Summary
פרוטוקול זה מנסה לקבוע פרוטוקול חוזר עבור נוירונים ראשוניים ובידוד גליה מ שלפוחית השתן של חולדה לניסויים תאיים נוספים.
Abstract
בדרכי השתן התחתונות יש שתי פונקציות עיקריות, כלומר, אחסון שתן תקופתי ומיקרוביום; פונקציות אלה מתווכים באמצעות נוירורגולציה מרכזית והיקפית. למרות מחקר מקיף על מערכת העצבים בדרכי השתן התחתונה נערך, רוב המחקרים התמקדו בתרבות העיקרית. פרוטוקול זה מציג שיטה לבידוד ותרבות של נוירונים בשלפוחית השתן וגליה מעכברושי ספראג-דוולי. בשיטה זו, הנוירונים וגליה היו דגירה ב 37 °C (60 °F), 5% CO2 חממה במשך 5-7 ימים. כתוצאה מכך, הם גדלו לצורות בוגרות המתאימות לניסויים הקשורים לכשל חיסוני. תאים נצפו מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ אופטי. נוירונים, סינפטי סינפטי, גליה זוהו על ידי β-III-טובולין ו MAP-2, Synapsin-1, ו GFAP כתמים, בהתאמה. בינתיים, אימונוציטוכימיה בוצעה על מספר חלבונים הקשורים נוירוטרנסמיטר, כגון אצטילטרנספראז כולין, DYNLL2, ו SLC17A9.
Introduction
לדרכי השתן התחתונות יש שתי פונקציות עיקריות: אחסון שתן תקופתי ומיקרוביום1. מערכת העצבים בדרכי השתן התחתונות (LUTNS) שולטת בתפקודים אלה והיא עדינה וראויה לנוירופתיות רבות, אשר יכול להיות מולד (פורפיריה), רכש (מחלת ליים), משני למצבי מחלה (ציסטופתיה סוכרתית), סמים המושרה (דלקת שלפוחית השתן דימומית), ניתוח שנגרם (כריתה abdominoperineal), או פציעה הנגרמת (פגיעה טראומטית בחוט השדרה)2,3,4,5,6,7. במחקרים פיזיולוגיים/פתולוגיים, ניסויים in vivo ו במבחנה חשובים באותה מידה. בעוד מחקר vivo על LUTNS נערך ברמות איברים, הסלולר, מולקולרית במשך זמן מה, אין ויטרו מחקר על נוירונים ראשוניים משלפוחית השתן הוא כמעט לא קיים8,9. למרות שהמחקר הנוכחי מוגבל, אנו מקווים ל החלוץ במחקר בתחום זה, כך שחוקרים אחרים יוכלו לשפר אותו. באופן זה, תרבות משותפת זו עלולה להוביל להבנה תאית של תפקוד לקוי פיזיולוגי בפנוטיפים, כגון תפקוד לקוי של נוירון שלפוחית השתן.
בניגוד לשרירים אנטריים עם כיווניות ברורה של תאי השריר לשכבות נפרדות, שרירי שלפוחית השתן אינם מאורגנים10. לכן, במקום לקלף את השכבה החיצונית של שלפוחית השתן, שיטה זו מציעה לעכל את שלפוחית השתן כולה כדי להפחית את קושי הפעולה ולקצר את זמן עיבוד מראש לשיעור הישרדות תאים גבוה.
בעקבות שיטה זו, אנו יכולים להשיג תרבות מעורבת של נוירונים ותאים אחרים. התאים האחרים הם הכרחיים כי נוכחותם מחקה סביבת vivo11. בנוסף, תאים כאלה מספקים את החומרים שאינם זמינים במדיום.
שיטה זו כוללת שני שלבים לעיכול. ראשית, קולגנאז מסוג II משמש הידרוליזה קולגן, ואחריו טריפסין, כדי לנתק את הרקמה לתאים10. באופן זה, רקמות שלפוחית השתן מפוזרות לתאים בודדים ולאחר מכן לגדול עצמאי יחסית. כאשר התרבות של נוירונים מתבגרת, הנוירונים יכולים לשמש להדמיה או מבחנים פונקציונליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסיוניים והנהלים בבעלי חיים עמדו בהנחיות העיקרון האתי של מועצת המחקר הלאומית.
1. הכנת חומרים
- לעקר את כל המכשירים ואת ddH2O באמצעות אוטוקלאב לפני ביצוע הניסוי. המכשירים כוללים אך אינם מוגבלים למספריים כירורגיים, מספריים עיניים, מלקחיים, מחלק גרעין כפות, כלי זכוכית (בקוטר 60-100 מ"מ) ושוברי זכוכית.
- הכן את הפתרון קרבס כדלקמן (טבלה 1): להמיס את כל הכימיקלים יחד עם ddH2O לפני השימוש. ממיסים את CaCI2 בנפרד ומוסיפים לאט לתמיסה המעורבת תוך כדי ערבוב כדי למנוע משקעים.
- הכינו את מדיית השטיפה, המורכבת ממדיית F12 עם 10% סרום שור עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטי/אנטי-מיקוטי (100x). הוסף 5 מ"ל של FBS ו 0.5 מ"ל של אנטיביוטיקה / אנטי מיקוטי ל 44.5 מ"ל של מדיה F12.
- הכן מדיה נוירון A, הכוללת נוירובאסל A מדיה עם 2% B-27, 1% FBS, 1% L-גלוטמין, 1% אנטיביוטי / antimycotic (100x), ו 0.1% גורם נוירוטרופי שמקורו גליה (GDNF). הוסף 200 μL של B-27, 100 μL של FBS, 100 μL של L-גלוטמין, 100 μL של אנטיביוטיקה / אנטימקוטיקה (100x), ו 10 μL של GDNF (10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי 9.5 מ"ל של מדיה נוירובסאלית A.
הערה: הכינו את מדיית הנוירונים A תוך שבוע מהשימוש כדי להבטיח רעננות של B-27, ל-גלוטמין ו-GDNF. - הכן מדיה נוירון B באמצעות הליך זהה להכנת מדיה נוירון A אבל בלי להוסיף FBS.
- הכן פתרון עיכול 1 על ידי המסת 20 מ"ג של קולגנאז סוג II, 6 מ"ג של אלבומין סרום שור, ו 200 μL של אנטיביוטי / אנטי מיקוטי (100x) ב 10 מ"ל של פתרון קרבס יציב חמצן.
- הכינו את פתרון העיכול 2 על ידי דילול 1 מ"ל של 0.25% טריפסין עם 4 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק.
- מכינים צלחת עם כיסויים מצופים.
- השתמשו במלקחיים בספסל זרימה למינארי בעת הנחת כיסויי זכוכית לצלחת תרבות של 48 באר.
- לדלל פולי-D-ליזן עם ddH2O לריכוז של 0.1 מ"ג / מ"ל כמו מלאי פולי-D-ליזן. אחסן את המלאי ב -20 °C (69 °F), ולהפשיר לפני השימוש.
- הוסף 40 μL של מלאי פולי-D-ליסין על גבי כל כיסוי, ולהדגיר את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
הערה: עבור צלחות שונות עם אזורי בסיס שונים, להתאים את הריכוז ל 4 מיקרוגרם / ס"מ2. לדוגמה, אם האזור הבסיסי של באר אחת מצלחת 24 באר הוא 2 ס"מ2, אז אנחנו צריכים להעביר 80 μL של מלאי פולי-D-ליצין בבאר. כל ס"מ2 יכיל 4 מיקרוגרם של פולי-די-ליצין. - הסר פולי-D-ליצין בצלחת 48-באר, ולשטוף coverslips עם ddH2O שלוש פעמים.
- יבש את הצלחת במכסה המנוע זרימה למינאר לפחות 30 דקות כדי להבטיח כי הצלחת היא נטולת מים.
- לאחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס לפני ציפוי למין במשך יום אחד לכל היותר. אחסון הצלחת ב -20 מעלות צלזיוס עדיף לאחסון לטווח ארוך.
- להפשיר למין ב 4 מעלות צלזיוס. לדלל למין עם ddH2O לריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל כמו מלאי למין. אחסן את המלאי ב -20 °C (69 °F), ולהפשיר ב 4 °C (69 °F) לפני השימוש.
- השתמש פיפטה להעביר 100 μL של למין מדולל לחלק העליון של כל כריכה דגירה למינצין ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות.
הערה: עבור צלחות שונות עם אזורי בסיס שונים, להתאים את הריכוז ל 5 מיקרוגרם / ס"מ2. לדוגמה, אם אזור הבסיס של באר אחת מצלחת 24 באר הוא 2 ס"מ2, ואז להעביר 200 μL של למין מדולל בבאר. כל ס"מ2 יכיל 5 מיקרוגרם של למין. - הסר את תמיסת למינין, ולשטוף coverslips עם ddH2O פעם אחת. בצע פעולה זו בקצה ה- coverslip כדי למנוע גירוד.
הערה: כיסויים מצופים ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 שבועות לכל היותר.
2. קציר שלפוחית השתן
- תשיג חולדות ספראג-דוולי בנות חמישה שבועות.
- להחדיר קרבוגן (95% חמצן, 5% CO2) לתוך הפתרון קרבס לפחות 30 דקות באמבט קרח כדי להגיע למצב חמצן יציב ורמת pH.
- לאחר המתת חסד באמצעות נקע בצוואר הרחם, להשרות את החולדות ב 75% אתנול עבור 30 s עבור עיקור.
- מניחים חולדות על מגבת כירורגית מעוקרת וחושפים את הבטן. פתח את חלל הבטן, ולחשוף את שלפוחית השתן עם קבוצה של מספריים ומלקחיים.
- הרם את שלפוחית השתן בעדינות וחתך את שלפוחית השתן מצוואר שלפוחית השתן עם קבוצה נוספת של מספריים ומלקחיים כדי למנוע זיהום צולב. מניחים את שלפוחית השתן במהירות בתמיסת קרבס קרה ויציבה לחמצן כדי לשפר את הישרדות התאים.
הערה: לאחר הסרת שלפוחית השתן, בצע את הפעולות הבאות במהירות כדי לשפר את הסיכוי להישרדות הנוירון. - מוסיפים את תמיסת קרבס לשלוש מנות זכוכית ושוברי זכוכית.
- הכינו מנות זכוכית ושוברי זכוכית עם תמיסת קרבס באמבט קרח לצביעה מוקדמת.
- סמן גורמים מכילים אלה במספרים 1-3 בהתאמה כדי למנוע בלבול.
- יש לזווג כל צלחת זכוכית עם מלקחיים ומפריד גרעיני כפות.
- בצלחת זכוכית 1, חותכים לפתוח את שלפוחית השתן עם מספריים עיניים, ולפתח אותו עם מלקחיים ומפריד גרעין כפיות.
- שוטפים את שלפוחית השתן במפסק זכוכית 1, ומניחים אותה בצלחת זכוכית 2.
- לחסל שומן דבק על פני הרקמה באמצעות מלקחיים ומספריים עיניים בצלחת זכוכית 2.
- שוטפים את שלפוחית השתן במפסק זכוכית 2, ומניחים אותה בצלחת זכוכית 3.
- בעדינות לגרד את שלפוחית השתן באמצעות מלקחיים ואת הכפות גרעין מחלק על צלחת זכוכית 3 כדי להסיר קבצים מצורפים אקסוגני.
- לשטוף את שלפוחית השתן במפסק זכוכית 3, להעביר את שלפוחית השתן לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל עם 14 מ"ל של פתרון קרבס קר, ולסובב את המדגם במשך 1 דקות ב 356 x גרם ו 4 מעלות צלזיוס.
- חזור על השלב הקודם פעמיים בשני צינורות אחרים עם פתרון קרבס כדי להפחית את הזיהום.
3. עיכול שלפוחית השתן דו-שלבי
- מעבירים את שלפוחית השתן מצינור הצנטריפוגה לבקבוקון 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסת עיכול 1. השתמש מספריים עיניים לחתוך את שלפוחית השתן לחתיכות קטנות (קטן מ 1 מ"מ) בתמיסה.
- מערבבים את פתרון שלפוחית השתן עם 9 מ"ל של פתרון עיכול 1 בצלחת תרבות תאים סטרילית (קוטר 100 מ"מ). בצע עיכול שלב 1 באינקובטור רועד במשך שעה תחת 5% CO2,37 °C (60 °F) ו 200 סל"ד.
- לאחר עיכול שלב 1, צנטריפוגה הפתרון ב 356 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות.
- מניחים את פתרון העיכול 2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס להתחממות מוקדמת.
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant המכיל פתרון עיכול 1, ולקצור את משקעים התא. חלק מהנוזל הנותר מותר. הסרה מלאה של הפתרון עשויה לקדם אובדן תאים.
- מערבבים משקעים בתאים עם תמיסת עיכול חמה 2 בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ומנערים את התערובת תוך כדי עיכול באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. אין לחרוג מ-7 דקות של עיכול שלב 2 או שתאי עצב יעברו.
- לאחר העיכול, מיד להשבית טריפסין בתערובת עם 10 מ"ל של מדיה לשטוף קר.
הערה: בצע את השלבים הבאים ב- 0 °C (70 °F) עד 4 °C (69 °F). אמבטיית קרח יכולה לספק מצב כזה. - לקצור את משקע התא לאחר צנטריפוגה ב 356 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות. הסר מדיה רבה ככל האפשר, כי טריפסין הנותרים מזיקים לצמיחת תאים.
- משקעים resuspend עם 3 מ"ל של מדיה נוירון בעדינות. ודא כי בועות אוויר אינן נוצרות בתמיסה המכילה תאים לשיעור הישרדות גבוה.
- סנן את המדיה תערובת דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
- שמור את הסינון על שייקר ב 30 סל"ד באמבט קרח במשך 30 דקות. שלב זה אינו נחוץ אך מומלץ.
- לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 356 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 דקות, בעדינות resuspend כדורי התא ב 1 מ"ל של מדיה נוירון A.
- מוסיפים 500 μL של תערובת תאים לתוך כל באר של צלחת 48-באר מוכן.
- תאי תרבות באינקובטור ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
- החלף את כל המדיה עם מדיה נוירון B ב 1 שעות כדי לספק תרבות ללא סרום.
- לשנות מחצית מדיה נוירון B כל 3 ימים.
הערה: נוירונים מוכנים לניסויים אימונוציטוכימיים לאחר 5-7 ימים של תרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתהליך של תרבות תאים ראשית, התאים שנרכשו היו עגולים עם גבולות בהירים וברורים לפני המצב המצורף. ככל שהנוירונים גדלו, דנדריטים ואקסונים החלו להיות ברורים. לאחר 5-7 ימים של תרבות, הנוירונים הגיעו לצורה בוגרת עם תחזיות ארוכות, שהיו אידיאליות למחקרי הדמיה או תפקוד. למרות שניתן היה להסיר את רוב הזיהומים ופסולת התאים עקב מדיה משתנה, ניתן היה לראות שאריות מסוימות המחוברות לציפוי פולי-די-ליצין ולמינין(איור 1).
לאחר התרבות הנכונה, נוירונים ניתן לזהות באמצעות β-III-tubulin טיפוסי MAP-2 immunostaining10,12. בנוסף, גליה זוהתה במיוחד באמצעות חיסון GFAP10. נוירונים בוגרים פיתחו קוצים סינפטיים, שהיו קרובים להתמחויות הפרסינפטיות שזוהו על ידי המערכת החיסונית של יצרנית החלבון הסינפטי, סינפסין-1 (איור 2)12. תוצאות אלה הצביעו על כך שתאים בוגרים עם סינפסות מפותחות התקבלו באמצעות שיטה זו. תוצאה זו מרמזת על תפקידה החשוב במחקרי פונקציה עתידיים.
בינתיים, כמה תת-סוגים של נוירונים זוהו באמצעות ניסויים אימונוציטוכימיים (איור 3). נוירונים פפטידרגיים, המכילים נוירופפטידים שונים, היו immunostained עם חומר P13. נוירונים Purinergic עם מובילי נוקלאוטידים כלי רכב לידי ביטוי זוהו באמצעות SLC17A9 מכתים14. נוירונים ניטרגיים היו דמיינו עם DYNLL-2, אשר מחבר nNOS עם חלבונים מוטוריים נוירונים15. נוירונים שימוש היו immunoreactive עם אצטילטרנספראז כולין16.
איור 1. תמונות חדות פאזה של תאים ראשוניים מבודדים מתרבות שלפוחית השתן החולדה נלקח ב 1, 3, ו 7 ימים לאחר ציפוי (A, B, C, בהתאמה). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. תמונות אימונופלואורסצנטיות של תאים ראשוניים מבודדים משלפוחית השתן של החולדה. ניתוח מיקרוסקופי Confocal הראה כתם חלבון cytoskeleton נוירון (β-III-tubulin, RRID: AB_2827688, 1:200) בנוירונים תרבות ראשונית (A) ובהכנה שלמה של שלפוחית השתן הר (B). בתרבית הנוירונים העיקריים, חיסון פוספופרוטאין עצבי (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) היה גם הדמיה (C). גליה זוהתה באמצעות כתמי חלבון חומצי פרפור גליה (D; AB_627673, 1:50). סינפסינים היו דמיינו באמצעות כתמי חלבון סינפסין (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) ברמות הסלולר (E) ורקמות (F). הנוגדנים המשניים המשמשים היו כדלקמן: אלקסה פלואור 488 (ירוק, עז נגד ארנב lgG, 1:200), אלקסה פלואור 555 (אדום, עז נגד עכבר lgG, 1:200). הגרעין היה חזותי באמצעות Hoechst 33342(A, C, D, E; כחול, 1 מיקרוגרם / מ"ל). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תמונות חיסוניות של מספר תת-סוגים של נוירונים של נוירונים ראשוניים. נוירונים פפטידרגיים היו immunostained עם חומר P (A; AB_785913, 1:50). נוירונים פורינרגיים זוהו באמצעות כתמי SLC17A9 (B; AB_10597575, 1:200). נוירונים ניטרגיים היו דמיינו באמצעות כתמי DYNLL-2 (C; AB_654147, 1:50). נוירונים שימוש היו immunoreactive עם כולין אצטילטרנספראז (D; AB_2244867, 1:100). הנוגדנים המשניים המשמשים היו כדלקמן: אלקסה פלואור 488 (ירוק, עז נגד ארנב lgG, 1:200), אלקסה פלואור 555 (אדום, עז נגד עכבר lgG, 1:200). הגרעין היה דמיין באמצעות Hoechst 33342(A, B, C, D,כחול, 1 מיקרוגרם / מ"ל). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מרכיבים | טוחנות (mM) |
| NACI | 120 |
| KCI | 5.9 |
| נהקו3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CACI2 | 2.5 |
| גלוקוז | 11.5 |
שולחן 1. הרכב פתרון קרבס
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכנת צלחת
השימוש בכיסויי זכוכית בצלחות תרבות של 6, 12 או 48 בארות לניסויים אימונופלואורסצנטיים או הדמיית סידן הוא פעולה חסכונית וחוסכת מדגם. תאים גדלים היטב בצלחות ללא כיסויים במהלך הכנת תרביות תאים ראשוניות. לכן, כיסויים ניתנים לוותר בניסויים, כגון כתם מערבי או תגובת שרשרת פולימראז. יתר על כן, ציפוי הוא צעד הכרחי לפני ציפוי תאים, עם או בלי כיסויים. למין ופולי-D-ליצין הן אפשרויות נפוצות בנוירונים ציפוי, במיוחד למין, אשר חיוני לצמיחה נוירון17.
הכנת מדיה
לאחר החלפה בינונית ראשונה, בידוד תאים דורש מדיה ללא סרום מכיוון שהסרום מגרה את חלוקת התאים ומוביל למרחב גידול נוירונים מוגבל18. לכן, גורמי גדילה נוירון הם קריטיים. האיכות של B27 ו- GDNF יכולה להשתנות במידה רבה מאצוות שונות ולגרום להשפעות משמעותיות על צמיחת הנוירונים19. לכן, בדיקת מספר הרבה של התקשורת מומלץ כאשר התשואה נוירון הוא עני. בינתיים, מניות התקשורת הטרייה הן קריטיות; יש לחשב ולהכין את הסכום הנדרש מראש בכל פעם לפני החלפת המדיה.
חיות
בשיטה זו נעשה שימוש בחולדות ספראג-דוולי. עכברי C57BL/6 מקובלים גם בניסוי זה. לכן, זנים אחרים של חולדות או עכברים עשויים גם להיות מאומצים עבור שיטה זו למרות כמה וריאציות מורפולוגיה מעגלים עצביים. במונחים של מודלים שונים של בעלי חיים, החוקרים צריכים לפתח פרוטוקול ממוטב וממוקד. יתר על כן, בעלי חיים צעירים תמיד צריך להיחשב לפני היישום של שיטה זו.
טיפול ברקמות
במהלך הניסויים, למעט תהליך העיכול, שמירה על רקמות בטמפרטורה נמוכה היא חיונית כדי להגדיל את הכדאיות של התא, אשר יכול להפחית את חילוף החומרים של התא ולמנוע גירעון באנרגיה. רמות חמצן, תזונה, ו- pH יכול להשפיע גם על תשואת התא11. יתר על כן, עבור רקמות אחרות, אנו מציעים כי החוקרים לבצע שיטה זו עם מצב עיכול מותאם.
תרבות תאים
מאפיין מדהים אחד של נוירונים כאשר מחוסנים הוא הדבקות המהירה שלהם צלחות מצופות20. במקרה זה, שינוי מדיה לאחר 1 h של תרבות מומלץ להשיג שיעור גבוה של נוירונים. יתר על כן, כאשר רוב התאים מתחילים לגדול פסאודופודיום, התדירות של שינוי מדיה ניתן להפחית כראוי בהתאם לצבע של התקשורת ואת המצב הסלולרי. תרבות תאים ראשית במצב טוב מציגה סומה שחורה עם גבול בהיר.
רוב תאי העצב המבודדים משלפוחית השתן הם גרעינים תוך-ורידיים בשלפוחית השתן, המורכבים מתוך פנימיות אדישה ואוטונומית של שלפוחית השתן13. יתר על כן, אין גרעיני אגן גדולים נוכחים ברקמה שנקטפו. הוא מתחלק מתחת לצוואר שלפוחית השתן21.
מגבלה
זהו מחקר ראשוני לבידוד ותרבות נוירונים וגליה. ניסיונות רבים נעשו, כמו טיפול ציטארבין או צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. עם זאת, חלקם של התאים הרצויים עדיין לא היה אידיאלי, ואובדן תאים עוד יותר הופיע. יתר על כן, תנאי העיכול המסורתיים בפרוטוקול זה, כגון 37 מעלות צלזיוס, עלולים להרוג כמה סוגים של נוירונים רגישים, ולגרום לביטוי גנים פוטנציאלייםממצאים 22.
לסיכום, פרוטוקול זה מציע שיטה לתרבות נוירונים גליה של שלפוחית השתן חולדה. הבידוד קל לחזרה, יעיל בזמן, וכרוך בזיהום מיקרוביאלי מינימלי. למרות שיפור לעורר את הטוהר של נוירונים יש צורך, אנו מקווים שיטה זו תורמת למחקר LUTNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים גדול.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס ' 81673676) ולשכת המדע והטכנולוגיה של דונגגוואן (גרנט מס ' 2019622101002). המחברים מודים לד"ר מרירוז סאליבן (פרופסור לכירורגיה, בית הספר לרפואה של הרווארד) על ייעוץ טכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants - A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G.
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
