skjuvningsspänning på myokardskivorna, eftersom de kan skada kardiomyocyterna.
  7. För att utföra den inledande tvätten, placera en ren 35 mm vävnadskulturskål på värmeplattan och fyll den med 2 mL förkrigad (37 °C) lösning 1. Överför 1–2 myokardskivor till den förberedda skålen med tärningar. Aspirera lösningen med en 1 mL-pipetten och utför tvättstegen 2x för att avlägsna rester av skärlösning.
    OBS: Aspirera inte hjärtskivorna. Lösningarna och skivorna bör ligga kvar vid en konstant temperatur på 35 °C på den upprörda värmeplattan. Justera värmeplattans temperatur om det behövs.
  8. Ta bort lösning 1 från skålen och tillsätt 2 mL av proteinaslösningen (steg 4.2). Inkubera i 12 min på värmeplattan vid 65 rpm.
  9. Tvätta 2x med 2 mL förvärmd lösning 1 (37 °C).
  10. Ta bort lösning 1 från skålen och tillsätt 2 mL kollagenaslösning (steg 4.3 och 4.4). Inkubera minst 30 min på värmeplattan vid 65 rpm.
  11. Kontrollera om det finns gratis enskilda myocyter på 30, 35, 40 min, etc., genom att placera skålen under ett ljusmikroskop. Arbeta snabbt för att undvika betydande kylning av lösningen.
    OBS: Den erforderliga rötningstiden kan variera beroende på vävnadskonstitution och graden av fibros. Så snart vävnaden blir synligt mjuk och dissociates lätt när försiktigt dras, den optimala matsmältningstiden har uppnåtts. Om tillräckligt med vävnad finns tillgänglig kan flera skivor smältas parallellt med varierande matsmältningstider.
  12. När vävnaden rötas och enskilda myocyter är synliga (steg 4.11), tvätta 2x med 2 mL förkrigad lösning 2 (37 °C) och fyll igen med 2 mL.

5. Dissociation av vävnad

  1. Dissociate den rötade vävnaden skivor med tlykningar genom att försiktigt dra fibrerna isär.
  2. Försiktigt pipettera flera gånger med en pasteur pipetter för engångsbruk (öppningsdiameter >2 mm).
    OBS: Användning av tes och pipettering kan framkalla mekanisk stress och orsaka kardiomyocyteskador. Det är dock ett avgörande steg för separation av cellerna. Använd fina tlyktor för att minimera cellskador och försiktigt dissociate skivorna till mindre bitar.
  3. Kontrollera om de befriade stavformade kardiomyocyterna under ljusmikroskopet.

6. Återinförande av fysiologisk kalciumkoncentration

  1. Öka långsamt kalciumkoncentrationen från 5 μM till 1,5 mM medan du agiterar vid 35 °C på värmeplattan. Använd 10 mM och 100 mM CaCl2 lagerlösningar. Rekommenderade steg: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1 200, 1 500 μM. Låt cellerna anpassa sig till de ökade kalciumnivåerna i 5 min inkubationsintervaller mellan varje steg.
  2. Ta bort osmälta vävnadsbitar försiktigt med tärna eller filtrera cellupphängningen genom ett nylonnät med 180 μm porstorlek i slutet av kalciumökningen.

7. Borttagande av mekaniskt frikopplingsmedel

  1. Stoppa agitation och ta långsamt bort en tredjedel av lösningen (~700 μL) från toppen med en 1 000 μL-pipett. Undvik aspiration av kardiomyocyterna.
    OBS: Om osmält vävnad togs bort, kommer kardiomyocyterna att ackumuleras i mitten av skålen, vilket underlättar aspiration av cellfri lösning. Om inte, överför celllösningen till ett 15 mL centrifugrör och låt cellerna sedimentera i 10 min vid 35 °C, därefter aspirera 700 μL av supernatanten och kassera, återbetala cellerna, föra dem tillbaka till en 35 mm vävnadsodlingsfat och fortsätt med steg 7.2.
  2. Tillsätt 700 μL lösning 3 till cellerna, återuppta agitation på värmeplattan och inkubera i 10 min.
  3. Upprepa steg 7.1 och 7.2.
  4. Överför lösningen till ett 15 mL centrifugeringsrör och låt kardiomyocyterna till sediment i minst 10 min och högst 30 min vid rumstemperatur eller snurra vid 50 x g i 1 min. Ta bort supernatanten helt och resuspend i modifierad Tyrodes lösning eller den önskade experimenteringsbufferten.
    OBS: Kardiomyocyter kan förvaras i modifierad Tyrodes lösning (Tabell 1) i flera timmar vid 37 °C och 5% CO2 före användning.
  5. Verifiera cellkvaliteten med ett vanligt ljusmikroskop vid 40x och 200x förstoring.
    OBS: Runt 30–50 % av kardiomyocyterna ska vara stavformade, släta utan membranbröbbar och visa tydliga tvärstrisationer. Endast 5–10 % av de livskraftiga cellerna ska visa spontana sammandragningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att verifiera isoleringseffektiviteten användes protokollet med råttmokardium och det resulterande antalet livskraftiga myocyter jämfördes med de siffror som erhölls genom isolering via koronarperfusion och genom isolering från små vävnadsbitar (bitisolering, Bild 2). Chunk isolering och isolering från vävnad skivor utfördes från samma hjärtan. För isoleringen via koronarperfusion, dock, hela hjärtat användes. Koronar perfusion gett övervägande stav-formad och tvärstrimerad kardiomyocyter. Med isoleringar från hjärtinfarkt skivor observerades en lägre andel av stavformade celler, men det totala antalet var fortfarande hög. Däremot, efter isolering från vävnad bitar, endast få stavformade celler återfanns (Bild 2A). Flödescytometri användes för att jämföra resultaten kvantitativt. På grund av deras relativt stora storlek och tvärstrimation, kardiomyocyter visar vanligtvis stora värden för både framåt och sida scatter. Dessa egenskaper användes för att räkna stavformade myocyter med en flöde-cytometric cell analyzer, tillämpa en enkel gating schema som diskriminerade stav-formad från hyperkontrakterade och rundade kardiomyocyter. (Kompletterande figur 1). Representativa punkttomter avbildas i Bild 2B. Statistisk analys visade tydligt högre antal i kardiomycytporten CM1 för isolering från skivor än från vävnadsbitar (41,5 ± 11,9 jämfört med 7,89 ± 3,6 %, respektive; n =3 isoleringar; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Bild 2C). Isoleringen av kardiomyocyter från vävnadsskivor når således inte den avkastning som erhålls genom koronarperfusion, men resulterar i ett betydligt större antal stavformade myocyter än isolering från vävnadsbitar, vilket ger tillräckligt med celler för efterföljande experiment. Förutom cellantal kvantifierades strukturella parametrar för råtta kardiomyocyter. Celllängd, cellbredd, och sarkomerlängd var inte olika i celler som isolerats genom perfusion eller från vävnadsskivor (längd = 110,0 ± 5,4 μm jämfört med 99,4 ± 3,2 μm, p > 0,05; bredd = 33,9 ± 1,9 μm jämfört med 30,6 ± 1,2 μm, p > 0,05, för n = 19 respektive n = 21 celler; sarkomerlängd = 1,62 ± 0,04 μm jämfört med 1,68 ± 0,04 μm, p = 0,28, n = 24 respektive n = 23 celler) (Kompletterande figur 2A–C). Använda Fluo-4 lastade myocyter utsätts för elektrisk fältstimulering17 funktionsparametrar bedömdes också (Kompletterande figur 2D–F). Medelaktiveringstid (27,5 ± 1,5 jämfört med 23,6 ± 2,5 ms, n = 100 jämfört med n = 31 celler; perfusion jämfört med skiva, p > 0,05) (Kompletterande figur 2D) och relativ förkortning (12,2 ± 1,1 jämfört med 11,3 ± 2,5 %, n = 42 jämfört med n= 7 celler, perfusion kontra skiva, p > 0,05) (Kompletterande figur 2F) av kardiomyocyter som svarade på stimulering skilde sig inte signifikant mellan de två grupperna. Den övergående amplituden för kalcium (maximal normaliserad Ca2+, F/F0) (Kompletterande figur 2E) förstärktdes något i kardiomyocyter isolerade från skivor när de jämfördes med kardiomyocyter som isolerats av perfusion (4,9 ± 0,2 jämfört med 5,7 ± 0,3, n = 104 vs. n = 25 celler, perfusion vs. skiva, p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Kompletterande figur 2G). För att bedöma cellkvaliteten efter odling bestämdes andelen myocyter som svar på elektrisk fältstimulering efter 48 h i cellodlingen17. Fraktionen av smötesceller reducerades med ungefär hälften i båda grupperna (41,9 ± 3,6 % jämfört med 31,5 ± 2,3 %, perfusion jämfört med skiva, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Kompletterande figur 2H).

Därefter tillämpades protokollet på humant hjärtmuskel. Antalet stavformade och livskraftiga isolerade humana ventrikulära kardiomyocyter som erhållits från vävnadsskivor jämfördes parvis med det antal som erhölls från vävnadsbitar av samma myokardprover (Figur 3). Vi fann att isoleringen från myokardskivor gav en stor andel stavformade och endast en liten andel avrundade kardiomyocyter (Figur 3A). Vi räknade stavformade myocyter från wide-field bilder och normaliserade deras nummer av vävnaden våt vikt som används för isolering. Kvantifieringen visade att isolering från myokardskivor resulterade i ett påfallande högre antal stavformade myocyter än isolering från vävnadsbitar (45,0 ± 15,0 jämfört med 6,87 ± 5,23 celler/mg, n = 7 isoleringar, p < 0,05, parade tvåstjärtade t-test) (Figur 3B). Vidare bedömdes livskraften med en MTT-genombilitetsanalys14, normaliserande av den fotometriska formazanabsorptionen till den totala mängden protein i cell lysate. Den fotometriska kvantifieringen bekräftade en väsentligen högre myocytens livskraft efter isolering från myokardskivor (4,76 ± 0,47 jämfört med 1,09 ± 0,18 AU, n = 3 isoleringar, p < 0,05, parade tvåsidiga t-test) (Figur 3C).

Totalt tillämpades metoden på myokardikopexemplar från 30 människohjärtan med transporttider på upp till 36 h. Från 23 av de 30 exemplarens livskraftiga celler erhölls för efterföljande experiment (se även Supplemental Table 1). Ett exempel på ett misslyckat experiment (dvs., <100 celler per maträtt) visas i Supplemental Figure 3. Här tolererade de flesta celler inte hög extracellulära kalcium och hypercontracted. Vi bedömde kontraktilitet i myocytes från 14 isoleringar, och i två fall cellerna inte svarade på elektrisk stimulering. Observera att tekniken inte bara arbetat med stora exemplar som erhållits från vuxna hjärtan, men också med små biopsier (så lite som 40 mg) från barn hjärtan (Kompletterande Figur 4).

För att visa att mänskliga celler isolerade med det beskrivna protokollet kan utsättas för strukturell analys, de var färgas med alfa-aktinin, EG koppling proteiner L-typ kalcium kanal (LTCC) och ryanodin receptor (RyR), samt cellmembranet och atomkärnor, enligt en färgning metod som beskrivs nyligen i råtta myocyter17 (Figur 4). Alfa-aktininfärgning visade ett tätt, regelbundet z-linjemönster och en medelsarkomlängd på 1,92 ± 0,06 μm i vilande kardiomyocyter (n = 4, Figur 4A). LTCC och RyR visade tydliga kluster och var, som väntat, colocalized nära cellmembranet och t-tubules (Figur 4B).

Det potentiometriska färgämnet FluoVolt18 och det kalciumkänsliga färgämnet Fluo-417 användes för att visa att humana kardiomyocyter som isolerats med det beskrivna protokollet var retbara och kunde användas för studier om cellulär elektrofysiologi eller exciterings-kontraktionskoppling (Figur 5). Actionpotential (AP) form och varaktighet analyserades (Figur 5A,B). Värdena 50% och 90% AP varaktighet (APD50: 400,6 ± 41,1 ms, APD90: 748,9 ± 56,6 ms, n = 10 celler) var i intervallet rapporteras av andra för ventrikulära kardiomyocyter från sviktande mänskliga hjärtan4,6,7,9. De kalciumtransienter som registrerats av konfokal linje skanning av Fluo4-laddade celler (Figur 5C,D) visade en tydlig upstroke efter stimulering och en godtagbar signal-till-brus-förhållande. Kalciumtransient amplituden (maximal F/F0) var 2,9 ± 0,5 (n = 31 celler). Kardiomyocyte förkortning genom kontraktion kan ses i exemplet från deformation av den nedre cellen gränsen, som hade ett medelvärde av 4,6 ± 0,8% (n = 31 celler).

Figure 1
Bild 1: Arbetsflöde för isoleringsprotokollet från skivor av mänsklig hjärtvävnad. Vävnadsblock eller biopsier från humant myokardium (överst till vänster) är inbäddade i lågsmältningspunktsagaros och 300 μm tjocka skivor genereras med det oscillerande bladet hos en vibratom (övre mitten). Skivorna överförs till en kulturskål och tas bort från den omgivande agarosen (överst till höger). Vävnadsuppslutning utförs vid ~35 °C och 65 rpm på en uppvärmd och upprörd platta (mitten, vänster) och omfattar: (steg 4.8) Inkubation i nominellt kalciumfri lösning kompletterad med proteinas, (steg 4.10) Rötning av den extracellulära matrisen med kollagenas, (steg 5) Dissociation och befrielse av individuella kardiomyocyter med forceps och pipettering. (steg 6) Långsam uppgång av den extracellulära kalciumkoncentrationen från 5 μM till 1,5 mM i intervall om 5 min. (steg 7) Stegvis borttagning av den mekaniska uncouplern 2,3-butanedione monoxime (BDM). Rod-formade och tvärstrigade mänskliga kardiomyocyter hämtas. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Kardiomycytutbyten av myokardskiva, perfusion och isolering av tjockbit. (A) Representativa lätta mikrografer av råttkardiomyocyter som isolerats antingen via koronarperfusion (Perfusion), från vibratomskuren vävnad (Myokardiska skivor), eller från hackad vävnad (Vävnadsbitar). (B) Respektive representativa flödescytometriptomer från kardiomyocyteisoleringar som beskrivs i A. Side scatter area (SSC-Area) och framåt scatter område (FSC-Area) användes som indikatorer på cellulära granularitet och storlek, respektive. Gating-schemat för porten CM1 för kardiomyocyter anges med den svarta linjen och respektive fraktioner av totala antalet i procent visas. (C) Medelvärde ± standardfel för fraktionerna av kardiomyocyter (CM1) bedömt genom flödes-cytometrisk analys enligt beskrivningen i B från n = 3 cellisoleringar per grupp. Isoleringen från myokardierade skivor och vävnadsbitar utfördes från samma hjärtan (parade tvåstjärtade t-test). Isolering genom perfusion utfördes från hela hjärtan av olika djur och jämfördes med det oparade tvåstjärtade t-testet. *p < 0,05, efter flervalsjämförelsekorrigering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Jämförelse av avkastning och livskraft hos humana kardiomyocyter efter isolering från myokardskivor och malda vävnadsbitar. (A) Representativ bild av kalciumtoleranta mänskliga ventrikulära kardiomyocyter efter isolering från vävnadsskivor. Rod-formade och striated kardiomyocyter är dominerande (svart pil), med endast få rundade och hyperkontrakterade celler (vit pil). (B) Kvantifiering av kalciumtoleranta, stavformade myocyter som isolerats parallellt, antingen från myokardinsnitt eller vävnadsbitar som räknats från breda fältmikrobografer och normaliserats till det våta vikten av indatamaterialet (i milligram) från n = 7 parade isoleringar. (C) Kvantifiering av kardiomyocytens viabilitet genom fotometrisk mätning av formazanfärgatabsorbans efter MTT-analys. Absorbans normaliserades till den totala proteinmängden, bedömd av BCA-analys från n = 3 parade isoleringar. *p < 0,05, **p < 0,01 (parat tvåstjärtat t-test). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Mikrostrukturell karakterisering av humana kardiomyocyter efter isolering. (A) Representativa confocal mikroskopisk bild efter immunfärgning av alfa-aktinin (grön) och nukleära fläck med 4′,6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, blå). Sarkomlängden var 1,92 ± 0,06 μm (n = 4 myocyter), bestämd genom att analysera Fourier-spektrumet. (B) Representativa confocal mikroskopiska bilder av en fast mänskliga Ventrikulärt kardiomyocyte coimmunostained för L-typ kalcium kanal (LTCC) och hjärt ryanodin receptor (RyR). Överlagringen av RyR och LTCC (overlay) och färgningen av den extracellulära matrisen med vetegroddar agglutinin (WGA, magenta) visas också. Kärnor var färgas med DAPI (blå). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Aktionspotential och intracellulär kalciumtransient i humana ventrikulära myocyter. (A) Tvådimensionell konfokal bild av en isolerad human kardiomyocyte laddad med det potentiometriska färgämnet FluoVolt (grön, 488 nm excitation våglängd). Den röda rutan anger ett element i det t-rörformiga systemet som mättes med en snabb linjeskanning vid elektrisk fältstimulering vid 0,5 Hz. (B) Medelvärde och baslinje-normaliserad FluoVolt-fluorescens (F/F0) av fem på varandra följande åtgärdspotentialer som erhållits genom konfokal avbildning enligt beskrivningen i A. (C) Linjeskanningsbild av en isolerad human kardiomyocyte laddad med det kalciumkänsliga färgämnet Fluo-4 AM (488 nm excitation våglängd) längs längs cellaxeln. Fluorescensintensiteten visas i gråvärden [AU] och de blå punkterna anger den maximala ökningen av fluorescensintensiteten (dF/dtmax) för varje pixel längs den skannade linjen. Samplingsfrekvensen var 529 Hz. (D) Kalciumtransient som erhålls genom att medelvärdet av fluorescensen för varje pixel längs den skannade linjen längs den skannade linjen från bilden i C och normalisering till baslinjevärden före stimulering (F/F0). Alla experiment utfördes i rumstemperatur.. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Namn Sammansättning i mmol/L Tillägg Ph Nödvändig volym i mL
Lösning 1 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glukos, 70 glutaminsyra, 20 taurin, 10 beta-hydroxybutyrat, 30 BDM 2 mg/ml bovint serumalbumin 7.3 med KOH 300
Lösning 2 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glukos, 70 glutaminsyra, 20 taurin, 10 beta-hydroxybutyrat, 0,005 CaCl2, 30 BDM 10 mg/ml bovint serumalbumin 7.3 med KOH 300
Lösning 3 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 glukos, 70 glutaminsyra, 20 taurin, 10 beta-hydroxybutyrat, 1,5 CaCl2 10 mg/ml bovint serumalbumin 7.3 med KOH 300
Modifierad Tyrodes lösning 130 NaCl, 0,4 NaH2PO4, 5,8 NaHCO3, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2, 1,5 CaCl2, 25 HEPES, 22 glukos 2 mg/ml bovint serumalbumin 7.3 med NaOH vid 5 % CO2 100
Skärlösning 138 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukos, 30 BDM 7.3 med NaOH 500

Tabell 1: Buffertar och lösningar. Sammansättning av de krävda buffertarna och lösningarna.

Kompletterande figur 1: Validering av kardiomyocyten (CM1) gating-schemat. Dot tomter från flödescytometri, mäta framåt- och sida-scatter-området (FSC-A, SSC-A) som anger storlek och granularitet av de upptäckta cellerna i ett kontrollprov (CTRL) från perfusion-isolerade råtta kardiomyocyter och efter inkubation av kardiomyocyter från samma preparat för 15 min vid 37 °C i modifierad Tyrode lösning som innehåller 100 mMM (kalcium överdos). Det höga extracellulära kalciumet orsakar hyperkontraktion och avrundning av stavformade kardiomyocyter, vilket resulterar i en minskning av celler (87,6% jämfört med 6,00%) i den definierade grinden (CM1). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Kompletterande figur 2: Kardiomycytegenskaper som isolerats genom perfusion eller från skivor. Celllängd (A) och cellbredd (B) fastställdes från råttkardiomyocyter som fixeras direkt efter isolering via perfusion eller från myokardierade skivor genom mikroskopi (n = 19 respektive n = 21 celler). Sarkomlängden (C) fastställdes från mikroskopiska bilder efter immunostaining med alfa-aktinin och Fourier analys (n = 24 och n = 23 celler, respektive). Medelvärdet aktiveringstid (D), den maximala F / F0 (E) och den relativa förkortningen (F) bedömdes från Fluo-4 laddade kardiomyocyter isolerade av perfusion eller från myokardsegment och lyhörd för elektrisk stimulering (n = 100/31 myocyter i D, n = 104/25 myocyter i E och n = 42/7 myocyter i F). Fraktionen av stavformade kardiomyocyter (G) som kontrakterade vid elektrisk stimulering, bedömt genom att räkna det totala antalet stavformade celler och de kontraktila cellerna i tio synfält vid 200x förstoring i ett standardljusmikroskop bedömdes för perfusion och skiva isolering (n = 452/276 celler, respektive). (H) Analys som utförts i G men efter 48 h odling (n = 371/329 celler, respektive). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Kompletterande figur 3: Human kardiomyocyte isolering med låg avkastning. Representativ ljusmikroskop bild av myocyter från en isolering med övervägande hypercontracted (blå) eller rundade celler (svart) och endast få stavformade och striated celler (vit). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Kompletterande figur 4: Kardiomycytisolering från spädbarns hjärtbiopsier. (A) Bild av en endomyocardial biopsi (våtvikt cirka 40 mg) som erhållits under korrigerande kirurgi för fallots tetrad hos ett spädbarn. (B) Myokardiskiva från vävnaden som visas i A, inbäddad i agaros. (C) Kardiomyocyter isolerade från en myokardskiva enligt vad som visas i B. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Kompletterande tabell 1: Mänskliga patientuppgifter. En förteckning över antalet prover från humana patienter som ingår i denna studie ges. Prover kategoriserades enligt kirurgi typer, ålder, sjukdom etiologi och transport tid, med respektive totala antalet prover och antalet framgångsrika myocyter isoleringar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om isoleringen av levande kardiomyocyter inrättades för mer än 40 år sedan och är fortfarande en förutsättning för många experimentella metoder i hjärtforskning, är det fortfarande en svår teknik med oförutsägbara resultat. Kardiomyocyte isolering via perfusion av kranskärlen med enzymlösning används ofta för hjärtan av små djur och ger ett stort antal livskraftiga celler. Detta kräver dock ett relativt komplicerat system och expertis. Vidare är de flesta mänskliga vävnadsprover inte lämpade för denna metod, på grund av sin ringa storlek eller frånvaron av kranskärlsgrenar, vilket gör nya metoder för isolering av mänskliga kardiomyocyter önskvärda. Det protokoll som beskrivs här är baserad på atraumatic generationen av tunna hjärt vävnad skivor, som sedan utsätts för enzymatisk matsmältning. Det kan tillämpas på hjärtinfarkt exemplar från djur hjärtan och mänskliga myokardium såsom apikala kärnor från vänster-ventrikulärt assist-enhet implantation, endomyocardial tarmbiopsier från septal myectomy, eller explanted hjärtan (se Kompletterande tabell 1), och tillförlitligt producerar tillräckliga mängder av livskraftiga, kalcium-toleranta kardiomyocyter som kan användas för efterföljande experiment, som cardiomyocyte odling17.

En viktig orsak till högre avkastning av myocyter från vibratome-cut vävnad skivor än från hackad vävnad bitar kan vara en lägre grad av myocyter skador under skivning. När koronarperfusion inte är möjligt, skivning eller malning av vävnadsprovet är nödvändigt att öka kontaktytan för att smälta enzymer. Slice dimensioner på cirka 8 mm x 8 mm x 0,3 mm möjliggör god åtkomst av enzymer på grund av en relativt stor yta-till-volym-förhållande (~ 7 mm-1). Med hjälp av sax kan ett liknande yt-till-volymförhållande (~6 mm-1) uppnås genom att förlagan till preparaten i små bitar på cirka 1 mm x 1 mm x 1 mm mals. Även myocyte skador i skivor och malda bitar innan enzymatisk matsmältningen inte kvantifieras, skivning på en vibratom sannolikt orsakar betydligt mindre skada eftersom det möjliggör mild skärning i fiberriktningen. I själva verket uppskattades det att i vibratome-cut skivor mindre än 5% av myocyterna är skadade19. Resultaten visar att mänskliga kardiomyocyter kan isoleras mycket effektivt med det protokoll som tillhandahålls, med en mycket högre andel livskraftiga celler jämfört med vävnad bitar. Detta är i enlighet med ett protokoll som använde skivor från förmaksvävnad20. Vår metod ger upp till 200 kalcium-toleranta ventrikulära myocyter per milligram vävnad och ger möjlighet att lagra eller transportera hjärtvävnad för upp till 36 h före isolering. Detta gör det protokoll som gäller för laboratorier utan hjärtkirurgi på plats och utökar därmed möjligheterna till samarbeten.

Kritiska steg i protokollet är den korrekta bearbetningen av myokardium till skivor på en vibratom och deras matsmältning samt de sista stegen i kalcium-återinförande och washout av BDM. I motsats till andra metoder19,21, är den hjärtvävnad inbäddade i agaros med en låg smälttemperatur för att undvika rörelse under skivningsproceduren14,15. Detta var nödvändigt för att stabilisera vävnadsblocket och för att generera enhetliga skivor. Vid inbäddning av vävnaden ska agaros fortfarande vara flytande, men temperaturen bör inte överstiga 37–38 °C för att undvika cellskador genom hypertermi. Omvänt, om agaros är för kallt (< 35 °C), binder det inte väl till vävnadsblocket och kan gå sönder under skivningen. För att testa för myocyte livskraft efter vibratome bearbetning, en enkel MTT analys som möjliggör snabb utvärdering av cellens livskraft genom ljusmikroskopi och även för kvantifiering genom fotometrisk analys föreslås14,22. Kardiomyocyteskador kan också uppstå vid återinsättning av extracellulärt kalcium efter en period av inkubation i kalciumfrilösning 23,24. Detta kalcium paradox fenomen i isolerade celler kan mildras genom en långsam, stegvis ökning av kalciumnivåerna så att kardiomyocyterna att anpassa sig. Detta steg bör utföras noggrant under kontinuerlig agitation vid 35 °C och med intervall på 5 min. Lätt hypotermi (21 °C) ökar kalciumtoleransen för råttkardiomyocyter vid återintroduktion, vilket är i enlighet med tidigarerapporter 25. Mänskliga kardiomyocyter visade dock inte på stora skillnader i kalciumtolerans vid 35 °C eller 21 °C. Användningen av BDM under skärning, matsmältning, och återinförande av kalcium förhindrar myocyter kontraktion och cellulära energiförbrukning samt hypercontraction och är därför skyddande. Men för efterföljande experiment bedöma hjärt kontraktilitet eller excitation-kontraktionskoppling, BDM måste tas bort26. En gradvis washout tillämpades för att minimera spontana hypercontractions. BDM kan utelämnas, men detta kommer att markant öka mängden hypercontracted myocyter, som observerats i tidigare experiment och studier6.

Det beskrivna protokollet använder en lösning som innehåller hög kalium och endast spår av natrium för matsmältningen. Denna lösning gav den högsta avkastningen av stavformade, tvärstrigda kardiomyocyter. För enzymatisk matsmältning, dock, Det krävs en högre koncentration av kollagenas (4 mg/mL) jämfört med matsmältningen i normala Tyrode lösning (1.5 mg/mL). Hög extracellulär natrium kan leda till intracellulär natrium överbelastning, förvärra de negativa effekterna av kalcium paradoxen, därmed minska cellen avkastning27. Därför föreslås att man använder lösningar med hög kalium och låg natriumhalt. En hög extracellulär magnesiumkoncentration är ofta anställd i kardiomyocyte isolering protokoll3,28, och har visat sig minska ischemi-reperfusion skada29,30 och förbättra hjärtfunktionen efter längre perioder av kall ischemi31. Därför innehåller lösningen som appliceras här också en hög koncentration av magnesium (10 mM). Emellertid, Det visades att retbarhet, kontraktion kraft, och ledningshastighet kan minskas genom höga magnesium koncentrationer32. Även om dessa effekter visade sig vara reversibla, kan effekter på isolerade kardiomyocyter inte uteslutas. Att använda magnesium vid fysiologiska koncentrationer (1–2 mM), kan alltså resultera i en lägre total cellavkastning men förbättra retbarheten.

Den optimala matsmältningstiden är ganska varierande, eftersom mängden extracellulär matris eller fibros kan variera avsevärt i mänskliga sviktande myokardium. Skulle vävnaden fortfarande vara fast ansluten vid tidpunkten för dissociation, med endast få livskraftiga myocyter frigörs, öka rötningstiden i steg om 5 min och regelbundet kontroll av gratis myocyter och texturen av skivorna rekommenderas. Om vävnaden förblir osmält efter längre perioder (>45 min), att öka koncentrationen av kollagenas i steg av 1 mg/mL eller testa en annan enzymsatsrekommenderas 16. De respektive värden som presenteras i detta arbete kan fungera som en primer för en robust isolering av kardiomyocyter, men förutsättningarna för optimal avkastning och livskraft kan förfinas i varje laboratorium, med hänsyn till den stora variationen i enzymaktiviteter och vävnadskonstitutioner. En fördel med metoden är att på grund av de små mängderna av erforderlig vävnad och det enkla arbetsflödet i små satser kan flera tester utföras parallellt. Således kan ett optimalt protokoll uppnås snabbt.

Genereringen av högkvalitativa myokardskivor kräver en vibratom med hög precision. Behovet av en hög precision vävnadsskivare eller vibratom är en möjlig nackdel med metoden, eftersom det inte är lätt tillgängligt vid varje laboratorium. Den apparat som används för denna studie beskrivs närmare på andra ställen14,15. Olika enheter har använts framgångsrikt för att generera myokardsegment av andragrupper 33,34,35. Om inställningarna för förflyttningshastighet, bladamplitud och svängningsfrekvens kan uppfyllas och en horisontell bladorientering med en z-deformation under 0,1 μm finns tillgänglig, bör framgångsrik skivning och isolering vara genomförbar med andra vibratomer. Dessutom är vävnadsslicningen genomarbetad och förlänger protokollets varaktighet avsevärt (ungefär 1–2 h). Användningen av BDM som ett mekaniskt uncoupling agent har skyddande effekter genom att minska cellulär energiexponering, ischemisk skada, och hypercontraction26,36,37. Även om den negativa inotropiska effekten av BDM visade sig vara snabbt reversibel efter washout38,39, är det inte klart om BDM kan ha okända konsekvenser på kardiomyocyte funktion40. Denna studie visar att celler kan isoleras med hög avkastning efter vävnad lagringstider på upp till 36 timmar och att mänskliga kardiomyocyter kan odlas i upp till tre dagar efter isolering med denna metod17. Vi märkte inte funktionella eller strukturella skillnader mellan myocyter med korta och långa lagringstider. Detta bedömdes dock inte systematiskt. Å andra sidan, för hela kanin hjärtan, det visades att funktionella skillnader mellan färska hjärtan och hjärtan utsätts för kall ischemi i extracellulär lösning som innehåller 30 mM BDM var försumbara31, och detsamma kan vara sant i detta fall.

Det presenterade protokollet ger en solid grund för alla typer av experiment med isolerade Ventrikulärt kardiomyocyter och kan vara särskilt värdefullt för forskning om mänskliga hjärtinfarkt exemplar. Med vissa anpassningar verkar isoleringen av andra hjärtceller, såsom fibroblaster eller endotelceller också möjlig41. Eftersom det kräver endast små mängder vävnad som kan skickas i kylförvaring lösning från andra laboratorier, tillämpning av protokollet kan minska antalet offrade försöksdjur. I själva verket har protokollet framgångsrikt tillämpas på kanin och svin hjärtvävnad. Vidare, som experiment med långsiktiga odlade myokardi vävnad skivoröka 21,33,42 och ständigt förbättras för att ge optimala odlingsförhållanden15,43,44, metoden kan lätt tillämpas efter skiva odling. Enda cell isolering från odlade myocardium kan därför bidra till att karakterisera förändringar i kardiomyocyter efter farmakologiska eller fysiska ingrepp in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Andreas Dendorfer från Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, LMU München, för hjälp med skivningsprotokollet. För att ge mänskliga myokardi vävnadsprover vi vill tacka Ghazali Minabari och Christian Heim från Institutionen för hjärtkirurgi, Universitetssjukhuset Erlangen, Hendrik Milting från Erich & Hanna Klessmann Institutet, Ruhr-University Bochum och Muhannad Alkassar från Institutionen för pediatrisk kardiologi, Universitetssjukhuset Erlangen. För stöd med flödescytometri vill vi tacka Simon Völkl och kollegor från det translationella forskningscentret (TRC), Universitetssjukhuset Erlangen. Vi vill också tacka Lorenz McCargo och Celine Grüninger från Institutet för cellulär och molekylär fysiologi Erlangen för utmärkt teknisk support.

Detta arbete stöddes av DZHK (tyska centrumet för kardiovaskulär forskning), av tvärvetenskapligt centrum för klinisk forskning (IZKF) vid universitetssjukhuset vid universitetet i Erlangen-Nürnberg, och Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Tags

Biologi människa hjärtsvikt myokardskivor kardiomyocyte isolering vibratom kontraktil myocyter kalcium imaging hjärt excitation-kontraktionskoppling
Isolering av mänskliga Ventrikulära kardiomyocyter från Vibratome-Cut Myokardial Skivor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter