Summary
מטרת הפרוטוקול היא לעקוב באופן רציף אחר הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי ועל הפונדקאי התורם לעומת תאי התורם. זה מושגת על ידי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של העין (ACE) של NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-נמען העכבר ואחריו הדמיה חוזרת של 2 פוטין.
Abstract
הדמיה תאי בטא הוא צעד מפתח לקראת הבנת השתלת איון. למרות פלטפורמות הדמיה שונות להקלטה של ביולוגיה תא בטא פותחו ומנוצלים vivo, הם מוגבלים במונחים של מתן רזולוציה תא יחיד והקלטות אורכיות רציפות. בגלל השקיפות של הקרנית, התא הקדמי של העין (ACE) בעכברים מתאים היטב ללמוד ביולוגיה של תאי אי הלבלב האנושי והעכבר. הנה תיאור של איך גישה זו יכולה לשמש לביצוע הקלטות אורכיות רציפות של השתלה ו revascularization של שתלים בודדים איון אנושי. שתלי אייון אנושיים מוכנסים לתוך ACE, באמצעות NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26סורtm4-Rag2-/- עכבריםנממענים. הדבר מאפשר חקירה של הרחבת תאי הנמען לעומת תאי התורם ותרומתם של תאי הנמען בקידום האנקפולציה וסקולריזציה של השתל. יתר על כן, גישה שלב אחר שלב לניתוח תמונה וכמת של נפח האי או כלי דם מחולקים וקפסולת איון ויוצרים תאים נמען מתואר.
Introduction
סוכרת מתאר קבוצה של מחלות מטבוליות המאופיינת ברמות גבוהות של גלוקוז בדם כתוצאה של ייצור אינסולין לא מספיק מאובדן או תפקוד לקוי של תאי ביתא איון הלבלב, לעתים קרובות מלווה תנגודת לאינסולין. סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D) הן מחלות מורכבות שבהן התפקוד הפרוגרסיבי של תאי הביתא גורם להתפתחות מחלות. T1D הוא זירז על ידי התקפה אוטואימונית על תאי בטא, בעוד T2D נחשב מונע על ידי גורמים מטבוליים, אם כי עם ראיות גוברות של דלקת מערכתית בדרגה נמוכה1. השתלת איונים אנושיים תורמים, במיוחד לחולים T1D, מציע את הפוטנציאל לספק שליטה גליקמית פיזיולוגית. עם זאת, מחסור של תורמי רקמות וחינוך איון עני מנע השתלת איון להפוך לאפוביה טיפולית הזרם המרכזי. חלק ניכר של שתל האי הפונקציונלי אובד בתקופה שלאחר השתלה מיידית (24-48 שעות) בשל הסביבה המארח היפוקסית, דלקתית, אימונוגנית2,,3. כדי להעריך את היעילות של שיטות התערבות לשיפור הישרדות איון, ניטור מתמשך של השתלות כאלה הוא הכרחי.
בטכניקות vivo כדי למצוא את גורלם של איונים הלבלב האנושי מושתלים לאחר השתלה עדיין נשאר אתגר עבור סוכרת מחקר4,5. עד כה, טכניקות הדמיה לא פולשניות, כולל טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET), הדמיית תהודה מגנטית (MRI), או אולטרסאונד (ארה"ב) להראות פוטנציאל לכמת והערכה פונקציונלית של איים מושתלים בתנאיםניסיוניים 5. עם זאת, בהתחשב בגדלים הקטנים של איון, מדידות כמותיות על ידי אותם מודאליות סובלות מרזולוציה לא מספקת. התא הקדמי של העין (ACE) כאתר השתלה לתצפית הוא פתרון הדמיה מבטיח שאינו פולשני המציע רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ביעילות וניטור תכופים על פני תקופותארוכות 6. שיטה זו נוצלה בהצלחה כדי ללמוד ביולוגיה איון העכבר (נבדק ביאנג ואח'. 7), תגובות חיסוניותאוטואימוניות 8, כמו גםהשתלת איוןאנושי 9,10.
כאן שיטת השתלת ACE משולבת עם גישה 2-פוטן הדמיה לחקור את הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי הלבלב engraftment על ידי הקלטות רציפות וחוזרות על עצמן על שתלי אי בודדים עד 10 חודשים לאחר ההשתלה. תכונות הדמיה multiphoton של עומקי הדמיה גדולים יותר והפחתת פוטו-בליך הכולל ונזק לצילום להתגבר על מגבלות ההדמיה של מיקרוסקופ confocal11. כימות של הדמיית פלורסנט כרוכה במספר שלבים, כולל הכנת מדגם איון, השתלת איון, רכישת תמונה, סינון תמונות להסרת רעש איון או רקע, פילוח, כימות וניתוח נתונים. השלב המאתגר ביותר הוא בדרך כלל חלוקה למחיצות או פילוח של תמונה לחלקים או לאזורים מרובים. הדבר עשוי לכלול הפרדת אות מרעש רקע, או אזורי קיבוץ באשכולות של voxels בהתבסס על קווי דמיון בצבע או צורה כדי לזהות ולתייג voxels של אמצעי אחסון תלת-מית-מיוידי המייצג כלי דם של איון, לדוגמה. לאחר המקטע, סטטיסטיקה כגון גדלי אמצעי אחסון של אובייקט היא בדרך כלל פשוטה לחילוץ. מסופקת שיטה לכמת ולחילוץ של נתוני ההדמיה, כגון פילוח ופריט חזותי של נתונים. תשומת לב מיוחדת משולמת להסרת autofluorescence איונים אנושיים והבחנה בין כלי דם איון כמוסה איון ויוצרים תאים נמען.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת האתיקה האזורית בלונד, שוודיה, אישרה את המחקר על פי החוק הנוגע לביקורת האתית של מחקרים הקשורים לבני אדם. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לאתיקה השבדית של ניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדות האתיקה של מאלמו ולונד. 6 עד 8 שבועות של אף פעם לא חיסוני. (Cg)-Gt(ROSA)26סורtm4-Rag2-/- (NOD. רוזה-עגבנייה. Rag2-/-) עכברים נמען שימשו נמענים להשתלה של איונים אנושיים10.
1. הכנת איילט להשתלה
- איונים אנושיים תרבות ב CMRL 1066 בתוספת עם 10 mM HEPES, 2 mM L-גלוטמין, 50 μg/mL gentamycin, 0.25 μg/mL פטריות, 20 μg/mL ציפרופלוקסאצין, 10 m nicotinamide (NIC), ו 10% חום לא פעילות סרום אנושי ב 37 °C ב 5% CO2 אוויר לח עד להשתלה, כפי שתוארקודם לכן 12.
הערה: אייונים צריכים להיות חופשיים מרקמות אקסוקריניות ולא לגעת אחד בשני בתרבות. רקמות אקסוקריניות נראות שקופות. - ביום ההשתלה, העבר את אמצעי התקשורת של התרבות המכילה את אייונים לצלחת פטרי חדשה באמצעות מכלול צינור שאפתור המחובר לניים מזכוכית נשלפת.
הערה: לחלופין, השתמש פיפטה 200 μL. צביעת החלק האחורי של צלחת פטרי מסייעת להפוך את איי ה-10 לבולטים יותר תחת מיקרוסקופ הסטריאו. - באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, לבחור ~ 20-40 איונים לכל השתלה ולהעביר צינור 1.5 מ"ל. מלא את הצינור למעלה עם תקשורת תרבות מהאינקובטור.
- לאטום את הצינורות עם סרט פרפין ולאחסן על קרח עד להשתלה. הכן כמות מתאימה עבור מספר ההשתלות שבוצעו.
- לחלופין, ודאושאינקובטור CO 2 זמין בחדר הניתוח כדי לשמור על איונים בתרבות ולבחור אותם מיד לפני כל השתלה.
2. הכנת ציוד השתלה ושולחן ניתוחים
הערה: יש לעבד את כל הכלים הכירורגיים, ושולחן הניתוחים והמכשירים ינותו ב-70% אלכוהול.
- חבר מחזיק ראש סטריאו-מסה להרדמה באמצעות מסכת אף והפעיל את משטח החימום.
- חבר מזרק המילטון חזק לצינורות פוליאתילן ופקניק עיניים קהה.
הערה: מומלץ למלא את כל החלקים ב- PBS לפני ההרכבה. בדוק אם בועות אוויר לכודות ולהסיר אם קיים. - חבר את מזרק המילטון בחוזקה לשולחן(איור 1a)או בסיס נייד(איור 1e)וצרף את הצינורות למיקרוסקופ הסטריאופוני, כאשר הנולה תלויה למטה (כלומר, עמדת המתנה).
הערה: השתמש בקלטת כירורגית, מכיוון שקל להסיר ולצרף מחדש. - הכן מזרק 1 מ"ל מחובר מחט 30 G מלא 0.1 מ"ג / ק"ג תמיסת buprenorphine.
- הכן מזרק עם פי.בי.אס סטרילי. לחלופין, השתמש פיפטה.
- הניחו בצד כלוב השכמה נקי עם מנורת חימום.
3. הרדמה ומיקום של עכברים נמענים לניתוח
הערה: כל בעלי החיים גודלו והתוחזקו בסביבה ללא פתוגן במתקני בעלי החיים באוניברסיטת לונד.
- להמם את העכבר בתא מלא 40% O2 /60%N2/3% isoflurane ולהעביר את העכבר המהדמה לפלטפורמת מחזיק הראש על משטח חימום חם(איור 1a). בדוק אם יש מחסור רפלקסים לדוושה.
הערה: הרדמה Isoflurane היא השיטה המועדפת של הרדמה להחלמה מהירה לאחר הניתוח. חדר המיקרוסקופ חייב להיות מאוורר כראוי כדי להשתמש isoflurane. - מקם את הנום של העכבר לתוך מסכת ההרדמה מחובר 40% O2/60% N2/0.9%–1.5% מכונת הרדמה isoflurane. השתמש באגודל ובצבע כדי להרים מעט את הראש ולהדק אותו באמצעות החלקים המתכתיים בצדדים. ודא שהאוזניות מתקנות את הראש ישירות מתחת לאוזניים. להזריק 0.1 מ"ג/ק"ג תמיסת buprenorphine תת עורית על הגב של העכבר.
הערה: Buprenorphine משמש כשכךכך כאבים. - הטה את הראש כך שהעין שיש לנתח פונה כלפי מעלה וקרובה לחוקר.
- משוך בעדינות את העפעפיים של העין להשתלה באמצעות מפסים קהים, להוציא את העין, ולתקן באופן רופף עם זוג פינצטה. ודא כי קצות הפינצטה מכוסים בצינור פוליאתילן המחובר לפלטפורמת מחזיק הראש(איור 1א,הכנס).
- תמיד לשמור על שתי העיניים רטובות על ידי החלת טיפה של PBS סטרילי על העין.
- להעביר את איי האדם מן הצינור אטום 1.5 מ"ל (סעיף 1) לצלחת פטרי עם PBS סטרילי ולוודא כי איונים קרובים זה לזה כדי למזער את כמות התקשורת תרבות התא מועבר(איור 1c).
- להרים ~ 20-30 איונים בקנולה העין מחובר באמצעות צינורות פוליאתילן מזרק המילטון.
הערה: קח מעט נוזל ככל האפשר עם איי. - לתלות את הצינורות הפוך ולצרף למיקרוסקופ סטריאו(איור 1d). להדביק את הצינורות בזהירות כדי לתת לאיים לשקוע עד קצה הצינור לכיוון הצינור.
4. הליך השתלה
הערה: שיטה זו תוארה בעבר עבור השתלת איי עכבר6. הליך שונה במקצת מוצג כאן.
- צבוט את הרפידות על הרגליים האחוריות כדי לוודא שהעכבר ישן.
- להדק את המרטיות לרסן את העין מבלי לשבש את זרימת הדם ולהחיל טיפה של PBS סטרילי על העין.
- באמצעות מחט 25 G כמו אזמל, משופע כלפי מעלה, בזהירות לחדור רק חצי מהקצה בקרנית ו לעשות חתך רוחטי יחיד. הפוך את החור בזווית כלפי מעלה; החור ייאטום בקלות רבה יותר לאחר ההשתלה (איור 1f).
- הרם בזהירות את הקרנית עם המנה טעון מראש עם איונים ולאט להחיל איונים בעין. הימנעו מהכנסת הנולה לתא הקדמי כדי למנוע נזק של הקשתית, אלא דחפו בזהירות כנגד פתח הקרנית(איור 1 גרם). לאט לאט למשוך את הנולה מן ACE.
הערה: לכוון נפח הזרקה של 3-8 μL. אם הנפח גדול מדי, זה יחשוף את העין ללחץ תוך עיני גבוה שלא לצורך עלול לגרום ריפלוקס של איים מוזרקים מתוך התא הקדמי. - כאשר הם מתמודדים עם קשיים בהחדרת איים עקב לחץ מוגבר בתא העיניים, הגדל את אתר החתך על ידי חיזוק אתר החתך לחוץ והטמיע מחדש איים.
הערה: מדי פעם, בועות אוויר הציג יכול לשמש כמחזיקי שטח. - למרוח ג'ל עיניים על העין, לשחרר את המרטי ריסון העין ולהשאיר את העכבר על isoflurane באותו מצב במשך 8-10 דקות כדי לאפשר לאיים להגדיר.
- הסר את המרטיות המחזיקות את העפעף והחזירו את העפעף למיקום הרגיל שלו.
- הסר את העכבר ממחזיק הראש והעבר אותו לכלוב התעוררות.
- כאשר העכבר ער וזז, העבר אותו בחזרה לכלוב המקורי והשמור על בית בעלי החיים עד לסריקה (מומלץ לפחות 5 ימים).
5. הדמיה של איונים אנושיים מושתלים על ידי מיקרוסקופי 2 פוטן
הערה: צילום תמונות סקירה של העין באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצי(איור 2a–c)4-5 ימים לאחר ההשתלה לפני הדמיה 2-פוטן מומלץ למצוא את איונים של עניין. הימנע מלרסן את העין חזק מדי בשלב זה מוקדם לאחר ההשתלה. השתמש בהדמיה של 2 פוטון 6-7 ימים לאחר ההשתלה.
- הפעל את התוכנה לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים). בתפריט "לייזר" להפעיל את לייזר מאי טאי (כוח "ON") וב "נתיב אור" להגדיר את אורך הגל 900 נה"מ ולהחיל כוח לייזר שידור מינימלי החל 5%-10% כוח לייזר (השתמש במחוונים).
הערה: בעת הסריקה, התאם את כוח הלייזר במידת הצורך. - הגדר ערוצים ירוקים, כתומים ואדומים. אסוף אור פליטה בו-זמנית על שלושה גלאים שאינם משורים (NDD) באמצעות מראה דיכרונית (LBF 760) ומידע מסנן פליטה כדלקמן: אדום/אנגיוסנס 680, 690-730 ננ"מ; ירוק/פלואורסנציה, 500-550 צפון;; ותפוז/עגבניה, 565-610nm (איור 2d).
- מניחים את שלב בעל הראש על שלב המיקרוסקופ הממונע וחברו את מסכת הגז לצינורות של מכונת ההרדמה והצינורות המחוברים למערכת האוורור. הפעל את משטח החימום.
- להרדים את העכבר הנמען, להעביר לפלטפורמת בעל הראש, לרסן את העין להדמיה, ולנהל פתרון buprenorphine כמתואר לעיל (שלבים 3.1-3.5).
- כוונן את אדי השופלוריין במידת הצורך. קצב נשימה של כ-55-65 נשימות לדקה (bpm) מצביע על הרדמה אופטימלית. אם ההרדמה עמוקה מדי, הקצב יהיה 50 bpm עם נשימה כבדה או מתנשף; אם קל מדי, הקצב יהיה >70 bpm עם נשימה שטחית. עקוב בזהירות אחר עכברים במהלך הרדמה על ידי בדיקה חזותית כל 15 דקות.
הערה: הרדמה משתנה מעכבר לעכבר, בין זנים של העכבר, וזמן תחת הרדמה מתקדם13. - לתת מספיק ג'ל עיניים על העין כנוזל טבילה בין הקרנית לעדשה, ומאפשר לה להצטבר לאט(איור 2f,הכנס). להימנע בועות אוויר.
הערה: תאורה צדדית עם מנורת צינור מתכת גמישה מומלצת כדי לכוונן את המיקוד ולמצוא למיקום אחר שתלי איי. - כדי לדמיין את כלי הדם, לנהל 100 μL של סוכן ההדמיה (למשל, Angiosense 680) דרך וירד לתוך וירק הזנב באמצעות אינסולין חד פעמי 30 G מזרק.
- במצברכישה " להתאיםאת גודל המסגרת ל- 512 x 512 ואת מהירות הסריקה.
הערה: סריקות איטיות יותר (כלומר, הגדלת זמן ההתעכבות) ישפרו את יחס האות לרעש. - בתפריט "ערוצים" להתאים רווח ראשי עבור כל PMT ב וולט כדי להגביר את האות עד תמונה נראית על המסך במצב סריקה חיה. כערך זה גבוה יותר, כך הגלאי הופך רגיש יותר לאותת ורעש.
הערה: רצוי, שמור ערכים בין 500-800 V. - בתפריט "Z-stack" להגדיר את ההתחלה ואת הסוף של z-stack על-ידי הזזת המוקד באופן ידני לראש שתל אייון. שמור מיקום על-ידי בחירה באפשרות "הגדר ראשון". עבור אל הישור התחתון האחרון שניתן להתמקד בהשתלת איון ולשמור מיקום על-ידי בחירה באפשרות "הגדר אחרון ". השתמש בגודל z-שלב של 2 μm.
- אסוף את ערימת התמונה הסופית על-ידילחיצהעל הכרטיסיה " התחל ניסוי " ושמור כקובץ CZI של 8 סיביות (כלומר, תבנית Carl Zeiss).
6. הדמיה של איונים אנושיים מושתלים על ידי מיקרוסקופית קונפוקלי
הערה: ניתן להעריך את הנפח הכולל, מורפולוגיה ופלסטיקיות של איים מושתלים על ידי ניטור אות פיזור vivo בסריקה נפרדת (כלומר, מסלול נפרד) על ידי זיהוי של אור backscatterלייזר 10.
- להוציא את מפצל הקורה הראשי (כלומר, LBF Filter) ובדו-שיח "נתיבאור " להגדיר מסלול נפרד עבור הדמיה confocal. בחר את לייזר ארגון עם אורך גל של 633 00 0m וזיהוי באותו אורך גל כמו אור הלייזר. Z-stacks נרכשים עם גודל שלב של 2-3 μm עבור אות אור backscatter.
- תקן מחדש את הגדרות z-stack כדי לוודא להקליט את כל אי המקום (ראה שלב 5.10).
- רכש את מחסנית התמונה ושמור כקובץ CZI של 8 סיביות.
7. ניתוח תמונה
הערה: תוכנה מסחרית (ראה טבלת חומרים)שימשה עבור שלב זה.
- הסרת שפעת אוטומטית של איון (איור 3b)
- בכרטיסיה "עיבוד תמונה" לבחור "חשבון ערוץ" והקלד "ch1-ch2". פעולה זו יוצרת ערוץ חדש 4 (ch 4); לשנות את שמו כ "כלי דם".
הערה: ערוץ ירוק/השפעה אוטומטית הוא חיסור מערוץ אדום/Angiosense. - חזור על השלב הקודם והקלד "ch3-ch2" כדי ליצור ערוץ חדש (ch 5); לשנות את שם "עגבניה (כל)".
הערה: ערוץ ירוק/פלואורסצינציה אוטומטית חסר מערוץ התפוז/עגבניות.
- בכרטיסיה "עיבוד תמונה" לבחור "חשבון ערוץ" והקלד "ch1-ch2". פעולה זו יוצרת ערוץ חדש 4 (ch 4); לשנות את שמו כ "כלי דם".
- הגדרת מסיכת איון לפי ציור ידני (איור 3c)
- צור משטח חדש (סמל כחול) ובבחור באשף בחר " ערוךבאופן ידני". השאר את המצביע במצב "בחר" ובתצוגת תלת-מיוד בטל את הלחץ על "אמצעיאחסון " (תחת סצינה)כדי להציג מקטעים באופן חזותי.
- לאפליה קלה יותר בגבול איון, הפעל את כל הערוצים, כולל ch 1-ch 3.
הערה: ערוץ תפוז/עגבניות שימושי להגדרת גבולות איון על ידי אות קפסולת עגבניות. לחלופין, להגביר את עוצמת הערוץ כדי להשתמש בפלאורסצנציה אוטומטית של האי רב ערוצי ואות רקע גלאי כהדרכה. - בכרטיסיה "ציור" בחר "מתאר" ולחץ על "צייר" כדי להתחיל לצייר קווי מתאר סביב גבול איון החל במיקום פרוסה 1.
- מעבר למיקום פרוסה חדש וחזור על קווי מתאר של ציור. סיים עם הפרוסה האחרונה בראש איון וסיום על-ידי לחיצה על הכרטיסיה "יצירת משטח". בדרך כלל זה מספיק כדי לצייר קווי מתאר כל פרוסה10.
- פילוח של "כלי דם של איון" ו "עגבניית איילט" פלואורסצנציה באמצעות מסכת איון (איור 3D).
- בחר את האובייקט"מסיכת איון"שהוגדר קודם לכן, עבור אל כרטיסיית העריכה(סימן עיפרון) ולחץ על הכרטיסיה "מסיכההכל ", הפותחת חלון חדש.
- בחר את הערוץ הקודם"Vasculature" (ch 4) בתפריט הנפתח של בחירת הערוץ והפעל אפשרויות " שכפל ערוץ לפניהחלת מסיכה", " קבוע בפנים/ בחוץ", ולהגדיר voxels מחוץ לפני השטח "0.000", אשר יוצר ערוץ חדש; לשנות את שם "כלי דם איילט" (ch 6).
- חזור על שלבים 7.3.1 ו- 7.3.2 ובחר את הערוץ שנוצר בעבר "עגבניה (כל )" (ch 5) בתפריט הנפתח בחירת ערוץ כדי ליצור את הערוץ החדש; לשנות את שם "עגבניית איון" (ch 7).
- עיבוד פני השטח של כלי דם של איון (איור 3e)
- צור משטח חדש בתפריט "סצינה" ובבחור באשף "יצירה אוטומטית".
- הגדר את ערוץ המקור ל"כלי דם של Islet" (ch 6) ובחר חיסור רקע. ניתן לכוונן הערכת סף אוטומטית במידת הצורך. השווה לערוץ הפלואורסץ המגיב (לדוגמה, על-ידי מיזוג לשונית פני השטח החדשה שנוצרה). המשך באשף.
- לחלופין, השתמש במסננים. לדוגמה, בחר "Volume" והתאם את המסנן (צהוב) בחלון, אשר יכול להסיר אובייקטי משטח נבחרים. סיים את האשף ותן שם לאובייקט פני השטח החדש "כלי דם של האי".
- פילוח של "אות פלואורסצט עגבניותאיילט " (איור 3f)
- באובייקט השטח"Islet vasculature" שנוצר בעבר, עבור אל כרטיסיית העריכה ולחץ על הכרטיסיה "מסיכההכל ", הפותחת חלון חדש.
- בחר את הערוץ שנקרא קודם לכן "עגבניית איון" (ch 7) בתפריט הנפתח של בחירת הערוץ והגדר voxels מחוץ לפני השטח "10.000", אשר יוצר את הערוץ החדש; לשנות את שם "כלי דם עגבניות איילט" (ch 8).
- פילוח של "כמוסת עגבניות" אות פלואורסנס( איור 3 גרם)
- בחר "ערוץ חשבון" בכרטיסיה "עיבוד תמונה" והקלד "ch7-ch8", יצירת הערוץ החדש; לשנות את שם "כמוסת עגבניות" (ch 9).
הערה: "אות הפלואורסצנציהשל עגבניות האיון"מנוקב מאיית הפלואורסצנציה הכוללת.
- בחר "ערוץ חשבון" בכרטיסיה "עיבוד תמונה" והקלד "ch7-ch8", יצירת הערוץ החדש; לשנות את שם "כמוסת עגבניות" (ch 9).
- עיבוד פני השטח של "כלי דם עגבניות איילט" ו "כמוסת עגבניות" (איור 3h)
- בצע שלב 7.4, באשף לבחור ערוצי מקור "כלי דם עגבניות איון" (ch 8) או "כמוסת עגבניות" (ch 9) כדי ליצור אובייקטים פני השטח חדשים בהתאם.
- עיבוד פני השטח של משטח איון כולל (איור 3i)
- פתח את קובץ ה-backscatter של איון וצור משטח חדש.
- באשף, בחר "יצירה אוטומטית" והגדר "אזור עניין".
הערה: "אזור עניין" משמש כדי להפריד את האותות של איים מרובים ולהגדיר את עומק האי שיש לנתח (לדוגמה, 75 μm העליון). - ב "עוצמה מוחלטת" להתאים סף במידת הצורך. ניתן ללחוץ על אובייקט פני השטח או כבוי כדי להצליב עם עוצמת הערוץ המתאימה. סגור את האשף.
- כימות (איור 3j)
- בחר אובייקט משטח שנוצר בתפריט "סצינה" ולך אל הכרטיסיה "סטטיסטיקה".
- כדי לאחזר נתוני אמצעי אחסון מפורטים באובייקט פני השטחשנבחר,בחר בכרטיסיה " מפורטת " ובחר "ערכים ספציפיים" ו "Volume" מהתפריט הנפתח . כדי לאחזר ערך אמצעי אחסון כולל של אובייקט פני השטח שנבחר, עבור אלהכרטיסיה" מפורט " ובחר "ערכים ממוצעים".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איונים אנושיים לא מתויגים הושתלו ב-ACE של ה-NOD הנשי בן ה-8 שבועות. (Cg)-Gt(ROSA)26סורtm4-Rag2-/-(NOD. רוזה- עגבניה. עכברי נמען Rag2./). כדי למנוע דחיית רקמות אנושיות, עכברי נוקאאוט של Rag2 לא חיסוניים נבחרו נמעני. בעכברים טרנסגניים אלה, כל התאים והרקמות הביעו חלבון פלואורסצי של עגבניות (mT) המנוגד לממברנה המאפשר זיהוי ברור של המטופל ורקמות התורם. הדמיה חוזרת ונשנית של שתלי איון על-ידי מיקרוסקופי 2-פוטן ברזולוציה גבוהה יכולה לזהות תאי mT+ נמען המעורבים בתהליך ההתלהמות ותבנית ההעברה הדינמית שלהם.
באופן כללי, ההתקנה השתלה של איונים אנושיים לתוך ACE שלהעכברים הנמען (איור 1a)היה דומה השתלות איון עכבר syngeneic לגבי צורת איון וגודל(איור 1b,ג). איור 1d,e מראה השתלה טיפוסית עם תרשים מפורט המציג את אתר החתךלחוץ (איור 1f) ופיזוראיונים לתוך תא העין(איור 1g) ותוצאה מייצגתשל איונים מוזרקים של עכבר(איור 1h)או איוניםאנושיים (איור 1i). שיעור ההשתלה של איונים אנושיים היה בדרך כלל נמוך יותר (כ-30%) מאשר זה של איים עכבר (50-70%). סיבה אפשרית לחוסר התאמה זה היא שהזמינות של איונים אנושיים היא בלתי צפויה, בדרך כלל עם התראה של יום אחד בלבד, וגם כי איים שהושגו משתנים בגיל התורם, התורם BMI, טוהר (45%-86%), וזמן תרבות לאחר ההפרה (2-5 ימים). לעומת זאת, ניתן לתכנן בקלות בידודי איונים מעכברים. אלה היו מבודדים מעכברים בני 6-8 שבועות (כלומר, מבוגר צעיר) עם טוהר גבוה וזמן תרבות קצר, לילה. יש לקחת בחשבון פערים אלה בין שתלי איון עכברים לבני אדם בעת פירוש התוצאות.
בהדמיית vivo פלואורסץ של שתלי איון אנושיים נפרץ על ידי הפרעה משמעותית של רקמות autofluorescence(איור 4). הדמיה של תהליך revascularization של ACE מושתלים שתלי איון אנושיים על ידי סוכני הדמיה באמצעות אורכי גל מסורתיים בספקטרום הנראה היה עכב על ידי יחס אות לרעש נמוך ורמה גבוהה של אוטומטי איון טבעי, מאויר על ידי תמונות של סריקה ρ בטווח ספקטרלי של 500-700 ננומטר(איור 4a)או על ידי גלאי PMT רגיש שאינו נסח ים עם מסנן לזיהוי דקסטרן TR (610-675 ננומטר) (איור 4b). רקע גבוה זה לא נצפה בשתלי איון העכבר (איור 4c). סוכן ההדמיה של ניר, Angiosense 680, הראה יחס אות לרקע גבוה יותר באופן ניכר עקב ירידה ברעשי הרקע בטווח NIR 690-730 נה"מ(איור 4d, איור 3א). הקלטה נוספת של ערוץ "לא בשימוש" (כלומר, 500-550 צפון-ייט) יכולה לשמש בשלב עיבוד תמונה מאוחר יותר כדי להסיר את רעשי הרקע הנותרים הנגרמים על ידי שפעת אוטומטית של איון טבעי. 2-פוטן / confocal הדמיה ההתקנה (איור 2d–f) דומה אלה שתוארו בעבר6, פרט לשימוש של 900 צפון צפון 2-פוטן וזיהוי פלואורסציה של Angiosense 680, autofluorescence, וערוצי עגבניות עם PMTs nondescanned 1-3(איור 2d). מומלץ למדוד את כוח פלט הלייזר להגיע לדגימה עבור כל הגדרת מיקרוסקופ (איור 2e). בנוסף, מומלץ בתחילה לצלם את איים מושתלים עם סטריאומקוסקופיה (איור 2א–ג),אשר יסייעו בבחירת איים מעניינים ולהימנע מתמונות מיקרוסקופיות של 2 פוטונים של השתלה לא מוצלחת.
מטרת חילוץ נתונים כמותיים מתמונות רבות הייתה להסיר הטיה פוטנציאלית בבחירת נתונים ולהשיג את הכוח הסטטיסטי הדרוש לזיהוי השפעה לגיטימית בעת השוואת ניסויים. כימות מהדמיית פלורסנט של איים הלבלב מעורב מספר שלבים, כל אחד מהם אולי השפיע על התוצאות אחר. כאן נעשה שימוש בתוכנת הדמיה אינטראקטיבית. הוא מכיל תכונות המאפשרות הדמיה חזותית של תמונות עוצמת הקול, עצמים וזיהוי אובייקטים בהתאם למורפולוגיה או לעוצמה שלהם. איור 3 מדגים את השלבים השונים במקטעי תמונה. הסרת שפעת אוטומטית על ידי חיסור של ערוץ "autofluorescence" שיפרה את יחס האות לרעש (איור 3א,ב). גבול איון הנקרא "מסיכת איון"(איור 3c)וערוצים מתאימים(איור 3d)הוגדר באופן ידני. פילוח אות העגבניות לתוך כלי הדם של האי וכמוסת האי(איור 3f,g)ועיבוד פני השטחהסופי (איור 3e,ח,i)שימש לחילוץ נתונים כמותיים.
איור 5 מציג מפגש הדמיה אורכי מייצג של אותו שתל איון אנושי ב- 2 שבועות, 2 חודשים, 5 חודשים ו- 8 חודשים לאחר השתלת לתוך ACE של NOD. רוזה- עגבניה. עכברנמען ראג2./- נמען. Rag2 מאויר הן תחזיות עוצמה מקסימלית (MIP) תמונות של נתוני RAW שהוקלטו במקור(איור 5a),תמונות מעובדות לאחר הסרת שפעת אוטומטית של איון(איור 5bq–e, e–i), ואובייקטי איון מפולחים כולל כמוסה ( איור 5 Figure 5nj,m) או כלידם איון ויוצרים mT+ תאים נמען (אדום, איור 50000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000n–q
איור 1: השתלת איונים בלבלב לתוך התא הקדמי של העין.
(א)התקנת השתלה המציגה עכבר מים מים קבוע במחזיק ראש סטריאוטקסי והעין החשופה (inset) ליד מזרק המילטון מוכן קבוע לשולחן ואת stereomicroscope מוכן לקטוף איונים עכבר (ב) או איונים אנושיים (ג). (ד)מיקום המתנה של נוולה העין עמוסה איונים. (ה)השתלה בתהליך, ו-(ו)ציור סכמטי של חתך רוחבי יחיד המשמש להרים בזהירות את הקרנית עם קצה העין מיכלית ולחלק איונים לתוך התא הקדמי(g). תמונה של העין מיד לאחר הזרקת איונים עכבר(h)או איונים אנושיים(i). סרגל קנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הדמיה של שתלי אי הלבלב המושתלים ב-ACE.
(a) מיקרוסקופ סטריאו ניסיוני מיקרוסקופי ההתקנה. שדה רחב (ב)או תמונת פלורסנט (c) של B6. רוזה- שתלי איי עגבניות. (ד)ערכה פשוטה יותר של נתיב אור הפליטה. LBF: מסנן חסימת לייזר (מפצל קרן ראשי); LP: מעבר ארוך; BP: מעבר פס; תסמונת קדם וסתית: צילום מוליפלייה. (ה)כוח פלט לייזר תלוי מאוד באורך הגל. דיאגרמה מציגה כוח פלט לייזר בפועל בוואטס (W) הקשורים לרמת הכוח של קרן הלייזר (%), נמדד עבור הגדרת מיקרוסקופ. מעגל: 800 נה"מ, מרובע: 900 נה"מ, משולש: 1,000 נמימ'. (ו)כיוונון הדמיה ניסיוני המציג את העכבר הנמען עם איונים מושתלים ACE (הכנס) המותקן על הבמה הממונע מיקרוסקופ מסחרי. סרגל קנה מידה = 100 μm אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: פילוח תמונה של איון אנושי המושתל ב- ACE של NOD. רוזה- עגבניה. עכברנמען ראג2./- נמען. Rag2
(א)הקלטה מקורית: מוצגת עיבוד תלת-ממדי של ערימת תמונה של אי אנושי עם ערוצים ממוזגים או קטעים אופטיים של ערוצים מפוצלים Angiosense 680 (ch 1), autofluorescence (ch 2) ועגבניות (ch 3). (ב)עיבוד תלת-ממדי של מחסנית תמונות עם ערוצים ממוזגים או מקטעים אופטיים עם ערוצים מפוצלים "Vasculature" (ch 4) ו "עגבניות (כל)" (ch 5) לאחר הסרת שפעת אוטומטית. (ג)מסכת אייל (צהוב). (ד)עיבוד תלת-ממדי של מחסנית תמונות עם ערוצים ממוזגים או מפוצלים "כלי דם איון" (ch 6, לבן), "עגבניית איון" (ch 7, אדום). (ה)אובייקט פניהשטח " כלי דםשל איון " נוצר מ ch 6. (f)עיבוד תלת-ממדי של מחסנית תמונות עם ערוצים ממוזגים "כלי דם איון" (ch 6, ירוק) ו "כלי דם עגבניות איון" (ch 8, אדום). (g) עיבוד תלת מיוד של "כמוסת עגבניות" (ch 9) לאחר חיסור ערוץ ch 7-ch 8 או קטע אופטי עם ערוציםממוזגים" כמוסת עגבניות " (ch 9, לבן), כלי דם עגבניות איון (ch 8, אדום), ו כלי דם איון (ch 6, ירוק). (h) עיבוד פני השטח של כמוסת עגבניות (נוצר ch 9) ו vasculature עגבניות איון (נוצר ch 8). (i)פילוח איון מאות backscatter האי האנושי המציג את הבחירה של "אזורעניין "(שמאל) ואת אובייקט פני השטח מחולק (באמצע) בהשוואה לעוצמת הערוץ (מימין). (j)אחזור נתונים מהלשונית סטטיסטיקה. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: שפעת אוטומטית של איונים אנושיים.
איונים אנושיים (a,b,d) או B6 איונים עכבר (c) הושתלו לתוך ACE של NOD. עכברי נמען Rag2-/- או B6 ומוזרקים עם דקסטרן TR (a–c) או Angiosense 680 חומר הדמיה(ד)להדמיה של כלי דם. (א)סריקה של שתל איון אנושי בטווח ש נע בין 500 ל-700 000 000 00:00-00:00,000 --&00:00,000-&00:00,000 --&00:00,000-&00:00,000 --&00:00,00 הקרנת תמונה מרבית (MIP) של שתל אי האדם (b) או אי העכבר (c) נרגש ב 900 ננומטר וזוהה עם מסנן TR (610-675 ננומטר) של NDD. (ד)MIP של שתל איון אנושי נרגש ב 900 ננ"מ וזיהוי עם מסנן Angiosense 680 (690-730 ננ"ר) של NDD. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: איונים אנושיים מושתלים הם בהדרגה revascularized ועטוף על ידי mT הבעת תאים ממוצא הנמען.
איונים אנושיים מושתלים בתא העין הקדמי של NOD. רוזה- עגבניה. עכברינמען Rag2(/) תמונה שוב ושוב למשך עד 8 חודשים. אנגיו-680 הוזרק להדמיה של כלי דם. (א) תחזיות עוצמה מרבית (MIP) של נתוני RAW מוקלטים מקוריים של פיצול (כלי דם, פלואורסצנה אוטומטית, mT) או ערוצים ממוזגים ואות אור backscatter ב 5 חודשים לאחר ההשתלה. MIPS של כלי דם סה"כ לבד (ב-ה) או מוזג עם קרום ממוקד פלואורסצנציה עגבניות (mT) (f-i) לאחר הסרת פלורלנות אוטומטית איון (ירוק, א). עיבודים תלת-ממדיים של קפסולת עגבניות איון מפולח (j–m) וסקולטורה עגבניות איון (אדום) או כלי דם סה"כ איון (ירוק) (n–q) בנקודות זמן שצוינו לאחר ההשתלה. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה מוצגת כדי לחקור את תהליך השתלת תאי איון הלבלב האנושי על ידי התבוננות המעורבות של הנמען ורקמות התורם. לאחר ניתוח פולשני מינימלי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של עין עכבר immunodeficient, העכבר מתאושש במהירות בתוך דקות לאחר הניתוח. ההליך מתבצע בעין אחת. בדרך כלל, מ 5-7 ימים לאחר השתלה ואילך הקרנית נרפא מספיק כדי לבצע הדמיה תוך-ויטלית.
בפרוטוקול זה, איכות שתלי הילטים האנושיים היא קריטית. איכות איון אנושי וכתוצאה ההשתלה יכול להשתנות בהתאם לגיל התורם, BMI, ותהליך הבידוד, כמו גם זמן של תרבות איון לפני ואחרי ההגעה. איונים אנושיים מעובדים מלבלב תורם איברים שאושרו להשתלה קלינית למטרות מחקר שימשו בהסכמת התורמים. הם הושגו לאחר תהליך של עיכול הלבלב וטיהור איון המתוארים במקום אחר12. בדומה לאימי מורין מבודדים, איונים אלה עוברים מספר תקיפות תאיות כגון איסכמיה, מתח מכני, אובדן חלבוני מרתף, ושיבוש חלקי של תאי אנדותל תוך-איון (ECs)במהלך שלב העיכול האנזימטי 14,15. למרות שיפור מתמיד בתנאי התרבות והתאוששות של מספר גדול של איונים אנושיים באיכות גבוהה, הזמן להשתלה נשאר גורם קריטי. בימים הראשונים של התרבות, האיים האנושיים מראים אובדן משמעותי של ECs תוך-איון ועל שישה ימים של תרבות רק מבנים אנדותל קטנים בליבת האיון ניתןלזהות 16. אובדן זה של תאי אנדותל תוך-איון יכול להוות גורם קריטי בהשתלה מופחתת של איונים אנושיים, כי ECs איון התורם הם שחקנים חשובים בתהליך revascularization17.
שמירה על עקרות במהלך הליך ההשתלה היא קריטית כדי למנוע זיהומי עיניים ב-NOD המונמוניזם. רוזה- עגבניה. עכברים.-/- בדרך כלל, הליכי השתלה מבוצעים בתנאים נקיים באמצעות כפפות, חלוק מעבדה, כיסוי ראש, ומסכת הפה, אבל לא בתוך ארון אבטחה ביולוגית. כל הפתרונות המשומשים מסוננים סטריליים, ומזרקים, קניולה, צינורות וגזה נוצתים ב-70% אתנול. כלובי ההשכה משועבדים אוטומטית. בעוד עקרות מלאה לא ניתן להבטיח בגלל טיפול ידני של העכבר במהלך ההליך, זיהום איון או זיהומים בעיניים לא היו בעיות עם הליך זה.
הרדמה יציבה ומתאימה היא גורם חשוב וקריטי להפחתת תנועות עיניים ולהיסחף במהלך רכישת נתונים ממסגרות נמוכות, והאפקטיביות יכולה להשתנות בין סוכני הרדמהשונים 18. תחת הרדמה כללית של isoflurane, העין נעה מדי פעם באופן מתגלגל לאט ועומק מוגבר של הרדמה (מ 1-2%) יכול בדרך כלל להפחית את תנועות העיניים. היתרון הברור של שימוש בהרדמה בשאיפה הוא האפקט המהיר שלה וזמן ההחלמה שלה. יש לציין, עם זאת, כי השימוש isoflurane עשוי לשנות הפרשת אינסולין19.
ניתוח תמונה ומפולח, או חלוקה למחיצות של תמונה לאזורים מרובים, הם מאתגרים וכפופים להטיה פוטנציאלית בבחירת נתונים20. פילוח נועד לזהות אובייקטים כמו "כלי הדם של האי" לכמת. כאן, שיטות המבוססות על סף עוצמה הוחלו על אזורים נבחרים (כלומר, "עוצמה מוחלטת") או על הבדלי עוצמה כדי למצוא קצוות (כלומר, "חיסור רקע"). נכון לכך, אין פתרונות אוניברסליים לפילוח במיקרוסקופ פלורסנט. גישה אחת היא להתנסות בתוכנה מסחרית התומכת במגוון שיטות. אם הסף נכשל עקב וריאציית עוצמת רקע, שינויים קטנים בהגדרות לכידת תמונה עשויים לשפר את תוצאות פילוח.
מגבלה של השיטה טמונה בעובדה כי השתל האנושי מוחלף במהירות רבה יותר על ידי תאים נמענים, למעשה, מחדש לחלוטין על ידי תאי אנדותל נמען העכבר. זה היה למנוע מחקרים של אינטראקציות תאים אנושיים אם המטרה היא ללמוד תאים חיסוניים אנושיים שהועברו באימוץ נודדים לתוך parenchyma איון באמצעות אינטראקציות עם תאי אנדותל אנושיים. עם זאת, הן בעכבר והן בשתלי איון אנושי, revascularization דומה מתרחשת מן הנמען ועוקב אחר תוכנית 3D אנטומית שונה ספציפית עבור המין.
שיעורי ההצלחה של טיפול בתחליפי תאי בטא המשיכו לשפר. עם זאת, אתגרים שונים בהערכת היעילות של השתלת איון והישרדות vivo להישאר לא פתור בשל היעדר טכנולוגיות הדמיה תוך-ויטאל מתאימות. תא העין הקדמית הוא אתר השתלה שימושי, התומך בהדמיה חוזרת וארוכת טווח של תאי איון לחקר מורפולוגיה של איון, דפוסי כלי דם, תפקוד תאי בטא ומוות תאי בטא ברזולוציה תאית.
הפרוטוקול לחקר תהליך ההשתלה של השתלות איון אנושי באתר השתלת ACE שדווח כאן מאפשר ניטור אורכי של שתלים איונים אנושיים ברזולוציה גבוהה בהרבה מזה שהושג עם פלטפורמות אורכיותחלופיות אחרותכגון MRI21,22, PET23, SPECT24, או Bioluminescence 25 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר השבדית, אזור המחקר האסטרטגי Exodiab, Dnr 2009-1039, הקרן השוודית למחקר אסטרטגי Dnr IRC15-0067 לLUDC-IRC, האגודה הפיזיוגרפית המלכותית בלונד, סוכרת ו Barndiabetesförbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al.
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
