Summary
Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri ve nakledilebilir genetik olarak tasarlanmış fare modelleri insan hastalığına sadık kalınarak rekapitulate edilir ve temel ve çevirisel meme kanseri araştırmaları için tercih edilen modellerdir. Burada, tümör biyolojisini incelemek ve ilaç yanıtını değerlendirmek için meme tümörü parçalarını meme yağ yastığına ortotopik olarak nakleden bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Tümör heterojenliğini ve terapötik yanıtı sadık bir şekilde nükseden preklinik modeller transilyapi meme kanseri araştırmaları için kritik öneme sahiptir. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının büyümesi kolaydır ve moleküler mekanizmaları incelemek için genetik olarak modifiye edilir, ancak hücre kültüründen gelen seçici basınç genellikle zaman içinde genetik ve epigenetik değişikliklere yol açar. Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri, insan meme tümörlerinin heterojenliğini ve ilaç yanıtını sadık bir şekilde yeniden özetler. PDX modelleri, meme tümörü biyolojisinin araştırılmasını ve ilaç yanıtını kolaylaştıran ortotopik transplantasyon sonrası nispeten kısa bir gecikme süresi sergiler. Genetik olarak tasarlanmış nakledilebilir fare modelleri meme tümörü bağışıklığının incelenmesini sağlar. Mevcut protokol, meme tümörü parçalarını meme yağ pedi içine ortotopik olarak nakletme yöntemini ve ardından ilaç tedavilerini açıklar. Bu preklinik modeller meme tümörü biyolojisi, ilaç yanıtı, biyobelirteç keşfi ve ilaç direnci mekanizmalarını araştırmak için değerli yaklaşımlar sağlar.
Introduction
Meme kanseri ölümlerinin çoğu konvansiyonel tedavilere dirençli tekrarlayan hastalığa atfedilebilir1,2. Meme kanserlerinin tümörler arası ve tümör içi heterojenliği tedavi direncine katkıda bulunur. Ayrıca, tümör heterojenliği doğru prognoza engel olabilir ve hastalık yönetimine meydan okuyabilir3,4. Yanıtın tahmine dayalı biyobelirteçlerinin tanımlanması, meme kanseri olan hastaların klinik sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirecektir. Meme kanseri türlerinin çoğu immünoterapiye tepkisiz olması muhtemel immünolojik olarak 'soğuk' tümörler olsa da, immün kontrol noktası inhibitörleri klinik çalışmalarda umut vaat etmişlerdir2,5. Örneğin, faz III denemesi, hastalıksız sağkalımda (DFS) iyileşme olduğunu ve atezolizumab'ın (PD-L1'e karşı monoklonal antikor) nab-paclitaxel ile birlikte% ≥1 PD-L1 boyama6olan tümörlerde tek başına nab-paclitaxel ile karşılaştırıldığında genel bir sağkalım yararı sağlayabileceğini göstermiştir. Meme tümörlerini immünoterapiye duyarlı hale getiren tedavilerin geliştirilmesi tedavi rejimlerinde devrim yapacaktır.
İnsan meme kanseri heterojenliğini ve ilaç yanıtını sadık bir şekilde nükseden preklinik modeller, tümör biyolojisini incelemek ve hedefe yönelik tedavi için potansiyel biyobelirteçleri tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları meme kanseri araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü bu hücre çizgilerinin büyümesi kolaydır ve moleküler mekanizmaları incelemek için genetik olarak modifiye edilir. Bununla birlikte, uzun süreli hücre kültürü in vitrosundan kaynaklanan seçici basınç nedeniyle, zamanla genetik sürüklenme meydana gelebilir ve meme kanseri hücre çizgileri primer meme tümörlerindeki sapmalardan farklı hücre hattına özgü genomik değişiklikler taşıyabilir7,8,9.
Hasta türevi ksinograft (PDX) tümör parçaları insan hastalığının heterojenliğini yeniden yakalayabilir ve histolojik ve immünohistokimyasal olarak 10 ,11 , 12,13,14,15,16, 17,18,19,20 , 21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Daha da önemlisi, PDX modelleri histoloji, transkriptom, proteom ve genomik analiz 10 , 11 , 12 ,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22ile kanıtlanan birden fazla transplantasyonda fenotipik olarak stabildir. ,23,24,25,26,27,28,29. PDX modelleri klinik olarak gözlenenlerle karşılaştırılabilir tedavi yanıtları gösterir10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Östrojen reseptörü pozitif (ER+), progesteron reseptör pozitif (PR+), epidermal büyüme faktörü 2 pozitif (ERBB2+, HER2+) ve üçlü negatif meme kanseri (TNBC) PDX modelleri oluşturulmuş dır ve endokrin, kemoterapi ve hedefe yönelik tedavileri test etmek için mükemmel bir platform sağlar. Bununla birlikte, şu anda PDX modellerinin ana uyarılarından biri, farede işlevsel bir bağışıklık sisteminin olmamasıdır.
Trp53 homozygous null, cMyc, Wnt1, PyMT veya Her2 overexpression modelleri gibi genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM), bozulmamış bir bağışıklık sistemi bağlamında spontan tümör başlatma, ilerleme ve metastaz çalışmasına izin verir. Bununla birlikte, tümör gecikmesi uzundur, bu da birden fazla kolla preklinik denemelerin yapılmasını zorlaştırır30,31. Bununla birlikte, GEMM, insan tümörlerini yakından rekapitula eden yeterli sayıda tümör oluşturmak için singeneik konaklara nakledilebilir32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Örneğin, bir p53-null BALB / c faresinden meme epitel, singeneik vahşi tip alıcı farelerin temizlenmiş yağ pedlerine nakledilerek birincil tümörler oluşturulmuştur, bu da singeneik konaklara daha fazla nakledilebilir56,57. P53-null tümörler insan tümörlerinin farklı alt tiplerini yeniden nükset etti.
PDX modelleri ve nakledilebilir GEMM kombinasyonu, meme tümörü biyolojisi, ilaç yanıtı ve anti-tümör bağışıklığını araştırmak için değerli preklinik araçlar sağlar. Mevcut protokolde, PDX ve GEMM tümör parçalarının fare meme yağ yastığına ortotopik nakli yöntemi açıklanmıştır. Bu modeller seri pasajlar için uygundur ve genellikle kararlı bir fenotip tutar. Zaman içinde pasajlarda genetik sürüklenme veya heterojenlik kaybını azaltmak için, biyolojik veya morfolojik değişikliklerin zaman içinde gözlenmesi durumunda sonraki transplantasyon için her pasajda birden fazla doku parçası kriyoprezerserved edilir29,58.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları kullanan tüm protokoller Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır. Yaklaşık 1−2 mm3 büyüklüğündeki tümör parçaları, Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Hasta Türevli Xenograft ve advanced In Vivo Models Core'dan elde edilen uygun şekilde dondurulmuş stoktandır.
1. Kriyoprezer korunmuş meme tümörü parçalarının transplantasyon için hazırlanması
- Tümör parçaları ile cryovial sıvı azottan 37 °C su banyosuna aktarın.
- Çözülme sırasında ara sıra hafif bir fiske ile cryovial'ı ajite edin.
- Doku çözüldükten sonra, cryovial'ı su banyosundan alın ve hafif bir ters çevirme ile karıştırın.
- Cryovial'ın dışını kurulayın ve% 70 etanol ile püskürtün. Biyogüvenlik başlığına aktarın.
- Çözülen tümör dokularını 10 mL soğuk Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) ile dolu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tüpü ters çevirerek iyice karıştırın. Doku parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
- Süpernatantı aspire edin ve 10 mL soğuk DMEM'de yeniden depolanın. Tüpü ters çevirerek iyice karıştırın. Doku parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
- Süpernatantı aspire edin ve 10 mL soğuk DMEM'de yeniden depolanın. Tüpü buza yerleştirin.
NOT: Doku nakil için hazırdır.
2. Transplantasyon için taze meme tümörünün toplanması ve hazırlanması
- Meme tümörü taşıyan fareyi ötenazi edin.
NOT: PDX konağı SCID/Bej, NSG veya NRG dişi fareler olabilirken, mevcut çalışmada 3−5 haftalık dişi Balb/c fareleri kullanılmaktadır. - Ötenaziye tabi farenin tümör bölgesini% 70 etanol ile püskürtün.
NOT: Kriyostoraj veya ekim için tümör parçalarının kirlenmesine neden olabilecek tümör örneği ile saçlardan kaçınmaya çalışın. - Tümörü çevreleyen cildi çimdiklemek ve kaldırmak için tırtıklı tokmaklarla, kısa bir kesi yapmak için makas kullanın.
- Tüm tümörü konak fareden ayırmak için tümörü makasla deriden ayırın. Tümörün dış yüzeyinden kalan fare yağ yastığı dokusunu kesin. Tümörü 5 mL soğuk DMEM ile dolu 15 mL konik bir tüpe yerleştirin.
NOT: Daha büyük tümörlerin nekrotik çekirdek içermesi muhtemel olduğundan, tümörleri maksimum 1 cm çapında kullanın. - Biyogüvenlik başlığında, parçalanmış tümörü kurumasını önlemek için yeterli DMEM içeren steril 10 cm Petri kabına aktarın.
- Aseptik koşullarda neşter veya bıçak ile tümörü 1 mm3 parçaya bölün.
NOT: Neşter veya bıçak, kullanımdan önce biyogüvenlik başlığındaki UV altında en az 20 dakika maruz kalmalıdır. - Tümör parçalarını soğuk DMEM ile dolu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tüpü buza yerleştirin.
NOT: Doku nakil için hazırdır. Adım 2.4'ten parçalanan tümör parçaları olabilir, 1) protein ve RNA / DNA ekstraksiyonu için sıvı nitrojende donmuş snap, 2) hematoksilin ve eozin (H&E) ve immünofizokimya (IHC) analizi için% 4 paraformaldehit (PFA) veya% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) ile sabitlenmiş veya 3) 1.25 mL donma ortamında (%10 dimetil sülfit [DMSO], %40 DMEM ve %50 fetal sığır serumu [FBS]), bir gecede -80 °C'lik bir dondurucuda yavaş dondurma ve daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarılarak.
3. Hayvanı ameliyata hazırlayın
- Hayvan ağrısı yönetimi için, subkutan olarak buprenorfin sürekli salınımını ameliyattan 60 dakika önce 1 mg / kg dozda enjekte edin veya 72 saat analjezik kapsama alanı için kurumun kılavuzunu izleyin.
- Cerrahi süiti aseptik ameliyatlar için kurumsal yönergelere göre ayarlayın.
- 4 haftalık bir dişiyi izofluran anestezi makinesinin indüksiyon odasında ~11.25 mL/s oranında uyuşturun. Fareyi prosedür alanına, küçük bir yüz maskesiyle anestezi alacağı steril (silikon kauçuk) ameliyat tahtasına aktarın. Fareyi sırtına koyun ve bacakları doğal konumlarında bantleyin.
NOT: PDX için SCID/Bej, NSG veya NRG, GEMM nakil modelleri için balb/c kullanılır. - Kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.
- Uygun sedasyon seviyesini parmakla kıstırarak onaylayın.
NOT: Hayvanın hiçbir yanıtı/hareketi, hayvanın yeterince uyuşturuldığını ve ameliyata hazır olduğunu gösterir. - Fareyi alt karın bölgesinde, özellikle ameliyatın yapılacağı dördüncü meme ucunun etrafındaki bölgede tıraş edin.
- Dairesel bir hareket kullanarak ve ameliyat bölgesinin merkezinden başlayarak, povidone-iyot cerrahi scrub ile dış kenarlara doğru çalışın, ardından% 70 izopropil etanol pedi ile povidone-iyot çıkarılması. İki kez daha tekrarlayın.
4. Tümör parçalarının dördüncü (kasık) meme yağ yastığına nakli
- Kesi bölgesi dışında hayvanın vücudunu örtmek için steril bir cerrahi örtü kullanın.
NOT: Kesiyi yapmadan önce uygun sedasyon seviyesini parmakla kıstırarak onaylayın. - Tırtıklı asaların kullanılması cildi 4 numaralı meme ucuna sıkıştırır ve kaldırır.
- Künt tarafı aşağıdayken, #4 meme ucundan başa doğru kısa (yaklaşık 1 cm), parazitik kesi yapmak için makas kullanın.
- Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, cildi kesiğin medial tarafındaki peritondan ayırın.
- Kesiğin yan tarafını tutarken, aynı bezi kullanarak 4 numaralı meme yağ yastığını deriden hafifçe soyun.
- Yağ yastığı ayrıldıktan sonra, cildi hayvanın vücuduna yakın 27 G'lık bir iğne ile sabitlayın.
- Endojen fare meme epitelinin yağ yastığını temizlemek deneysel olarak gerekliyse aşağıdaki adımları uygulayın.
- Tırtıklı tokaları kullanarak, yağ yastığını vücuttan yavaşça uzatın ve bezdeki ana damarların kesişim noktalarının altında bulunan kasık lenf düğümünü bulun (tokaların bezi tutacağı yere yakın).
- Damarları dikkatlice lenf düğümüne medial ve üçgen bir alan oluşturan dördüncü ve beşinci yağ pedlerine katılan yağlara dağlayın.
NOT: Bu adım için oksijen kaynağını geçici olarak kapatın. - Mikro diseksiyon makası kullanarak, yağ yastığının lenf düğümünü içeren bölümü çıkarılana kadar her koterize damarı teker teker kesin (her kesimden sonra kanama olmamasını sağlamak için).
- "Temizlenmiş" yağ pedi dokusunu atın.
- Dördüncü meme yağ yastığını künt ayırma askıları kullanarak tutun. Diğer taraftan, açılı ince tokmakların kapalı ucunu kalan kabın üzerindeki yağ yastığının ortasına ve periton duvarına yakın bir şekilde yerleştirin. Küçük bir cep yapmak için yavaşça tostiki açın. Açılı ince asaları yağ yastığından çıkarın.
- Açılı ince kümes uçlarını kullanarak, bir parça tümör parçası alın ve cebe yerleştirin.
- Tümör parçasını yağ yastığı cebine bırakmak içinps uçlarını yavaşça açın.
- Açılı ince kanatları dikkatlice çekin.
NOT: Tümör parçasının, tostu çekerken meme yağ yastığının cebinde kaldığını doğrulamak için cebe bakın. Deneyler veya bankacılık için fazla tümör dokusu gerektiğinde tümörler her iki kontralateral yağ pedine de yerleştirildiğinde. Kontrasepteral tümörler arasındaki bilinen etkileşimler nedeniyle çift taraflı nakilli hayvanlar tedavi çalışmaları için önerilmez. Alternatif olarak, implantasyon işlemi için bir trokar cihazı kullanılabilir. - Kesi tabanından başlayarak, pençe ve tırtıklı toparlama kullanarak her iki taraftaki cildi toplayın. İki tarafı bir araya getirin ve cildi yara klipsi uygulamasına hazırlamak için hafifçe kaldırın. Kesiğin kenarlarını pençe forsepsleri ile sıkıştırın ve üstte sürekli bir yüzey oluşturmak için kenarları birleştirin.
- İki tarafı tırtıklı tokalarla bir arada tutarak, kesiğin ortasına bir yara klipsi yerleştirmek için yara klipsi aplikatörunu kullanın. Gerekirse, kapalı ve güvenli tutmak için kesi uçlarına doku yapıştırıcısı uygulayın.
- Hayvanı ısınan bir yüzeyde bulunan temiz bir kafese yerleştirin. Postürjik dönemde kanama, dehiscence belirtileri ve ağrı nedir izleyin. Hayvan birkaç dakika içinde ayağa kalkmalı ve hareket etmelidir.
- Ameliyattan sonra en az 3 gün boyunca kesi bölgesine ve hayvanların genel sağlığına çok dikkat edin. Ağrı yönetimi için kurumsal yönergeleri izleyin.
- Bir sonraki nakile devam etmeden önce cerrahi aletleri cam boncuk sterilizatörde 10 sn temizler. Kullanmadan önce aletlerin soğumasını bekleyin.
- Tüm fareler nakledilene kadar 4.1−4.15 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Su veya yavaş salınım peletleri ile sağlanabilen ER+ tümörler için östrojen takviyesi gereklidir59.
5. İlaç tedavisine yanıt olarak tümör büyümesinin izlenmesi
NOT: Yerleşik nakledilebilir PDX'lerin ve p53-null tümörlerin palpable tümörlerinin, intrinsik tümör büyüme oranlarına bağlı olarak ameliyat sonrası gelişmesi 2 hafta ile 8 hafta arasında sürer.
- Haftada iki kez kaliper kullanarak tümörleri iki boyutta ölçün. Formülü kullanarak birimi hesaplayın:
Tümör hacmi (mm3)= W2 x L/2
burada W genişlik ve L tümörün uzunluğudur. - Tümör hacmi 150−300 mm3'eulaştığında ilaç tedavisine başlayın.
NOT: İlaçların özelliğine bağlı olarak, ilaçların teslimi için oral gavage veya intraperitoneal enjeksiyon kullanılabilir. - Tümör örneklerini toplayın ve çeşitli amaçlar için IHC boyama60,protein ve RNA/DNA izolasyonu ve immün fenotipleme61 gerçekleştirin. Kan toplayın ve immün fenotipleme gerçekleştirin veya farmakokinetik / farmakodinamik çalışmalar için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de ortopedik transplantasyonun ekipmanı (Şekil 1A) ve anahtar prosedürleri (Şekil 1B) göstermektedir. Şekil 2'de nakledilen PDX tümörünün (MC1) karakterizasyonu gösterilmiştir. MC1 modelinin tümör parçaları(1 mm 3),SCID/Bej farelerin 4 numaralı yağ yastığına nakledildi. Bir ay sonra, ortalama tümör büyüklüğü yaklaşık 350 mm3'e ulaştı. Tümör hacmi bir ay boyunca haftada iki kez izlendi. Normalde 1 mm3 tümör parçası nakledilerek yaklaşık 2 hafta ila 8 hafta içinde çeşitli PDX veya GEMM için hissedilebilir tümörler elde ederiz (Şekil 2A). Morfoloji ve sinyal analizi için tümör örnekleri toplanabilir (Şekil 2B−D). Patolojiyi analiz etmek için H&E boyama yapıldı (Şekil 2B). IHC, belirli hücre soyu (keratin 19 (K19), epitel hücre, Şekil 2C),hücre durumu (Ki67, çoğalma, Şekil 2D)veya ilgi molekülü sinyali için belirteçleri izlemek için kullanıldı.
Şekil 1: Ameliyat tekniğini gösteren şematik. (A) Ortotopik transplantasyon için gerekli cerrahi ekipman. (B) Tümör gövdesi nakli için meme yağ yastığının maruziyetini gösteren temsili görüntü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nakledilen tümörlerin karakterizasyonu. (A) Kaliper ile ölçülen tümör büyümesinin temsili kinetiği. Tümör hacmi (mm3) = W2 x L/2 (W = genişlik ve L = uzunluk). (B) MC1 PDX patolojisini gösteren H&E lekeleme. IHC, MC1 PDX'te epitel belirteci keratin 19 (C) ve çoğalma yapıcı Ki67 (D) gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm, büyütme = 40x. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hayvanlar arasında tümör büyümesindeki varyasyonları azaltmak için, tümör dokusunun transplantasyon için 1 mm3 parçaya kesilmesi kritik öneme sahiptir. Yumuşak doku büyüyen modellerle çalışmak daha zordur ve tümör parçalarının biraz daha büyük kesilmesi gerekir (1−2 mm3). Dokuyu meme yağ yastığı cebine yerleştirirken, birden fazla küçük tümöre veya garip şekilli tümörlere neden olacağından, dokuyu birden fazla parçaya bölmemeye dikkat edin.
Ek olarak, ilaç tedavisi çalışmaları için kullanılacak hayvanların nakli için taze tümör kullanın. Kriyoprezervasyondan doku implante etmek daha değişken bir alma oranı ve biraz daha yavaş büyüme kinetiği sağlayacaktır. Tümörler kriyoprezerserved malzemeden büyüdüğünde, ikinci nakil nesli bu model için tipik alma oranını ve büyüme kinetiğini verecektir. Ayrıca, transplantasyon için hafif nekrozu olmayan veya hafif tümörleri kullanmaya çalışın. Çoğu model için bu 400−600 mm3boyut aralığı olacaktır. Belirgin bir nekrotik çekirdek gözlenirse, nakil için tümörün dış tabakasından doku kullanın ve nekrotik bölgeleri kullanmayın. Tümör dokusunun buzda tutulması ve kurumaya karşı korunması önemlidir.
GEMM'den farklı mikroçevrelerle periferi veya tümör çekirdeğinden elde edilmiş olabilecek tümör parçaları arasındaki değişkenliği azaltmak için alternatif bir yöntem, birincil hücre süspansiyonu hazırlamak ve tümör modeline bağlı olarak yaklaşık 5.000−30.000 hücreyi meme yağ yastığına nakletmektir. Sınırlı kollajenaz sindirimi, DMEM/F12'de 1 mg/mL tipi I kollajenaz ile 125 rpm'de dönen 37 °C'de 2 saat boyunca herhangi bir katkı maddesi olmadan gerçekleştirilir. Meme tümörü hücreleri 3 kısa santrifüj adımı ile zenginleştirilebilir. Kısaca, hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpe ve 7 s için 450 x g'da santrifüje aktarın. Süpernatantı aspire ve peletin 1x Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) 10 mL resuspend. Nabız santrifüjlemesini iki kez daha tekrarlayın. Bu, parçalar arasındaki farkları rastgele hale getireceğiz.
Normal meme epitelinin nakli, endojen fare epitel varlığında morfolojik olarak normal ve fonksiyonel bir düktal ağacı yenilemez. Normal epitel naklinin büyümesi için endojen fare epitelini (temizleme) çıkarmak gerekir62. Bununla birlikte, neoplastik doku bozulmamış endojen fare epitelinin varlığında bile büyüyebilir. Ancak bu mutlaka böyle bir inhibitör sinyalin olmadığı anlamına gelmez. Meme yağ pedi temizleme, endojen fare meme epitelinin engrafted malzeme ile etkileşimini yasaklamak için bazı deneysel protokoller için gereklidir. Ek olarak, endojen epitel genom, transkriptom ve proteom analizi gibi bazı aşağı akış analizlerini zorlaştırabilir.
PDX modeli ve nakledilebilir GEMM, klinik alt tiplerin heterojenliğini ve insan meme kanserinin ilaç tedavisine yanıtını sadık bir şekilde yeniden özetleyebilir. Daha da önemlisi, bu modellerin nakledilması ve sınırlı sayıda seri geçiş sırasında kararlı bir fenotipin korunması kolaydır. Tümör büyümesi kaliperlerle kolayca ölçülebilir. PDX modelinin ve nakledilebilir GEMM'in bir uyarısı, bu modellerin tümör başlangıçlarının erken adımlarını rekapitüle etmemeleridir. Ayrıca, PDX modelleri tümörün fonksiyonel bir bağışıklık sistemi ile etkileşimi eksikliği. Bu preklinik modeller meme kanseri biyolojisini incelemek ve ilaç yanıtını değerlendirmek için değerli bir sistem sağlar. İlaç yanıtının her tümör modeli için genomik ve proteomik bilgilerle birleştirilmesi, yanıt tahmini ve tedavi direnci mekanizmaları için biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. Bu tür veriler, tek başına ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için kemoterapi veya immünoterapi ile birlikte kullanılabilecek yeni hedefe yönelik tedavilere yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MTL, StemMed, Ltd.'de sınırlı bir ortağın kurucusu ve genel ortağı stemmed holdings'in kurucusu ve yöneticisidir. MTL, Tvardi Therapeutics, Inc.'in kurucusu ve özkaynak sahibidir ve StemMed, Ltd.'nin telafi edilmiş bir çalışanıdır.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R37CA228304 ve R01HL146642'den Xi Chen'e, CA148761'den Jeffrey M. Rosen'a), ABD Savunma Bakanlığı (W81XWH-19-1-0524'ten Xi Chen'e, W81XWH-19-1-0035'ten Xiangdong Lv'ye), Amerikan Kanser Derneği'ne (RSG-18-181-01-TBE'den Xi Chen'e) ve Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü'ne (RR150009 CPRIT Bilim Adamı Baylor College of Medicine'daki Hasta Kaynaklı Xenograft ve Advanced In Vivo Models Core (RP170691 CPRIT Core Facility Award ve NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant'ten finansman).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mg/mL Buprenorphine-SR | ZooPharm (via BCM veterinarians) | Sterile | |
| 26G syringe | BD | 148232E | Sterile |
| Betadine Scrub | Fisher | 19-027132 | |
| Cotton Swabs | VWR International Laboratory | 89031-272 | Sterile |
| DMEM | Fisher | MT 10-013-CM | Sterile |
| Electric shaver | Oster | 78005-050 | |
| Glass beads sterilizer (Germinator) | Roboz Surgical Store | DS-401 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-062-35 | |
| Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5139 | Sterile |
| Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) | Roboz Surgical Store | RS-5658BT | Sterile |
| Micro Forceps (tissue placing forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5069 | Sterile |
| Petri Dish | Fisher | 08-757- 100D | Sterile |
| Sterile drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | Sterile |
| Surgery scissors | Roboz Surgical Store | RS-5960 | Sterile |
| Tissue Forceps (claw forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5158 | Sterile |
| Wound clip applier | BD Autoclip Wound System | 01-804 | Sterile |
| Wound clip remover | BD Autoclip Wound System | 01-804-15 | Sterile |
| Wound clips | BD Autoclip Wound System | 01-804-5 | Sterile |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Harbeck, N., et al.
- Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C. Personalized treatment of early-stage breast cancer: present concepts and future directions. Cancer Treatment Reviews. 36 (8), 584-594 (2010).
- Zardavas, D., Irrthum, A., Swanton, C., Piccart, M. Clinical management of breast cancer heterogeneity. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (7), 381 (2015).
- Esteva, F. J., Hubbard-Lucey, V. M., Tang, J., Pusztai, L. Immunotherapy and targeted therapy combinations in metastatic breast cancer. The Lancet Oncology. 20 (3), e175-e186 (2019).
- Schmid, P., et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. New England Journal of Medicine. 379 (22), 2108-2121 (2018).
- Tsuji, K., et al. Breast cancer cell lines carry cell line-specific genomic alterations that are distinct from aberrations in breast cancer tissues: comparison of the CGH profiles between cancer cell lines and primary cancer tissues. BMC Cancer. 10 (1), 15 (2010).
- Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
- Clarke, R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer-the immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Research and Treatment. 39 (1), 69-86 (1996).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514 (2011).
- Kuperwasser, C., et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America. 101 (14), 4966-4971 (2004).
- Vaillant, F., et al. Targeting BCL-2 with the BH3 mimetic ABT-199 in estrogen receptor-positive breast cancer. Cancer Cell. 24 (1), 120-129 (2013).
- Li, S., et al. Endocrine-therapy-resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast-cancer-derived xenografts. Cell Reports. 4 (6), 1116-1130 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Current Protocols in Pharmacology. 60 (1), 14.23.11-14.23.43 (2013).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Research. 16 (2), R36 (2014).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118 (2007).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: Influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. International Journal of Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
- Sebesteny, A., et al. Primary human breast carcinomas transplantable in the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 63 (6), 1331-1337 (1979).
- Sakakibara, T., et al. Growth and metastasis of surgical specimens of human breast carcinomas in SCID mice. The Cancer Journal from Scientific American. 2 (5), 291-300 (1996).
- Rae-Venter, B., Reid, L. M. Growth of human breast carcinomas in nude mice and subsequent establishment in tissue culture. Cancer Research. 40 (1), 95-100 (1980).
- Outzen, H., Custer, R. Brief communication: Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Noël, A., et al. Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nude mice. Anticancer Research. 15 (1), 1-7 (1995).
- Naundorf, H., Fichtner, I., Büttner, B., Frege, J. Establishment and characterization of a new human oestradiol-and progesterone-receptor-positive mammary carcinoma serially transplantable in nude mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 119 (1), 35-40 (1992).
- Murthy, M. S., Scanlon, E. F., Jelachich, M. L., Klipstein, S., Goldschmidt, R. A. Growth and metastasis of human breast cancers in athymic nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 13 (1), 3-15 (1995).
- Fichtner, I., Becker, M., Zeisig, R., Sommer, A. In vivo models for endocrine-dependent breast carcinomas: special considerations of clinical relevance. European Journal of Cancer. 40 (6), 845-851 (2004).
- Ding, L., et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft. Nature. 464 (7291), 999 (2010).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Borowsky, A. D. Choosing a mouse model: experimental biology in context-the utility and limitations of mouse models of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a009670 (2011).
- Caligiuri, I., Rizzolio, F., Boffo, S., Giordano, A., Toffoli, G. Critical choices for modeling breast cancer in transgenic mouse models. Journal of Cellular Physiology. 227 (8), 2988-2991 (2012).
- Backlund, M. G., et al. Impact of ionizing radiation and genetic background on mammary tumorigenesis in p53-deficient mice. Cancer Research. 61 (17), 6577-6582 (2001).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052-1058 (2000).
- Hüsler, M. R., et al. Lactation-induced WAP-SV40 Tag transgene expression in C57BL/6J mice leads to mammary carcinoma. Transgenic Research. 7 (4), 253-263 (1998).
- Simin, K., et al. pRb inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and progression in divergent epithelia. PLoS Biology. 2 (2), e22 (2004).
- Sandgren, E. P., et al. Inhibition of mammary gland involution is associated with transforming growth factor α but not c-myc-induced tumorigenesis in transgenic mice. Cancer Research. 55 (17), 3915-3927 (1995).
- Gallahan, D., et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis. Cancer Research. 56 (8), 1775-1785 (1996).
- Tsukamoto, A. S., Grosschedl, R., Guzman, R. C., Parslow, T., Varmus, H. E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell. 55 (4), 619-625 (1988).
- Guy, C. T., Cardiff, R., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Guy, C. T., et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22), 10578-10582 (1992).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37 (1999).
- Maroulakou, I. G., Anver, M., Garrett, L., Green, J. E. Prostate and mammary adenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor antigen fusion gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (23), 11236-11240 (1994).
- Yin, Y., et al. Characterization of medroxyprogesterone and DMBA-induced multilineage mammary tumors by gene expression profiling. Molecular Carcinogenesis. 44 (1), 42-50 (2005).
- Cressman, V. L., et al. Mammary tumor formation in p53-and BRCA1-deficient mice. Cell Growth and Differentiation-Publication American Association for Cancer Research. 10 (1), 1-10 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Pond, A. C., et al. Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer. Cancer Research. 70 (12), 4868-4879 (2010).
- Sinn, E., et al. Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: synergistic action of oncogenes in vivo. Cell. 49 (4), 465-475 (1987).
- Muller, W. J., et al. The int-2 gene product acts as an epithelial growth factor in transgenic mice. The EMBO Journal. 9 (3), 907-913 (1990).
- Liu, S., et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell. 15 (6), 539-550 (2009).
- Torres-Arzayus, M. I., et al. High tumor incidence and activation of the PI3K/AKT pathway in transgenic mice define AIB1 as an oncogene. Cancer Cell. 6 (3), 263-274 (2004).
- Chan, S. R., et al. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas. Breast Cancer Research. 14 (1), R16 (2012).
- Jiang, Z., et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3296-3309 (2010).
- Adams, J. R., et al. Cooperation between Pik3ca and p53 mutations in mouse mammary tumor formation. Cancer Research. 71 (7), 2706-2717 (2011).
- Pei, X. H., et al. CDK inhibitor p18INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis. Cancer Cell. 15 (5), 389-401 (2009).
- Bultman, S., et al. Characterization of mammary tumors from Brg1 heterozygous mice. Oncogene. 27 (4), 460 (2008).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052 (2000).
- Zhang, M., et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Cancer Research. 68 (12), 4674-4682 (2008).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Research. 15 (1), 201 (2013).
- Zhang, X., Lewis, M. T. Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models of Human Breast Cancer. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (1), 21-29 (2013).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of Visualized Experiments. (8), e308 (2007).
- Zhao, N., et al. Pharmacological targeting of MYC-regulated IRE1/XBP1 pathway suppresses MYC-driven breast cancer. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1283-1299 (2018).
- DeOme, K., Faulkin, L., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Research. 19 (5), 515 (1959).
