Summary
Bu protokol, birincil nöronlar için tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaya ve daha fazla hücresel deney için sıçan mesanesinden glia izolasyonu oluşturmaya çalışır.
Abstract
Alt idrar yolu, periyodik idrar depolama ve miktürasyon olmak üzere iki ana işleve sahiptir; bu fonksiyonlar merkezi ve periferik nöroregülasyon yoluyla aracılık edilir. Alt idrar yolu sinir sistemi hakkında kapsamlı araştırmalar yapılmış olmasına rağmen, çoğu çalışma birincil kültüre odaklanmıştır. Bu protokol, Sprague-Dawley sıçanlarından mesane nöronlarının ve glialarının izolasyonu ve kültürü için bir yöntem sunar. Bu yöntemde nöronlar ve glialar 5-7 gün boyunca 37 °C,%5 CO 2 inkübatörde inkübe edildi. Sonuç olarak, ilgili sonraki immünofluoresans deneyleri için uygun olgun şekillere dönüştüler. Hücreler morfolojik olarak optik mikroskop kullanılarak gözlendi. Nöronlar, sinaptik veziküller ve glia sırasıyla β-III-tubulin ve MAP-2, Synapsin-1 ve GFAP boyama ile tanımlanmıştır. Bu arada, immünosistokimya kolin asetiltransfenaz, DYNLL2 ve SLC17A9 gibi nörotransmitter ile ilgili çeşitli proteinler üzerinde yapıldı.
Introduction
Alt idrar yollarının iki ana işlevi vardır: periyodik idrar depolama ve miktürasyon1. Alt idrar yolu sinir sistemi (LUTNS) bu fonksiyonları kontrol eder ve hassas ve birçok nöropatiye duyarlıdır, doğuştan gelen (porfiri), edinilmiş (Lyme hastalığı), hastalık durumlarına ikincil (diyabetik sistopati), ilaca bağlı (hemorajik sistit), neden olduğu ameliyat (abdominoperineal rezeksiyon) veya yaralanma (travmatik omurilik yaralanması)2, 3,4,5,6,7olabilir. Fizyolojik/patolojik çalışmalarda in vivo ve in vitro deneyler de aynı derecede önemlidir. LUTNS ile ilgili in vivo araştırmalar bir süredir organ, hücresel ve moleküler düzeylerde yapılırken, idrar kesesinden birincil nöronlar üzerinde in vitro araştırmalar yok denecek kadarazdır 8,9. Mevcut çalışma sınırlı olsa da, diğer araştırmacıların geliştirebilmesi için bu alandaki araştırmalara öncülük etmeyi umuyoruz. Bu şekilde, bu ortak kültür, mesane nöron disfonksiyonu gibi fenotiplerdeki fizyolojik disfonksiyonun hücresel olarak anlaşılmasına yol açabilir.
Kas hücrelerinin ayrık katmanlara açık bir yönüne sahip enterik kasların aksine, mesanenin kasları örgütsüz10. Bu nedenle, bu yöntem mesanenin dış tabakasını soymak yerine, çalışma zorlığını azaltmak ve yüksek hücre sağkalım oranı için ön işlem süresini kısaltmak için tüm mesaneyi sindirmeyi önerir.
Bu yöntemi izleyerek, nöronların ve diğer hücrelerin karışık bir kültürünü elde edebiliriz. Diğer hücreler vazgeçilmezdir, çünkü varlıkları bir in vivo ortamı taklit eder11. Ek olarak, bu tür hücreler ortamda bulunmayan maddeleri sağlar.
Bu yöntem sindirim için iki adım içerir. İlk olarak, kollajen tip II, kollajeni hidroliz yapmak için kullanılır, ardından tripsin, dokuyu hücrelere dağıtmak için10. Bu şekilde, mesane dokuları tek hücrelere dağılır ve daha sonra nispeten bağımsız büyür. Nöronların kültürü olgunlaştığında, nöronlar görüntüleme veya fonksiyonel tahliller için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller ve hayvan prosedürleri Ulusal Araştırma Konseyi'nin etik ilke yönergelerine uygun olarak yapıldı.
1. Malzemelerin hazırlanması
- Deneyi yapmadan önce bir otoklav kullanarak tüm aletleri ve ddH2O'yu sterilize edin. Aletler cerrahi makas, oftalmik makas, hardallar, kaşık çekirdeği bölücü, cam tabaklar (60-100 mm çapında) ve cam kırıcılar içerir ancak bunlarla sınırlı değildir.
- Krebs çözeltisini aşağıdaki gibi hazırlayın (Tablo 1): Kullanmadan önce tüm kimyasalları ddH2O ile birlikte çözün. CaCI2'yi ayrı ayrı çözün ve tortuyu önlemek için karıştırırken karışık çözeltiye yavaşça ekleyin.
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik/antimycotic (100x) ile F12 ortamlarından oluşan Durulama medyasını hazırlayın. 44,5 mL F12 ortama 5 mL FBS ve 0,5 mL antibiyotik/antimikotik ekleyin.
- %2 B-27, %1 FBS, %1 L-glutamin, %1 antibiyotik/antimycotic (100x) ve %0,1 glia türevi nörotrofik faktör (GDNF) ile nörobakal A ortamını oluşturan nöron media A'yı hazırlayın. 9,5 mL nörobasal A ortamına 200 μL B-27, 100 μL FBS, 100 μL L-glutamin, 100 μL antibiyotik/antimycotic (100x) ve 10 μL GDNF (10 μg/mL) ekleyin.
NOT: B-27, L-glutamin ve GDNF'nin tazeliğini sağlamak için kullanımdan sonraki bir hafta içinde nöron media A'yı hazırlayın. - Nöron media A'nın hazırlanmasıyla aynı prosedürü kullanarak ancak FBS eklemeden B nöron medyasını hazırlayın.
- 10 mL oksijen stabil Krebs çözeltisinde 20 mg kollajenaz tip II, 6 mg sığır serum albümini ve 200 μL antibiyotik/ antimikkotik (100x) eriterek sindirim çözeltisi 1'i hazırlayın.
- Hank'in dengeli tuz çözeltisinin 4 mL'si ile %0,25 tripsin 1 mL seyrelterek sindirim çözeltisi 2 hazırlayın.
- Kaplamalı kapaklı bir tabak hazırlayın.
- Cam kapakları 48 kuyulu bir kültür plakasına yerleştirirken laminer akış tezgahında uzunlamasına kullanın.
- Poli-D-lizin stoku olarak0,1mg/mL konsantrasyonda ddH 2 O ile seyreltin. Stoku –20 °C'de saklayın ve kullanmadan önce çözün.
- Her kapak kapağının üzerine 40 μL poli-D-lizin stoğu ekleyin ve çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Farklı bazal alanlara sahip farklı plakalar için konsantrasyonu 4 μg/cm2olarak ayarlayın. Örneğin, 24 kuyulu bir plakadan bir kuyunun bazal alanı 2 cm2ise, 80 μL poli-D-lizin stoğunu bir kuyuya aktarmalıyız. Her cm2 4 μg poli-D-lizin içerir. - 48 kuyulu plakadaki poli-D-lizini çıkarın ve kapak örtülerini ddH2O üç kez durulayın.
- Plakanın susuz olduğundan emin olmak için plakayı laminer akış davlumbazında en az 30 dakika kurutun.
- Plakayı laminin kaplamadan önce en fazla 1 gün boyunca 4 °C'de saklayın. Plakanın −20 °C'de saklanması uzun süreli depolama için tercih edilir.
- Laminin'i 4 °C'de çözün. Laminin stok olarak 50 μg / mL konsantrasyonda ddH2O ile seyreltin. Stoku –20 °C'de saklayın ve kullanmadan önce 4 °C'de çözün.
- 100 μL seyreltilmiş laminin'i her kapak kapağının üstüne aktarmak ve 1 saat boyunca 4 °C'de laminin kuluçkaya yatırmak için bir pipet kullanın.
NOT: Farklı bazal alanlara sahip farklı plakalar için konsantrasyonu 5 μg/cm2olarak ayarlayın. Örneğin, 24 kuyulu bir plakadan bir kuyunun bazal alanı 2 cm2ise, bir kuyuya 200 μL seyreltilmiş laminin aktarın. Her cm2 5 μg laminin içerir. - Laminin çözeltisini çıkarın ve kapak örtülerini bir kez ddH2O ile durulayın. Kazıma önlemek için bu işlemi kapak kapağının kenarında gerçekleştirin.
NOT: Kaplamalı kapaklar en fazla 2 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.
2. Mesane hasadı
- Beş haftalık Sprague-Dawley fareleri elde edin.
- Karbojeni (%95 oksijen,%5 CO 2)krebs çözeltisine bir buz banyosunda en az 30 dakika süreyle demlenerek sabit bir oksijen durumuna ve pH seviyesine ulaşın.
- Servikal çıkık yoluyla ötanaziden sonra, sıçanları sterilizasyon için 30 sn boyunca% 75 etanol içine batırın.
- Sıçanları sterilize edilmiş bir cerrahi havluya yerleştirin ve karınlarını açığa çıkar. Karın boşluğunu açın ve mesaneyi bir makas ve ön ayak seti ile ortaya dökün.
- Mesaneyi nazikçe kaldırın ve çapraz kontaminasyonu önlemek için mesane boynunu başka bir makas ve tostiki seti ile mesane boynundan kesin. Hücre sağkalımını iyileştirmek için mesaneyi hızlı bir şekilde soğuk oksijene stabil Krebs çözeltisine yerleştirin.
NOT: Mesane çıkarıldıktan sonra, nöron sağkalım olasılığını iyileştirmek için aşağıdaki işlemleri hızlı bir şekilde gerçekleştirin. - Krebs solüsyonlarını üç cam tabak ve cam kırıcıya ekleyin.
- Ön soğutma için buz banyosunda Krebs solüsyonu ile cam tabaklar ve cam kırıcılar hazırlayın.
- Karışıklığı önlemek için bu kapları 1–3 numaralarıyla işaretleyin.
- Her bir cam tabağı, bir kaşık çekirdeği bölücü ile eşleştirin.
- Cam tabak 1'de, mesaneyi oftalmik makasla kesin ve önps ve kaşık çekirdeği bölücü ile açın.
- Mesaneyi cam kırıcı 1'de durulayın ve cam tabağa yerleştirin 2.
- Cam tabaktaki tokmakları ve oftalmik makası kullanarak doku yüzeyindeki yapışan yağı ortadan kaldırın 2.
- Mesaneyi cam kırıcı 2'de durulayın ve cam tabağa yerleştirin 3.
- Eksojen ataşmanları çıkarmak için mesaneyi cam tabak 3'e kanatçıklar ve kaşık çekirdek bölücü kullanarak hafifçe kazıyın.
- Mesaneyi cam kırıcı 3'te durulayın, mesaneyi 14 mL soğuk Krebs çözeltisine sahip 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi 356 x g ve 4 °C'de 1 dakika döndürün.
- Kontaminasyonu azaltmak için Krebs çözeltisi ile diğer iki tüpte önceki adımı iki kez tekrarlayın.
3. İki aşamalı mesane sindirimi
- Mesaneyi santrifüj tüpünden 1 mL sindirim çözeltisi içeren 2 mL şişeye aktarın 1. Mesaneyi çözelti halinde küçük parçalara (1 mm'den küçük) kesmek için oftalmik makas kullanın.
- Mesane çözeltisini steril bir hücre kültürü çanağına (100 mm çapında) 9 mL sindirim çözeltisi 1 ile karıştırın. %5 CO2,37 °C ve 200 rpm altında 1 saat boyunca sallanan bir inkübatörde 1.
- 1. adım sindirimden sonra, çözeltiyi 8 dakika boyunca 4 °C'de 356 x g'da santrifüj edin.
- Sindirim çözeltisi 2'yi ön ısıtma için 37 °C su banyosuna yerleştirin.
- Santrifüjlemeden sonra, sindirim çözeltisi 1 içeren üstnatantı çıkarın ve hücre tortusunu hasat edin. Kalan bazı sıvılara izin verilir. Çözeltinin tamamen çıkarılması hücre kaybını artırabilir.
- Hücre tortusunu 15 mL santrifüj tüpünde ılık sindirim çözeltisi 2 ile karıştırın ve 37 °C su banyosunda 5 dakika sindirirken karışımı çalkalayın. 7 dakikayı aşmayın adım 2 sindirim veya nöronlar yok olacaktır.
- Sindirimden sonra, trypsin'i 10 mL soğuk durulama ortamı ile karışımda derhal devre dışı bırakın.
NOT: Aşağıdaki adımları 0 °C–4 °C'de gerçekleştirin. Bir buz banyosu böyle bir durum sağlayabilir. - Santrifüjlemeden sonra hücre tortusunu 8 dakika boyunca 4 °C'de 356 x g'da hasat edin. Kalan tripsin hücre büyümesine zararlı olduğundan mümkün olduğunca fazla medya çıkarın.
- Tortuları 3 mL nöron ortamı ile nazikçe yeniden sunun. Yüksek sağkalım oranı için hücre içeren çözeltide hava kabarcıklarının oluşmamasını sağlayın.
- Karışım medyasını 70 μm hücre süzgeçten 50 mL santrifüj tüpüne filtreleyin.
- Filtrat 30 dakika boyunca bir buz banyosunda 30 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde tutun. Bu adım gerekli değildir, ancak önerilir.
- Hücreleri 8 dakika boyunca 4 °C'de 356 x g'da santrifüjleme ile toplayın ve hücre peletlerini 1 mL nöron ortamı A'da hafifçe yeniden biriktirin.
- Hazırlanan 48 kuyu plakasının her kuyusuna 500 μL hücre karışımı ekleyin.
- 37 °C ve %5 CO2'debir inkübatörde kültür hücreleri.
- Serumsuz bir kültür sağlamak için tüm medyayı 1 saat içinde nöron media B ile değiştirin.
- Nöron media B'nin yarısını her 3 günde bir değiştirin.
NOT: Nöronlar 5-7 günlük kültürden sonra immünosimyasal deneylere hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birincil hücre kültürü sürecinde, elde edilen hücreler ekli durumdan önce parlak ve net sınırlarla yuvarlaktı. Nöronlar büyüdükçe dendritler ve aksonlar farklı olmaya başladı. 5-7 günlük kültürden sonra, nöronlar görüntüleme veya fonksiyon çalışmaları için ideal olan uzun projeksiyonlarla olgun bir forma ulaştılar. Değişen ortam nedeniyle safsızlıkların ve hücre kalıntılarının çoğu giderilebilse de poli-D lizin ve laminin kaplamaya bağlı bazı kalıntılar görülebiliyordu(Şekil 1).
Uygun kültürden sonra, nöronlar tipik β-III-tubulin ve MAP-2 immünostaining10,12ile tanımlanabilir. Ek olarak, glia özellikle GFAP immünostaining10. Olgun nöronlar, sinaptik protein yapıcının immünostainingi ile tanımlanan presynaptik uzmanlıklara yakın olan sinaptik dikenler geliştirdi, sinapsin-1 (Şekil 2)12. Bu sonuçlar, iyi gelişmiş sinapslara sahip olgun hücrelerin bu yöntemle elde edildiğini gösterdi. Bu sonuç, gelecekteki fonksiyon çalışmalarındaki önemli rolünü göstermektedir.
Bu arada, immünostokimya deneyleri ile çeşitli nöron alt tipleri tanınmıştır (Şekil 3). Çeşitli nöropeptitler içeren peptiderjik nöronlar, P13maddesi ile immünostain edildi. Ekspres veziküler nükleotid taşıyıcılara sahip pürinerjik nöronlar SLC17A9 boyama14ile tanımlanmıştır. Nitrerjik nöronlar, nNOS'u nöronlardaki motor proteinlere bağlayan DYNLL-2 ile görselleştirildi15. Kolinerjik nöronlar kolin asetiltransfelaz16ile immünoreaktifti.
Şekil 1. Sıçan mesane kültüründen izole edilmiş primer hücrelerin faz kontrast görüntüleri kaplamadan 1, 3 ve 7 gün sonra çekilmiştir (sırasıyla A, B, C). Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Sıçan mesanesinden izole edilmiş birincil hücrelerin immünoresans görüntüleri. Konfokal mikroskopi analizi, birincil kültür nöronlarında(A)ve tüm mesane preparatında(B)nöron sitoskeleton protein boyası (β-III-tubulin, RRID: AB_2827688, 1:200) gösterdi. Primer kültür nöronlarında nöronal fosfoprotein immünostaining (MAP 2, RRID:AB_2827689, 1:200) de görselleştirildi (C). Glia glial fibril asidik protein boyanma yoluyla tanımlanmıştır (D; RRID: AB_627673, 1:50). Sinapsinler hücresel(E)ve doku(F)düzeylerinde sinapsin protein boyama (Synapsin-1, RRID: AB_2798146, 1:200) ile görselleştirildi. Kullanılan ikincil antikorlar şunlardı: Alexa Fluor 488 (yeşil, keçi anti-tavşan lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (kırmızı, keçi anti-fare lgG, 1:200). Çekirdek Hoechst 33342(A, C, D, E; mavi, 1 μg/mL) kullanılarak görselleştirildi. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Primer nöronların çeşitli nöron alt tiplerinin immünoresans görüntüleri. Peptidergic nöronlar P (A) maddesi ile immünostain edildi. RRID: AB_785913, 1:50). Pürinerjik nöronlar SLC17A9 boyama (B; RRID: AB_10597575, 1:200). Nitrerjik nöronlar DYNLL-2 boyama(C; RRID: AB_654147, 1:50). Kolinerjik nöronlar kolin asetiltransfenaz(D; RRID: AB_2244867, 1:100). Kullanılan ikincil antikorlar şunlardı: Alexa Fluor 488 (yeşil, keçi anti-tavşan lgG, 1:200), Alexa Fluor 555 (kırmızı, keçi anti-fare lgG, 1:200). Çekirdek Hoechst 33342(A, B, C, D , mavi,1 μg/mL) kullanılarak görselleştirildi. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Malzemeler | Azı dişleri (mM) |
| Naci | 120 |
| KCI | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| Glikoz | 11.5 |
Tablo 1. Krebs çözüm bileşimi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plaka Hazırlama
İmmünofluoresan veya kalsiyum görüntüleme deneyleri için 6, 12 veya 48 kuyulu kültür plakalarında cam kapakların kullanılması ekonomik ve örneklemsiz bir işlemdir. Hücreler, birincil hücre kültürlerinin hazırlanması sırasında kapaksız plakalarda iyi büyür. Bu nedenle, kapaklar Batı blot veya polimeraz zincir reaksiyonu gibi deneylerde dağıtılabilir. Ayrıca, kaplama, kapaklı veya kapaksız hücreleri kaplamadan önce gerekli bir adımdır. Laminin ve poli-D lizin, nöronların, özellikle de nöron büyümesi için gerekli olan laminin kaplamada yaygın seçeneklerdir17.
Medya Hazırlığı
İlk ortam değişiminden sonra, hücre izolasyonu serumsuz ortam gerektirir, çünkü serum hücre bölünmesini uyarır ve sınırlı bir nöron yetiştirme alanına yol açar18. Bu nedenle, nöron büyüme faktörleri çok önemlidir. B27 ve GDNF kalitesi büyük ölçüde farklı partilerden değişebilir ve nöron büyümesi üzerinde büyük etkilere neden olabilir19. Bu nedenle, nöron verimi zayıf olduğunda ortamın lot sayısını kontrol etmek önerilir. Bu arada, taze medya stoku çok önemli; ortam değiştirilmeden önce gerekli miktar her seferinde önceden hesaplanmalı ve hazırlanmalıdır.
Hayvan
Bu yöntemde Sprague-Dawley sıçanları kullanılmaktadır. C57BL/6 fareler de bu deneyde kabul edilebilir. Bu nedenle, morfoloji ve nöronal devrelerde birkaç varyasyona rağmen, bu yöntem için diğer sıçan veya fare suşları da benimsenebilir. Farklı hayvan modelleri açısından, araştırmacılar optimize edilmiş ve hedeflenmiş bir protokol geliştirmelidir. Ayrıca, genç hayvanlar her zaman bu yöntemin uygulanmasından önce düşünülmelidir.
Doku Tedavisi
Deneyler sırasında, sindirim süreci dışında, dokuları düşük sıcaklıkta tutmak, hücre metabolizmasını azaltabilen ve enerji açığını önleyebilen hücre canlılığını artırmak için gereklidir. Oksijen seviyeleri, beslenme ve pH hücre verimini de etkileyebilir11. Ayrıca, diğer dokular için, araştırmacıların bu yöntemi ayarlanmış sindirim durumu ile gerçekleştirmelerini öneririz.
Hücre Kültürü
Aşılandığında nöronların dikkat çekici bir özelliği, kaplamalı plakalara hızlı yapışmasıdır20. Bu durumda, yüksek oranda nöron kazanmak için 1 saat kültürden sonra ortam değiştirmeniz önerilir. Ayrıca, hücrelerin çoğu psödopodyum büyümeye başladığında, ortamın rengine ve hücresel duruma bağlı olarak ortam değiştirme sıklığı uygun şekilde azaltılabilir. İyi durumdaki birincil hücre kültürü, parlak bir kenarlıkla siyah soma görüntüler.
Mesaneden izole edilen sinir hücrelerinin çoğu, mesanenin afferent ve otonom efferent innervasyonlarından oluşan mesane intramural gangliyonlarıdır13. Ayrıca, hasat edilen dokuda majör pelvik gangliyon yoktur. Mesane boynunun altına dağılır21.
Sınırlama
Bu, nöronları ve gliaları izole etmek ve kültüre etmek için bir ön araştırmadır. Cytarabine tedavisi veya yoğunluk gradyan santrifüjleme gibi birçok girişimde bulunulmuştu. Bununla birlikte, istenen hücrelerin oranı hala ideal değildi ve daha da fazla hücre kaybı ortaya çıktı. Ayrıca, bu protokoldeki 37 °C gibi geleneksel sindirim koşullarının bazı hassas nöron türlerini öldürmesi ve potansiyel gen ekspresyon eserlerine neden olma olasılığı yüksektir22.
Sonuç olarak, bu protokol sıçan mesanesinden nöronları ve gliaları kültüre etmek için bir yöntem sunar. İzolasyonun tekrarlanması kolaydır, zaman verimlidir ve minimum mikrobiyal kontaminasyon içerir. Nöronların saflığını çağrıştıran iyileştirme gerekli olsa da, bu yöntemin LUTNS araştırmasına katkıda bulunduğunu umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar büyük bir çıkar çatışması olmadığını beyanlarlar.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant no. 81673676) ve Dongguan Bilim ve Teknoloji Bürosu (Grant no. 2019622101002) tarafından desteklendi. Yazarlar teknik danışmanlık için Dr. Maryrose Sullivan'a (Harvard Tıp Fakültesi Cerrahi Yardımcı Doçenti) teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Golbidi, S., Laher, I.
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, Pt 9 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants - A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G.
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
