Summary
Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.
Abstract
Präklinische Modelle, die Tumorheterogenität und therapeutisches Ansprechen originalgetreu rekapitulieren, sind für die translationale Brustkrebsforschung von entscheidender Bedeutung. Immortalisierte Zelllinien sind leicht zu züchten und genetisch zu modifizieren, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, aber der selektive Druck der Zellkultur führt im Laufe der Zeit oft zu genetischen und epigenetischen Veränderungen. Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) rekapitulieren die Heterogenität und Arzneimittelreaktion menschlicher Brusttumoren originalgetreu. PDX-Modelle weisen eine relativ kurze Latenz nach orthotopischer Transplantation auf, die die Untersuchung der Brusttumorbiologie und des Arzneimittelverhaltens erleichtert. Die transplantierbaren gentechnisch veränderten Mausmodelle ermöglichen die Untersuchung der Immunität von Brusttumoren. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Methode, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, gefolgt von medikamentösen Behandlungen. Diese präklinischen Modelle bieten wertvolle Ansätze zur Untersuchung der Brusttumorbiologie, der Arzneimittelreaktion, der Biomarkerentdeckung und der Mechanismen der Arzneimittelresistenz.
Introduction
Die meisten Brustkrebstodesfälle können auf wiederkehrende Erkrankungen zurückgeführt werden, die gegen konventionelle Therapien resistent sind1,2. Die Inter- und Intratumorheterogenität von Brustkrebserkrankungen trägt zur Therapieresistenz bei. Darüber hinaus kann tumorheterogenität die genaue Prognose beeinträchtigt und das Krankheitsmanagement herausfordern3,4. Die Identifizierung prädiktiver Biomarker für das Ansprechen wird die klinischen Ergebnisse von Patientinnen mit Brustkrebs signifikant verbessern. Obwohl die meisten Brustkrebsarten immunologisch "kalte" Tumoren sind, die wahrscheinlich nicht auf eine Immuntherapie ansprechen, haben sich Immun-Checkpoint-Inhibitoren in klinischen Studienals vielversprechend erwiesen 2,5. Zum Beispiel zeigte eine Phase-III-Studie ein verbessertes krankheitsfreies Überleben (DFS) und vorläufige Beweise, dass Atezolizumab (monoklonaler Antikörper gegen PD-L1) in Kombination mit nab-Paclitaxel einen Gesamtüberlebensvorteil im Vergleich zu nab-Paclitaxel allein bei Tumoren mit ≥1% PD-L1-Färbung bieten kann6. Die Entwicklung von Therapien, die Brusttumoren für eine Immuntherapie sensibilisieren, wird die Behandlungsschemata revolutionieren.
Präklinische Modelle, die die Heterogenität und das Ansprechen von Brustkrebs beim Menschen originalgetreu rekapitulieren, sind entscheidend für die Untersuchung der Tumorbiologie und die Identifizierung potenzieller Biomarker für eine gezielte Therapie. Immortalisierte Zelllinien werden häufig für die Brustkrebsforschung verwendet, da diese Zelllinien leicht zu züchten und genetisch verändert sind, um molekulare Mechanismen zu untersuchen. Aufgrund des selektiven Drucks durch langfristige Zellkultur in vitro kann es jedoch im Laufe der Zeit zu genetischer Drift kommen und Brustkrebszelllinien können zelllinienspezifische genomische Veränderungen tragen, die sich von Aberrationen in primären Brusttumoren unterscheiden7,8,9.
Patienten-abgeleitete Xenograft (PDX) Tumorblöcke sind in der Lage, die Heterogenität der menschlichen Krankheit zu rekapitulieren, und sind histologisch und immunhistochemisch dem Tumor des Ursprungs10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Wichtig ist, dass PDX-Modelle phänotypisch stabil über mehrere Transplantationen hinweg sind, wie histologische, transkriptom-, Proteom- und genomische Analysenbelegen 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. PDX-Modelle zeigen Behandlungsreaktionen, die mit denen vergleichbarsind,die klinisch beobachtet wurden10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. PDX-Modelle für Östrogenrezeptor-positive (ER+),Progesteronrezeptor-positive (PR+),epidermale Wachstumsfaktor-2-positive (ERBB2+,HER2+)und dreifach negative Brustkrebs (TNBC) PDX-Modelle wurden etabliert und bieten eine hervorragende Plattform, um endokrine, chemo- und zielgerichtete Therapien zu testen. Ein Hauptvorbehalt der PDX-Modelle ist derzeit jedoch das Fehlen eines funktionierenden Immunsystems in der Maus.
Die gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEMM), wie Trp53 homozygote Null-, cMyc-, Wnt1-, PyMT- oder Her2-Überexpressionsmodelle, erlauben die Untersuchung spontaner Tumorinitiation, -progression und -metastasierung im Kontext eines intakten Immunsystems. Die Tumorlatenz ist jedoch lang, was es schwierig macht, präklinische Studien mit mehreren Armendurchzuführen 30,31. GEMM kann jedoch auf syngene Wirte transplantiert werden, um eine ausreichende Anzahl von Tumoren zu erzeugen, die die menschlichen Tumoren32,33,34 ,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Zum Beispiel wurde das Brustepithel einer p53-Null-BALB / c-Maus in die gereinigten Fettpolster syngener Wildtyp-Empfängermäuse transplantiert, um Primärtumoren zu bilden, die weiter in syngene Wirte transplantiert werden können56,57. Die p53-Null-Tumoren rekapitulierten verschiedene Subtypen menschlicher Tumoren.
Die Kombination von PDX-Modellen und transplantierbarem GEMM bietet wertvolle präklinische Werkzeuge zur Untersuchung der Brusttumorbiologie, der Arzneimittelreaktion und der Antitumorimmunität. Im aktuellen Protokoll wird eine Methode der orthotopen Transplantation von PDX- und GEMM-Tumorfragmenten in das Brustfettpolster der Maus beschrieben. Diese Modelle sind für serielle Passagen geeignet und behalten in der Regel einen stabilen Phänotyp. Um das Risiko einer genetischen Drift oder eines Verlustes der Heterogenität über Passagen im Laufe der Zeit zu verringern, werden an jeder Passage mehrere Gewebefragmente für die anschließende Transplantation kryokonserviert, falls im Laufe der Zeit biologische oder morphologische Veränderungen beobachtet werden29,58.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Protokolle, in denen Tiere verwendet werden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) überprüft und genehmigt. Die Tumorfragmente, etwa 1-2 mm3 groß, stammen aus lebensgefrorenen Beständen, die aus dem patientenabgeleiteten Xenograft und Advanced In Vivo Models Core am Baylor College of Medicine gewonnen wurden.
1. Herstellung von kryokonservierten Brusttumorfragmenten für die Transplantation
- Übertragen Sie das Kryovial mit Tumorfragmenten von flüssigem Stickstoff in ein 37 °C wasserhaltiges Bad.
- Rühren Sie das Kryovial mit einem gelegentlichen sanften Schlag während des Auftauens.
- Nachdem das Gewebe aufgetaut ist, nehmen Sie das Kryovial aus dem Wasserbad und mischen Sie es durch sanfte Inversion.
- Trocknen Sie die Außenseite des Kryovials ab und sprühen Sie es mit 70% Ethanol. Übertragen Sie es auf eine Biosicherheitshaube.
- Übertragen Sie das aufgetaute Tumorgewebe in ein 15-ml-konisches Röhrchen, das mit 10 ml kaltem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gefüllt ist. Mischen Sie gut, indem Sie das Rohr umkehren. Lassen Sie die Gewebefragmente sich am Boden der Röhre absetzen.
- Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie in 10 ml kaltem DMEM. Mischen Sie gut, indem Sie das Rohr umkehren. Lassen Sie die Gewebefragmente sich am Boden der Röhre absetzen.
- Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie in 10 ml kaltem DMEM. Legen Sie die Röhre auf Eis.
HINWEIS: Das Gewebe ist bereit für die Transplantation.
2. Sammlung und Vorbereitung von frischem Brusttumor für die Transplantation
- Euthanisieren Sie die Brusttumor tragende Maus.
HINWEIS: PDX-Wirt können SCID/Beige-, NSG- oder NRG-weibliche Mäuse sein, während in der aktuellen Studie weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 3-5 Wochen verwendet werden. - Besprühen Sie die Tumorregion der eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol.
HINWEIS: Versuchen Sie, Haare mit der Tumorprobe zu vermeiden, die eine Kontamination von Tumorfragmenten für Kryolager oder Transplantation verursachen könnten. - Mit gezackten Zinnen, um die Haut, die den Tumor umgibt, zu kneifen und anzuheben, verwenden Sie eine Schere, um einen kurzen Schnitt zu machen.
- Trennen Sie den Tumor mit der Schere von der Haut, um den gesamten Tumor von der Wirtsmaus zu sezieren. Schneiden Sie das verbleibende Mausfettpolstergewebe von der äußeren Oberfläche des Tumors ab. Legen Sie den Tumor in ein 15 ml konisches Röhrchen, das mit 5 ml kaltem DMEM gefüllt ist.
HINWEIS: Verwenden Sie Tumore mit einer maximalen Größe von 1 cm Durchmesser, da größere Tumore wahrscheinlich nekrotische Kerne enthalten. - In einer Biosicherheitshaube den sezierten Tumor in eine sterile 10 cm Petrischale geben, die genügend DMEM enthält, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Schneiden Sie den Tumor in 1 mm3 Fragmente mit Skalpell oder Klinge unter aseptischen Bedingungen.
HINWEIS: Das Skalpell oder die Klinge sollte vor Gebrauch mindestens 20 Minuten lang in der Biosicherheitshaube unter UV-Strahlen ausgesetzt werden. - Übertragen Sie die Tumorfragmente in ein 15 ml konisches Röhrchen, das mit kaltem DMEM gefüllt ist. Legen Sie die Röhre auf Eis.
HINWEIS: Das Gewebe ist bereit für die Transplantation. Die sezierten Tumorfragmente aus Schritt 2.4 können 1) in flüssigem Stickstoff für die Protein- und RNA/DNA-Extraktion eingefroren, 2) mit 4% Paraformaldehyd (PFA) oder 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) für hämatoxylin und Eosin (H&E) und immunhistochemische (IHC) Analyse fixiert oder 3) in 1,25 mL Gefriermedium (10% Dimethylsulfoxid [DMSO] kryokonserviert werden, 40% DMEM und 50% fetales Rinderserum [FBS]) durch langsames Einfrieren in einem -80 °C Gefrierfach über Nacht und anschließender Übertragung auf flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung.
3. Tier auf die Operation vorbereiten
- Zur Schmerzbehandlung bei Tieren, subkutan Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung 60 Minuten vor der Operation in einer Dosis von 1 mg / kg injizieren oder befolgen Sie den Leitfaden der Institution für 72 Stunden Analgetikum.
- Richten Sie den Operationssaal nach institutionellen Richtlinien für aseptische Operationen ein.
- Betäuben Sie eine 4 Wochen alte Frau in einer Induktionskammer des Isofluran-Anästhesiegeräts mit einer Geschwindigkeit von ~ 11,25 ml / h. Übertragen Sie die Maus in den Eingriffsbereich, auf die sterile (Silikonkautschuk) Operationsplatte, wo sie durch eine kleine Gesichtsmaske betäubt wird. Legen Sie die Maus auf den Rücken und kleben Sie die Beine in ihren natürlichen Positionen ab.
HINWEIS: SCID/Beige, NSG oder NRG werden für PDX und Balb/c für GEMM-Transplantationsmodelle verwendet. - Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
- Bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zehenklemmen.
HINWEIS: Keine Reaktion/Bewegung des Tieres deutet darauf hin, dass das Tier ausreichend betäubt und bereit für die Operation ist. - Rasieren Sie die Maus am Unterbauch, insbesondere an der Region um die vierte Brustwarze, in der die Operation stattfinden wird.
- Arbeiten Sie mit einer kreisförmigen Bewegung und beginnen Sie in der Mitte der Operationsstelle mit einem chirurgischen Povidon-Jod-Peeling zu den äußeren Rändern, gefolgt von der Entfernung von Povidon-Jod mit einem 70% igen Isopropyl-Ethanol-Pad. Wiederholen Sie zwei weitere Male.
4. Transplantation von Tumorfragmenten in das vierte (leistenale) Brustfettpolster
- Verwenden Sie einen sterilen chirurgischen Vorhang, um den Körper des Tieres mit Ausnahme der Schnittstelle zu bedecken.
HINWEIS: Bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zehenklemmen, bevor Sie den Schnitt machen. - Mit gezackter Zette die Haut an der Brustwarze Nr. 4 zusammendrücken und anheben.
- Mit der stumpfen Seite nach unten, verwenden Sie eine Schere, um einen kurzen (ca. 1 cm), parasagittalen Schnitt von der Brustwarze Nr. 4 in Richtung Kopf zu machen.
- Trennen Sie mit einem Applikator mit Baumwollspitze die Haut vom Peritoneum auf der medialen Seite des Schnitts.
- Während Sie die seitliche Seite des Schnitts halten, schälen Sie das Brustfettpolster Nr. 4 vorsichtig mit demselben Tupfer von der Haut.
- Sobald das Fettpolster getrennt ist, fixieren Sie die Haut mit einer 27 G-Nadel in der Nähe des Körpers des Tieres.
- Wenn es experimentell notwendig ist, das Fettpolster des endogenen Maus-Brustepithels zu befreien, führen Sie die folgenden Schritte durch.
- Mit der gezackten Zette das Fettpolster vorsichtig vom Körper wegstrecken und den Leistenlymphknoten lokalisieren, der sich unter den Schnittpunkten der Hauptgefäße in der Drüse befindet (in der Nähe der Stelle, an der die Zette die Drüse hält).
- Kauterisieren Sie vorsichtig die Gefäße medial zum Lymphknoten und das Fett, das das vierte und fünfte Fettpolster bildet, das einen dreieckigen Bereich bildet.
HINWEIS: Schalten Sie die Sauerstoffquelle für diesen Schritt vorübergehend aus. - Schneiden Sie mit einer Mikrodynezierungsschere jedes kauterisierte Gefäß einzeln ab (um sicherzustellen, dass nach jedem Schnitt keine Blutungen auftreten), bis der Abschnitt des Fettpolsters, der den Lymphknoten enthält, entfernt ist.
- Entsorgen Sie das "gereinigte" Fettpolstergewebe.
- Halten Sie das vierte Brustfettpolster mit einer stumpfen Trennzette. Mit der anderen Hand die geschlossene Spitze der abgewinkelten Feinzette in die Mitte des Fettpolsters über dem verbleibenden Gefäß und nahe an der Wand des Peritoneums einführen. Öffnen Sie langsam die Zette, um eine kleine Tasche zu machen. Entfernen Sie die abgewinkelte feine Zette aus dem Fettpolster.
- Nehmen Sie mit der abgewinkelten feinen Zette ein Stück Tumorfragment und führen Sie es in die Tasche ein.
- Öffnen Sie langsam die Zettenspitzen, um das Tumorfragment in die Fettpolstertasche freizusetzen.
- Ziehen Sie die abgewinkelte feine Truppe vorsichtig zurück.
HINWEIS: Schauen Sie sich die Tasche an, um zu bestätigen, dass das Tumorfragment in der Tasche des Brustfettpolsters verbleibt, wenn Sie die Zette zurückziehen. Tumore können in beide kontralateralen Fettpolster implantiert werden, wenn überschüssiges Tumorgewebe für Experimente oder Banking benötigt wird. Tiere mit doppelseitigen Transplantationen werden wegen bekannter Wechselwirkungen zwischen kontralateralen Tumoren nicht für Behandlungsstudien empfohlen. Alternativ kann ein Trokargerät für den Implantationsprozess verwendet werden. - Ausgehend von der Basis des Schnitts die Haut auf jeder Seite mit der Klaue und der gezackten Zette sammeln. Bringen Sie die beiden Seiten zusammen und heben Sie sie leicht an, um die Haut auf die Anwendung des Wundclips vorzubereiten. Entkrümmen Sie die Kanten des Einschnitts mit der Klauenzette und kneifen Sie die Kanten zusammen, um oben eine durchgehende Oberfläche zu bilden.
- Halten Sie die beiden Seiten mit einer gezackten Zette zusammen und verwenden Sie den Wundclip-Applikator, um einen Wundclip in der Mitte des Schnitts zu platzieren. Tragen Sie bei Bedarf Gewebekleber an den Enden des Schnitts auf, um sie geschlossen und gesichert zu halten.
- Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig, der sich auf einer wärmenden Oberfläche befindet. Überwachen Sie auf Blutungen, Anzeichen von Dehiszenz und Schmerzen während der postoperativen Phase. Das Tier sollte innerhalb von Minuten nach der Chirurgie aufstehen und sich bewegen.
- Achten Sie mindestens 3 Tage nach der Operation genau auf die Inzisionsstelle und die allgemeine Gesundheit der Tiere. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Schmerzbehandlung.
- Reinigen Sie die chirurgischen Werkzeuge für 10 s in einem Glasperlensterilisator, bevor Sie mit der nächsten Transplantation fortfahren. Warten Sie, bis die Werkzeuge vor der Verwendung abgekühlt sind.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1−4.15, bis alle Mäuse transplantiert sind.
HINWEIS: Östrogen-Supplementierung ist für ER+ Tumore erforderlich, die durch Wasser oder langsam freisetzenden Pellets59zugeführt werden können.
5. Überwachung des Tumorwachstums als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung
HINWEIS: Tastbare Tumoren etablierter transplantierbarer PDXs und p53-Null-Tumoren brauchen zwischen 2 Wochen und 8 Wochen, um sich nach der Operation zu entwickeln, abhängig von den intrinsischen Tumorwachstumsraten.
- Messen Sie Tumore in zwei Dimensionen mit Bremssätteln zweimal pro Woche. Berechnen Sie das Volumen mit der Formel:
Tumorvolumen (mm3) = B2 x L/2
wobei W die Breite und L die Länge des Tumors ist. - Beginnen Sie mit der medikamentösen Behandlung, wenn das Tumorvolumen 150-300 mm3erreicht.
HINWEIS: Abhängig von der Eigenschaft der Medikamente kann mundgeschützte oder intraperitoneale Injektion verwendet werden, um die Medikamente zu verabreichen. - Sammeln Sie Tumorproben und führen SieIHC-Färbung 60,Protein- und RNA / DNA-Isolierung und Immunphänotypisierung61 für verschiedene Zwecke durch. Sammeln Sie Blut und führen Sie eine Immunphänotypisierung durch oder verwenden Sie es für pharmakokinetische / pharmakodynamische Studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Ausrüstung (Abbildung 1A) und die wichtigsten Verfahren (Abbildung 1B) der orthotopischen Transplantation. Abbildung 2 zeigt die Charakterisierung eines transplantierten PDX-Tumors (MC1). Tumorfragmente (1 mm3) des MC1-Modells wurden in das Fettpolster Nr. 4 von SCID/Beige-Mäusen transplantiert. Einen Monat später erreichte die durchschnittliche Tumorgröße etwa 350 mm3. Das Tumorvolumen wurde einen Monat lang zweimal pro Woche überwacht. Normalerweise erhalten wir tastbare Tumoren für verschiedene PDX oder GEMM in etwa 2 Wochen bis 8 Wochen mit 1 mm3 Transplantaten (Abbildung 2A). Tumorproben können für die Morphologie und Signalanalyse entnommen werden (Abbildung 2B−D). Zur Analyse der Pathologie wurde eine H&E-Färbung durchgeführt (Abbildung 2B). IHC wurde verwendet, um Marker für spezifische Zelllinien (Keratin 19 (K19), Epithelzellen, Abbildung 2C),Zellstatus (Ki67, Proliferation, Abbildung 2D)oder Signalmoleküle von Interesse zu überwachen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Operationstechnik. (A) Chirurgische Ausrüstung, die für die orthotopische Transplantation erforderlich ist. (B) Repräsentatives Bild, das die Exposition von Brustfettpolstern für die Tumorstammtransplantation zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Charakterisierung der transplantierten Tumoren. (A) Repräsentative Kinetik des Tumorwachstums, gemessen mit einem Messschieber. Tumorvolumen (mm3) = B2 x L/2 (B = Breite und L = Länge). (B) H & E-Färbung zeigt Pathologie von MC1 PDX. IHC zeigt den epithelialen Marker Keratin 19 (C) und den Proliferationsmacher Ki67 (D) in MC1 PDX. Maßstabsleiste = 20 μm, Vergrößerung = 40x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Um Variationen im Tumorwachstum bei Tieren zu reduzieren, ist es wichtig, das Tumorgewebe für die Transplantation in 1 mm3 Fragmente zu schneiden. Modelle, bei denen Weichgewebe wachsen, sind schwieriger zu bearbeiten und die Tumorfragmente müssen etwas größer geschnitten werden (1−2 mm3). Wenn Sie das Gewebe in die Brustfettpolstertasche legen, achten Sie darauf, das Gewebe nicht in mehrere Stücke zu spalten, da dies zu mehreren kleinen Tumoren oder seltsam geformten Tumoren führt.
Verwenden Sie außerdem frischen Tumor für die Transplantation von Tieren, die für medikamentöse Behandlungsstudien verwendet werden. Die Implantation von Gewebe aus der Kryokonservierung führt zu einer variableren Aufnahmerate und einer etwas langsameren Wachstumskinetik. Sobald Tumore aus dem kryokonservierten Material wachsen, liefert die zweite Transplantationsgeneration die typische Aufnahmerate und Wachstumskinetik für dieses Modell. Versuchen Sie außerdem, Tumore ohne oder mit leichter Nekrose für die Transplantation zu verwenden. Bei den meisten Modellen wird dies ein Größenbereich von 400−600 mm3 sein. Wenn ein offensichtlicher nekrotischer Kern beobachtet wird, verwenden Sie Gewebe aus der äußeren Schicht des Tumors für die Transplantation und verwenden Sie nicht die nekrotischen Bereiche. Es ist wichtig, das Tumorgewebe auf Eis zu halten und vor dem Austrocknen zu schützen.
Um die Variabilität zwischen Tumorbrocken aus GEMM zu reduzieren, die möglicherweise aus der Peripherie oder dem Tumorkern mit unterschiedlichen Mikroumgebungen stammen, besteht eine alternative Methode darin, eine primäre Zellsuspension herzustellen und je nach Tumormodell etwa 5.000-30.000 Zellen in das Brustfettpolster zu transplantieren. Die eingeschränkte Kollagenaseverdauung erfolgt mit 1 mg/ml Typ I Kollagenase in DMEM/F12 ohne Zusatzstoffe für 2 h bei 37 °C rotierend bei 125 U/min. Brusttumorzellen können durch 3 kurze Zentrifugationsschritte angereichert werden. Kurz gesagt, die Zellsuspension in ein 15 mL konisches Röhrchen und eine Zentrifuge bei 450 x g für 7 s geben. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml 1x Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Wiederholen Sie die Pulszentrifugation noch zwei weitere Male. Dies hilft, Unterschiede zwischen Den Chunks zu randomisieren.
Die Transplantation eines normalen Brustepithels regeneriert keinen morphologisch normalen und funktionellen duktalen Baum in Gegenwart von endogenem Mausepithel. Es ist notwendig, das endogene Mausepithel (Clearing) zu entfernen, damit die normale Epitheltransplantation62 wachsen kann. Neoplastisches Gewebe kann jedoch auch in Gegenwart von intaktem endogenem Mausepithel wachsen. Dies bedeutet jedoch nicht unbedingt, dass solche hemmenden Signale nicht existieren. Die Reinigung des Brustfettpolsters ist für bestimmte experimentelle Protokolle notwendig, um die Interaktion des endogenen Maus-Brustepithels mit dem transplantierten Material zu verbieten. Darüber hinaus kann das endogene Epithel einige nachgelagerte Analysen wie Genom-, Transkriptom- und Proteomanalysen erschweren.
Das PDX-Modell und das transplantierbare GEMM können die Heterogenität klinischer Subtypen und das Ansprechen auf die medikamentöse Therapie von menschlichem Brustkrebs originalgetreu rekapitulieren. Wichtig ist, dass diese Modelle leicht zu verpflanzen sind und einen stabilen Phänotyp während einer begrenzten Anzahl von seriellen Passagen beibehalten. Das Tumorwachstum kann leicht mit Bremssätteln gemessen werden. Ein Vorbehalt des PDX-Modells und des transplantierbaren GEMM ist, dass diese Modelle frühe Schritte der Tumorinitiierung nicht rekapitulieren. Außerdem fehlt PDX-Modellen die Interaktion des Tumors mit einem funktionellen Immunsystem. Diese präklinischen Modelle bieten ein wertvolles System, um die Biologie von Brustkrebs zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten. Die Kombination der Arzneimittelreaktion mit den genomischen und proteomischen Informationen für jedes Tumormodell wird die Identifizierung von Biomarkern für die Vorhersage des Ansprechens und die Resistenzmechanismen der Behandlung erleichtern. Diese Art von Daten kann zu neuartigen zielgerichteten Therapien führen, die allein und in Kombination mit Chemotherapie oder Immuntherapie eingesetzt werden könnten, um die Patientenergebnisse zu verbessern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MTL ist Gründer einer Kommanditgesellschaft in StemMed, Ltd. und Gründer und Manager von StemMed Holdings, deren Komplementärin. MTL ist Gründer und Anteilseigner von Tvardi Therapeutics, Inc. LED ist ein entschädigter Mitarbeiter von StemMed, Ltd.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von den National Institutes of Health (R37CA228304 und R01HL146642 bis Xi Chen, CA148761 an Jeffrey M. Rosen), dem US Department of Defense (W81XWH-19-1-0524 an Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 an Xiangdong Lv), der American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE an Xi Chen) und dem Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award an Xi Chen), der Patient-Derived Xenograft and Advanced In Vivo Models Core am Baylor College of Medicine (Finanzierung durch RP170691 CPRIT Core Facility Award und NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mg/mL Buprenorphine-SR | ZooPharm (via BCM veterinarians) | Sterile | |
| 26G syringe | BD | 148232E | Sterile |
| Betadine Scrub | Fisher | 19-027132 | |
| Cotton Swabs | VWR International Laboratory | 89031-272 | Sterile |
| DMEM | Fisher | MT 10-013-CM | Sterile |
| Electric shaver | Oster | 78005-050 | |
| Glass beads sterilizer (Germinator) | Roboz Surgical Store | DS-401 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-062-35 | |
| Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5139 | Sterile |
| Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) | Roboz Surgical Store | RS-5658BT | Sterile |
| Micro Forceps (tissue placing forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5069 | Sterile |
| Petri Dish | Fisher | 08-757- 100D | Sterile |
| Sterile drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | Sterile |
| Surgery scissors | Roboz Surgical Store | RS-5960 | Sterile |
| Tissue Forceps (claw forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5158 | Sterile |
| Wound clip applier | BD Autoclip Wound System | 01-804 | Sterile |
| Wound clip remover | BD Autoclip Wound System | 01-804-15 | Sterile |
| Wound clips | BD Autoclip Wound System | 01-804-5 | Sterile |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Harbeck, N., et al.
- Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C. Personalized treatment of early-stage breast cancer: present concepts and future directions. Cancer Treatment Reviews. 36 (8), 584-594 (2010).
- Zardavas, D., Irrthum, A., Swanton, C., Piccart, M. Clinical management of breast cancer heterogeneity. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (7), 381 (2015).
- Esteva, F. J., Hubbard-Lucey, V. M., Tang, J., Pusztai, L. Immunotherapy and targeted therapy combinations in metastatic breast cancer. The Lancet Oncology. 20 (3), e175-e186 (2019).
- Schmid, P., et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. New England Journal of Medicine. 379 (22), 2108-2121 (2018).
- Tsuji, K., et al. Breast cancer cell lines carry cell line-specific genomic alterations that are distinct from aberrations in breast cancer tissues: comparison of the CGH profiles between cancer cell lines and primary cancer tissues. BMC Cancer. 10 (1), 15 (2010).
- Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
- Clarke, R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer-the immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Research and Treatment. 39 (1), 69-86 (1996).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514 (2011).
- Kuperwasser, C., et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America. 101 (14), 4966-4971 (2004).
- Vaillant, F., et al. Targeting BCL-2 with the BH3 mimetic ABT-199 in estrogen receptor-positive breast cancer. Cancer Cell. 24 (1), 120-129 (2013).
- Li, S., et al. Endocrine-therapy-resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast-cancer-derived xenografts. Cell Reports. 4 (6), 1116-1130 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Current Protocols in Pharmacology. 60 (1), 14.23.11-14.23.43 (2013).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Research. 16 (2), R36 (2014).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118 (2007).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: Influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. International Journal of Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
- Sebesteny, A., et al. Primary human breast carcinomas transplantable in the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 63 (6), 1331-1337 (1979).
- Sakakibara, T., et al. Growth and metastasis of surgical specimens of human breast carcinomas in SCID mice. The Cancer Journal from Scientific American. 2 (5), 291-300 (1996).
- Rae-Venter, B., Reid, L. M. Growth of human breast carcinomas in nude mice and subsequent establishment in tissue culture. Cancer Research. 40 (1), 95-100 (1980).
- Outzen, H., Custer, R. Brief communication: Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Noël, A., et al. Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nude mice. Anticancer Research. 15 (1), 1-7 (1995).
- Naundorf, H., Fichtner, I., Büttner, B., Frege, J. Establishment and characterization of a new human oestradiol-and progesterone-receptor-positive mammary carcinoma serially transplantable in nude mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 119 (1), 35-40 (1992).
- Murthy, M. S., Scanlon, E. F., Jelachich, M. L., Klipstein, S., Goldschmidt, R. A. Growth and metastasis of human breast cancers in athymic nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 13 (1), 3-15 (1995).
- Fichtner, I., Becker, M., Zeisig, R., Sommer, A. In vivo models for endocrine-dependent breast carcinomas: special considerations of clinical relevance. European Journal of Cancer. 40 (6), 845-851 (2004).
- Ding, L., et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft. Nature. 464 (7291), 999 (2010).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Borowsky, A. D. Choosing a mouse model: experimental biology in context-the utility and limitations of mouse models of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a009670 (2011).
- Caligiuri, I., Rizzolio, F., Boffo, S., Giordano, A., Toffoli, G. Critical choices for modeling breast cancer in transgenic mouse models. Journal of Cellular Physiology. 227 (8), 2988-2991 (2012).
- Backlund, M. G., et al. Impact of ionizing radiation and genetic background on mammary tumorigenesis in p53-deficient mice. Cancer Research. 61 (17), 6577-6582 (2001).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052-1058 (2000).
- Hüsler, M. R., et al. Lactation-induced WAP-SV40 Tag transgene expression in C57BL/6J mice leads to mammary carcinoma. Transgenic Research. 7 (4), 253-263 (1998).
- Simin, K., et al. pRb inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and progression in divergent epithelia. PLoS Biology. 2 (2), e22 (2004).
- Sandgren, E. P., et al. Inhibition of mammary gland involution is associated with transforming growth factor α but not c-myc-induced tumorigenesis in transgenic mice. Cancer Research. 55 (17), 3915-3927 (1995).
- Gallahan, D., et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis. Cancer Research. 56 (8), 1775-1785 (1996).
- Tsukamoto, A. S., Grosschedl, R., Guzman, R. C., Parslow, T., Varmus, H. E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell. 55 (4), 619-625 (1988).
- Guy, C. T., Cardiff, R., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Guy, C. T., et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22), 10578-10582 (1992).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37 (1999).
- Maroulakou, I. G., Anver, M., Garrett, L., Green, J. E. Prostate and mammary adenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor antigen fusion gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (23), 11236-11240 (1994).
- Yin, Y., et al. Characterization of medroxyprogesterone and DMBA-induced multilineage mammary tumors by gene expression profiling. Molecular Carcinogenesis. 44 (1), 42-50 (2005).
- Cressman, V. L., et al. Mammary tumor formation in p53-and BRCA1-deficient mice. Cell Growth and Differentiation-Publication American Association for Cancer Research. 10 (1), 1-10 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Pond, A. C., et al. Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer. Cancer Research. 70 (12), 4868-4879 (2010).
- Sinn, E., et al. Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: synergistic action of oncogenes in vivo. Cell. 49 (4), 465-475 (1987).
- Muller, W. J., et al. The int-2 gene product acts as an epithelial growth factor in transgenic mice. The EMBO Journal. 9 (3), 907-913 (1990).
- Liu, S., et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell. 15 (6), 539-550 (2009).
- Torres-Arzayus, M. I., et al. High tumor incidence and activation of the PI3K/AKT pathway in transgenic mice define AIB1 as an oncogene. Cancer Cell. 6 (3), 263-274 (2004).
- Chan, S. R., et al. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas. Breast Cancer Research. 14 (1), R16 (2012).
- Jiang, Z., et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3296-3309 (2010).
- Adams, J. R., et al. Cooperation between Pik3ca and p53 mutations in mouse mammary tumor formation. Cancer Research. 71 (7), 2706-2717 (2011).
- Pei, X. H., et al. CDK inhibitor p18INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis. Cancer Cell. 15 (5), 389-401 (2009).
- Bultman, S., et al. Characterization of mammary tumors from Brg1 heterozygous mice. Oncogene. 27 (4), 460 (2008).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052 (2000).
- Zhang, M., et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Cancer Research. 68 (12), 4674-4682 (2008).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Research. 15 (1), 201 (2013).
- Zhang, X., Lewis, M. T. Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models of Human Breast Cancer. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (1), 21-29 (2013).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of Visualized Experiments. (8), e308 (2007).
- Zhao, N., et al. Pharmacological targeting of MYC-regulated IRE1/XBP1 pathway suppresses MYC-driven breast cancer. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1283-1299 (2018).
- DeOme, K., Faulkin, L., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Research. 19 (5), 515 (1959).
