Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

زرع العظام لأورام الثدي كنماذج ما قبل السريرية لسرطان الثدي

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/61173
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 2Lester and Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 3Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX) ونماذج الماوس المعدلة وراثيا القابلة للزراعة تلخص بأمانة الأمراض البشرية وهي نماذج مفضلة لأبحاث سرطان الثدي الأساسية والترجمة. هنا، يتم وصف طريقة لزرع orthotopically شظايا ورم الثدي في لوحة الدهون الثديية لدراسة بيولوجيا الورم وتقييم الاستجابة للأدوية.

Abstract

نماذج ما قبل السريرية التي تلخص بأمانة عدم تجانس الورم والاستجابة العلاجية حاسمة لأبحاث سرطان الثدي المترجمة. خطوط الخلايا الخالدة سهلة النمو والتعديل وراثيا لدراسة الآليات الجزيئية، ومع ذلك فإن الضغط الانتقائي من زراعة الخلايا غالبا ما يؤدي إلى تغييرات وراثية ولاجينية مع مرور الوقت. نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX) تلخص بأمانة عدم التجانس والاستجابة الدوائية لأورام الثدي البشرية. نماذج PDX تظهر الكمون قصيرة نسبيا بعد زرع العظام التي تسهل التحقيق في بيولوجيا ورم الثدي والاستجابة للأدوية. تسمح نماذج الماوس المعدلة وراثيا القابلة للزراعة بدراسة مناعة ورم الثدي. يصف البروتوكول الحالي طريقة زرع شظايا ورم الثدي بشكل متعامد في وسادة الدهون الثديية تليها العلاجات الدوائية. توفر هذه النماذج قبل السريرية نهجا قيمة للتحقيق في بيولوجيا ورم الثدي والاستجابة للأدوية واكتشاف العلامات الحيوية وآليات مقاومة الأدوية.

Introduction

يمكن أن تعزى معظم وفيات سرطان الثدي إلى الأمراض المتكررة المقاومة للعلاجات التقليدية1،2. عدم التجانس بين وداخل الورم من سرطان الثدي تسهم في مقاومة العلاج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤثر عدم تجانس الورم على التشخيص الدقيق وتحدي إدارة الأمراض3،4. إن تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية للاستجابة سيحسن بشكل كبير النتائج السريرية للمرضى المصابين بسرطان الثدي. على الرغم من أن معظم أنواع سرطان الثدي هي أورام "باردة" من الناحية المناعية التي من المرجح أن لا تستجيب للعلاج المناعي ، فقد أظهرت مثبطات نقاط التفتيش المناعية وعدا في التجارب السريرية2و5. على سبيل المثال، أظهرت تجربة المرحلة الثالثة تحسن البقاء على قيد الحياة خالية من الأمراض (DFS) والأدلة الأولية على أن atezolizumab (الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضد PD-L1) جنبا إلى جنب مع nab-paclitaxel قد توفر فائدة البقاء على قيد الحياة عموما بالمقارنة مع nab-paclitaxel وحدها في الأورام مع ≥1٪ PD-L1تلطيخ 6. تطوير العلاجات التي تتحسس أورام الثدي للعلاج المناعي سوف تحدث ثورة في نظم العلاج.

النماذج قبل السريرية التي تلخص بأمانة عدم التجانس سرطان الثدي البشري والاستجابة للأدوية حاسمة لدراسة بيولوجيا الورم وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة للعلاج المستهدف. وتستخدم خطوط الخلايا الخالدة على نطاق واسع لأبحاث سرطان الثدي لأن هذه الخطوط الخلوية سهلة النمو وتعديلها وراثيا لدراسة الآليات الجزيئية. ومع ذلك، بسبب الضغط الانتقائي من زراعة الخلايا على المدى الطويل في المختبر، قد يحدث الانجراف الوراثي مع مرور الوقت وخطوط خلايا سرطان الثدي قد تحمل التغيرات الجينومية الخاصة بخط الخلية التي تختلف عن الانحرافات في أورام الثدي الأولية7و8و9.

قطع الورم المشتقة من المريض xenograft (PDX) قادرة على تلخيص عدم التجانس في المرض البشري ، وهي مشابهة من الناحية النسيجية والمناعية الكيميائية لورم المنشأ10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22 ،23،24،25،26،27،28،29. الأهم من ذلك، نماذج PDX مستقرة phenotypically عبر عمليات زرع متعددة كما يتضح من الأنسجة، transcriptome، البروتيوم والتحليل الجينومي10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22 ،23،24،25،26،27،28،29. نماذج PDX تظهر استجابات العلاج مماثلة لتلك التي لوحظتسريريا 10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24، 25،26،27،28،29. نماذج PDX لمستقبلات هرمون الاستروجين إيجابية (ER+), مستقبلات البروجسترون إيجابية (العلاقات العامة+), تم إنشاء عامل نمو البشرة 2 إيجابية (ERBB2+, HER2+) وثلاثية سلبية سرطان الثدي (TNBC) نماذج PDX, وتوفير منصة ممتازة لاختبار الغدد الصماء, العلاج الكيميائي- والعلاجات المستهدفة. ومع ذلك ، فإن أحد المحاذير الرئيسية لنماذج PDX في الوقت الحاضر هو عدم وجود جهاز مناعي وظيفي في الماوس.

نماذج الماوس المعدلة وراثيا (GEMM)، مثل Trp53 homozygous null، cMyc، Wnt1، PyMT، أو نماذج التعبير المفرط Her2، تسمح بدراسة بدء الورم التلقائي والتقدم والانبثاث في سياق نظام المناعة السليم. ومع ذلك ، فإن زمن وصول الورم طويل ، مما يجعل من الصعب إجراء تجارب ما قبل السريرية بأذرع متعددة30،31. ومع ذلك، يمكن زرع GEMM إلى المضيفين syngeneic لتوليد أعداد كافية من الأورام التي تلخص عن كثب الأورام البشرية32،33،34،35،36،37،38،39،40 ، 41،42،43،44،45، 46،47،48،49،50،51،52،53،54،55. على سبيل المثال ، تم زرع الظهارة الثديية من فأر BALB / c p53-null في منصات الدهون الخالية من الفئران المتلقية من النوع البري السينغي لتشكيل الأورام الأولية ، والتي يمكن زرعها بشكل أكبر في مضيفي syngeneic56،57. الأورام p53-null خلاصة أنواع فرعية مختلفة من الأورام البشرية.

مزيج من نماذج PDX وGEMM القابلة للزراعة يوفر أدوات قيمة قبل السريرية للتحقيق في بيولوجيا ورم الثدي، والاستجابة للأدوية والمناعة المضادة للورم. في البروتوكول الحالي ، يتم وصف طريقة زراعة العظام لشظايا ورم PDX و GEMM في لوحة الدهون الثديية الماوس. هذه النماذج قابلة للمقاطع التسلسلية وعادة ما تحتفظ بنمط الظاهري مستقرة. للتخفيف من خطر الانجراف الجيني أو فقدان التغايرية عبر الممرات مع مرور الوقت ، يتم تقديم شظايا أنسجة متعددة في كل ممر لزرعها لاحقا في حالة ملاحظة تغييرات بيولوجية أو مورفولوجية بمرور الوقت29،58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد استعرضت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها جميع البروتوكولات التي تستخدم الحيوانات ووافقت عليها. شظايا الورم، حوالي 1-2 ملم3 في الحجم، هي من المخزون المجمدة قابلة للحياة التي تم الحصول عليها من Xenograft المشتقة من المريض والمتقدمة في فيفو نماذج الأساسية في كلية بايلور للطب.

1. إعداد شظايا الورم الثديي المبرد لزرعها

  1. نقل cryovial مع شظايا الورم من النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. هياج cryovial مع نفض الغبار لطيف في بعض الأحيان أثناء ذوبان الجليد.
  3. بعد ذوبان الأنسجة، واتخاذ cryovial من حمام الماء وتخلط عن طريق عكس لطيف.
  4. تجف خارج cryovial ورذاذ مع الإيثانول 70٪. نقله إلى غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية.
  5. نقل أنسجة الورم المذاب إلى أنبوب مخروطي 15 مل مليئة 10 مل من المتوسط النسر المعدلة دولبيكو الباردة (DMEM). تخلط جيدا عن طريق عكس الأنبوب. السماح لشظايا الأنسجة لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  6. يستنشق العملاقة و resuspend في 10 مل من DMEM الباردة. تخلط جيدا عن طريق عكس الأنبوب. السماح لشظايا الأنسجة لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  7. يستنشق العملاقة و resuspend في 10 مل من DMEM الباردة. ضع الأنبوب على الثلج.
    ملاحظة: النسيج جاهز للزرع.

2. جمع وإعداد الورم الثديي الطازج لزرعه

  1. قتل الفأر الحامل لورم الثدي.
    ملاحظة: قد يكون المضيف PDX SCID / البيج، NSG أو NRG الفئران الإناث بينما في الدراسة الحالية يتم استخدام الفئران الإناث بالب / ج الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أسابيع.
  2. رش منطقة الورم من الماوس القتل الرحيم مع الإيثانول 70٪.
    ملاحظة: حاول تجنب الشعر باستخدام عينة الورم التي قد تسبب تلوث شظايا الورم للحفاظ على التبريد أو الزرع.
  3. مع ملقط مسنن لقرصة ورفع الجلد المحيطة الورم، واستخدام مقص لجعل شق قصير.
  4. فصل الورم من الجلد مع مقص لتشريح الورم كله من الماوس المضيف. تقليم قبالة أي أنسجة لوحة الدهون الماوس المتبقية من السطح الخارجي للورم. ضع الورم في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مليء ب 5 مل من DMEM البارد.
    ملاحظة: استخدم الأورام بقطر أقصاه 1 سم نظرا لأن الأورام الكبيرة من المرجح أن تحتوي على نواة نخرية.
  5. في غطاء محرك السيارة السلامة الحيوية، نقل الورم تشريح إلى طبق بيتري 10 سم معقمة تحتوي على ما يكفي من DMEM لمنع التجفيف.
  6. قطع الورم إلى 1 مم3 شظايا مع مشرط أو شفرة في ظل ظروف مطهرة.
    ملاحظة: يجب أن يتعرض المشرط أو النصل تحت الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة للسلامة الحيوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
  7. نقل شظايا الورم إلى أنبوب مخروطي 15 مل مليئة DMEM الباردة. ضع الأنبوب على الثلج.
    ملاحظة: النسيج جاهز للزرع. شظايا الورم تشريح من الخطوة 2.4 يمكن أن يكون، 1) المفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل للبروتين واستخراج الحمض النووي الريبي / الحمض النووي، 2) ثابتة مع 4٪ paraformaldehyde (PFA) أو 10٪ محايدة العازلة الفورمالين (NBF) للهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) والكيمياء المناعية (IHC) تحليل، أو 3) cryopreserved في 1.25 مل تجميد المتوسطة (10٪ ثنائي ميثيل سلفوإكسيد [DMSO]، 40٪ DMEM و 50٪ مصل البقر الجنيني [FBS]) عن طريق التجميد البطيء في ثلاجة -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها ومن ثم نقلها إلى النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.

3. إعداد الحيوان للجراحة

  1. لإدارة آلام الحيوانات، حقن تحت الجلد البوبرينورفين الإفراج المستمر 60 دقيقة قبل الجراحة بجرعة 1 ملغ / كغ أو اتبع دليل المؤسسة لمدة 72 ساعة من التغطية المسكنة.
  2. إعداد الجناح الجراحي وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لعمليات جراحية العقيم.
  3. تخدير أنثى عمرها 4 أسابيع في غرفة تعريف آلة التخدير isoflurane بمعدل ~ 11.25 مل / ساعة. نقل الماوس إلى منطقة الإجراء، على لوحة جراحة معقمة (المطاط السيليكون)، حيث أنها سوف تتلقى التخدير من خلال قناع وجه صغير. وضع الماوس على ظهره والشريط الساقين إلى أسفل في مواقعها الطبيعية.
    ملاحظة: يتم استخدام SCID / Beige أو NSG أو NRG ل PDX ويستخدم Balb/c لنماذج زراعة GEMM.
  4. تطبيق مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف.
  5. تأكيد المستوى المناسب من التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم.
    ملاحظة: لا توجد استجابة / حركة الحيوان يشير إلى أن الحيوان مخدر بما فيه الكفاية وجاهز للجراحة.
  6. حلق الماوس على أسفل البطن، وخاصة المنطقة المحيطة الحلمة الرابعة حيث ستجري الجراحة.
  7. باستخدام حركة دائرية والبدء في وسط موقع الجراحة ، والعمل نحو الحواف الخارجية مع فرك بوفيدوني اليود الجراحية ، تليها إزالة بوفيدوني اليود مع 70 ٪ ايزوبروبيل الإيثانول وسادة. كرر مرتين إضافيتين.

4. زرع شظايا الورم في الرابع (الأربي) وسادة الدهون الثديية

  1. استخدام الستائر الجراحية العقيمة لتغطية جسم الحيوان باستثناء موقع الشق.
    ملاحظة: تأكد من المستوى المناسب من التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم قبل إجراء الشق.
  2. باستخدام ملقط مسنن قرصة ورفع الجلد في الحلمة # 4.
  3. مع الجانب الحاد لأسفل ، استخدم مقصا لصنع شق قصير (حوالي 1 سم) ، من الحلمة رقم 4 نحو الرأس.
  4. باستخدام قضيب القطن يميل، فصل الجلد من الصفاق على الجانب المتوسط من الشق.
  5. أثناء الإمساك بالجانب الجانبي من الشق ، قم بتقشير وسادة الدهون الثديية رقم 4 برفق من الجلد باستخدام نفس المسحة.
  6. بمجرد فصل وسادة الدهون، دبوس أسفل الجلد مع إبرة 27 G قريبة من جسم الحيوان.
  7. إذا كان من الضروري تجريبيا لمسح لوحة الدهون من ظهارة الماوس الذاتية mammary تنفيذ الخطوات التالية.
    1. باستخدام ملقط مسننة، تمديد بلطف لوحة الدهون بعيدا عن الجسم وتحديد موقع العقدة الليمفاوية الإربية، والتي هي تحت نقاط تقاطع الأوعية الرئيسية في الغدة (على مقربة من حيث الملقط سيتم عقد الغدة).
    2. الكي بعناية الأوعية التوسط إلى العقدة الليمفاوية والدهون الانضمام إلى منصات الدهون الرابع والخامس الذي يشكل منطقة مثلثة.
      ملاحظة: إيقاف تشغيل مصدر الأكسجين مؤقتا لهذه الخطوة.
    3. باستخدام مقص تشريح صغير، وقطع كل وعاء الكي واحد في وقت واحد (لضمان عدم وجود نزيف بعد كل قطع) حتى يتم إزالة الجزء من لوحة الدهون التي تحتوي على العقدة الليمفاوية.
    4. تجاهل "تطهير" الأنسجة وسادة الدهون.
  8. عقد لوحة الدهون الثديي الرابع باستخدام ملقط الفصل حادة. مع الجانب الآخر، أدخل الطرف المغلق من ملقط غرامة الزاوية في منتصف لوحة الدهون فوق السفينة المتبقية وعلى مقربة من جدار الصفاق. فتح ملقط ببطء لجعل جيب صغير. إزالة ملقط غرامة الزاوية من لوحة الدهون.
  9. باستخدام ملقط غرامة الزاوية، واتخاذ قطعة من جزء الورم وإدراجه في الجيب.
  10. فتح ببطء نصائح ملقط للافراج عن جزء الورم في جيب وسادة الدهون.
  11. سحب ملقط غرامة الزاوية بعناية.
    ملاحظة: انظر إلى الجيب للتأكد من أن جزء الورم لا يزال في جيب وسادة الدهون الثديية عند سحب ملقط. قد يتم زرع الأورام في كل من منصات الدهون العكسية عندما تكون هناك حاجة إلى أنسجة الورم الزائد للتجارب أو الخدمات المصرفية. لا ينصح بالحيوانات التي تقوم بزراعة الأعضاء على الوجهين لدراسات العلاج بسبب التفاعلات المعروفة بين الأورام المضادة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام جهاز تروكار لعملية الزرع.
  12. بدءا من قاعدة الشق، وجمع الجلد على كل جانب باستخدام مخلب والملقط مسننة. جلب الجانبين معا ورفع قليلا لإعداد الجلد لتطبيق مقطع الجرح. فك حواف الشق مع ملقط مخلب وقرصة حواف معا لتشكيل سطح مستمر في الجزء العلوي.
  13. عقد الجانبين جنبا إلى جنب مع ملقط مسننة، واستخدام قضيب مقطع الجرح لوضع مقطع الجرح في وسط الشق. إذا لزم الأمر، وتطبيق لاصقة الأنسجة إلى نهايات الشق من أجل الاحتفاظ بها مغلقة ومؤمنة.
  14. ضع الحيوان في قفص نظيف على سطح دافئ. مراقبة النزيف وعلامات التعفن والألم خلال فترة ما بعد الجراحة. يجب أن يكون الحيوان فوق ويتحرك في غضون دقائق الجراحة.
  15. إيلاء اهتمام وثيق لموقع شق والصحة العامة للحيوانات لمدة 3 أيام على الأقل بعد الجراحة. اتبع الإرشادات المؤسسية لإدارة الألم.
  16. تنظيف الأدوات الجراحية لمدة 10 ق في تعقيم الخرز الزجاجي قبل الاستمرار في عملية الزرع التالية. انتظر حتى تهدأ الأدوات قبل الاستخدام.
  17. كرر الخطوات 4.1-4.15 حتى يتم زرع جميع الفئران.
    ملاحظة: مطلوب مكملات الإستروجين ل ER+ الأورام, التي يمكن توفيرها من خلال الماء أو بطء إطلاق الكريات59.

5. رصد نمو الورم استجابة للعلاج الدوائي

ملاحظة: الأورام واضح من PDXs زرع المنشأة و P53-null الأورام يستغرق ما بين 2 أسابيع و 8 أسابيع لتطوير بعد الجراحة, اعتمادا على معدلات نمو الورم الجوهري.

  1. قياس الأورام في بعدين باستخدام الفرجار مرتين في الأسبوع. حساب مستوى الصوت باستخدام الصيغة:
    حجم الورم (مم3) = W2 × L/2
    حيث W هو العرض وL هو طول الورم.
  2. ابدأ العلاج الدوائي عندما يصل حجم الورم إلى 150−300 مم3.
    ملاحظة: اعتمادا على خاصية المخدرات، يمكن استخدام الغافاج الفموي أو الحقن داخل الصفاق لتسليم الأدوية.
  3. جمع عينات الورم وإجراء IHCتلطيخ 60والبروتين والحمض النووي الريبي / عزلة الفينوتيبينج المناعي61 لأغراض مختلفة. جمع الدم وأداء phenotyping المناعي أو استخدامه للدراسات الدوائية / الدوائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 المعدات(الشكل 1أ)والإجراءات الرئيسية(الشكل 1باء)لزرع العظام. يوضح الشكل 2 توصيف ورم PDX المزروع (MC1). تم زرع شظايا الورم (1 مم3)من نموذج MC1 في وسادة الدهون رقم 4 من الفئران SCID / Beige. بعد شهر واحد، وصل متوسط حجم الورم حوالي 350 مم3. تم رصد حجم الورم مرتين في الأسبوع لمدة شهر واحد. عادة نحصل على أورام واضحة لمختلف PDX أو GEMM في حوالي 2 أسابيع إلى 8 أسابيع مع 1 مم3 شظايا الورم المزروعة(الشكل 2A). يمكن جمع عينات الورم لتحليل المورفولوجيا والإشارات(الشكل 2B−D). تم إجراء تلطيخ H &؛ E لتحليل علم الأمراض (الشكل 2B). تم استخدام IHC لرصد علامات النسب الخلية محددة (الكيراتين 19 (K19)، الخلية الظهارية، الشكل 2C)،حالة الخلية (Ki67، الانتشار، الشكل 2D)أو جزيء إشارة من الفائدة.

Figure 1
الشكل 1: تخطيطي يوضح تقنية الجراحة. أ)المعدات الجراحية اللازمة لزرع العظام. (ب) صورة تمثيلية تظهر تعرض وسادة الدهون الثديية لزرع جذع الورم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توصيف الأورام المزروعة. (أ)الحركية التمثيلية لنمو الورم التي تقاس بالفرجار. حجم الورم (مم3) = W2 × L/2 (W = العرض وL = الطول). (ب) H &؛ E تلطيخ تظهر علم الأمراض من MC1 PDX. IHC تظهر علامة الظهارية الكيراتين 19 (C) وصانع الانتشار Ki67 (D) في MC1 PDX. شريط المقياس = 20 ميكرومتر، التكبير = 40x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

للحد من الاختلافات في نمو الورم عبر الحيوانات، من المهم قطع أنسجة الورم إلى 1 مم3 شظايا لزرعها. النماذج التي تنمو الأنسجة الرخوة من الصعب العمل مع وشظايا الورم تحتاج إلى قطع أكبر قليلا (1-2 مم3). عند وضع الأنسجة في جيب وسادة الدهون الثديية الحرص على عدم تقسيم الأنسجة إلى قطع متعددة لأن هذا سيؤدي إلى أورام صغيرة متعددة أو أورام على شكل غريب.

بالإضافة إلى ذلك، استخدم الورم الطازج لزرع الحيوانات التي سيتم استخدامها لدراسات العلاج الدوائي. زرع الأنسجة من التبريد سوف تسفر عن معدل اتخاذ أكثر متغير وحركية النمو أبطأ قليلا. بمجرد أن تنمو الأورام من المواد المبردة ، فإن الجيل الثاني من زرع الأعضاء سوف ينتج معدل الأخذ النموذجي وحركية النمو لهذا النموذج. وعلاوة على ذلك، في محاولة لاستخدام الأورام مع عدم وجود أو نخر خفيف لزرع. بالنسبة لمعظم الموديلات، سيكون نطاق حجمها 400−600 مم3. إذا لوحظ نواة نخرية واضحة، استخدم الأنسجة من الطبقة الخارجية للورم لزرعها ولا تستخدم المناطق النخرية. من المهم الحفاظ على نسيج الورم على الجليد والحماية من التجفيف.

للحد من التباين بين قطع الورم من GEMM التي قد تكون مشتقة من المحيط أو نواة الورم مع بيئة دقيقة مختلفة ، فإن الطريقة البديلة هي إعداد تعليق الخلية الأولية وزرع ما يقرب من 5000-30000 خلية اعتمادا على نموذج الورم في وسادة الدهون الثديية. يتم الهضم الكولاجينز محدودة مع 1 ملغ / مل نوع I collagenase في DMEM/F12 دون أي إضافات لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية بالتناوب في 125 دورة في الدقيقة. يمكن إثراء خلايا الورم الثديي من خلال 3 خطوات قصيرة للطرد المركزي. لفترة وجيزة، نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 450 × ز لمدة 7 ق. أسبيرات supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 10 مل من 1x الفوسفات دولبيكو المالحة المخزنة (DPBS). كرر جهاز الطرد المركزي نبض مرتين أخريين. وهذا سوف يساعد على عشوائيا الاختلافات بين القطع.

زرع ظهارة الثدي العادي لن تجديد شجرة مجاري طبيعية بشكل شكلي وظيفي في وجود ظهارة الماوس الذاتية. من الضروري إزالة ظهارة الماوس الذاتية (المقاصة) لزراعة الظهارة الطبيعية لتنمو62. ومع ذلك ، فإن الأنسجة البلاستيكية الجديدة قادرة على النمو حتى في وجود ظهارة فأرة داخلية سليمة. ومع ذلك، فإن هذا لا يعني بالضرورة عدم وجود مثل هذه الإشارات المثبطة. Mammary إزالة وسادة الدهون ضروري لبعض البروتوكولات التجريبية لحظر التفاعل بين ظهارة الماوس الذاتية mammary مع المواد المحمر. بالإضافة إلى ذلك ، قد تعقد الظهارة الذاتية بعض التحليلات المصبية مثل تحليل الجينوم والنسخ والبروتيوم.

يمكن لنموذج PDX وGEMM القابل للزراعة أن يلخص بأمانة عدم التجانس في الأنواع الفرعية السريرية والاستجابة للعلاج الدوائي لسرطان الثدي البشري. الأهم من ذلك، هذه النماذج من السهل زرع والحفاظ على النمط الظاهري مستقرة خلال عدد محدود من الممرات التسلسلية. يمكن قياس نمو الورم بسهولة مع الفرجار. تحذير واحد من نموذج PDX وGEMM القابلة للزراعة هو أن هذه النماذج لا تلخص الخطوات المبكرة لبدء الورم. أيضا، تفتقر نماذج PDX إلى تفاعل الورم مع جهاز المناعة الوظيفي. توفر هذه النماذج قبل السريرية نظاما قيما لدراسة بيولوجيا سرطان الثدي وتقييم الاستجابة للأدوية. ومن شأن الجمع بين الاستجابة للأدوية والمعلومات الجينومية والبروتيوميكية لكل نموذج ورم أن يسهل تحديد المؤشرات الحيوية للتنبؤ بالاستجابة وآليات مقاومة العلاج. قد تؤدي هذه الأنواع من البيانات إلى علاجات جديدة مستهدفة يمكن استخدامها بمفردها وبالاقتران مع العلاج الكيميائي أو العلاج المناعي لتحسين نتائج المرضى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MTL هو مؤسس شريك محدود في StemMed المحدودة ومؤسس ومدير في StemMed القابضة، شريكها العام. MTL هو مؤسس وصاحب الأسهم في Tvardi العلاجية، وشركة LED هو موظف تعويض من StemMed، المحدودة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (R37CA228304 وR01HL146642 إلى شي تشن، CA148761 إلى جيفري م. روزين)، وزارة الدفاع الأمريكية (W81XWH-19-1-0524 إلى شي تشن، W81XWH-19-1-0035 إلى شيانغدونغ لف)، وجمعية السرطان الأمريكية (RSG-18-181-01-TBE إلى شي تشن) ومعهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (RR150009 CPRIT الباحث في جائزة أبحاث السرطان لشي تشن)، وXenograft المستمدة من المريض والمتقدمة في نماذج فيفو الأساسية في كلية بايلور للطب (التمويل من RP170691 CPRIT جائزة مرفق الأساسية وNCI-CA125123 P30 منحة دعم مركز السرطان).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mg/mL Buprenorphine-SR ZooPharm (via BCM veterinarians) Sterile
26G syringe BD 148232E Sterile
Betadine Scrub Fisher 19-027132
Cotton Swabs VWR International Laboratory 89031-272 Sterile
DMEM Fisher MT 10-013-CM Sterile
Electric shaver Oster 78005-050
Glass beads sterilizer (Germinator) Roboz Surgical Store DS-401
Lubricant ophthalmic ointment Akorn Animal Health 17478-062-35
Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) Roboz Surgical Store RS-5139 Sterile
Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) Roboz Surgical Store RS-5658BT Sterile
Micro Forceps (tissue placing forceps) Roboz Surgical Store RS-5069 Sterile
Petri Dish Fisher 08-757- 100D Sterile
Sterile drape Sai Infusion Technology PSS-SD1 Sterile
Surgery scissors Roboz Surgical Store RS-5960 Sterile
Tissue Forceps (claw forceps) Roboz Surgical Store RS-5158 Sterile
Wound clip applier BD Autoclip Wound System 01-804 Sterile
Wound clip remover BD Autoclip Wound System 01-804-15 Sterile
Wound clips BD Autoclip Wound System 01-804-5 Sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
  2. Harbeck, N., et al. Breast cancer. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 66 (2019).
  3. Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C. Personalized treatment of early-stage breast cancer: present concepts and future directions. Cancer Treatment Reviews. 36 (8), 584-594 (2010).
  4. Zardavas, D., Irrthum, A., Swanton, C., Piccart, M. Clinical management of breast cancer heterogeneity. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (7), 381 (2015).
  5. Esteva, F. J., Hubbard-Lucey, V. M., Tang, J., Pusztai, L. Immunotherapy and targeted therapy combinations in metastatic breast cancer. The Lancet Oncology. 20 (3), e175-e186 (2019).
  6. Schmid, P., et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. New England Journal of Medicine. 379 (22), 2108-2121 (2018).
  7. Tsuji, K., et al. Breast cancer cell lines carry cell line-specific genomic alterations that are distinct from aberrations in breast cancer tissues: comparison of the CGH profiles between cancer cell lines and primary cancer tissues. BMC Cancer. 10 (1), 15 (2010).
  8. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  9. Clarke, R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer-the immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Research and Treatment. 39 (1), 69-86 (1996).
  10. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514 (2011).
  11. Kuperwasser, C., et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America. 101 (14), 4966-4971 (2004).
  12. Vaillant, F., et al. Targeting BCL-2 with the BH3 mimetic ABT-199 in estrogen receptor-positive breast cancer. Cancer Cell. 24 (1), 120-129 (2013).
  13. Li, S., et al. Endocrine-therapy-resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast-cancer-derived xenografts. Cell Reports. 4 (6), 1116-1130 (2013).
  14. DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Current Protocols in Pharmacology. 60 (1), 14.23.11-14.23.43 (2013).
  15. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  16. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
  17. Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Research. 16 (2), R36 (2014).
  18. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118 (2007).
  19. Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: Influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. International Journal of Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
  20. Sebesteny, A., et al. Primary human breast carcinomas transplantable in the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 63 (6), 1331-1337 (1979).
  21. Sakakibara, T., et al. Growth and metastasis of surgical specimens of human breast carcinomas in SCID mice. The Cancer Journal from Scientific American. 2 (5), 291-300 (1996).
  22. Rae-Venter, B., Reid, L. M. Growth of human breast carcinomas in nude mice and subsequent establishment in tissue culture. Cancer Research. 40 (1), 95-100 (1980).
  23. Outzen, H., Custer, R. Brief communication: Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 55 (6), 1461-1466 (1975).
  24. Noël, A., et al. Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nude mice. Anticancer Research. 15 (1), 1-7 (1995).
  25. Naundorf, H., Fichtner, I., Büttner, B., Frege, J. Establishment and characterization of a new human oestradiol-and progesterone-receptor-positive mammary carcinoma serially transplantable in nude mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 119 (1), 35-40 (1992).
  26. Murthy, M. S., Scanlon, E. F., Jelachich, M. L., Klipstein, S., Goldschmidt, R. A. Growth and metastasis of human breast cancers in athymic nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 13 (1), 3-15 (1995).
  27. Fichtner, I., Becker, M., Zeisig, R., Sommer, A. In vivo models for endocrine-dependent breast carcinomas: special considerations of clinical relevance. European Journal of Cancer. 40 (6), 845-851 (2004).
  28. Ding, L., et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft. Nature. 464 (7291), 999 (2010).
  29. Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73 (15), 4885-4897 (2013).
  30. Borowsky, A. D. Choosing a mouse model: experimental biology in context-the utility and limitations of mouse models of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a009670 (2011).
  31. Caligiuri, I., Rizzolio, F., Boffo, S., Giordano, A., Toffoli, G. Critical choices for modeling breast cancer in transgenic mouse models. Journal of Cellular Physiology. 227 (8), 2988-2991 (2012).
  32. Backlund, M. G., et al. Impact of ionizing radiation and genetic background on mammary tumorigenesis in p53-deficient mice. Cancer Research. 61 (17), 6577-6582 (2001).
  33. Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052-1058 (2000).
  34. Hüsler, M. R., et al. Lactation-induced WAP-SV40 Tag transgene expression in C57BL/6J mice leads to mammary carcinoma. Transgenic Research. 7 (4), 253-263 (1998).
  35. Simin, K., et al. pRb inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and progression in divergent epithelia. PLoS Biology. 2 (2), e22 (2004).
  36. Sandgren, E. P., et al. Inhibition of mammary gland involution is associated with transforming growth factor α but not c-myc-induced tumorigenesis in transgenic mice. Cancer Research. 55 (17), 3915-3927 (1995).
  37. Gallahan, D., et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis. Cancer Research. 56 (8), 1775-1785 (1996).
  38. Tsukamoto, A. S., Grosschedl, R., Guzman, R. C., Parslow, T., Varmus, H. E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell. 55 (4), 619-625 (1988).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Guy, C. T., et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22), 10578-10582 (1992).
  41. Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37 (1999).
  42. Maroulakou, I. G., Anver, M., Garrett, L., Green, J. E. Prostate and mammary adenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor antigen fusion gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (23), 11236-11240 (1994).
  43. Yin, Y., et al. Characterization of medroxyprogesterone and DMBA-induced multilineage mammary tumors by gene expression profiling. Molecular Carcinogenesis. 44 (1), 42-50 (2005).
  44. Cressman, V. L., et al. Mammary tumor formation in p53-and BRCA1-deficient mice. Cell Growth and Differentiation-Publication American Association for Cancer Research. 10 (1), 1-10 (1999).
  45. Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
  46. Pond, A. C., et al. Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer. Cancer Research. 70 (12), 4868-4879 (2010).
  47. Sinn, E., et al. Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: synergistic action of oncogenes in vivo. Cell. 49 (4), 465-475 (1987).
  48. Muller, W. J., et al. The int-2 gene product acts as an epithelial growth factor in transgenic mice. The EMBO Journal. 9 (3), 907-913 (1990).
  49. Liu, S., et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell. 15 (6), 539-550 (2009).
  50. Torres-Arzayus, M. I., et al. High tumor incidence and activation of the PI3K/AKT pathway in transgenic mice define AIB1 as an oncogene. Cancer Cell. 6 (3), 263-274 (2004).
  51. Chan, S. R., et al. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas. Breast Cancer Research. 14 (1), R16 (2012).
  52. Jiang, Z., et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3296-3309 (2010).
  53. Adams, J. R., et al. Cooperation between Pik3ca and p53 mutations in mouse mammary tumor formation. Cancer Research. 71 (7), 2706-2717 (2011).
  54. Pei, X. H., et al. CDK inhibitor p18INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis. Cancer Cell. 15 (5), 389-401 (2009).
  55. Bultman, S., et al. Characterization of mammary tumors from Brg1 heterozygous mice. Oncogene. 27 (4), 460 (2008).
  56. Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052 (2000).
  57. Zhang, M., et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Cancer Research. 68 (12), 4674-4682 (2008).
  58. Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Research. 15 (1), 201 (2013).
  59. Zhang, X., Lewis, M. T. Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models of Human Breast Cancer. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (1), 21-29 (2013).
  60. Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of Visualized Experiments. (8), e308 (2007).
  61. Zhao, N., et al. Pharmacological targeting of MYC-regulated IRE1/XBP1 pathway suppresses MYC-driven breast cancer. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1283-1299 (2018).
  62. DeOme, K., Faulkin, L., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Research. 19 (5), 515 (1959).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 159، سرطان الثدي، نموذج ما قبل السريرية، زرع وسادة الدهون الثديية، بيولوجيا الورم، الاستجابة للأدوية، العلامة الحيوية
زرع العظام لأورام الثدي كنماذج ما قبل السريرية لسرطان الثدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lv, X., Dobrolecki, L. E., Ding, Y., … More

Lv, X., Dobrolecki, L. E., Ding, Y., Rosen, J. M., Lewis, M. T., Chen, X. Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer. J. Vis. Exp. (159), e61173, doi:10.3791/61173 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter