Summary
이 프로토콜은 추가 세포 실험을 위한 쥐 방광에서 1 차적인 신경세포 및 glia 격리를 위한 반복가능한 프로토콜을 설치하기 위하여 시도합니다.
Abstract
낮은 요로는 두 가지 주요 기능, 즉, 주기적인 소변 저장 및 배뇨; 이러한 기능은 중앙 및 말초 신경 조절을 통해 중재됩니다. 낮은 요로 신경계에 대한 광범위한 연구가 실시되었지만 대부분의 연구는 1 차 문화에 초점을 맞추고 있습니다. 이 프로토콜은 스프라그-Dawley 쥐에서 방광 뉴런과 glia의 격리 및 문화에 대한 방법을 소개합니다. 이 방법에서, 뉴런과 glia는 5-7 일 동안 37 °C, 5 % CO2 인큐베이터에서 배양되었다. 그 결과, 그(것)들은 관련 후속 면역 형광 실험에 적합한 성숙한 모양으로 성장했습니다. 세포는 광학 현미경을 사용하여 형태학적으로 관찰되었다. 뉴런, 시냅스 소포 및 glia는 각각 β-III-tubulin 및 MAP-2, 시냅신-1 및 GFAP 염색에 의해 확인되었다. 한편, 면역세포화학은 콜린 아세틸트랜스퍼라제, DYNLL2 및 SLC17A9와 같은 여러 신경전달물질 관련 단백질에서 수행되었다.
Introduction
하부 요로에는 두 가지 주요 기능이 있습니다: 주기적인 소변 저장 및 배뇨1. 하부 요로 신경계(LUTNS)는 이러한 기능을 제어하고 많은 신경병증에 섬세하고 민감하며, 이는 선천적(포르피리아), 획득(라임병), 질병 상태(당뇨병 세포질), 약물 유도(출혈성 방광염), 수술 발생(복부 절제술 절제술, 4, 외상성 척추 상해, 4, 외상성 척추 상해, 4, 외상성 척추 손상, 4, 외상성 척추 손상, 3) 및 상해(외상성 척추 손상, 3) 및 상해(외상성 척추 손상, 5, 외상성 척추 손상,3) 생리적/병리학 연구에서 생체 내 및 체외 실험도 똑같이 중요합니다. LUTNS에 대한 생체 내 연구는 장기, 세포 및 분자 수준에서 한동안 수행되었지만, 오줌 방광에서 1 차 적인 뉴런에 대한 체외 연구는 거의 존재하지 않는8,9. 본 연구는 제한적이지만, 우리는 다른 연구자들이 그것을 개선할 수 있도록 이 지역에 있는 연구를 개척하기를 희망합니다. 이러한 방식으로, 이러한 공동 배양은 방광 뉴런 기능 장애와 같은 표현형에 있는 생리적 기능 장애의 세포 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.
근육 세포의 명확한 방향성을 가진 장내 근육과 는 대조적으로, 방광의 근육은 조직되지 않습니다10. 따라서 방광의 외부 층을 벗겨내는 대신, 이 방법은 방광 전체를 소화하여 작동의 어려움을 줄이고 높은 세포 생존율에 대한 전처리 시간을 단축할 것을 제안합니다.
이 방법에 따라, 우리는 뉴런 과 다른 세포의 혼합 배양을 얻을 수 있습니다. 그들의 존재는 생체 내환경(11)을모방하기 때문에 다른 세포는 필수 불가결하다. 또한, 이러한 세포는 배지에서 사용할 수 없는 물질을 제공한다.
이 방법은 소화를 위한 두 단계를 포함합니다. 먼저, 콜라게나아제 형 II는 콜라겐을 가수분해하는 데 사용되며, 트립신이 이어서 조직을세포(10)로해리한다. 이런 식으로, 방광 조직은 단 하나 세포로 분산되고 그 때 상대적으로 독립적으로 성장합니다. 뉴런의 문화가 성숙할 때, 뉴런은 화상 진찰 또는 기능적인 소사에 사용될 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 프로토콜과 동물 절차는 국가 연구 위원회의 윤리적 원칙 지침을 준수했다.
1. 재료 의 준비
- 실험을 수행하기 전에 자동 복제를 사용하여 모든 기기및 ddH2O를 멸균합니다. 기기에는 수술 용 가위, 안과 가위, 집게, 숟가락 핵 칸막이, 유리 접시 (직경 60-100mm) 및 유리 차단기를 포함하지만 이에 국한되지 않습니다.
- 다음과 같이 Krebs 용액을 준비(표 1): 사용하기 전에 ddH2O와 함께 모든 화학 물질을 용해하십시오. CaCI2를 별도로 녹이고 침전물을 피하기 위해 교반하는 동안 혼합 용액에 천천히 추가합니다.
- 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 항생제 / 항진균 (100x)F12 미디어로 구성된 린스 미디어를 준비하십시오. F12 미디어의 44.5 mL에 FBS 5mL 및 항생제/항마이코틱의 0.5 mL를 추가합니다.
- 2% B-27, 1% FBS, 1% L-글루타민, 1% 항생제/항마이코틱(100x), 그리고 0.1% glia 유래 신경영양인(GDNF)을 포함하는 신경물질 A를 포함하는 신경 세포 A를 준비합니다. B-27의 200 μL, FBS 100 μL, L-글루타민 100 μL, 항생제/항진균제 100μL(100x), GDNF(10 μg/mL) 10μL를 신경분질 A 미디어의 9.5mL에 추가합니다.
참고: B-27, L-글루타민 및 GDNF의 신선도를 보장하기 위해 사용 후 1주일 이내에 뉴런 미디어 A를 준비합니다. - 뉴런 미디어 A의 준비와 동일한 절차를 사용 하 여 신경 미디어 B를 준비 하지만 FBS를 추가 하지 않고.
- 소화용액 10 mg의 콜라게나아제 타입 II, 소 세럼 알부민 6mg, 산소 안정크렙스 용액 10mL에서 항생제/항진균(100x)의 200μL를 용해하여 소화용액 1을 준비한다.
- 행크의 균형 잡힌 소금 용액 4mL로 0.25% 트립신 1mL을 희석하여 소화 용액 2를 준비합니다.
- 코팅 된 커버립접시를 준비합니다.
- 유리 커버립을 48웰 배양판에 넣을 때 라미나르 플로우 벤치에 집게를 사용하십시오.
- 폴리-D-리신을 ddH2O로 희석하여 폴리-D-lysine 재고로 0.1 mg/mL농도로 희석합니다. 재고를 -20°C에 보관하고 사용하기 전에 해동합니다.
- 각 커버슬립 위에 폴리-D-리신 스톡 40μL을 추가하고 실온에서 10분 동안 용액을 배양합니다.
참고: 기저 영역이 다른 플레이트의 경우 농도를 4 μg/cm2로조정합니다. 예를 들어, 24웰 플레이트로부터 1개의 우물의 기저면적이 2cm2인경우, 폴리-D-리신 재고의 80 μL을 잘 전달해야 한다. 각 cm2에는 폴리 D-리신 4μg가 포함됩니다. - 48웰 플레이트에서 폴리-D-리신을 제거하고, ddH2O 세 번으로 커버립을 헹구세요.
- 플레이트가 무수성인지 확인하기 위해 최소 30분 동안 라미나르 플로우 후드로 플레이트를 건조시다.
- 라미닌 코팅 전에 4°C에서 플레이트를 1일 동안 보관하십시오. 플레이트를 -20°C로 저장하는 것이 장기 보관에 바람직하다.
- 4 °C에서 라미닌을 해동하십시오. 라미닌 육수로 50 μg/mL의 농도로 ddH2O로 라미닌을 희석시하십시오. 재고를 -20°C로 저장하고 사용하기 전에 4°C에서 해동하십시오.
- 파이펫을 사용하여 희석된 라미닌 100μL을 각 커버슬립의 맨 위로 옮기고 라미닌을 4°C에서 1h로 배양한다.
참고: 기저 영역이 다른 플레이트의 경우 농도를 5 μg/cm2로조정합니다. 예를 들어, 24웰 플레이트로부터 하나의 우물의 기저 면적이 2cm2인경우, 희석된 라미닌200μL을 우물에 옮기는다. 각 cm2에는 라미닌 5μg가 포함됩니다. - 라미닌 용액을 제거하고 커버립을 ddH2O로 한 번 헹구는 다. 긁어방지를 위해 커버슬립 가장자리에서 이 작업을 수행합니다.
참고: 코팅된 커버립은 최대 2주 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.
2. 방광 수확
- 5주 된 스프라그-Dawley 쥐를 구하십시오.
- 안정적인 산소 상태와 pH 수준에 도달하기 위해 얼음 욕조에서 적어도 30 분 동안 크렙스 용액에 카보겐 (95 % 산소, 5 % CO2)을주입합니다.
- 자궁 경부 탈구를 통해 안락사 후, 살균을 위해 30 에탄올에 75 %의 쥐를 담그십시오.
- 소독 수술 수건에 쥐를 놓고 복부를 노출. 복강을 열고 가위와 집게 세트로 방광을 드러냅니다.
- 방광을 부드럽게 들어 올리고 방광목에서 방광을 다른 가위와 집게로 잘라 교차 오염을 방지합니다. 방광을 감기 산소 안정 크렙스 솔루션에 빠르게 배치하여 세포 생존을 향상시킵니다.
참고: 방광이 제거되면 다음 작업을 신속하게 수행하여 뉴런 생존 가능성을 개선하십시오. - 크렙스 용액을 세 개의 유리 요리와 유리 차단기에 추가합니다.
- 프리쿨링을 위해 얼음 욕조에 크렙스 용액으로 유리 접시와 유리 차단기를 준비합니다.
- 혼동을 방지하기 위해 해당 번호 1-3로 이러한 컨테이너를 표시합니다.
- 각 유리 접시에 집게와 숟가락 핵 분배기와 함께 페어링합니다.
- 유리 접시 1에서 안과 가위로 방광을 열고 집게와 숟가락 핵 칸막이로 펴놓습니다.
- 방광을 유리 차단기 1에 헹신 다음 유리 접시 2에 놓습니다.
- 유리 접시 2의 집게와 안과 가위를 사용하여 조직 표면에 부착 된 지방을 제거하십시오.
- 방광을 유리 차단기 2에 헹신 다음 유리 접시 3에 놓습니다.
- 집게와 숟가락 핵 분배기를 유리 접시 3에 사용하여 방광을 부드럽게 긁어 외인성 부착물을 제거합니다.
- 방광을 유리 차단기 3에서 헹구고, 방광을 14mL의 콜드 크렙스 용액으로 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고, 356 x g 및 4°C에서 1분 동안 샘플을 회전시합니다.
- 오염을 줄이기 위해 크렙스 용액을 사용하여 두 개의 다른 튜브에서 이전 단계를 두 번 반복합니다.
3. 2단계 방광 소화
- 원심분리기 관에서 1mL의 소화용액 1을 포함하는 2mL 바이알로 방광을 전달한다. 안과 가위를 사용하여 방광을 용액의 작은 조각 (1mm 보다 작은)으로 자른다.
- 방광 용액을 멸균 세포 배양 접시(직경 100mm)에 9mL의 소화용액 1과 섞는다. 5% CO2,37°C 및 200 rpm 미만의 1시간 동안 흔들리는 인큐베이터에서 1단계 소화를 수행합니다.
- 1단계 소화 후, 원심분리기는 용액을 4°C에서 356 x g에서 8분 동안 356 x g로 한다.
- 예열을 위해 37°C 수조에 소화용액 2를 놓습니다.
- 원심 분리 후, 소화 용액 1을 포함하는 상체를 제거하고 세포 퇴적물을 수확한다. 일부 남은 액체는 허용됩니다. 용액의 완전한 제거는 세포 손실을 촉진할 수 있다.
- 15mL 원심분리기 튜브에 따뜻한 소화용액 2와 세포 침전물을 섞고 37°C 수조에서 소화하면서 혼합물을 흔들어 5분 동안 섞는다. 단계 2 소화의 7 분 이상하지 마십시오 또는 뉴런은 멸망한다.
- 소화 후, 즉시 차가운 헹기 매체의 10 mL와 혼합물에 트립신을 비활성화합니다.
참고: 0°C-4°C에서 다음 단계를 수행합니다. 얼음 목욕은 그러한 상태를 제공 할 수 있습니다. - 원심분리 후 세포 퇴적물을 4°C에서 356 x g에서 8분 동안 수확하십시오. 남은 트립신이 세포 성장에 유해하기 때문에 가능한 한 많은 미디어를 제거하십시오.
- 3mL의 뉴런 미디어로 퇴적물을 부드럽게 재중단합니다. 높은 생존율을 위해 세포를 포함하는 용액에서 기포가 생성되지 않았는지 확인합니다.
- 70 μm 세포 스트레이너를 통해 혼합물 매체를 50mL 원심분리기 튜브로 필터링합니다.
- 30 분 동안 얼음 목욕에 30 rpm에 셰이커에 여과물을 유지합니다. 이 단계는 필요하지 않지만 권장됩니다.
- 4°C에서 356 x g에서 원심분리로 세포를 수거하고, 1mL의 뉴런 미디어 A에서 세포 펠릿을 부드럽게 재보냅니다.
- 준비된 48웰 플레이트의 각 웰에 500 μL의 셀 혼합물을 넣습니다.
- 37°C 및 5% CO2에서인큐베이터내의 배양 세포.
- 모든 미디어를 1h의 뉴런 미디어 B로 교체하여 혈청없는 문화를 제공합니다.
- 3일마다 뉴런 미디어 B의 절반을 변경합니다.
참고: 뉴런은 5-7일 간의 배양 후 면역 세포화학 실험을 위한 준비가 되어 있습니다.
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Representative Results
1 차 세포 배양 과정에서, 획득 된 세포는 부착 된 상태 전에 밝고 명확한 경계로 둥글게되었다. 뉴런이 성장함에 따라, 수상자와 축축은 구별되기 시작했다. 문화의 5-7 일 후에, 신경은 화상 진찰 또는 기능 연구 결과에 이상적이었던 긴 돌출을 가진 성숙한 양식에 도달했습니다. 대부분의 불순물 및 세포 파편은 변화하는 매체로 인해 제거될 수 있었지만, 폴리-D-리신 및 라미닌 코팅에 부착된 특정 잔류물이보였다(도 1).
적절한 배양 후, 전형적인 β-III-tubulin 및 MAP-2 면역염색10,12를통해 뉴런을 식별할 수 있었다. 또한, glia는 특히 GFAP 면역염색(10)을통해 확인되었다. 성숙한 뉴런은 시냅스 단백질 제조사, 시냅신-1(도2)12의면역염색에 의해 확인된 사전 시냅스 전문화에 가까웠던 시냅스 척추를 개발하였다. 이러한 결과는 잘 발달된 시냅스를 가진 성숙한 세포가 이 방법을 통해 얻어졌다는 것을 표시했습니다. 이 결과는 미래 기능 연구에서 중요한 역할을 제안합니다.
한편, 몇몇 뉴런 아류형은 면역세포화학실험(도 3)을통해 인식되었다. 다양한 신경 펩티드를 함유한 펩티드릭 뉴런은 물질 P13으로면역염색되었다. 발현 된 성구 뉴클레오티드 수송기를 가진 퓨너기뉴런은 SLC17A9 염색14를통해 확인되었다. Nitrergic 뉴런은 NNOS와 뉴런15의운동 단백질을 연결하는 DYNLL-2로 시각화되었다. 콜린 아세틸트랜스퍼라제(16)로수능 뉴런은 면역활성이었다.
그림 1. 도금 후 1, 3 및 7일 후에 취한 쥐 방광 배양으로부터 분리된 1차 세포의 위상 대비 이미지(A, B, C, 각각). 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 쥐 방광으로부터 분리된 1차 세포의 면역형광 이미지. 공초점 현미경 분석은 1 차적인 배양 신경(A)에서신경 세포골격 단백질 염색 (β-III-tubulin, RRID: AB_2827688, 1:200)와 전체 산 방광 준비(B)를보여주었습니다. 1차 배양뉴런에서는 뉴런 인포단백질 면역스테인팅(MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200)도시각화되었다(C). Glia는 신경교 세동 산성 단백질 염색을 통해 확인되었다(D; RRID: AB_627673, 1:50). 시냅신은 시냅신 단백질 염색(Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200)을세포(E)및조직(F)수준을 통해 시각화하였다. 사용된 이차 항체는 다음과 같습니다: 알렉사 플루어 488 (녹색, 염소 안티 토끼 lgG, 1:200), 알렉사 플루어 555 (빨간색, 염소 안티 마우스 lgG, 1:200). 핵은 Hoechst 33342(A, C, D, E;블루, 1 μg/mL)를 사용하여 시각화되었다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 1 차신경의 몇몇 뉴런 특수형의 면역 형광 심상. 펩티드르기크 뉴런은 물질P(A; RRID: AB_785913, 1:50). 퓨리너기세포는 SLC17A9염색(B; RRID: AB_10597575, 1:200). Nitrergic 뉴런은 DYNLL-2 염색(C)을 통해 시각화되었다. RRID: AB_654147, 1:50). 콜린 아세틸 트랜스퍼라제(D; RRID: AB_2244867, 1:100). 사용된 이차 항체는 다음과 같습니다: 알렉사 플루어 488 (녹색, 염소 안티 토끼 lgG, 1:200), 알렉사 플루어 555 (빨간색, 염소 안티 마우스 lgG, 1:200). 핵은 Hoechst 33342(A, B, C, D,파란색, 1 μg/mL)를 사용하여 시각화하였다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 재료 | 어모함 (mM) |
| 나시 (주) | 120 |
| KCI | 5.9 |
| 나에코3 | 25 |
| 나2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| 포도당 | 11.5 |
표 1. 크렙스 솔루션 조성
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Discussion
플레이트 준비
면역형광 또는 칼슘 이미징 실험을 위한 6-, 12 또는 48웰 배양 판에서 유리 커버립을 사용하는 것은 경제적이고 시료 절약 적인 동작입니다. 세포는 1 차적인 세포 배양의 준비 도중 커버립 없이 접시에서 잘 자랍니다. 따라서, 커버립은 서양 블롯 또는 폴리머라제 연쇄 반응과 같은 실험에서 분배할 수 있다. 또한, 코팅은 커버립의 유무에 관계없이 세포를 도금하기 전에 필요한 단계입니다. 라미닌과 폴리-D-리신은 신경 세포 성장에 필수적인 특히 라미닌을 코팅하는 일반적인 선택이다17.
미디어 준비
첫 번째 중간 치환 후, 세포 격리는 혈청이 세포 분열을 자극하고 제한된 뉴런 성장 공간으로 이어지기 때문에 혈청없이 미디어가필요합니다(18). 따라서, 신경 성장 인자는 중요 하다. B27 및 GDNF의 품질은 다른 배치에서 크게 다를 수 있으며 뉴런 성장에 큰 영향을 미칠 수있습니다 19. 따라서, 신경 수율이 좋지 때 미디어의 로트 수를 확인하는 것이 좋습니다. 한편, 신선한 미디어 주식은 매우 중요합니다. 필요한 금액은 미디어를 교체하기 전에 매번 미리 계산하고 준비해야 합니다.
마리
스프라그-Dawley 쥐는 이 방법에 사용됩니다. C57BL/6 마우스는 또한 이 실험에서 허용된다. 따라서, 쥐 또는 마우스의 다른 변종은 또한 형태학 및 신경 회로에 있는 몇몇 변이에도 불구하고 이 방법을 위해 채택될 수 있습니다. 다른 동물 모델의 관점에서, 연구원은 최적화되고 표적으로 한 프로토콜을 개발해야 합니다. 또한, 젊은 동물은 항상이 방법의 적용 전에 고려되어야한다.
조직 치료
실험 중, 소화 과정을 제외 하 고, 낮은 온도에서 조직을 유지 하는 것은 세포 생존을 증가 하는 데 필수적 이다, 세포 신진 대사를 줄일 수 있는 에너지 적자를 방지 할 수 있는. 산소 수준, 영양 및 pH는 세포 수율11에영향을 줄 수 있다. 또한, 다른 조직에 대 한, 우리는 연구원 조정 된 소화 조건으로이 방법을 수행 하는 것이 좋습니다.
세포 배양
접종 할 때 뉴런의 한 가지 놀라운 특성은 코팅 된 플레이트(20)에대한 빠른 준수입니다. 이 경우, 문화의 1 h 후 미디어를 변경 하는 신경의 높은 비율을 얻기 위해 권장 됩니다. 더욱이, 세포의 대부분이 의사 연단성장하기 시작하면, 미디어의 색상과 세포 상태에 따라 미디어 변화의 빈도가 적절하게 감소될 수 있다. 좋은 상태에서 1 차 세포 배양은 밝은 테두리를 가진 검은 색 소마를 표시합니다.
방광에서 분리된 대부분의 신경 세포는 방광13의방광 및 자율 방출 내분으로 구성된 방광 교내 신경리아입니다. 더욱이, 수확된 조직에는 주요 골반 간증이 존재하지 않습니다. 방광목(21)아래에 분포한다.
제한
이것은 고립시키고 배양 신경및 glia를 위한 예비 연구입니다. 시타라빈 치료 나 밀도 그라데이션 원심 분리와 같은 많은 시도가 수행되었습니다. 그러나, 원하는 세포의 비율은 아직도 이상적이지 않았고, 더 많은 세포 손실이 나타났습니다. 더욱이, 37°C와 같은 이 프로토콜의 전통적인 소화 조건은 일부 민감한 뉴런 유형을 죽이고 잠재적인 유전자 발현유물(22)을유발할 가능성이 있다.
결론적으로, 이 프로토콜은 쥐 방광에서 신경 세포와 glia를 배양하는 방법을 제공합니다. 격리는 반복하기 쉽고 시간 효율적이며 최소한의 미생물 오염이 수반됩니다. 뉴런의 순도를 연상시키는 개선이 필요하지만, 우리는이 방법이 LUTNS 연구에 기여하기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 큰 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연과학 재단(81673676)과 동관과학기술국(2019622101002)의 지원을 받았습니다. 저자는 메리 로즈 설리반 박사 (수술조교수, 하버드 의과 대학) 기술 컨설팅에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
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- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
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