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Neuroscience

वयस्क चूहा मूत्राशय से प्राथमिक न्यूरॉन्स और ग्लिया की अलगाव और संस्कृति

Published: May 23, 2020 doi: 10.3791/61177
Automatic Translation
1, 3, 1, 1, 1, 3, 1,2, 1,2
1School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, 2Dongguan & Guangzhou University of Chinese Medicine Cooperative Academy of Mathematical Engineering for Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, 3School of Basic Medical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल प्राथमिक न्यूरॉन्स और आगे सेलुलर प्रयोगों के लिए चूहा मूत्राशय से ग्लिया अलगाव के लिए एक दोहराने योग्य प्रोटोकॉल स्थापित करने का प्रयास करता है।

Abstract

निचले मूत्र पथ में दो मुख्य कार्य होते हैं, अर्थात् आवधिक मूत्र भंडारण और मिक्चरिशन; इन कार्यों को केंद्रीय और परिधीय न्यूरोरेगुलेशन के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है। हालांकि निचले मूत्र पथ तंत्रिका तंत्र पर व्यापक शोध किया गया है, ज्यादातर अध्ययनों प्राथमिक संस्कृति पर ध्यान केंद्रित किया है । यह प्रोटोकॉल स्प्राग-डावले चूहों से मूत्राशय न्यूरॉन्स और ग्लिया के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का परिचय देता है। इस विधि में, न्यूरॉन्स और ग्लिया को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर को 5-7 दिनों तक इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटेड किया गया था। नतीजतन, वे संबंधित बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों के लिए उपयुक्त परिपक्व आकार में वृद्धि हुई। कोशिकाओं को ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रूपात्मक रूप से देखा गया था। न्यूरॉन्स, सिनैप्टिक वेसिकल्स और ग्लिया की पहचान क्रमशः β-III-ट्यूबलिन और एमएपी-2, सिनैप्सिन-1 और जीएफएपी स्टेनिंग द्वारा की गई थी । इस बीच, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री कई न्यूरोट्रांसमीटर से संबंधित प्रोटीन, जैसे कोलीन एसीटिलट्रांसफरेज, DYNLL2, और SLC17A9 पर किया गया था ।

Introduction

निचले मूत्र पथ में दो मुख्य कार्य होते हैं: आवधिक मूत्र भंडारण और मिक्चरिशन1। निचला मूत्र पथ तंत्रिका तंत्र (LUTNS) इन कार्यों को नियंत्रित करता है और कई न्यूरोपैथी के लिए नाजुक और अतिसंवेदनशील होता है, जो जन्मजात (पोर्फिरिया), अधिग्रहीत (लाइम रोग), माध्यमिक से रोग राज्यों (मधुमेह सिस्टोपैथी), दवा प्रेरित (रक्तस्रावी सिस्टिटिस), सर्जरी के कारण (एब्डोमिनोपिनियल रीसेक्शन), या चोट के कारण (दर्दनाक रीढ़ की हड्डी की चोट)2,3,4,5,6, 7हो सकती है। शारीरिक/रोग अध्ययनों में, वीवो में और इन विट्रो प्रयोग समान रूप से महत्वपूर्ण हैं । जबकि LUTNS पर वीवो अनुसंधान में कुछ समय के लिए अंग, सेलुलर, और आणविक स्तर पर आयोजित किया गया है, मूत्राशय से प्राथमिक न्यूरॉन्स पर इन विट्रो अनुसंधान लगभग अस्तित्वहीन8,9है । हालांकि वर्तमान अध्ययन सीमित है, हम इस क्षेत्र में अग्रणी अनुसंधान की उम्मीद है ताकि अन्य शोधकर्ताओं ने इसे बेहतर बना सकते हैं। इस तरीके से, इस सह-संस्कृति से फेनोटाइप में शारीरिक शिथिलता की सेलुलर समझ हो सकती है, जैसे मूत्राशय न्यूरॉन डिसफंक्शन।

मांसपेशियों की कोशिकाओं की स्पष्ट दिशात्मकता के साथ आंत्र मांसपेशियों के विपरीत असतत परतों में, मूत्राशय की मांसपेशियां असंगठित10हैं। इसलिए, मूत्राशय की बाहरी परत को छीलने के बजाय, इस विधि में ऑपरेशन की कठिनाई को कम करने और उच्च सेल जीवित रहने की दर के लिए प्रीप्रोसेसिंग समय को छोटा करने के लिए पूरे मूत्राशय को पचाने का प्रस्ताव है।

इस विधि के बाद, हम न्यूरॉन्स और अन्य कोशिकाओं की मिश्रित संस्कृति प्राप्त कर सकते हैं। अन्य कोशिकाएं अपरिहार्य हैं क्योंकि उनकी उपस्थिति वीवो वातावरण में एक की नकल करती है11. इसके अलावा ऐसी कोशिकाएं ऐसे पदार्थ उपलब्ध कराती हैं जो माध्यम में अनुपलब्ध हैं।

इस विधि में पाचन के लिए दो कदम शामिल हैं। सबसे पहले, कोलेजने प्रकार II का उपयोग हाइड्रोलाइज कोलेजन के लिए किया जाता है, इसके बाद ट्राइप्सिन द्वारा ऊतक को कोशिकाओं में अलग करने के लिए10। इस तरीके से, मूत्राशय के ऊतकों को एकल कोशिकाओं में फैलाया जाता है और फिर अपेक्षाकृत स्वतंत्र हो जाता है। जब न्यूरॉन्स की संस्कृति परिपक्व होती है, तो न्यूरॉन्स का उपयोग इमेजिंग या कार्यात्मक परख के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल और पशु प्रक्रियाओं ने राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद के नैतिक सिद्धांत दिशा-निर्देशों का पालन किया ।

1. सामग्री की तैयारी

  1. प्रयोग करने से पहले एक ऑटोक्लेव का उपयोग करके सभी उपकरणों और डीडीएच2ओ को निष्फल करें। उपकरणों में शामिल हैं, लेकिन सर्जिकल कैंची, नेत्र कैंची, संदंश, चम्मच नाभिक डिवाइडर, कांच के व्यंजन (व्यास में 60-100 मिमी), और कांच तोड़ने तक ही सीमित नहीं हैं।
  2. क्रेब्स समाधान को इस प्रकार तैयार करें(तालिका 1):उपयोग से पहले सभी रसायनों को डीएच2ओ के साथ एक साथ भंग करें। CaCI2 को अलग से भंग करें और तलछट से बचने के लिए सरगर्मी करते हुए मिश्रित समाधान में धीरे-धीरे जोड़ें।
  3. कुल्ला मीडिया तैयार करें, जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक (100x) के साथ F12 मीडिया शामिल हैं । एफबीएस के 5 एमएल और 0.5 एमएल एंटीबायोटिक/एंटीमाइकॉटिक को 44.5 एमएल F12 मीडिया में जोड़ें।
  4. न्यूरॉन मीडिया ए तैयार करें, जिसमें 2% बी-27, 1% एफबीएस, 1% एल-ग्लूटामाइन, 1% एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक (100x) और 0.1% ग्लिया-व्युत्पन्न न्यूरोट्रोफिक फैक्टर (GDNFNF) के साथ न्यूरोबेसल ए मीडिया शामिल है। बी-27 के 200 माइक्रोन, एफबीएस के 100 माइक्रोन, एल-ग्लूटामाइन के 100 माइक्रोन, एंटीबायोटिक/एंटीमायकोटिक (100x) के 100 माइक्रोन और जीडीएनएफ के 10 माइक्रोन (10 माइक्रोन/एमएल) को न्यूरोबासल ए मीडिया के 9.5 एमएल में जोड़ें।
    नोट: बी-27, एल-ग्लूटामाइन और जीडीएनएफ की ताजगी सुनिश्चित करने के लिए उपयोग के एक सप्ताह के भीतर न्यूरॉन मीडिया ए तैयार करें।
  5. न्यूरॉन मीडिया ए की तैयारी के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर न्यूरॉन मीडिया बी तैयार लेकिन FBS जोड़ने के बिना।
  6. पाचन समाधान तैयार करें 1 कोलेजनेस टाइप II, 6 मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन, और ऑक्सीजन-स्थिर क्रेब्स समाधान के 10 एमएल में एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक (100x) का 200μL घोलकर।
  7. हैंक के संतुलित नमक समाधान के 4 मिलील के साथ 0.25% ट्राइपसिन के 1 मिलील को कमजोर करके पाचन समाधान 2 तैयार करें।
  8. लेपित कवर्लिप्स के साथ एक प्लेट तैयार करें।
    1. 48-अच्छी संस्कृति प्लेट में ग्लास कवरलिप रखते समय लेमिनार प्रवाह बेंच में संदंश का उपयोग करें।
    2. डीएच2ओ के साथ तनु पॉली-डी-lysine पॉली-डी-lysine स्टॉक के रूप में ०.१ मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के लिए । स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और उपयोग से पहले गल जाएं।
    3. प्रत्येक कवरस्लिप के शीर्ष पर पॉली-डी-lysine स्टॉक के 40 μL जोड़ें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान इनक्यूबेट।
      नोट: विभिन्न बेसल क्षेत्रों के साथ विभिन्न प्लेटों के लिए, एकाग्रता को 4 μg/सेमी2में समायोजित करें । उदाहरण के लिए, यदि 24-अच्छी प्लेट से एक कुएं का बेसल क्षेत्र 2 सेमी2है, तो हमें पॉली-डी-lysine स्टॉक के 80 माइक्रोल को एक कुएं में स्थानांतरित करना चाहिए। प्रत्येक सेमी2 में पॉली-डी-lysine के 4 माइक्रोन शामिल होंगे।
    4. 48-वेल प्लेट में पॉली-डी-lysine निकालें, और डीडीएच2ओ के साथ कवरस्लिप को तीन बार कुल्ला करें।
    5. प्लेट को कम से कम 30 मिनट के लिए लैमिनार प्रवाह हुड में सुखा लें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्लेट निर्जल है।
    6. सबसे कम 1 दिन के लिए लेमिनिन कोटिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्टोर करें। प्लेट को −20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करना दीर्घकालिक भंडारण के लिए बेहतर है।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर गल लैमिनिन। लैमिनिन स्टॉक के रूप में 50 μg/mL की एकाग्रता के लिए डीडीएच2ओ के साथ पतला लेमिनिन। स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर गल जाएं।
    8. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक कवरलिप और इनक्यूबेट लैमिनिन के शीर्ष पर पतला टुकड़े के 100 माइक्रोन स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
      नोट: विभिन्न बेसल क्षेत्रों के साथ विभिन्न प्लेटों के लिए, एकाग्रता को 5 माइक्रोन/सेमी2में समायोजित करें । उदाहरण के लिए, यदि 24-अच्छी प्लेट से एक कुएं का बेसल क्षेत्र 2 सेमी2है, तो एक कुएं में पतला लेमिनिन के 200 माइक्रोन स्थानांतरित करें। प्रत्येक सेमी2 में 5 माइक्रोन लैमिनिन होता है।
    9. लैमिनिन समाधान निकालें, और एक बार डीडीएच2ओ के साथ कवर्लिप्स कुल्ला। स्क्रैपिंग से बचने के लिए कवरस्लिप के किनारे पर इस ऑपरेशन को करें।
      नोट: लेपित कवरस्लिप को 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. मूत्राशय की फसल

  1. पांच सप्ताह पुराने स्प्राग-डावले चूहों को प्राप्त करें।
  2. एक स्थिर ऑक्सीजन स्थिति और पीएच स्तर तक पहुंचने के लिए एक बर्फ स्नान में कम से कम 30 मिनट के लिए क्रेब्स समाधान में कार्ब्स समाधान में कार्बोजन (95% ऑक्सीजन, 5% सीओ2)का संचार करें।
  3. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से इच्छामृत्यु के बाद, नसबंदी के लिए 30 एस के लिए 75% इथेनॉल में चूहों को भिगोएं।
  4. एक निष्फल सर्जिकल तौलिया पर चूहों रखें और उनके पेट का पर्दाफाश करें। पेट की गुहा खोलें, और कैंची और संदंश के एक सेट के साथ मूत्राशय प्रकट करें।
  5. मूत्राशय को धीरे से उठाएं और मूत्राशय की गर्दन से मूत्राशय को कैंची और संदंश के एक अन्य सेट के साथ काट लें ताकि क्रॉस-संदूषण से बचा जा सके। कोशिका अस्तित्व में सुधार करने के लिए मूत्राशय को ठंडे ऑक्सीजन-स्थिर क्रेब्स समाधान में तेजी से रखें।
    नोट: एक बार मूत्राशय हटा दिया जाता है, न्यूरॉन अस्तित्व की संभावना में सुधार करने के लिए तेजी से निम्नलिखित आपरेशनों प्रदर्शन करते हैं।
  6. तीन ग्लास व्यंजन और कांच तोड़ने वालों में क्रेब्स समाधान जोड़ें।
  7. प्रीकूलिंग के लिए आइस बाथ में क्रेब्स सॉल्यूशन के साथ ग्लास व्यंजन और ग्लास ब्रेकर तैयार करें।
  8. भ्रम को रोकने के लिए इन कंटेनरों को 1-3 नंबरों के साथ तदनुसार चिह्नित करें।
  9. प्रत्येक ग्लास डिश को संदंश और एक चम्मच नाभिक डिवाइडर के साथ पेयर करें।
  10. ग्लास डिश 1 में, मूत्राशय को नेत्र कैंची से खोलें, और इसे संदंश और एक चम्मच नाभिक डिवाइडर के साथ प्रकट करें।
  11. कांच के ब्रेकर में मूत्राशय कुल्ला 1, और यह कांच पकवान 2 में जगह है।
  12. कांच के पकवान 2 में संदंश और नेत्र कैंची का उपयोग कर ऊतक सतह पर अनुयायी वसा को खत्म करें।
  13. कांच के ब्रेकर 2 में मूत्राशय कुल्ला, और यह कांच पकवान 3 में जगह है।
  14. धीरे-धीरे एक्सोजेनस अटैचमेंट को हटाने के लिए कांच के पकवान 3 पर संदंश और चम्मच नाभिक डिवाइडर का उपयोग करके मूत्राशय को परिमार्जन करें।
  15. कांच के ब्रेकर 3 में मूत्राशय कुल्ला, ठंड क्रेब्स समाधान के 14 एमएल के साथ एक 15 मिलीएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए मूत्राशय हस्तांतरण, और 356 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए नमूना स्पिन।
  16. संदूषण को कम करने के लिए क्रेब्स समाधान के साथ दो अन्य ट्यूबों में पिछले चरण को दो बार दोहराएं।

3. दो कदम मूत्राशय पाचन

  1. मूत्राशय को सेंट्रलाइज ट्यूब से 2 एमएल शीशी में स्थानांतरित करें जिसमें पाचन समाधान 1 का 1 एमएल होता है। समाधान में मूत्राशय को छोटे टुकड़ों (1 मिमी से छोटे) में काटने के लिए नेत्र कैंची का उपयोग करें।
  2. मूत्राशय के घोल को एक बाँझ सेल कल्चर डिश (व्यास में 100 मिमी) में पाचन समाधान 1 के 9 मिलीलन के साथ मिलाएं। 5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस और200आरपीएम के तहत 1 घंटे के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में चरण 1 पाचन करें।
  3. चरण 1 पाचन के बाद, 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 356 x ग्राम पर समाधान को अपकेंद्रित्र करें।
  4. पाचन समाधान 2 को प्रीहीटिंग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें।
  5. अपकेंद्रित्र के बाद, पाचन समाधान 1 शामिल सुपरनेट को हटा दें, और कोशिका तलछट को फसल करें। कुछ शेष तरल की अनुमति है। समाधान को पूरी तरह से हटाने से सेल हानि को बढ़ावा दिया जा सकता है।
  6. 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में गर्म पाचन समाधान 2 के साथ सेल तलछट मिलाएं, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पचाने के दौरान मिश्रण को हिलाएं। चरण 2 पाचन के 7 मिनट से अधिक न करें या न्यूरॉन्स नष्ट हो जाएंगे।
  7. पाचन के बाद, तुरंत 10 मिलीएल ठंड कुल्ला मीडिया के साथ मिश्रण में ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करें।
    नोट: 0 डिग्री सेल्सियस-4 डिग्री सेल्सियस पर निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें। एक आइस बाथ ऐसी स्थिति प्रदान कर सकता है ।
  8. 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 356 x g पर अपकेंद्रित्र के बाद सेल तलछट फसल। जितना संभव हो उतना मीडिया निकालें क्योंकि शेष ट्राइप्सिन सेल विकास के लिए हानिकारक है।
  9. न्यूरॉन मीडिया के 3 एमएल के साथ तलछट को धीरे-धीरे रीसुस्ल करें। सुनिश्चित करें कि उच्च जीवित रहने की दर के लिए कोशिकाओं वाले समाधान में हवा के बुलबुले उत्पन्न नहीं होते हैं।
  10. मिश्रण मीडिया को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  11. 30 मिनट के लिए आइस बाथ में 30 आरपीएम पर एक शेकर पर फिलट्रेट रखें। यह कदम आवश्यक नहीं है लेकिन अनुशंसित है।
  12. 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 356 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए, और धीरे से न्यूरॉन मीडिया ए के 1 एमएल में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें।
  13. तैयार 48-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल मिश्रण के 500 μL जोड़ें।
  14. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक इनक्यूबेटर में संस्कृति कोशिकाओं ।
  15. सीरम मुक्त संस्कृति प्रदान करने के लिए 1 घंटे में न्यूरॉन मीडिया बी के साथ सभी मीडिया की जगह ।
  16. हर 3 दिन में न्यूरॉन मीडिया बी का आधा बदलें।
    नोट: न्यूरॉन्स संस्कृति के 5-7 दिनों के बाद इम्यूनोसाइटोकेमिकल प्रयोगों के लिए तैयार हैं।

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Representative Results

प्राथमिक कोशिका संस्कृति की प्रक्रिया में, अधिग्रहीत कोशिकाओं को संलग्न राज्य से पहले उज्ज्वल और स्पष्ट सीमाओं के साथ दौर थे । जैसे-जैसे न्यूरॉन्स बढ़े, डेंड्राइट्स और एक्सॉन अलग होने लगे। संस्कृति के 5-7 दिनों के बाद, न्यूरॉन्स लंबे अनुमानों के साथ एक परिपक्व रूप तक पहुंच गया, जो इमेजिंग या कार्य अध्ययन के लिए आदर्श थे। यद्यपि अधिकांश अशुद्धियों और सेल मलबे को बदलते मीडिया के कारण हटाया जा सकता है, लेकिन पॉली-डी-लाइसिन और लेमिनिन कोटिंग से जुड़े कुछ अवशेष दिखाई दे रहे थे(चित्रा 1)।

उचित संस्कृति के बाद, न्यूरॉन्स की पहचान ठेठ β-III-ट्यूबलिन और एमएपी-2 इम्यूनोस्टेपिंग10, 12के माध्यम से की जा सकती है। इसके अलावा, ग्लिया को विशेष रूप से GFAP इम्यूनोदाता10के माध्यम से पहचाना गया था। परिपक्व न्यूरॉन्स ने सिनैप्टिक कताई विकसित की, जो सिनैप्टिक प्रोटीन निर्माता, सिनैप्टिक प्रोटीन निर्माता, सिनैप्सिन-1(चित्र 2)12के इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा पहचाने गए प्रेसिनैप्टिक विशेषज्ञताओं के करीब थे। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस विधि के माध्यम से अच्छी तरह से विकसित सिनेप्स वाली परिपक्व कोशिकाओं को प्राप्त किया गया था। यह परिणाम भविष्य के समारोह के अध्ययन में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देता है।

इस बीच, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रयोगों(चित्र 3)के माध्यम से कई न्यूरॉन उपप्रकारों को पहचाना गया। पेप्टिडेर्गिक न्यूरॉन्स, जिसमें विभिन्न न्यूरोपेप्टाइड होते हैं, पदार्थ पी13के साथ इम्यूनोडांडा हुआ था। व्यक्त वेसिकुलर न्यूक्लियोटाइड ट्रांसपोर्टरों के साथ प्यूरिएंर्जिक न्यूरॉन्स की पहचान SLC17A9 स्टेनिंग14के माध्यम से की गई थी । नाइट्रेर्गिक न्यूरॉन्स को DYNLL-2 के साथ कल्पना की गई थी, जो न्यूरॉन्स15में मोटर प्रोटीन के साथ एनएनओएस को जोड़ता है। कोलिनेर्जिक न्यूरॉन्स कोलीन एसिटिलट्रांसफेरेज16के साथ इम्यूनोरेएक्टिव थे ।

Figure 1
चित्रा 1. 1, 3, और चढ़ाना (ए, बी, सी, क्रमशः) के बाद 7 दिनों में लिया चूहा मूत्राशय संस्कृति से अलग प्राथमिक कोशिकाओं के चरण के विपरीत छवियों । स्केल बार: 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। चूहे के मूत्राशय से अलग प्राथमिक कोशिकाओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से पता चला है कि प्राथमिक संस्कृति न्यूरॉन्स(ए)और पूरे माउंट ब्लैडर तैयार करने(बी)में न्यूरॉन साइटोस्केलेटन प्रोटीन स्टेनिंग (β-III-ट्यूबलिन, आरआरआईडी: AB_2827688, 1:200) में। प्राथमिक संस्कृति न्यूरॉन्स में, न्यूरोनल फॉस्फोप्रोटीन इम्यूनोस्टेनिंग (मानचित्र 2, आरआरआरआई: AB_2827689, 1:200) की भी कल्पना की गई थी(सी)। ग्लिया की पहचान ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन स्टेनिंग(डी)के माध्यम से की गई थी। RRID: AB_627673, 1:50) । Synapsins सिनेप्सिन प्रोटीन धुंधला (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) सेलुलर(ई)और ऊतक(एफ)के स्तर में के माध्यम से कल्पना की गई । उपयोग किए जाने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी इस प्रकार थे: एलेक्सा फ्लोर 488 (हरा, बकरी विरोधी खरगोश एलजीजी, 1:200), एलेक्सा फ्लोर 555 (लाल, बकरी विरोधी माउस एलजीजी, 1:200)। नाभिक Hoechst ३३३४२(ए, सी, डी, ई, नीले,1 μg/mL) का उपयोग कर कल्पना की थी । स्केल बार: 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। प्राथमिक न्यूरॉन्स के कई न्यूरॉन उपप्रकारों की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। पेप्टिडेर्गिक न्यूरॉन्स पदार्थ पी(ए)के साथ इम्यूनोटांडा थे। RRID: AB_785913, 1:50) । Purinergic न्यूरॉन्स SLC17A9 धुंधला(बीके माध्यम से पहचान की गई; RRID: AB_10597575, 1:200) । नाइट्रेर्गिक न्यूरॉन्स को DYNLL-2 धुंधला(सी)के माध्यम से कल्पना की गई थी। RRID: AB_654147, 1:50) । कोलिनेर्जिक न्यूरॉन्स कोलिन एसिटिलट्रांसफेरेज(डी)के साथ इम्यूनोरेएक्टिव थे; RRID: AB_2244867, 1:100) । उपयोग किए जाने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी इस प्रकार थे: एलेक्सा फ्लोर 488 (हरा, बकरी विरोधी खरगोश एलजीजी, 1:200), एलेक्सा फ्लोर 555 (लाल, बकरी विरोधी माउस एलजीजी, 1:200)। नाभिक Hoechst ३३३४२(ए, बी, सी, डी, नीले,1 μg/mL) का उपयोग कर कल्पना की थी । स्केल बार: 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सामग्री मोलेरिटी (एमएम)
एनएसीआई 120
केसीआई 5.9
नाहको3 25
एनए 2एचपीओ4·12H2O 1.2
एमजीसीआई2·6H2O 1.2
कैसीआई2 2.5
ग्‍लूकोज़ 11.5

तालिका 1. क्रेब्स समाधान संरचना

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Discussion

प्लेट तैयार करना
इम्यूनोफ्लोरेसेंट या कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए 6-, 12-, या 48-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में ग्लास कवरस्लिप का उपयोग एक किफायती और नमूना-बख्शते ऑपरेशन है। कोशिकाएं प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की तैयारी के दौरान कवरस्लिप के बिना प्लेटों में अच्छी तरह से बढ़ती हैं। इसलिए, पश्चिमी दाग या पॉलीमरेज चेन रिएक्शन जैसे प्रयोगों में कवरस्लिप अपरिहार्य हैं। इसके अलावा, कोटिंग कोशिकाओं चढ़ाना से पहले एक आवश्यक कदम है, के साथ या कवरस्लिप के बिना । लेमिनिन और पॉली-डी-लाइसाइन कोटिंग न्यूरॉन्स, विशेष रूप से लैमिनिन में आम विकल्प हैं, जो न्यूरॉन विकास17के लिए आवश्यक है।

मीडिया की तैयारी
पहले मध्यम प्रतिस्थापन के बाद, सेल अलगाव को सीरम के बिना मीडिया की आवश्यकता होती है क्योंकि सीरम कोशिका विभाजन को उत्तेजित करता है और एक सीमित न्यूरॉन-बढ़ते अंतरिक्ष18की ओर जाता है। इस प्रकार, न्यूरॉन विकास कारक महत्वपूर्ण हैं। बी 27 और जीडीएनएफ की गुणवत्ता काफी हद तक विभिन्न बैचों से भिन्न हो सकती है और न्यूरॉन विकास19पर बड़े प्रभाव पैदा कर सकती है । इसलिए, जब न्यूरॉन उपज खराब होती है तो मीडिया की बहुत संख्या की जांच करने की सिफारिश की जाती है। इस बीच, ताजा मीडिया स्टॉक महत्वपूर्ण है; आवश्यक राशि की गणना की जानी चाहिए और हर बार मीडिया को बदलने से पहले अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए।

जानवरों
स्प्राग-डावले चूहों का उपयोग इस विधि में किया जाता है। C57BL/6 चूहों भी इस प्रयोग में स्वीकार्य हैं। इसलिए, आकृति विज्ञान और न्यूरोनल सर्किटरी में कुछ बदलावों के बावजूद चूहों या चूहों के अन्य उपभेदों को भी इस विधि के लिए अपनाया जा सकता है। विभिन्न पशु मॉडलों के संदर्भ में, शोधकर्ताओं को एक अनुकूलित और लक्षित प्रोटोकॉल विकसित करना चाहिए। इसके अलावा, युवा जानवरों को हमेशा इस विधि के आवेदन से पहले माना जाना चाहिए।

ऊतक उपचार
प्रयोगों के दौरान, पाचन प्रक्रिया को छोड़कर, ऊतकों को कम तापमान पर रखना सेल व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए आवश्यक है, जो सेल मेटाबॉलिज्म को कम कर सकता है और ऊर्जा की कमी से बच सकता है। ऑक्सीजन का स्तर, पोषण और पीएच भी कोशिका उपज11को प्रभावित कर सकते हैं । इसके अलावा, अन्य ऊतकों के लिए, हमारा सुझाव है कि शोधकर्ता समायोजित पाचन स्थिति के साथ इस विधि को करते हैं।

सेल संस्कृति
टीका लगने पर न्यूरॉन्स की एक उल्लेखनीय विशेषता यह है कि लेपित प्लेटों का उनका त्वरित पालन20है . इस मामले में, 1 घंटे की संस्कृति के बाद मीडिया बदलने की सिफारिश की जाती है ताकि न्यूरॉन्स का उच्च अनुपात हासिल किया जा सके। इसके अलावा, जब अधिकांश कोशिकाएं छद्मोडियम विकसित करना शुरू कर देती हैं, तो मीडिया और सेलुलर राज्य के रंग के आधार पर मीडिया को बदलने की आवृत्ति को उचित रूप से कम किया जा सकता है। एक अच्छे राज्य में प्राथमिक सेल संस्कृति एक उज्ज्वल सीमा के साथ काले सोमा प्रदर्शित करता है।

मूत्राशय से अलग अधिकांश तंत्रिका कोशिकाएं मूत्राशय इंट्राम्यूरल गंगलिया होती हैं, जिसमें मूत्राशय13के अफरेंट और स्वायत्त आफरीरंट इनरवेशन होते हैं। इसके अलावा, काटा गया ऊतक में कोई बड़ा पेल्विक गैंगलिया मौजूद नहीं है। यह मूत्राशय गर्दन21के नीचे वितरित करता है ।

सीमाएँ
यह न्यूरॉन्स और ग्लिया को अलग और संस्कृति के लिए एक प्रारंभिक शोध है। कई प्रयास किए गए थे, जैसे साइटराबिन उपचार या घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र। हालांकि, वांछित कोशिकाओं का अनुपात अभी भी आदर्श नहीं था, और इससे भी अधिक सेल हानि दिखाई दी। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में पारंपरिक पाचन स्थितियों, जैसे 37 डिग्री सेल्सियस, कुछ संवेदनशील न्यूरॉन प्रकारों को मारने की संभावना है, और संभावित जीन अभिव्यक्ति कलाकृतियों का कारण बनता है22।

अंत में, यह प्रोटोकॉल चूहे मूत्राशय से न्यूरॉन्स और ग्लिया को संस्कृति प्रदान करता है। अलगाव को दोहराना आसान है, समय कुशल है, और इसमें न्यूनतम माइक्रोबियल संदूषण शामिल है। हालांकि न्यूरॉन्स की शुद्धता में सुधार आवश्यक है, हमें उम्मीद है कि यह विधि LUTNS अनुसंधान में योगदान देती है।

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Disclosures

लेखक हितों के किसी बड़े टकराव की घोषणा नहीं करते ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर 81673676) और डोंगगुआन साइंस एंड टेक्नोलॉजी ब्यूरो (ग्रांट नंबर 2019622101002) ने सपोर्ट किया। लेखक तकनीकी परामर्श के लिए डॉ मैरीरोज सुलिवान (सर्जरी में सहायक प्रोफेसर, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin Gibico 15050065 Enzyme digestion
48-well culture plate Corning 3548 Coating dish
antibiotic/antimycotic Gibico 15240062 Culture media/Rinse media
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody Santa Cruz sc-33673 ICC
B-27 Gibico 17504044 Culture media
BSA Fraction V Gibico 332 Enzyme digestion
Choline Acetyltransferase Antibody Abcam ab18736 ICC
CO2 Incubator Heraeus B16UU Cells culture
Collagenase type II Sigma 2593923 Enzyme digestion
DMEM/F-12 Gibico 11330032 Rinse media
DYNLL2 Antibody Santa Cruz sc-13969 ICC
Fetal Bovine Serum Gibico 10100147 Culture media/Rinse media
Forceps Shanghai Jin Zhong Medical Devices 1383 10 cm; Sterile operation
Glass breakers Huan Qiu Medical Devices 1101 50 ml; Sterile operation
Glass coverslips WHB Scientific WHB-48-CS Coating dish
Glass dishes Huan Qiu Medical Devices 1177 100 mm; Sterile operation
Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 Southernbiotech 3050-30 ICC
Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 Southernbiotech 3050-30 ICC
Hoechst 33342 BD 561908 ICC
Laminar flow bench Su Jie Medical Devices CB 1400V Sterile operation
Laminin Sigma L2020 Coating dish
L-glutamine Gibico 25030081 Culture media
MAP-2 Antibody Affinity AF5156 ICC
Murine GDNF Peprotech AF45044 Culture media
Neurobasal-A Medium Gibico 10888022 Culture media
Ophthalmic scissors Shanghai Jin Zhong Medical Devices J21010 12.5 cm; Sterile operation
Pipettes Eppendorf 3120000240 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting
Pipettes Eppendorf 3120000267 10-100 ul; Reagent and sample pipetting
Poly-D-lysine Sigma P7280 Coating dish
Refrigerated centrifuge Ping Fan Instrument TGL-16A Enzyme digestion
Shaking incubator Haimen Kylin-Bell Lab Instruments T8-1 Enzyme digestion
SLC17A9 Antibody MBL International BMP079 ICC
Spoons nucleus divider Shanghai Jin Zhong Medical Devices YZR030 12 cm; Sterile operation
Substance P Antibody Santa Cruz sc-58591 ICC
Surgical scissors Shanghai Jin Zhong Medical Devices J21130 16 cm; Sterile operation
Surgical towel Fu Kang Medical Devices 5002 40 x 50 cm; Sterile operation
Synapsin-1 Antibody CST 5297T ICC
Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) Affinity AF7011 ICC

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 159 तंत्रिका विज्ञान प्राथमिक न्यूरॉन्स प्राथमिक ग्लिया अलगाव संस्कृति न्यूरॉन उपप्रकार
वयस्क चूहा मूत्राशय से प्राथमिक न्यूरॉन्स और ग्लिया की अलगाव और संस्कृति
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Wang, R., Huang, Z. t., Ren, W. k., Zhang, J., Zhang, Y., Tan, B., Huang, P., Cao, H. y. Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder. J. Vis. Exp. (159), e61177, doi:10.3791/61177 (2020).

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