Summary
Målet med detta protokoll är att kontinuerligt övervaka dynamiken i den mänskliga bukspottskörteln holme engraftment processen och den bidragande värd kontra givaren celler. Detta åstadkoms genom att mänskliga holmar transplanteras in i ögats främre kammare (ACE) hos en NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-musmottagare följt av upprepad 2-fotonavbildning.
Abstract
Imaging betaceller är ett viktigt steg mot förståelse av holme transplantation. Även om olika bildåtergivning plattformar för inspelning av beta cellbiologi har utvecklats och utnyttjas in vivo, de är begränsade när det gäller att tillåta encellsupplösning och kontinuerlig longitudinella inspelningar. På grund av öhinnans transparens är ögats främre kammare (ACE) i möss väl lämpad att studera human- och muspanscreatic holme cellbiologi. Här är en beskrivning av hur detta tillvägagångssätt kan användas för att utföra kontinuerliga longitudinella inspelningar av ympning och revascularization av enskilda mänskliga holme ympkvistar. Mänskliga holme ympkvistar sätts in i ACE, med hjälp av NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-möss som mottagare. Detta möjliggör för undersökningen av expansionen av mottagaren kontra givare celler och bidraget från mottagarceller i att främja inkapsling och vaskularisering av transplantatet. Vidare beskrivs en stegvis metod för bildanalys och kvantifiering av holmevolymen eller segmenterad vasculature- och holmekapsel som bildar mottagarceller.
Introduction
Diabetes mellitus beskriver en grupp av metabola sjukdomar som kännetecknas av förhöjda nivåer av blodglukos som resultat av otillräcklig insulinproduktion från förlust eller dysfunktion av bukspottskörteln holme betaceller, ofta åtföljs av insulinresistens. Typ 1 (T1D) och typ 2-diabetes (T2D) är komplexa sjukdomar där betacellernas progressiva dysfunktion orsakar sjukdomsutveckling. T1D fälls ut av en autoimmun attack på betacellerna, medan T2D anses vara driven av metabola faktorer, om än med ökande bevis på låggradig systemisk inflammation1. Transplantation av givaren mänskliga holmar, särskilt till T1D patienter, erbjuder potential för att ge fysiologiska glykemisk kontroll. Men, en brist på vävnad givare och dålig holme engraftment har förhindrat holme transplantation att bli en mainstream terapeutiska alternativ. En väsentlig andel av det funktionella holmetransplantatet går förlorat under den omedelbara posttransplantationsperioden (24–48 h) på grund av den hypoxiska, inflammatoriska, immunogena värdmiljön2,3. För att utvärdera effektiviteten av interventionsmetoder för förbättring av holmeöverlevnad är kontinuerlig övervakning av sådana transplantationer nödvändig.
In vivo tekniker för att bilden och spåra ödet för transplanterade mänskliga bukspottskörteln holmar efter transplantation fortfarande en utmaning för diabetes forskning4,5. Hittills visar noninvasive imaging tekniker, inklusive positron emissions tomografi (PET), magnetisk resonanstomografi (MRI), eller ultraljud (US) potential för kvantifiering och funktionell utvärdering av transplanterade holmar i experimentella förhållanden5. Med tanke på de små storlekarna i skäret lider dock kvantitativa mätningar av dessa modaliteter av otillräcklig upplösning. Ögats främre kammare (ACE) som transplantationsplats för observation är en lovande noninvasiv avbildningslösning som erbjuder effektivt högre rumslig upplösning och frekvent övervakning under långa tidsperioder6. Denna metod har framgångsrikt utnyttjats för att studera mus holme biologi (granskas i Yang et al.7), autoimmuna immunsvar8, samt mänskliga holme ympning9,10.
Här ACE transplantation metoden kombineras med en 2-foton bildframställning strategi för att undersöka dynamiken i den mänskliga bukspottskörteln holme engraftment processen genom kontinuerliga och upprepade inspelningar på enskilda holme ympkvistar i upp till 10 månader efter transplantation. Multiphoton imaging egenskaper större bildframställning djup och minskad övergripande fotobleaching och fotoskador övervinna bildframställning begränsningar konfokalmikroskopi11. Kvantifiering av fluorescerande avbildning innebär flera steg, inklusive holme prov beredning, holme transplantation, bild förvärv, bild filtrering för att ta bort holme buller eller bakgrund, segmentering, kvantifiering och dataanalys. Det mest utmanande steget är vanligtvis partitionering eller segmentering av en bild i flera delar eller regioner. Detta kan innebära att separera signal från bakgrundsljud, eller klustring regioner av voxels baserat på likheter i färg eller form för att upptäcka och märka voxels av en 3D-volym som representerar holme vaskula, till exempel. När den har segmenterats är statistik som objektvolymstorlekar vanligtvis okomplicerad att extrahera. Förutsatt är en metod för kvantifiering och extrahering av bildframställning data, såsom segmentering och datavisualisering. Särskild uppmärksamhet ägnas åt avlägsnandet av autofluorescens i mänskliga holmar och åtskillnad mellan holme vasculature och holme kapsel bildar mottagarceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den regionala etikkommittén i Lund, Sverige, godkände studien enligt lagen Om etikprövning av forskning som involverar människor. Djurförsök utfördes i strikt överensstämmelse med den svenska etiken i djurförsök och godkändes av etikkommittéerna i Malmö och Lund. 6 till 8 veckor gamla immunodeficient NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA - tomat. Rag2-/-) mottagarmöss användes som mottagare för transplantation av mänskliga holmar10.
1. Holmepreparat för transplantation
- Kulturmänniska holmar i CMRL 1066 kompletterade med 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 μg/mL gentamycin, 0,25 μg/mL fungizon, 20 μg/mL ciproxfloxacin, 10 mM nikotinamid (NIC) och 10 % värmeaktiverat humant serum vid 37 °C i 5 % CO2 och befuktad luft tills transplantation, som beskrivitstidigare 12.
OBS: Holmar ska vara fria från exokrin vävnad och inte röra vid varandra i kultur. Exokrina vävnader verkar genomskinliga. - På transplantationsdagen överför du kulturmedier som innehåller holmarna till en ny petriskål med hjälp av en aspiratorrörsmontering som är ansluten till en dragna glaskeaillary.
OBS: Alternativt, använd en 200 μL-pipett. Färgläggning baksidan av Petri-skålen hjälper till att göra holmarna lättare att skilja under stereomikroskopet. - Med hjälp av ett stereomikroskop, plocka ~ 20 –40 holmar per transplantation och överför till ett 1,5 mL-rör. Fyll röret till toppen med kulturmedia från inkubatorn.
- Försegla rören med paraffinfilm och förvara på is fram till transplantation. Förbered en lämplig mängd för antalet utförda transplantationer.
- Alternativt, se till2 att en CO 2-inkubator finns tillgänglig i operationsrummet för att hålla holmar i kultur och plocka dem omedelbart före varje transplantation.
2. Beredning av transplantationsutrustning och operationsbord
OBS: Alla kirurgiska verktyg bör autoklaveras, och kirurgi bordet och instrument desinficeras med 70% alkohol.
- Anslut en stereotaxisk huvudhållare till anestesi via en munstycksmask och sätt på värmedynan.
- Anslut en gastät Hamilton spruta till polyeten slangar och en trubbig ändögat kanyl.
OBS: Det rekommenderas att fylla alla delar med PBS före montering. Kontrollera om instängda luftbubblor och ta bort om närvarande. - Fäst Hamiltonsprutan tätt på bordet (Bild 1a) eller en rörlig bas (Bild 1e) och fäst slangen på stereomikroskopet, med kanyl hängande ner (dvs. väntläge).
OBS: Använd kirurgisk tejp, eftersom det är lätt att ta bort och sätta tillbaka. - Förbered en 1 mL spruta ansluten till en 30 G-nål fylld med 0,1 mg/kg buprenorfinlösning.
- Förbered en spruta med steril PBS. Alternativt, använd en pipett.
- Ställ undan en ren uppvakningsbur med värmelampa.
3. Anestesi och positionering av mottagarmöss för kirurgi
OBS: Alla djur var uppfödda och underhållna i en patogenfri miljö vid djuranläggningarna vid Lunds universitet.
- Söva musen i en kammare fylld med 40% O2/60% N2/3% isofluran och överföra den sövda musen till huvudhållarens plattform på en varm värmeplatta (Bild 1a). Kontrollera om det saknas pedalreflexer.
OBS: Isoflurane anestesi är den föredragna metoden för anestesi för snabb återhämtning efter operation. Mikroskoprummet måste vara ordentligt ventilerat för att använda isofluran. - Placera nosen på musen i anestesimasken kopplad till 40% O2/60% N2/0,9%–1,5% isofluranbedövningsmaskin. Använd tummen och fingret för att lyfta upp huvudet något och fäst det med hjälp av de metalliska bitarna på sidorna. Se till att öronsnäckorna fixerar huvudet direkt under öronen. Injicera 0,1 mg/kg buprenorfinlösning subkutant på musens baksida.
OBS: Buprenorfin används som smärtstillande medel. - Luta huvudet så att ögat som ska manövreras på är vänt uppåt och är nära forskaren.
- Dra försiktigt tillbaka ögonlocken i ögat som ska transplanteras med hjälp av trubbiga pincett, pop ögat ut, och löst fixa med ett par pincett. Se till att pincettens spetsar är täckta med ett polyetenrör som är fäst vid huvudhållarplattformen (Figur 1a, infoga).
- Håll alltid båda ögonen våta genom att applicera en droppe steril PBS på ögat.
- Överför de mänskliga holmarna från det förseglade 1,5 mL-röret (avsnitt 1) till en petriskål med steril PBS och se till att holmarna ligger nära varandra för att minimera mängden överförs cellkulturmedia (Figur 1c).
- Plocka upp ~20–30 holmar i ögat kanylen ansluten via polyeten slangar till Hamilton sprutan.
OBS: Ta upp så lite vätska som möjligt med holmarna. - Häng slangen upp och ned och fäst vid stereomikroskopet (Bild 1d). Tejpa slangen försiktigt för att låta holmarna sjunka till slutet av röret mot kanylen.
4. Transplantationsförfarande
OBS: Denna metod har tidigare beskrivits för transplantation av mus holmar6. Här presenteras ett något modifierat förfarande.
- Nyp ner kuddarna på bakbenen för att se till att musen sover.
- Dra åt tången som håller fast ögat utan att störa blodflödet och applicera en droppe steril PBS på ögat.
- Med hjälp av en 25 G nål som skalpell, avfasning uppåt, försiktigt penetrera endast hälften av spetsen i hornhinnan och göra en enda lateral snitt. Gör hålet i en uppåtriktad vinkel; hålet kommer att täta lättare efter transplantationen (Bild 1f).
- Lyft försiktigt upp hornhinnan med kanylen förladdad med holmar och applicera långsamt holmar i ögat. Undvik insättning av kanylen i den främre kammaren för att förhindra skador av iris, utan snarare trycka försiktigt mot hornhinnans öppning (Figur 1g). Dra långsamt tillbaka kanylen från ACE.
OBS: Sikta på en injektionsvolym på 3–8 μL. Om volymen är för stor kommer den att utsätta ögat för onödigt högt intraokulärt tryck och kan resultera i återflöde av de injicerade holmarna ut ur den främre kammaren. - När du står inför svårigheter med insättning av holmarna på grund av ökat tryck i ögonkammaren, förstora snittplatsen genom att förstärka det laterala snittstället och återapplicera holmar.
OBS: Ibland kan introducerade luftbubblor användas som rymdhållare. - Applicera ögongel i ögat, lossa ögonshållande kraftpens och låt musen på isofluran i samma läge i 8–10 min låta holmarna ställa in.
- Ta bort de tröpar som håller ögonlocket och sätt tillbaka ögonlocket till sitt normala läge.
- Ta bort musen från huvudhållaren och överför den till en wake up-bur.
- När musen är vaken och rör sig, överför den tillbaka till den ursprungliga buren och hålla i djurhuset tills skanning (minst 5 dagar rekommenderas).
5. Avbildning av inopererade människosn holmar genom 2-fotonmikroskopi
OBS: Att ta översiktsbilder av ögat med hjälp av ett fluorescenssterekopiskt mikroskop (Figur 2a–c) 4–5 dagar efter transplantation före 2-fotonavbildning rekommenderas att lokalisera de syner av intresse. Undvik att hålla tillbaka ögat för hårt så här tidigt efter transplantation. Använd 2-foton bildbehandling 6–7 dagar posttransplantation.
- Starta programvaran för bildanskaffning (se Table of Materials). I " Laser "-menynaktivera Mai Tai laser (Power "ON") och i "Ljusbana" menyn ställa våglängden till 900 nm och tillämpa en minimal överföring lasereffekt börjar med 5%–10% laserkraft (använd reglage).
OBS: Medan du skannar, justera lasereffekten efter behov. - Ställ in gröna, orangea och röda kanaler. Samla in utsläppsljus samtidigt på tre icke-tillskansade detektorer (NDD) med hjälp av en diconic spegel (LBF 760) och information om utsläppsfilter enligt följande: Röd/Angiosense 680, 690–730 nm; Grön/Autofluorescens, 500–550 nm; och Orange/Tomat, 565–610nm (Figur 2d).
- Placera huvudhållarens scen på den motoriserade mikroskopstadiet och anslut gasmasken till anestesimaskinens slangar och slangar som är kopplade till ventilationssystemet. Sätt på värmedynan.
- Söva mottagarmusen, överför till huvudhållarens plattform, hålla tillbaka ögat för avbildning och administrera buprenorfinlösning enligt beskrivningen ovan (steg 3.1–3.5).
- Justera isofluranångor efter behov. En andningsfrekvens på ~55–65 andetag per minut (bpm) indikerar optimal anestesi. Om anestesi är för djup, kommer hastigheten att vara <50 bpm med tung andning eller flämtning; om alltför ljus, kommer hastigheten att vara >70 bpm med ytlig andning. Övervaka möss noggrant under anestesi genom visuell inspektion var 15:e min.
OBS: Anesthetization varierar från mus till mus, mellan mus stammar, och som tid under anestesi fortskrider13. - Administrera tillräckligt med ögongel på ögat som en nedsänkningsvätska mellan hornhinnan och linsen, vilket gör att den långsamt kan samlas ihop (Figur 2f, infoga). Undvik luftbubblor.
OBS: Side belysning med en flexibel metall slang lampa rekommenderas att justera fokus och lokalisera holme ympkvistar. - För att visualisera blodkärlen administrerar du 100 μL av bildbehandlingsmedlet (t.ex. Angiosense 680) intravenöst i svansvenen med hjälp av en engångsinsulin 30 G-spruta.
- I "Förvärvsläge" justera ramstorleken till 512 x 512 och skanningshastigheten.
OBS: Långsammare skanningar (dvs. ökande uppehållstid) kommer att förbättra signal-brusförhållandet. - I "Kanalerna" menyn justera Master Gain för varje PMT i Volt för att förstärka signalen tills en bild ses på skärmen i Live scanning-läge. Ju högre detta värde, desto känsligare blir detektorn för att signalera och buller.
OBS: Helst, håll värden mellan 500–800 V. - I menyn "Z-stack" definiera början och slutet av z-stacken genom att manuellt flytta fokus till toppen av holmetransplantatet. Spara position genom att välja "Ställ in först". Flytta till det sista bottenplanet som kan fokuseras i holmetransplantatet och spara position genom att välja"Ställ in sista". Använd en z-stegstorlek på 2 μm.
- Samla den slutliga bildstacken genom att klicka på fliken "Starta experimentet" och spara som 8-bitars CZI (dvs. Carl Zeiss-format) fil.
6. Avbildning av inopererade människosn holmar genom konfokalmikroskopi
OBS: Den totala volymen, morfologi, och plasticitet av transplanterade holmar kan bedömas genom att övervaka in vivo spridningssignal i en separat genomsökning (dvs. separat spår) genom detektering av laser backscatter ljus10.
- Ta ut helljussklyven (dvs. LBF Filter) och i "Light Path" -dialogen som inrättats ett separat spår för konfokal avbildning. Välj Argon laser med våglängd på 633 nm och detektering vid samma våglängd som laserljuset. Z-stackar förvärvas med stegstorleken 2–3 μm för backscatter ljussignal.
- Justera z-stack-inställningarna för att se till att spela in hela holmen (se steg 5.10).
- Förvärva bilden stacken och spara som 8 bitars CZI fil.
7. Bildanalys
OBS: Kommersiell programvara (se Table of Materials) användes för detta steg.
- Ta bort holme autofluorescens (Bild 3b)
- I "Bildbehandling" fliken välj "Kanal aritmetik's" och typ "ch1-ch2". Detta skapar en ny kanal 4 (ch 4); byta namn som "Vasculature".
OBS: Green/Autofluorescens kanalen subtraheras från Red/Angiosense kanal. - Upprepa föregående steg och skriv "ch3-ch2" för att skapa en ny kanal (ch 5); byta namn som "Tomat (alla)".
OBS: Green/Autofluorescenskanalen subtraheras från Orange/Tomatkanalen.
- I "Bildbehandling" fliken välj "Kanal aritmetik's" och typ "ch1-ch2". Detta skapar en ny kanal 4 (ch 4); byta namn som "Vasculature".
- Definiera holme mask genom manuell ritning (Bild 3c)
- Skapa en ny yta (blå symbol) och i guiden välja "Redigera manuellt". Håll pekaren i "Välj" -läge och i 3D-vyn oklicka "Volym" (under Scen) för att visualisera avsnitt.
- För enklare islet gränsdiskriminering, aktivera alla kanaler, inklusive 1– lm 3.
OBS: Orange/ Tomatkanalen är användbar för att definiera holmekantlinjer genom Tomatkapselsignalen. Alternativt öka kanalintensiteter att använda flerkanalig holme autofluorescens och detektor bakgrundssignal som vägledning. - I fliken "Ritning" välj " Kontur "ochklicka på "Rita" för att börja rita konturer runt holmekanten med början i segmentposition 1.
- Flytta till en ny segmentposition och upprepa ritningskonturer. Avsluta med det sista segmentet på toppen av holmen och avsluta genom att klicka på fliken "Skapayta " . Vanligtvis är det tillräckligt att dra konturer varje 10:e skiva.
- Segmentering av "Islet vasculature" och "Holme tomat" fluorescens med hjälp av holme mask (Figur 3d).
- Välj det tidigare definierade "Isletmask" -objektet, gå till redigeringsfliken (pennsymbolen) och klicka på fliken " Maskalla" som öppnar ett nytt fönster.
- Välj den tidigare namngivna kanalen "Vasculature" (ch 4) i menyn för dropdown för kanalval och aktivera alternativ "Duplicera kanalinnan du applicerar mask ", "Konstant insida/utsida", och ställ in Voxels Outside Surface till "0.000", vilket skapar en ny kanal; byta namn som "Islet vasculature" (ch 6).
- Upprepa steg 7.3.1 och 7.3.2 och välj den tidigare skapade kanalen "Tomat (alla)" (ch 5) i kanalen val rullgardinsmenyn för att skapa den nya kanalen; byta namn som "Holmetomat" (ch 7).
- Ytåtergivning av holmevaskulatur (Bild 3e)
- Skapa en ny yta i menyn "Scen" och i guiden välj " Automatisktskapande".
- Ställ in källkanalen på tidigare skapad "Islet vasculature" (ch 6) och välj subtraktion med bakgrund. Automatisk tröskeluppskattning kan justeras om det behövs. Jämför med den smöte fluorescenskanalen (t.ex. genom att blanda in/ut den nyskapade fliken yta). Fortsätt i guiden.
- Använd valfritt filter. Välj till exempel "Volym" och justera filtret (gult) i fönstret, vilket kan ta bort markerade ytobjekt. Gör klart guiden och ge det nya ytobjektet namnet "Islet vasculature".
- Segmentering av "Islet tomat vasculature" fluorescenssignal (Bild 3f)
- I det tidigare skapadesurface-objektet " Islet vasculature" går du till redigeringsfliken och klickar på fliken "Mask all" som öppnar ett nytt fönster.
- Välj den tidigare namngivna kanalen "Holmetomat" (ch 7) i rullgardinsmenyn för kanalval och ställ in Voxels outside surface till "10.000", vilket skapar den nya kanalen; byta namn som "Islet tomat vasculature" (ch 8).
- Segmentering av "Tomatkapsel" fluorescenssignal (Bild 3g)
- Välj "Channel Arithmetic's" i fliken "Bildbehandling" och skriv "ch7-ch8", vilket skapar den nya kanalen; byta namn som "Tomatkapsel" (ch 9).
OBS: Fluorescenssignalen "Islet tomat" subtraheras från den totala "Holmetomaten" fluorescenssignalen.
- Välj "Channel Arithmetic's" i fliken "Bildbehandling" och skriv "ch7-ch8", vilket skapar den nya kanalen; byta namn som "Tomatkapsel" (ch 9).
- Ytåtergivning av "Islet tomatvaskulatur" och "Tomatkapsel" (Figur 3h)
- Följ steg 7.4, och i guiden välja källkanaler "Islet tomat vasculature" (ch 8) eller "Tomatkapsel" (ch 9) för att skapa nya ytobjekt därefter.
- Ytrendering av total holmeyta( Figur 3i)
- Öppna filen med islets backscatter och skapa en ny yta.
- I guiden väljer du " Automatisktskapande" och definierar "Region av intresse".
OBS: "Region av intresse" används för att separera signalerna från flera holmar och för att definiera djupet av den holme som ska analyseras (t.ex. topp 75 μm). - I "Absolut intensitet" justera tröskelvärdet om det behövs. Ytobjektet kan klickas på eller av för att dubbelkolla med motsvarande kanalintensitet. Stäng guiden.
- Kvantifiering (figur 3j)
- Markera ett skapat ytobjekt i menyn "Scen" och gå till fliken"Statistik " .
- För att hämta detaljerade volymdata i det markerade ytobjektet välj "Detaljerad" fliken och välj "Specifika värden" och "Volym" från dropdown-menyn. Om du vill hämta ett totalt volymvärde för det markerade ytobjektet går du till fliken "Detaljerad" och väljer "Genomsnittsvärden".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Icke-märkta mänskliga holmar var transplanteras in i ACE av 8 veckor gamla kvinnliga NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomat. Rag2−/−) mottagarmöss. För att förhindra att mänsklig vävnad avstötning, immundeficient Rag2 knockout möss valdes som mottagare. Hos dessa transgena möss uttryckte alla celler och vävnader ett membraninriktat tomatfluorescensprotein (mT) som möjliggör tydlig identifiering av mottagaren och givarvävnaden. Upprepad bildframställning av holme ympkvistar genom högupplösta 2-foton mikroskopi kunde identifiera mT+ mottagare celler som deltar i engraftment processen och deras dynamiska migration mönster.
I allmänhet var transplantationsuppställningen av mänskliga holmar i ACE för mottagarmössen (Figur 1a) liknande syngeneiska mus holme transplantationer med avseende på holme form och storlek (Figur 1b,c). Figur 1d,e visar en typisk transplantation med en detaljerad schematisk som visar det laterala snittstället ( Figur1f) och spridning av holmar i ögonkammaren (Figur 1g) och ett representativt utfall av injicerade mus holmar (Figur 1h) eller mänskliga holmar (Figur 1i). Ympningshastigheten för mänskliga holmar var i allmänhet lägre (~30%) än musskulsens (50–70 %). En möjlig orsak till denna diskrepans är att tillgången på mänskliga holmar är oförutsägbar, oftast med endast 1 dagars varsel, och även att de erhållna holmarna varierar i givarålder, givar-BMI, renhet (45%–86 %), och postisolationskulturtid (2–5 dagar). Däremot kan holme isoleringar från möss enkelt planeras. Dessa isolerades från 6–8 veckor gamla (dvs. unga vuxna) möss med hög renhet och korta, övernattningskulturtider. Dessa avvikelser mellan mus och mänskliga holme ympkvistar bör beaktas vid tolkning av resultaten.
In vivo fluorescens avbildning av mänskliga holme ympkvistar äventyrades av betydande störningar från vävnad autofluorescens (Figur 4). Visualiseringen av revaskulariseringsprocessen av ACE-transplanterade humana holmetransplantat genom bildframställningsmedel med hjälp av traditionella våglängder i det synliga spektrumet hindrades av ett lågt signal-brusförhållande och hög nivå av naturlig holme autofluorescens, illustrerad av bilder av en λ-scan i spektralområdet 500–700 nm (Figur 4a) eller av den känsliga icke-tillskansade PMT-detektorn med filter för detektering av dextran TR (610–675 nm) (Bild 4b). Denna höga bakgrund observerades inte i mus holme ympkvistar( Figur 4c). NIR-avgivande bildbehandlingsmedlet Angiosense 680 visade ett synbart högre signal-bakgrundsförhållande på grund av minskningar av bakgrundsbrus i NIR-området 690–730 nm (Figur 4d, Bild 3a). Den extra inspelningen av en "oanvänd" kanal (dvs. 500–550 nm) kunde användas i ett senare bildbehandlingssteg för att avlägsna kvarvarande bakgrundsljud som orsakas av naturlig holme autofluorescens. 2-foton/konfokala bildframställning (Figur 2d–f) liknar tidigare beskrivna6, med hjälp av 900 nm 2-foton excitation och fluorescens detektion av Angiosense 680, autofluorescens, och tomatkanaler med icke-såskanade PMTs 1-3 (Figur 2d). Det är lämpligt att mäta den laserutgångseffekt som når provet för varje mikroskopinställning (Figur 2e). Vidare rekommenderas att initialt bild de ympade holmar med stereomikroskopi (Figur 2a–c), som kommer att hjälpa välja holmar av intresse och undvika 2-foton mikroskopi bilder av en misslyckad transplantation.
Syftet med att extrahera kvantitativa data från många bilder var att ta bort potentiella partiskhet i dataval och att få den statistiska makt som krävs för att upptäcka en legitim effekt när man jämför experiment. Kvantifiering från fluorescerande avbildning av bukspottskörteln holmar inblandade flera steg, som var och en kan ha påverkat resultaten i en annan. Här användes interaktiva bildhanteringsprogram. Den innehåller funktioner som möjliggör visualisering av volymbilder och objekt och identifiering av objekt enligt deras morfologi eller intensitet. Bild 3 illustrerar de olika stegen i bildsegmenteringen. Borttagandet av autofluorescens genom subtraktion av "autofluorescens" kanalen förbättrade signal-brusförhållandet (Figur 3a,b). Den holmegräns som kallas "holmemask" (Bild 3c) och motsvarande kanaler (Bild 3d) definierades manuellt. In segmenteringen av tomatsignalen i holmevaskulaturen och holmekapseln (bild 3f,g) och slutlig ytrendering (Bild 3e,h, i )användesför att extrahera kvantitativa data.
Figur 5 visar en representativ longitudinell bildbehandling session av samma mänskliga holme moderplantor vid 2 veckor, 2 månader, 5 månader och 8 månader posttransplantation i ACE av en NOD. ROSA-tomat. Rag2-/- mottagarmus. Illustrerade är maximal intensitet prognoser (MIP) bilder av ursprungligen inspelade RAW-data (Figur 5a), bearbetade bilder efter holme autofluorescens borttagning (Figur 5b–e, f– i ),ochsegmenterade holme objekt inklusive kapsel (Figur 5j,m) eller holme vasculature bildar mT+ mottagarceller (röd, Figur 5n–q) och totala holme vaskulatur (grön, Figur 5n–q).
Figur 1: Transplantation av bukspottskörtelskult i ögats främre kammare.
(a) Transplantationsupplägg som visar sövd mus fixerad i stereotaxisk huvudhållare och det utsatta ögat (infällt) bredvid den beredda Hamiltonsprutan som är fastlagd vid bordet och stereomikroskopet redo att plocka musögnar (b) eller mänskliga holmar (c). (d) Väntläge för ögon kanylen laddad med holmar. (e) Transplantation i processen, och (f) schematisk ritning av ett enda lateralt snitt som används för att försiktigt lyfta upp hornhinnan med spetsen av ögat kanylen och dispensera holmar i främre kammaren (g). Bild av ögat omedelbart efter injektion av musöletar (h) eller mänskliga holmar (i). Skala bar = 500 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Bildframställning av ACE-implanterade bukspottkörtel-holmetransplantat.
(a) Experimentell lysrörsradiomikroskop avbildning setup. Vidfält (b) eller fluorescerande bild (c) av B6. ROSA-tomat holme ympkvistar. (d) Förenklad ordning för utsläppsljusbanan. LBF: Laserblockerande filter (helljusdelare); LP: Lång passning; BP: Bandpass; PMT: Fotomultiplier. (e) Laserutgångseffekt beror starkt på våglängden. Diagram visar faktisk laseruteffekt i Watt (W) relaterat till effektnivån för laserstrålen (%), mätt för mikroskopinställningen. Cirkel: 800 nm, kvadrat: 900 nm, triangel: 1 000 nm. (f) Experimentell avbildningsuppställning som visar mottagarmusen med ACE-ympade skär (skär) monterade på den motoriserade scenen ett kommersiellt mikroskop. Skala bar = 100 μm Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Bildsegmentering av en mänsklig holme som ympats i ACE i en NOD. ROSA-tomat. Rag2-/- mottagarmus.
(a) Originalinspelning: Visas är en 3D-rendering av en bildstack av en mänsklig holme med sammanslagna kanaler eller optiska sektioner av delade kanaler Angiosense 680 (ch 1), autofluorescens (ch 2), och tomat (ch 3). (b)3D-återgivning av bildstack med sammanslagna kanaler eller optiska sektioner med delningskanaler "Vasculature" (ch 4) och "Tomato(all)" (ch 5) efter borttagning av autofluorescens. (c) Holme mask (gul). (d) 3D-återgivning av bildstack med sammanslagna eller delade kanaler "holme vasculature" (ch 6, vit), "holmetomat" (ch 7, röd). (e) Ytobjekt "holme vasculature" som skapats från 6 ch. (f) 3D-återgivning av bildstack med sammanslagna kanaler "holme vasculature" (ch 6, grön) och "holmetomat vasculature" (ch 8, röd). (g) 3D-återgivning av "tomatkapsel" (ch 9) efter kanal subtraktion ch 7–ch 8 eller optisk sektion med sammanslagna kanaler "tomatkapsel" (ch 9, vit), holmetomat vasculature (ch 8, röd), och holme vasculature (ch 6, grön). (h) Ytåtergivning av tomatkapsel (skapad av ch 9) och holmetomatvaskulatur (skapad av 8 ch). (i) Holme segmentering från mänskliga holme backscatter signal som visar valet av "Region av intresse"(vänster) och den segmenterade ytan objekt (mitten) jämfört med kanalen intensitet (höger). (j) Hämtning av data från statistikfliken. Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Autofluorescens av mänskliga holmar.
Mänskliga holmar (a,b,d) eller B6 mus holmar (c) transplanterades in i ACE av NOD. Rag2-/- eller B6-mottagarmöss och injicerats med dextran TR (a–c) eller Angiosense 680 bildbehandlingsmedel (d) för visualisering av blodkärl. (a) λ-scan av humant holmympkvist i intervallet från 500–700 nm med 2-fotonexcitation vid 900 nm. Maximal bildprojektion (MIP) bild av human (b) eller mus holme graft (c) upphetsad vid 900 nm och detekteras med TR filter (610–675 nm) av NDD. (d) MIP av en mänsklig holme ympkvisten upphetsad vid 900 nm och upptäckt med Angiosense 680 filter (690–730 nm) av NDD. Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Transplanterade människoskålar omvaskuleras successivt och inkapslas in genom att mT uttrycker celler med mottagarbeskärning.
Mänskliga holmar transplanteras in i främre ögat kammaren av NOD. ROSA-tomat. Rag2−/− mottagaremöss, avbildades upprepade gånger i upp till 8 månader. Angiosense 680 injicerades för visualisering av vasculature. (a) Prognoser för maximal intensitet (MIP) av originalinspelade RAW-data av split (vasculature, autofluorescens, mT) eller sammanslagna kanaler och backscatter ljussignal vid 5 månader posttransplantation. MIPS av total vasculature ensam (b–e) eller samman med membran-riktade tomat fluorescens (mT) (f–i) efter holme autoflourescence borttagning (grön, en). 3D-renderingar av segmenterad holmetomatkapsel (j–m) och holmetomatvaskulatur (röd) eller total holmevaskulatur (grön) (n–q) vid angivna tidpunkter posttransplantation. Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metod presenteras för att studera den mänskliga bukspottskörteln holme cell ympning processen genom att observera medverkan av mottagare och givare vävnad. Efter en minimal invasiv kirurgi implantera mänskliga holmar i främre kammaren av en immunodeficient mus öga, musen återhämtar sig snabbt inom några minuter efter operationen. Proceduren utförs på ett öga. Generellt, från 5 – 7 dagar postimplantation och framåt hornhinnan är tillräckligt läkt för att utföra intravital bildbehandling.
I detta protokoll är kvaliteten på de mänskliga holme ympkvistarna kritisk. Mänsklig holme kvalitet och därmed transplantation resultatet kan variera beroende på givarens ålder, BMI och isolering process, samt tid för holme kultur före och efter ankomsten. Mänskliga holmar bearbetas från organdonator bukspottkörteln godkänts för klinisk transplantation och forskningsändamål användes med samtycke av givarna. De erhölls efter en process av bukspottkörteln matsmältningen och holme rening beskrivs någon annanstans12. I likhet med isolerade murin holmar, dessa holmar genomgår ett antal cellulära överfall såsom ischemi, mekanisk stress, förlust av källare proteiner, och partiell störning av intra-holme endotelceller (ECs) under den enzymatiska matsmältningensteg 14,15. Trots att ständigt förbättra kultur villkor och återvinning av ett stort antal högkvalitativa mänskliga holmar, tiden till transplantation är fortfarande en kritisk faktor. Under de första dagarna av kultur, mänskliga holmar visar en betydande förlust av intra-holme ECs och på sex dagar av kultur endast små endotelstrukturer i holme kärnan kan upptäckas16. Denna förlust av intra-holme endotelceller skulle kunna utgöra en kritisk faktor i den minskade ympning av mänskliga holmar, eftersom givaren holme ECs är viktiga aktörer i revascularization processen17.
Att bibehålla steriliteten under transplantationsförfarandet är avgörande för att undvika ögoninfektioner i den immunkomprometterade NOD. ROSA-tomat. Rag2-/- möss. Typiskt, transplantation förfaranden utförs under rena förhållanden med hjälp av handskar, labbrock, huvudskydd, och munmask, men inte inuti en biosäkerhet skåp. Alla använda lösningar är sterila filtreras, och sprutor, kanyl, slangar, och gasväv sköljs i 70% etanol. Väckningsburar autoklaveras. Även full sterilitet inte kan garanteras på grund av manuell hantering av musen under förfarandet, holme kontaminering eller ögoninfektioner har inte varit problem med detta förfarande.
Stabil och adekvat anestesi är en viktig och kritisk faktor för att minska ögonrörelser och drift under låg framerate datainsamling, och effektiviteten kan variera mellan olika anestesimedel18. Under ljus, allmän isofluranbedövning rör sig ögat emellanåt på ett långsamt rullande sätt och ökat djup av anestesi (från 1–2 %) generellt kan minska ögonrörelser. Den tydliga fördelen med att använda inhalerbar anestesi är dess snabba effekt och återhämtningstid. Det bör dock påpekas att användning av isofluran kan förändra insulinsekretion19.
Bildanalys och segmentering, eller partitioneringen av en bild i flera regioner, är utmanande och föremål för potentiell partiskhet i dataval20. Segmentering syftar till att identifiera objekt som "holme vasculature" för kvantifiering. Här tillämpades metoder som bygger på intensitet-tröskel för att välja regioner (dvs., "absolut intensitet") eller intensitetsskillnader för att hitta kanter (dvs., "bakgrunds subtraktion"). För närvarande finns det inga universallösningar för segmentering i fluorescerande mikroskopi. Ett tillvägagångssätt är att experimentera med kommersiell programvara som stöder en rad metoder. Om tröskelvärden misslyckas på grund av bakgrundsintensitetsvariation, då små ändringar i bildfångstinställningarna kan förbättra segmenteringsresultat.
En begränsning av metoden ligger i det faktum att det mänskliga transplantatet snabbare ersätts av mottagarceller och i själva verket helt rekonstituerade av musmottagare endotelceller. Detta skulle hindra studier av mänskliga cell interaktioner om syftet är att studera adoptivt överfört mänskliga immunceller migrerar till holme parenkym via interaktioner med mänskliga endotelceller. Men både i mus och mänskliga holme ympkvistar, liknande revascularization sker från mottagaren och följer de olika anatomiska 3D-plan specifika för arten.
Andelen framgångsrika behandling med ersättningsbehandling med betaceller har fortsatt att förbättras. Fortfarande, olika utmaningar i utvärderingen av effektiviteten i holme ympning och överlevnad in vivo förblir olösta på grund av bristen på lämpliga intravital imaging teknik. Den främre ögat kammaren är en användbar transplantation webbplats, stödja upprepade och långsiktiga in vivo avbildning av holme celler för studier av holme morfologi, vascularization mönster, beta cell funktion och beta celldöd vid en cellulär upplösning.
Protokollet för att studera ympningsprocessen för mänskliga holme transplantationer i ACE transplantation webbplats som rapporteras här möjliggör för longitudinell övervakning av mänskliga holmar ympkvistar med betydligt högre upplösning än den som erhållits med andra alternativa longitudinella plattformar sådan MRI21,22, PET23, SPECT24, eller Bioluminescens25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie har fått stöd av Vetenskapsrådet, Strategiska forskningsområdet Exodiab, Dnr 2009-1039, Stiftelsen för Strategisk Forskning Dnr IRC15-0067 till LUDC-IRC, Kungliga Fysiografiska Sällskapet i Lund, Diabetes och Barndiabetförbundetes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al.
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
