Cancer Research

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/61173

Xiangdong Lv*^1,2,3, Lacey E. Dobrolecki*^1,2,3, Yao Ding^1,2,3, Jeffrey M. Rosen^1,2,3, Michael T. Lewis^1,2,3, Xi Chen^1,2,3

¹Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, ²Lester and Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, ³Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Summary

מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה ומודלים של עכברים מהונדסים גנטית הניתנים להשתלה מחדשים בנאמנות מחלות אנושיות והם מודלים מועדפים לחקר בסיסי ותרגום של סרטן השד. כאן, שיטה מתוארת להשתלה אורתוטופית שברי גידול השד לתוך כרית השומן הממארי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול ולהעריך את תגובת התרופה.

Abstract

מודלים פרה-קליניים המשיבים בנאמנות את ההטרוגניות של הגידול ואת התגובה הטיפולית הם קריטיים לחקר סרטן השד התרגומי. קווי תאים מונצחים קלים לגידול ושינוי גנטי כדי לחקור מנגנונים מולקולריים, אך הלחץ הסלקטיבי מתרבית התאים מוביל לעתים קרובות לשינויים גנטיים ואפיגנטיים לאורך זמן. מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה מסכמים בנאמנות את ההטרוגניות ואת התגובה ההתרופהית של גידולי השד האנושיים. דגמי PDX מציגים השהיה קצרה יחסית לאחר השתלה אורתוטופית המאפשרת את החקירה של ביולוגיה של גידול השד ותגובת התרופה. מודלי העכברים המונדסים גנטית הניתנים להשתלה מאפשרים לחקור חסינות לגידול בשד. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטה להשתלה אורתוטופית של שברי גידול בשד לתוך כרית השומן הממירי ואחריו טיפולים תרופתיים. מודלים פרה-אקליניים אלה מספקים גישות חשובות לחקור ביולוגיה של גידול השד, תגובת התרופה, גילוי סמנים ביולוגיים ומנגנונים של עמידות לתרופות.

Introduction

ניתן לייחס את רוב מקרי המוות מסרטן השד למחלות חוזרות ונשנות העמידות בפני טיפולים קונבנציונליים¹^,². ההטרוגניות הבין-גידולית של סרטן השד תורמת להתנגדות לטיפול. יתר על כן, הטרוגניות הגידול יכול לפגוע באבחנה מדויקת ולאתגר ניהול מחלות^3,⁴. זיהוי סמנים ביולוגיים חזויים של תגובה ישפר באופן משמעותי את התוצאות הקליניות של חולים עם סרטן השד. למרות שרוב סוגי סרטן השד הם גידולים 'קרים' מבחינה חיסונית שסביר להניח שאינם מגיבים לאימונותרפיה, מעכבי מחסום חיסוני הראו הבטחה בניסויים קליניים^2,⁵. לדוגמה, ניסוי שלב III הראה הישרדות משופרת ללא מחלות (DFS) וראיות ראשוניות כי atezolizumab (נוגדן חד שבטי נגד PD-L1) בשילוב עם nab-paclitaxel עשוי לספק יתרון הישרדותי כולל לעומת nab-paclitaxel לבד בגידולים עם ≥1% PD-L1 מכתים⁶. פיתוח טיפולים החושניים גידולי שד לאימונותרפיה יחולל מהפכה במשטרי הטיפול.

מודלים פרה-קליניים המשיבים בנאמנות הטרוגניות של סרטן השד האנושי ותגובה תרופתית הם קריטיים לחקר ביולוגיה של הגידול ולזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לטיפול ממוקד. קווי תאים מונצחים נמצאים בשימוש נרחב לחקר סרטן השד מכיוון שקווי תאים אלה קלים לגידול ושינוי גנטי כדי לחקור מנגנונים מולקולריים. עם זאת, בשל הלחץ הסלקטיבי מתרבית התאים לטווח ארוך במבחנה, סחיפה גנטית עלולה להתרחש לאורך זמן וקווי תאים של סרטן השד עשויים לשאת שינויים גנומיים ספציפיים לקו התאים הנבדלים מסטיות בגידולי השד העיקריים⁷^,⁸^,⁹.

גושי גידול קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה מסוגלים לשחזר את ההטרוגניות של המחלה האנושית, והם דומים מבחינה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימית לגידול ממוצא^10,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²² ^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. חשוב לציין, מודלים PDX יציבים פנוטיפי על פני השתלות מרובות כפי שמעידים היסתולוגיה, תמלולום, פרוטאום וניתוח גנומי¹⁰^,^11,^12,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²² ^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. דגמי PDX מראים תגובות טיפול דומות לאלה שנצפו קלינית¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^, ²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. דגמי PDX עבור קולטן אסטרוגן חיובי (ER⁺), קולטן פרוגסטרון חיובי (PR⁺), גורם גדילה אפידרמלי 2 חיובי (ERBB2⁺, HER2⁺) ומשולש שלילי סרטן השד (TNBC) דגמי PDX הוקמו, ומספקים פלטפורמה מצוינת לבדיקת טיפולים אנדוקריניים, כימותרפיים וממוקדים. עם זאת, אזהרה עיקרית אחת של דגמי PDX כיום היא היעדר מערכת חיסונית פונקציונלית בעכבר.

מודלי העכבר מהונדסים גנטית (GEMM), כגון Trp53 homozygous null, cMyc, Wnt1, PyMT או מודלים של ביטוי יתר של Her2, מאפשרים לחקור ייזום גידול ספונטני, התקדמות וחלומות בהקשר של מערכת חיסונית שלמה. עם זאת, השהיית הגידול ארוכה, מה שמקשה על ביצוע ניסויים פרה-קליניים עם זרועות מרובות³⁰^,³¹. עם זאת, GEMM ניתן להשתיל מארחים סינגניים כדי ליצור מספר מספיק של גידולים כי מקרוב recapitulate גידולים אנושיים³²^,³³^,^34,^35,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^, ⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²^,⁵³^,⁵⁴^,⁵⁵. לדוגמה, אפיתל הממכר מעכבר BALB/c p53-null הושתל ברפידות השומן המנוקות של עכברי נמען מסוג בר סינגנים כדי ליצור גידולים ראשוניים, אשר ניתן להשתיל עוד יותר לתוך פונדקאים סינגנים⁵⁶^,⁵⁷. הגידולים p53-null recapitulated תת סוגים שונים של גידולים אנושיים.

השילוב של דגמי PDX ו- GEMM הניתנת להשתלה מספק כלים פרה-אקליניים יקרי ערך לחקור ביולוגיה של גידול בשד, תגובת תרופות וחסינות נגד גידולים. בפרוטוקול הנוכחי, מתוארת שיטה להשתלה אורתוטופית של שברי גידול PDX ו- GEMM לתוך כרית השומן של העכבר. מודלים אלה מקובלים על מעברים סדרתיים ובדרך כלל לשמור על פנוטיפ יציב. כדי למתן את הסיכון של הסחף הגנטי או אובדן הטרוגניות על פני מעברים לאורך זמן, שברי רקמות מרובים הם cryop שמורים בכל מעבר להשתלה הבאה במקרה ששינויים ביולוגיים או מורפולוגיים נצפים לאורך זמן²⁹^,⁵⁸.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים המשתמשים בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC). שברי הגידול, בגודל של כ-1−2 מ"מ^3, הם ממלאי קפוא בת קיימא המתקבל מ-Xenograft שמקורו בחולה וליבת דגמי Vivo מתקדמים במכללת ביילור לרפואה.

1. הכנת שברי גידול מאמרי קריופיזמי להשתלה

מעבירים את הקריוביאל עם שברי הגידול מחנקן נוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
להסעיר את cryovial עם סרט עדין מדי פעם במהלך הפשרה.
לאחר ההפשרה של הרקמה, מוציאים את הקריוביאל מאמבט המים ומערבבים על ידי היפוך עדין.
יבש את החלק החיצוני של cryovial וריסוס עם 70% אתנול. תעביר את זה למכסה בטיחות ביולוגית.
העבר את רקמות הגידול המופשרות לתוך צינור חרוט 15 מ"ל מלא 10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco קר (DMEM). מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור. אפשר לרסיסי הרקמה להתיישב לתחתית הצינור.
שאפו את supernatant ו resuspend ב 10 מ"ל של DMEM קר. מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור. אפשר לרסיסי הרקמה להתיישב לתחתית הצינור.
שאפו את supernatant ו resuspend ב 10 מ"ל של DMEM קר. הנח את הצינור על קרח.
הערה: הרקמה מוכנה להשתלה.

2. איסוף והכנת גידול ממארי טרי להשתלה

להרדים את העכבר נושא הגידול בשד.
הערה: מארח PDX עשוי להיות SCID / בז ', NSG או עכברים נשיים NRG בעוד במחקר הנוכחי עכברי Balb / c בגילאי 3−5 שבועות משמשים.
לרסס את אזור הגידול של העכבר המתת חסד עם 70% אתנול.
הערה: נסו להימנע משיער עם דגימת הגידול שעלולה לגרום לזיהום של שברי גידולים להקפאה או להשתלה.
עם מלקחיים משוננים לצבוט ולהרים את העור המקיף את הגידול, להשתמש במספריים כדי לבצע חתיכה קצרה.
להפריד את הגידול מהעור עם המספריים כדי לנתח את כל הגידול מהעכבר המארח. לקצץ את כל רקמת כרית שומן העכבר הנותרת מפני השטח החיצוניים של הגידול. מניחים את הגידול בצינור חרוט 15 מ"ל מלא 5 מ"ל של DMEM קר.
הערה: השתמש בגידולים בגודל מרבי של קוטר של 1 ס"מ מאז גידולים גדולים יותר צפויים להכיל ליבות נמק.
במכסה המנוע של biosafety, מעבירים את הגידול המנותח לצלחת פטרי סטרילית 10 ס"מ המכילה מספיק DMEM כדי למנוע ייבוש.
חותכים את הגידול לשברים 1 מ"מ³ עם אזמל או להב בתנאים אספטיים.
הערה: האזמל או הלהב צריך להיחשף תחת UV במכסה המנוע הבטיחות הביולוגית לפחות 20 דקות לפני השימוש.
העבר את שברי הגידול לצינור חרוט 15 מ"ל מלא DMEM קר. הנח את הצינור על קרח.
הערה: הרקמה מוכנה להשתלה. שברי הגידול נותחו בשלב 2.4 יכולים להיות, 1) הצמד קפוא בחנקן נוזלי עבור חלבון ומיצוי RNA/DNA, 2) קבוע עם 4% paraformaldehyde (PFA) או 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (NBF) עבור המטוקסילין ואוסין (H&E) וניתוח אימונוהיסטוכימיה (IHC), או 3) cryop שמור במדיום הקפאה של 1.25 מ"ל (10% דימתיל סולפוקסיד [DMSO], 40% DMEM ו 50% סרום בקר עוברי [FBS]) על ידי הקפאה איטית במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולאחר מכן העברה לחנן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

3. הכן את בעלי החיים לניתוח

לטיפול בכאב בעלי חיים, להזריק buprenorphine תת עורית שחרור מתמשך 60 דקות לפני הניתוח במינון של 1 מ"ג/ק"ג או בצע את המדריך של המוסד עבור 72 שעות של כיסוי משכך כאבים.
הקימו את הסוויטה הכירורגית בהתאם להנחיות המוסדיות לניתוחים אספטיים.
מרדים נקבה בת 4 שבועות בתא אינדוקציה של מכונת ההרדמה איזופלורן בקצב של ~ 11.25 mL / שעה. העבר את העכבר לאזור ההליך, ללוח הניתוח הסטרילי (גומי סיליקון), שם הוא יקבל הרדמה דרך מסכת פנים קטנה. שים את העכבר על גבו והדבק את הרגליים בתנוחות הטבעיות שלהם.
הערה: SCID / בז ', NSG או NRG משמשים PDX ו Balb / c משמש עבור מודלים השתלת GEMM.
יש למרוח משחה עיניים על העיניים כדי למנוע יובש.
אשר את הרמה המתאימה של סם ההפוגה על-ידי צביטת בוהן.
הערה: אין תגובה / תנועה של החיה מצביעה על כך שבעל החיים הוא מספיק מרדים ומוכן לניתוח.
לגלח את העכבר על הבטן התחתונה, במיוחד את האזור סביב הפטמה הרביעית שבו הניתוח יתקיים.
באמצעות תנועה מעגלית והחל במרכז אתר הניתוח, לעבוד לקראת הקצוות החיצוניים עם לשפשף כירורגי פוידון-יוד, ואחריו הסרת פוידון-יוד עם כרית אתנול איזופרופיל 70%. חזור על הפעולה פעמיים נוספות.

4. השתלת שברי גידול לתוך כרית השומן הממארי הרביעי (המשתנה)

השתמש בוילונות כירורגיים סטריליים כדי לכסות את הגוף של החיה למעט אתר החתך.
הערה: אשר את הרמה המתאימה של סם ההרמה על ידי צביטת בוהן לפני ביצוע ההסתה.
באמצעות מלקחיים משוננים לצבוט ולהרים את העור בפטמה #4.
עם הצד הקהה כלפי מטה, השתמש במספריים כדי להפוך קצר (כ 1 ס"מ), חתכת parasagittal, מן הפטמה #4 לכיוון הראש.
באמצעות אפליקטור כותנה קצה, להפריד את העור מן צפק בצד הממצע של החתך.
תוך כדי החזקת הצד הצדדי של החתינה, לקלף בעדינות את כרית השומן #4 mammary מהעור באמצעות אותה ספוגית.
לאחר כרית השומן מופרד, להצמיד את העור עם מחט 27 G קרוב לגוף של החיה.
אם יש צורך ניסיוני לנקות את כרית השומן של אפיתל עכבר אנדוגני לבצע את השלבים הבאים.
1. באמצעות מלקחיים משוננים, בעדינות להרחיב את כרית השומן הרחק מהגוף ולאתר את בלוטות הלימפה מפשעתית, אשר מתחת לנקודות הצומת של כלי השיט העיקריים בבלוטה (קרוב למקום שבו המלקחיים יחזיקו את הבלוטה).
2. בזהירות לצרוב את כלי החצים לבלוטות הלימפה ואת השומן מצטרף רפידות השומן הרביעי והחמישי אשר יוצר אזור משולש.
  הערה: כבה באופן זמני את מקור החמצן עבור שלב זה.
3. באמצעות מספריים מנתחים מיקרו, חותכים כל כלי צרבי אחד בכל פעם (כדי להבטיח שאין דימום לאחר כל חתך) עד להסרת החלק של כרית השומן המכילה את בלוטות הלימפה.
4. השלך את רקמת כרית השומן "המנוקה".
החזק את כרית השומן המאמרי הרביעית באמצעות מלקחיים בהפרדה קהה. עם היד השנייה, הכנס את הקצה הסגור של המלקחיים העדינים הזוויתיים לאמצע כרית השומן מעל כלי השיט הנותר וקרוב לקיר הצפק. פתחו לאט את המלקחיים כדי להכין כיס קטן. הסר את המלקחיים העדינים הזוויתיים ממשטח השומן.
בעזרת המלקחיים העדין הזוויתיים, קחו חתיכה מרסיס הגידול והכניסו אותו לכיס.
פתחו לאט את המלקחיים כדי לשחרר את שבר הגידול לכיס כרית השומן.
משוך את המלקחיים העדין הזוויתיים בזהירות.
הערה: תסתכל על הכיס כדי לאשר כי שבר הגידול נשאר בכיס של כרית השומן הממארי בעת משיכת המלקחיים. גידולים עשויים להיות מושתלים לתוך שתי רפידות שומן contralateral כאשר רקמת הגידול עודף נדרש לניסויים או בנקאות. בעלי חיים עם השתלות דו-צדדיות אינם מומלצים למחקרי טיפול בגלל אינטראקציות ידועות בין גידולים מנוגדים. לחלופין, מכשיר trocar עשוי לשמש עבור תהליך ההשתלה.
החל מבסיס החתיכה, לאסוף את העור מכל צד באמצעות הטפר ומלקחיים משוננים. מביאים את שני הצדדים יחד ומרימים מעט כדי להכין את העור ליישום קליפ הפצע. נתק את קצות ההסתעפות עם מלקחיים טופר לצבוט את הקצוות יחד כדי ליצור משטח רציף בחלק העליון.
מחזיקים את שני הצדדים יחד עם מלקחיים משוננים, להשתמש אפליקטור קליפ הפצע למקם קליפ פצע במרכז החתך. במידת הצורך, להחיל דבק רקמה על קצות החתירה על מנת לשמור אותם סגורים ומאובטחים.
מניחים את החיה בכלוב נקי שנמצא על משטח מחמם. צג אחר דימום, סימנים של דה-פשפש וכאב במהלך התקופה הפוסט-כירורגית. החיה צריכה לקום ולנוע תוך דקות ספורות.
שימו לב לאתר ההסתה והבריאות הכללית של בעלי החיים לפחות 3 ימים לאחר הניתוח. פעל בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול בכאב.
נקו את הכלים הכירורגיים במשך 10 s בחיטוי חרוזי זכוכית לפני שתמשיכו עם ההשתלה הבאה. המתן עד שהכלים יתקררו לפני השימוש.
חזור על שלבים 4.1−4.15 עד שכל העכברים מושתלים.
הערה: תוספי אסטרוגן נדרש ER⁺ גידולים, אשר ניתן לספק דרך מים או כדורי שחרור איטי⁵⁹.

5. ניטור גידול בתגובה לטיפול תרופתי

הערה: גידולים מוחשיים של PDXs מושתלים מבוססים וגידולים p53-null לוקח בין שבועיים ל 8 שבועות לפתח לאחר הניתוח, בהתאם לשיעורי גידול מהותי.

למדוד גידולים בשני ממדים באמצעות calipers פעמיים בשבוע. חשב את אמצעי האחסון באמצעות הנוסחה:
נפח הגידול (מ"מ³) = W² x L/2
כאשר W הוא רוחב ו L הוא אורך הגידול.
התחל טיפול תרופתי כאשר נפח הגידול מגיע 150−300 מ"מ³.
הערה: בהתאם לרכוש התרופות, gavage אוראלי או הזרקה תוך-איטרא-א-קואל עשוי לשמש להעברת התרופות.
לאסוף דגימות גידול ולבצע IHC כתמים⁶⁰, חלבון ובידוד RNA / DNA ופנוטיפינג חיסוני⁶¹ למטרות שונות. לאסוף דם ולבצע פנוטיפינג חיסוני או להשתמש בו למחקרים פרמקוקינטיים/פרמקודינמיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את הציוד (איור 1A) ואת ההליכים העיקריים (איור 1B) של השתלה אורתוטופית. איור 2 מראה אפיון של גידול PDX מושתל (MC1). שברי גידול (1 מ"מ³⁾של מודל MC1 הושתלו לתוך כרית השומן #4 של עכברי SCID / בז '. חודש לאחר מכן, גודל הגידול הממוצע הגיע סביב 350 מ"מ³. נפח הגידול היה במעקב פעמיים בשבוע במשך חודש אחד. בדרך כלל אנו מקבלים גידולים מוחשיים עבור PDX שונים או GEMM בסביבות שבועיים עד 8 שבועות עם 1 מ"מ³ שברי גידול מושתלים (איור 2A). ניתן לאסוף דגימות גידול עבור מורפולוגיה וניתוח איתות (איור 2B−D). הכתמת H&E בוצעה כדי לנתח את הפתולוגיה (איור 2B). IHC שימש לניטור סמנים עבור שושלת תאים ספציפית (קרטין 19 (K19), תא אפיתל, איור 2C), מצב התא (Ki67, התפשטות, איור 2D) או מולקולתאיתות של עניין.

איור 1: שרטוט המציג את טכניקת הניתוח. (א)ציוד כירורגי הנדרש להשתלה אורתוטופית. (B)תמונה מייצגת המציגה את החשיפה של כרית שומן מאמרי להשתלת תא המטען של הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אפיון הגידולים המושתלים. (א)קינטיקה מייצגת של גידול נמדד על ידי caliper. נפח הגידול (מ"מ³) = W² x L/2 (W = רוחב ו- L = אורך). (B)H&E מכתים מראה פתולוגיה של MC1 PDX. IHC מראה קרטין סמן אפיתל 19 (C) ויצרן התפשטות Ki67 (D) ב- MC1 PDX. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר, הגדלה = 40x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להפחית את הווריאציות בגידול על פני בעלי חיים, זה קריטי לחתוך את רקמת הגידול לתוך 1 מ"מ³ שברים להשתלה. מודלים המגדלים רקמות רכות קשה יותר לעבודה עם שברי הגידול צריך להיות לחתוך קצת יותר גדול (1−2 מ"מ³). בעת הצבת הרקמה בכיס כרית השומן הממארי יש להקפיד לא לפצל את הרקמה לחתיכות מרובות שכן הדבר יגרום לגידולים קטנים מרובים או גידולים בעלי צורה מוזרה.

בנוסף, יש להשתמש בגידול טרי להשתלת בעלי חיים שישמשו למחקרי טיפול תרופתי. השתלת רקמה מהקפאה תניב קצב לקיחת משתנה יותר וקינטיקה של גדילה מעט איטית יותר. ברגע שהגידולים יגדלו מהחומר ההקפאתי, דור ההשתלות השני יניב את קצב ההשתלה הטיפוסי ואת קינטיקה הצמיחה של מודל זה. יתר על כן, נסה להשתמש בגידולים ללא נמק קל או מתון להשתלה. עבור רוב הדגמים זה יהיה טווח גודל של 400−600 מ"מ³. אם נצפתה ליבה נמקית ברורה, יש להשתמש ברקמה מהשכבה החיצונית של הגידול להשתלה ולא להשתמש באזורים הנמקיים. חשוב לשמור על רקמת הגידול על הקרח ולהגן מפני ייבוש.

כדי להפחית את השונות בין נתחי הגידול מ- GEMM שייתכן שנגזרו מהפריפריה או מליבת הגידול עם מיקרו-סביבה שונה, שיטה חלופית היא להכין השעיית תאים ראשונית ולהשתיל כ-5,000−30,000 תאים בהתאם למודל הגידול לתוך כרית השומן של הממבית. עיכול קולגנאז מוגבל מתבצע עם 1 מ"ג / מ"ל סוג I collagenase ב DMEM / F12 ללא תוספים עבור 2 שעות ב 37 °C סיבוב ב 125 סל"ד. תאי גידול ממכר יכול להיות מועשר על ידי 3 צעדי צנטריפוגה קצרים. בקצרה, להעביר את השעיית התא לצינור חרוטי 15 מ"ל צנטריפוגה ב 450 x g עבור 7 s. שאפו את הסופר-נט והגדילו מחדש את הכדור ב-10 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (DPBS) של 1x Dulbecco. חזור על צנטריפוגת הדופק עוד פעמיים. פעולה זו תסייע בהבדלים אקראיים בין נתחים.

השתלה של אפיתל ממארי רגיל לא תחדש עץ דביק נורמלי ותפקודי מורפולוגית בנוכחות אפיתל עכבר אנדוגני. יש צורך להסיר את אפיתל העכבר אנדוגני (ניקוי) עבור השתלת אפיתל נורמלי לגדול⁶². עם זאת, רקמה ניאופלאסית מסוגלת לגדול אפילו בנוכחות אפיתל עכבר אנדוגני שלם. עם זאת, אין זה אומר בהכרח שאין אותות מעכבים כאלה קיימים. ניקוי כרית שומן ממירי הכרחי לפרוטוקולים ניסיוניים מסוימים כדי לאסור את האינטראקציה של אפיתל ממארי עכבר אנדוגני עם החומר החרוט. בנוסף, האפיתל האנדוגני עלול לסבך כמה ניתוח במורד הזרם כגון גנום, transcriptome וניתוח פרוטאום.

מודל PDX ו- GEMM להשתלה יכולים לשחזר בנאמנות את ההטרוגניות של תת-סוגים קליניים ואת התגובה לטיפול תרופתי בסרטן השד האנושי. חשוב לציין, מודלים אלה קל להשתיל ולשמור על פנוטיפ יציב במהלך מספר מוגבל של מעברים סדרתיים. גידול ניתן למדוד בקלות עם calipers. אזהרה אחת של מודל PDX ו GEMM להשתלה היא כי מודלים אלה אינם מסכמים צעדים מוקדמים של ייזום הגידול. כמו כן, דגמי PDX חסרים את האינטראקציה של הגידול עם מערכת חיסונית פונקציונלית. מודלים פרה-אקליניים אלה מספקים מערכת בעלת ערך לחקר ביולוגיה של סרטן השד ולהעריך את תגובת התרופה. שילוב תגובת התרופה עם המידע הגנומי והפרוטומי עבור כל מודל גידול יאפשר זיהוי סמנים ביולוגיים לחיזוי תגובה ומנגנוני עמידות לטיפול. סוגים אלה של נתונים עשויים להוביל לטיפולים ממוקדים חדשניים שניתן להשתמש בהם לבדם ובשילוב עם כימותרפיה או אימונותרפיה כדי לשפר את תוצאות המטופל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MTL הוא מייסד שותף מוגבל ב-StemMed בע"מ ומייסד ומנהל ב-StemMed Holdings, השותף הכללי שלה. MTL הוא מייסד ובעל מניות ב Tvardi Therapeutics, Inc. LED הוא עובד פיצוי של StemMed, בע"מ

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R37CA2228304 ו R01HL146642 לשי חן, CA148761 לג'פרי מ. רוזן), משרד ההגנה האמריקאי (W81XWH-19-1-0524 לשי צ'ן, W81XWH-19-1-0035 ל-Xiangdong Lv), האגודה האמריקנית לסרטן (RSG-18-181-01-TBE לשי צ'ן) והמכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (RR150009 CPRIT Scholar In Cancer Research Award ל-Xi Chen), ליבת דגמי Vivo המתקדמים של קסנוגרפט (קסנוגרפט ודגמי Vivo המתקדמים המתקדמים ביילור קולג' לרפואה) (מימון מענק מתקן הליבה של RP170691 ומענק תמיכה במרכז הסרטן NCI-CA125123 P30).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mg/mL Buprenorphine-SR	ZooPharm (via BCM veterinarians)		Sterile
26G syringe	BD	148232E	Sterile
Betadine Scrub	Fisher	19-027132
Cotton Swabs	VWR International Laboratory	89031-272	Sterile
DMEM	Fisher	MT 10-013-CM	Sterile
Electric shaver	Oster	78005-050
Glass beads sterilizer (Germinator)	Roboz Surgical Store	DS-401
Lubricant ophthalmic ointment	Akorn Animal Health	17478-062-35
Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)	Roboz Surgical Store	RS-5139	Sterile
Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)	Roboz Surgical Store	RS-5658BT	Sterile
Micro Forceps (tissue placing forceps)	Roboz Surgical Store	RS-5069	Sterile
Petri Dish	Fisher	08-757- 100D	Sterile
Sterile drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1	Sterile
Surgery scissors	Roboz Surgical Store	RS-5960	Sterile
Tissue Forceps (claw forceps)	Roboz Surgical Store	RS-5158	Sterile
Wound clip applier	BD Autoclip Wound System	01-804	Sterile
Wound clip remover	BD Autoclip Wound System	01-804-15	Sterile
Wound clips	BD Autoclip Wound System	01-804-5	Sterile