Summary
このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。
Abstract
ベータ細胞のイメージングは、小子移植を理解するための重要なステップです。ベータ細胞生物学の記録のための異なるイメージングプラットフォームが 開発され、インビボで利用されているが、それらは単一細胞分解能および連続的な縦断記録を可能にするという点で限られている。角膜の透明性のために、マウスの眼前房(ACE)は、ヒトおよびマウス膵島細胞生物学の研究に適している。ここでは、このアプローチを使用して、個々のヒト小口移植片の移植および再血管化の連続的な縦方向の記録を行うことができる方法の説明を示す。ヒトの小子移植片は、NODを使用して、ACEに挿入される。(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-マウスをレシピエントとして使用する。これにより、レシピエント対ドナー細胞の拡張の調査と、移植片のカプセル化および血管化を促進するレシピエント細胞の寄与を可能にする。また、レシピエント細胞を形成する島の体積またはセグメント化された血管系および小島カプセルの画像分析および定量化のためのステップバイステップのアプローチが概説されている。
Introduction
糖尿病は、膵島ベータ細胞の喪失または機能不全からのインスリン産生不十分な結果として、血糖のレベルの上昇を特徴とする代謝疾患のグループを記述し、しばしばインスリン抵抗性を伴う。1型(T1D)および2型糖尿病(T2D)は、ベータ細胞の進行性機能障害が疾患の発症を引き起こす複雑な疾患である。T1Dはベータ細胞に対する自己免疫攻撃によって沈殿し、一方T2Dは代謝因子によって駆動されると考えられるが、低位の全身炎症の証拠は増加する1である。ドナーヒト小島の移植は、特にT1D患者に、生理的血糖コントロールを提供する可能性を提供する。しかし、組織ドナーの不足と貧しい小地の生着は、主流の治療オプションになるための小地移植を妨げている。機能的な小子移植片のかなりの割合は、低酸素、炎症性、免疫原性宿主環境22、33のために、即時の移植後期間(24〜48時間)で失われる。イレット生存率の改善のための介入方法の効率を評価するためには、このような移植の継続的なモニタリングが必要である。
移植後に移植されたヒト膵島の運命を画像化および追跡するin vivo技術は、糖尿病研究4,55に依然として4課題である。現在までに、非侵襲的イメージング技術は、陽電子放出断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、または超音波(US)を含む、実験条件5における移植された小島の定量化および機能評価の可能性を示す。しかし、小さな小さな小さな小さな小さな小さい小さい小さいと、それらのモダリティによる定量的な測定は、不十分な解像度に苦しむ。眼前室(ACE)を観察用の移植部位としては、長期間にわたって効果的に高い空間分解能と頻繁なモニタリングを提供する有望な非侵襲的イメージングソリューションである。この方法は、マウスの小子生物学(ヤンら7でレビュー)、自己免疫免疫応答8、ならびにヒトの小子移植9,9、10を研究するためにうまく利用されている。
ここでACE移植法を2光子イメージング手法と組み合わせて、移植後最大10ヶ月間、個々の膵島移植片に対する連続的かつ繰り返しの記録によってヒト膵島の生着プロセスのダイナミクスを調べる。より大きな撮像深度の多光子イメージング特性と、全体的な光漂白および光損傷の減少は、共焦点顕微鏡11のイメージング限界を克服する。蛍光イメージングの定量化には、小島サンプル調製、小島移植、画像取得、島のノイズや背景を除去するための画像フィルタリング、セグメンテーション、定量、データ分析など、いくつかの段階が含まれます。最も困難な手順は、通常、イメージを複数のパーツまたはリージョンに分割または分割することです。これには、バックグラウンドノイズから信号を分離することや、色や形状の類似性に基づいてボクセルの領域をクラスタリングして、たとえば、アイレット血管系を表す3Dボリュームのボクセルを検出してラベル付けすることが含まれます。セグメント化されると、オブジェクトのボリュームサイズなどの統計は、通常、簡単に抽出できます。提供される方法は、セグメンテーションやデータ可視化などのイメージングデータの定量・抽出方法である。特に注意は、ヒト小島における自己蛍光の除去と、受け手細胞を形成する小島の血管系と小島カプセルの区別に関する。
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Protocol
スウェーデンのルンドにある地域倫理委員会は、人間を含む研究の倫理的見直しに関する法律に従って研究を承認した。動物実験は、スウェーデンの動物実験の倫理に厳密に従って行われ、マルメとルンドの倫理委員会によって承認されました。6〜8週齢の免疫不全NOD。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-ラグ2-/- (NOD.ローザトマト。Rag2-/-)レシピエントマウスは、ヒト小島10の移植のレシピエントとして使用した。 Rag2
1. 移植のための小子の準備
- 培養ヒト小島をCMRL 1066で10 mM HEPESで補い、 2 mM L-グルタミン、50 μg/mLゲンタマイシン、0.25 μg/mL真菌、20μg/mLシプロフロキサシン、10 μg/mLチクロキシフロキサキシン、10 mMニコ2チンアミド(NIC)、および10%熱不活化ヒト血清(5%CO2で37°C)、および移植まで空気を加湿した。
注:島は外分泌組織を含まないと培養中に互いに触れ合うべきではありません。外分泌組織は半透明に見える。 - 移植の日に、引っ張られたガラスの毛細管に接続された吸引管アセンブリを使用して、新しいペトリ皿に小島を含む培養培地を移す。
注:または、200 μL ピペットを使用してください。ペトリ皿の裏を着色すると、小島をステレオ顕微鏡で区別しやすくなります。 - ステレオ顕微鏡を使用して、移植ごとに約20~40個の小島を摘み取り、1.5mLチューブに移します。チューブをインキュベーターの培養培地で上部に充填します。
- パラフィンフィルムでチューブを密封し、移植まで氷の上に保管してください。移植の回数に応じて適量を準備する。
- あるいは、培養で島を保ち、各移植の直前にそれらを選ぶために手術室でCO2 インキュベーターが利用できることを確認してください。
2. 移植装置・手術台の準備
注:すべての外科用ツールはオートクレーブされ、手術台と器具は70%のアルコールで汚染される。
- ステレオタックスヘッドホルダーをノーズマスクで麻酔に接続し、暖房パッドをオンにします。
- ガス密ハミルトンシリンジをポリエチレンチューブと鈍いエンドアイカニューレに接続します。
注: すべての部品をPBSで埋めるのは、アセンブリの前に行うことをお勧めします。閉じ込められた気泡を確認し、存在する場合は取り外します。 - ハミルトンのシリンジをテーブル(図1a)または可動ベース(図1e)にしっかりと取り付け、カニューレを垂れ下ろして、チューブをステレオ顕微鏡に取り付けます(すなわち、待機位置)。
メモ:取り外しや再び取り付けやすいので、外科テープを使用してください。 - 0.1 mg/kg ブプレノルフィン溶液で満たされた30G針に接続された1 mLの注射器を準備します。
- 滅菌PBSで注射器を準備します。あるいは、ピペットを使用します。
- 暖房ランプ付きの清潔なウェイクアップケージを脇に置きます。
3. 手術のためのレシピエントマウスの麻酔と位置付け
注:すべての動物は、ルンド大学の動物施設で病原体のない環境で飼育され、維持されました。
- 40%O2/60%N 2/3%イソフルランで2満たされたチャンバー内でマウスを麻酔し、麻酔付きマウスを温かい加熱パッドのヘッドホルダープラットフォームに移します(図1a)。ペダル反射の欠如を確認してください。
注:イソフルラン麻酔は、手術後の速い回復のための麻酔の好ましい方法です。顕微鏡室はイオブルランを使用するために適切に換気されなければならない。 - マウスのスナを40%O2 /60%N2/0.9%~1.5%2イソフルラン麻酔機に接続された麻酔マスクに入れます。2親指と指を使って頭を少し上げ、側面の金属片を使用して固定します。耳の部分が耳の真下に固定されていることを確認します。マウスの背面に0.1mg/kgブプレノルフィン溶液を皮下に注入する。
メモ:ブプレノルフィンは 鎮痛薬として使用されます。 - 手術する目が上向きになり、研究者に近いように頭を傾けます。
- 鈍い鉗子を使用して移植する目のまぶたを穏やかに引き込み、目を飛ばしてピンセットでゆるく固定します。ピンセットの先端がヘッドホルダープラットフォームに取り付けられたポリテーンチューブで覆われていることを確認します(図1a、挿入)。
- 滅菌PBSの液滴を目に塗布することで、常に両眼を濡らしてください。
- 密閉された1.5mLチューブ(セクション1)から滅菌PBSのペトリ皿にヒト小島を移し、細胞培養培地の移動量を最小限に抑えるために小島が互いに近いであることを確認する(図1c)。
- ハミルトンシリンジにポリテーンチューブを介して接続された眼カニューレの〜20〜30の小島を拾います。
注:小島でできるだけ少ない液体を取ります。 - チューブを上下逆さまに掛け、ステレオ顕微鏡に取り付けます(図1d)。チューブを慎重にテープで貼り付け、小島をカニューレに向かってチューブの端に沈めます。
4. 移植手順
注:この方法は、マウス島の移植のために以前に説明されています6.ここでは、少し変更された手順を示します。
- 後ろ足のパッドをつまんで、マウスが眠っていることを確認します。
- 血流を乱さずに目を抑制する鉗子を締め、無菌PBSの液滴を目に当てなさい。
- メスとして25G針を使用して、上向きにベベル、慎重に角膜の先端の半分だけを貫通し、単一の側面切開を行います。上向きの角度で穴を作ります。穴は移植後より容易に密封する(図1f)。
- カニューレに小島をプリロードして角膜を慎重に持ち上げ、ゆっくりと目に小島を塗布します。虹彩の損傷を防ぐために前房にカニューレを挿入することを避けるが、むしろ角膜の開口部に対して慎重に押す(図1g)。 ACE からカニューレをゆっくりと引き込む。
注:3~8 μLの注入量を目指します。体積が大きすぎると、眼が不必要に高い眼圧にさらされ、前房から注入された小島の還流を招く可能性があります。 - 眼室内の圧力の増大による小島の挿入に伴う困難に直面した場合、側面切開部位を補強して切開部位を拡大し、島を再適用する。
注:時折、導入された気泡は、スペースホルダーとして使用することができます。 - 目に目ジェルを塗布し、目を抑制する鉗子を緩め、イオブルランの上にマウスを8〜10分間同じ位置に置いて、島をセットさせます。
- まぶたを保持している鉗子を取り外し、まぶたを通常の位置に戻します。
- ヘッドホルダーからマウスを取り外し、目覚めのケージに移します。
- マウスが目を覚まして移動したら、元のケージに戻し、スキャンするまで動物のハウジングに保管してください(少なくとも5日間は推奨)。
5. 2光子顕微鏡による埋め込みヒト小島のイメージング
注:2光子イメージングの前に移植後4〜5日の蛍光立体顕微鏡(図2a–c)を用いて眼の概要画像を撮ることを、関心の高い島を局所化することを推奨します。移植後の早い段階で目をしっかりと拘束しすぎないようにしてください。2光子イメージング6~7日の移植を使用してください。
- イメージ取得ソフトウェアを起動します( 資料一覧を参照)。「レーザー」メニューでマイタイレーザー(電源"ON")をアクティブにし、「ライトパス」メニューで波長を900nmに設定し、5%~10%レーザーパワー(スライダーを使用)から最小限の伝送レーザーパワーを適用します。
メモ:スキャン中に、必要に応じてレーザーパワーを調整します。 - 緑、オレンジ、および赤のチャンネルを設定します。次のように、非スキャントディテクタ(NDD)と放出フィルタ情報を使用して、同時に3つの非スキャン検出器(NDD)に発光光を収集します。緑/自己蛍光、500〜550 nm;オレンジ/トマト,565-610nm(図2d)。
- ヘッドホルダーステージを電動顕微鏡ステージに設置し、ガスマスクを麻酔機のチューブと換気システムに接続されたチューブに接続します。暖房パッドをオンにします。
- 受け取り側マウスを麻酔し、ヘッドホルダープラットフォームに移し、目を拘束してイメージングを行い、上記のブプレノルフィン溶液を投与します(ステップ3.1~3.5)。
- 必要に応じて、イオブルランの蒸気を調整します。1分間に55~65回の呼吸速度(bpm)は最適な麻酔を示します。麻酔が深すぎる場合、速度は、重い呼吸やあえぎで<50 bpmになります。明るすぎると、速度は表面呼吸で70bpmになります。15分ごとに目視検査を行い、麻酔中のマウスを注意深く監視します。
注:麻酔はマウスからマウス、マウスの緊張、および麻酔下の時間が13に進行するにつれて異なります。 - 角膜とレンズの間の浸漬液として眼に十分な眼ゲルを投与し、ゆっくりと蓄積することを可能にする(図2f、挿入)。気泡を避けてください。
注:柔軟な金属ホースランプを備えたサイド照明は、焦点を調整し、小子移植片を局所化することをお勧めします。 - 血管を可視化するために、使い捨てインスリン30Gシリンジを用いて、100μLの画像化剤(例えば、アンジオセンス680)を尾静脈内に静脈内投与する。
- 「取得モード」では、フレームサイズを512 x 512、スキャン速度に調整します。
注意:スキャンが遅い(すなわち、ドウェル時間を増やす)信号対雑音比が向上します。 - 「チャンネル」メニューでは、ライブスキャンモードで画面上に画像が表示されるまで信号を増幅するために、ボルトの各PMTのマスターゲインを調整します。この値が大きいほど、検出器は信号とノイズに対する感度が高くなります。
注: 500 ~ 800 V の値を使用することをお勧めします。 - 「Zスタック」メニューでは、手動でフォーカスを小子移植片の上部に移動して、zスタックの始まりと終わりを定義します。「最初に設定」を選択して位置を保存します。「最後に設定」を選択して、左寄りの移植片に焦点を合わせることができる最後の底面に移動し、位置を保存します。z ステップサイズは 2 μm で使用します。
- [実験の開始] タブをクリックして最終的なイメージ スタックを収集し、8 ビット CZI (カール ツァイス形式) ファイルとして保存します。
6. 共焦点顕微鏡による移植ヒト小島のイメージング
注:移植された小島の総体積、形態、可塑性は、レーザー後方散乱光10の検出により別のスキャン(すなわち、別のトラック)でin vivo散乱信号を監視することによって評価することができる。
- メインビームスプリッター(LBFフィルタ)を取り出し、「ライトパス」ダイアログで、共焦点イメージング用の別のトラックを設定します。633 nmの波長とレーザー光と同じ波長の検出を有するアルゴンレーザーを選択してください。Zスタックは、後方散乱光信号用のステップサイズ2~3μmで取得します。
- z スタック設定をリジャストして、すべての小子を記録するようにします (ステップ 5.10 を参照)。
- イメージスタックを取得し、8ビットCZIファイルとして保存します。
7. 画像解析
注: この手順では、商用ソフトウェア (「 資料表」を参照) が使用されました。
- イレットの自己蛍光を除去する(図3b)
- [画像処理] タブで "チャンネル算術" を選択し、 "ch1-ch2" と入力します。これにより、新しいチャンネル4(ch 4)が作成されます。として名前を変更 "血管構造"
メモ:緑/自己蛍光チャネルは、レッド/アンジオセンスチャンネルから差し引かれます。 - 前の手順を繰り返し、"ch3-ch2"と入力して新しいチャンネルを作成します (ch 5)。「トマト (すべて)」と改名します。
注: オレンジ/トマトチャンネルから緑/自己蛍光チャンネルを差し引きます。
- [画像処理] タブで "チャンネル算術" を選択し、 "ch1-ch2" と入力します。これにより、新しいチャンネル4(ch 4)が作成されます。として名前を変更 "血管構造"
- 手動描画によるアイレットマスクの定義 (図 3c)
- 新しいサーフェス (青いシンボル) を作成し、ウィザードで [手動で編集]を選択します。ポインタを [選択]モードで、3D ビューで [ボリューム] ([シーン]の下) をクリック解除してセクションを視覚化します。
- 簡単に小子の境界の識別のために、ch 1–ch 3を含むすべてのチャネルをアクティブにします。
注:オレンジ/トマトチャンネルは、トマトカプセル信号で小海峡の境界を定義するのに便利です。あるいは、チャネル強度を高くして、マルチチャンネルの小子自己蛍光と検出器のバックグラウンド信号をガイダンスとして使用します。 - [描画] タブで [輪郭] を選択し、[描画] をクリックして、スライス位置 1 から始まる、小地の境界線の周囲の輪郭の描画を開始します。
- 新しいスライス位置に移動し、描画の輪郭を繰り返します。最後のスライスを小水の上に置き終え、[サーフェスの作成] タブをクリックして終了します。通常は、10番目 のスライスごとに輪郭を描くのに十分です。
- 「小子脈管構造」と「アイレットトマト」のセグメンテーションは、アイレットマスクを用いた蛍光(図3d)
- 定義済みの"Islet マスク" オブジェクトを選択し、編集タブ (鉛筆 の記号) に移動して、新しいウィンドウを開く [すべてマスク] タブをクリックします。
- チャンネル選択ドロップダウンメニューで以前に命名したチャンネル"Vasculature"(ch4)を選択し、マスクを適用する前に「チャンネルを複製する」を有効にして、サーフェス外のボクセルを"0.000"に設定すると、新しいチャネルが作成されます。「小子脈管構造」(ch 6)と改名します。
- ステップ 7.3.1 と 7.3.2 を繰り返し、チャンネル選択ドロップダウンメニューで以前に作成したチャンネル"Tomato(すべて)"(ch 5)を選択して新しいチャンネルを作成します。「小子トマト」(ch 7)と改名します。
- 小地血管系の表面レンダリング(図3e)
- [シーン] メニューで新しいサーフェスを作成し、ウィザードで [自動作成] を選択します。
- ソースチャネルを以前に作成した「Islet血管構造」(ch 6)に設定し、バックグラウンド減算を選択します。自動しきい値推定は、必要に応じて調整できます。応答蛍光チャネルと比較します(例えば、新しく作成されたサーフェスタブをブレンド/ブレンドして)。ウィザードを続行します。
- 必要に応じて、フィルターを使用します。たとえば、[ボリューム] を選択し、選択したサーフェス オブジェクトを削除できるウィンドウでフィルタ (黄色) を調整します。ウィザードを終了し、新しいサーフェス オブジェクトに"Islet 血管構造"という名前を付けます。
- 「小子トマト脈管系」蛍光シグナルのセグメンテーション(図3f)
- 以前に作成した"Islet 血管構造" サーフェス オブジェクトで、編集タブに移動し、新しいウィンドウを開く [すべてマスク] タブをクリックします。
- チャンネル選択ドロップダウンメニューで、以前に名前が付けられたチャンネル"Islet tomato"(ch 7) を選択し、新しいチャンネルを作成する「10.000」に外表面のボクセルを設定します。「小子トマト血管構造」(ch 8)と改名します。
- 「トマトカプセル」蛍光シグナルのセグメンテーション(図3g)
- [ 画像処理] タブで [チャンネル演算] を選択し、 "ch7-ch8" と入力して、新しいチャネルを作成します。「トマトカプセル」(ch 9)と改名します。
注: "小子トマト脈管系"蛍光シグナルは、全「アイレットトマト」蛍光シグナルから差し引かれます。
- [ 画像処理] タブで [チャンネル演算] を選択し、 "ch7-ch8" と入力して、新しいチャネルを作成します。「トマトカプセル」(ch 9)と改名します。
- 「小地トマトの脈管」と「トマトカプセル」(図3h)の表面レンダリング
- 手順 7.4 に従い、ウィザードでソース チャンネル "アイレット トマト血管構造" (ch 8) または "トマト カプセル" (ch 9) を選択して、それに応じて新しいサーフェス オブジェクトを作成します。
- 総小水界の表面レンダリング (図 3i)
- 小子の後方散乱ファイルを開き、新しいサーフェスを作成します。
- ウィザードで [自動作成] を選択し、対象地域を定義します。
注: 「対象領域」は、複数の島の信号を分離し、分析する島の深さを定義するために使用されます(例えば、上位75μm)。 - "絶対強度" では、必要に応じてしきい値を調整します。サーフェス オブジェクトをクリックまたはオフにして、対応するチャネル強度とクロスチェックできます。ウィザードを閉じます。
- 定量化 (図 3j)
- [シーン] メニューで作成したサーフェス オブジェクトを選択し、[統計情報] タブに移動します。
- 選択したサーフェス オブジェクトの詳細なボリューム データを取得するには、[詳細]タブを選択し、ドロップダウン メニューから [特定の値] と [ボリューム] を選択します。選択したサーフェス オブジェクトの合計ボリューム値を取得するには、[詳細]タブに移動し、[平均値] を選択します。
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Representative Results
非標識ヒト小島を8週齢の雌NODのACEに移植した。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-ラグ2-/-(NOD.ローザトマト。Rag2-/−)レシピエントマウス。ヒト組織拒絶反応を防ぐために、免疫不全Rag2ノックアウトマウスをレシピエントとして選んだ。これらのトランスジェニックマウスにおいて、全ての細胞および組織は、レシピエントおよびドナー組織の明確な同定を可能にする膜標的トマト蛍光タンパク質(mT)を発現した。高解像2光子顕微鏡による小地移植片の繰り返しイメージングは、生着プロセスおよびそれらの動的移動パターンに関与するmT+ レシピエント細胞を同定することができた。
一般に、レシピエントマウスのACEへのヒト小島の移植設定(図1a)は、小島の形状および大きさに関する同系マウス島の移植と類似していた(図1b、c)。c図1dは、eを示す詳細な概略を用いた典型的な移植を示し、眼室への横切り部位(図1f)およびアイチャンバーへの小島の分散(図1g)および注射されたマウス島の代表的な結果(図1h)またはヒト小島(図1i)を示す。ヒト小島の移植速度は一般的に低かった(〜30%マウスの小島のそれよりも(50〜70%)。この不一致の原因として考えられる理由は、人間の島の利用可能性が予測不能であり、通常は1日の通知のみであり、また、得られた小島はドナー年齢、ドナーBMI、純度(45%〜86%)および分離後培養時間(2〜5日)で変化する。対照的に、マウスからの小子の分離は容易に計画することができる。これらは、高純度および短い一晩培養時間を有する6-8週齢(すなわち、若年成人)マウスから単離された。マウスとヒトの小子移植片の間のこれらの不一致は、結果を解釈する際に考慮されるべきです。
生体内でヒト小軟子移植片の蛍光イメージングは、組織自家蛍光からの有意な干渉によって損なわれた(図4)。可視スペクトルにおける従来の波長を用いた画像化剤によるACE移植ヒト小地移植片の再血管化過程の可視化は、低いシグナル対雑音比と高レベルの天然小地自己蛍光によって妨げられ、 500~700 nmのスペクトル範囲のλ-スキャンの画像(図4a)またはデキストランTR(610-675 nm)の検出フィルタ付きの感度非スキャンPMT検出器(図4b)によって示される。この高い背景はマウスの小子移植片では観察されなかった(図4c)。NIR発光イメージング剤Angiosense 680は、NIR範囲のバックグラウンドノイズの減少に伴い、目に見えて高い信号対バックグラウンド比を示した(図4d、図3a)。「未使用」チャンネル(すなわち、500〜550 nm)の追加記録は、自然な小海自家蛍光によって引き起こされる残りのバックグラウンドノイズを除去するために、後の画像処理ステップで使用することができる。2光子/共焦点イメージング設定(図2d-f)は、アンジオセンス680の900 nm 2光子励起および蛍光検出、自家蛍光、および非スキャンPMTs 1-3(図2d)を有するトマトチャネルの使用のために保存する6に類似している。各顕微鏡のセットアップに対してサンプルに到達するレーザー出力電力を測定することをお勧めします(図2e)。さらに、最初に、移植された小島をステレオ顕微鏡(図2a–c)で画像化することが推奨され、目的の島を選択し、移植に失敗した2光子顕微鏡画像を避けるのに役立ちます。
多くの画像から定量的データを抽出する目的は、データ選択における潜在的な偏りを取り除き、実験を比較する際に正当な効果を検出するために必要な統計的な力を得る。膵島の蛍光イメージングからの定量は、いくつかのステップを伴い、それぞれが別の結果に影響を与えた可能性があります。ここでは、インタラクティブイメージングソフトウェアが使用された。ボリューム画像やオブジェクトの視覚化、およびその形態や強度に応じたオブジェクトの識別を可能にする機能が含まれています。図 3は、イメージセグメンテーションの異なる手順を示しています。「自己蛍光」チャネルの減算による自己蛍光の除去は、信号対雑音比を改善した(図3a、b)。b「アイレットマスク」(図3c)と呼ばれるイレット境界と対応するチャネル(図3d)を手動で定義した。トマト信号を小子脈管及び小地カプセル(図3f、g)および最終表面gレンダリング(図3e、h、i)に分けて定量的データiを抽出した。Figure 3fh
図5は、同じヒト小島移植片の2週間、2ヶ月、5ヶ月、および8ヶ月の後のNODのACEへの移植の代表的な縦断画像セッションを示す。ローザトマト。Rag2-/-受信者マウス。図示は、元々記録Figure 5nされたRAWデータ(図5a)の最大強度投影(MIP)画像、小子自毛蛍光除去後の処理画像(図5b-e、f-i)、カプセル(f図5j,m)またはimT++レシピエント細胞(赤e、図5n-q)を含むセグメント化された小地素オブジェクトである。
図1:眼前房への膵島移植。
(aa ) 麻酔付きマウスをステレオタキシックヘッドホルダーに固定し、準備されたハミルトン注射器の隣に露出した目(インセット)を示す移植セットアップと、マウスの小島(b)または人間の島を選ぶ準備ができている実体顕微鏡の横に置く。(d) アイカニューレの待ち位置に小島を積み込む。(e)プロセス中の移植、および(f)眼カニューレの先端で角膜を慎重に持ち上げ、前房(g)に小島を分配するために使用される単一の側面切開の模式図。マウス島(h)またはヒト島(i)の注射直後の眼の画像スケールバー= 500 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ACE移植膵島移植片の画像化。
(a) 実験的蛍光ステレオ顕微鏡イメージングセットアップ.B6の広視野(b)または蛍光画像(c)。ローザ-トマト小子移植片.(d) 発光灯路の簡易化スキーム。LBF:レーザー遮断フィルター(メインビームスプリッター);LP: ロングパス;BP: バンドパス;PMT:フォトマルチプライヤ。(e)レーザー出力電力は波長に強く依存する。図は、顕微鏡の設定のために測定されたレーザービームの電力レベル(%)に関連するワット(W)の実際のレーザー出力電力を示しています。円:800 nm、正方形:900 nm、三角形:1,000 nm。(f)市販の顕微鏡を電動ステージに取り付けたACE移植された小島(インサート)を用いてレシピエントマウスを示す実験的イメージング設定。スケールバー= 100 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:NODのACEに移植されたヒト小子の画像セグメンテーション。ローザトマト。Rag2-/- 受信者マウス。
(a)オリジナル記録:示されているのは、結合されたチャネルまたは分割チャンネルAngiosense 680(ch1)、自己蛍光(ch2)、およびトマト(ch3)の光セクションを持つ人間の小水の画像スタックの3Dレンダリングです。(b) 自己蛍光除去後の「血管構造」(ch 4)と「トマト(すべて)」(ch 5)を分割したチャンネルまたは光学セクションを含む画像スタックの3Dレンダリング。(c) アイレットマスク (黄色).(d) マージまたはスプリットチャネルを持つイメージスタックの3Dレンダリング "アイレット血管構造" (ch 6, 白), ""アイレットトマト" (ch 7, 赤).(e) 表面物体 "小地血管構造" ch 6から作成した。(f)マージされたチャンネルを持つ画像スタックの3Dレンダリング "アイレット血管構造" (ch 6, 緑) と "アイレットトマト血管構造" (ch 8, 赤)。(g)3Dレンダリングの "トマトカプセル" (ch 9) チャネル減算後 ch 7–ch 8 または結合チャネルと光学セクション "トマトカプセル" (ch 9, 白), 小子トマト血管系 (ch 8, 赤), アイレット血管系 (ch 6, 緑).(h)トマトカプセル(ch 9から作成)と小地トマト血管系(ch 8から作成)の表面レンダリング。(i) 「対象領域」(左)とセグメント化された表面物体(中央)の選択を示すヒトの小地後方散乱信号からの小海峡セグメンテーション(右)。(j) 統計タブからのデータの取得。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒト小島の自己蛍光
ヒトの小島a(a、b、d)またはB6マウス小島(c)をNODのACEに移植した。bdRag2---またはB6レシピエントマウスを、血管の可視化用デキストランRag2TR(a–c)またはアンジオセンス680イメージング剤(d)を注射した。()ヒトの小地移植片のλ-スキャンは、900 nmで2光子励起を有する500〜700 nmの範囲で行う。ヒト(b)またはマウスの最大画像投影(MIP)画像(b)またはマウスの小子移植片(c)は900nmで励起され、NDDのTRフィルター(610〜675nm)で検出された。(d) ヒトの小子移植片のMIPは900 nmで励起され、NDDのアンジオセンス680フィルター(690〜730 nm)で検出された。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:移植されたヒト小島は、徐々に再血管化され、レシピエント起源のmT発現細胞によって封入される。
NODの前眼室に移植されたヒトの小島。ローザトマト。Rag2Rag2−/−レシピエントマウスは、最大8ヶ月間繰り返し画像化した。血管系680を血管系の可視化のために注入した。(a)5ヶ月の移植後に、分割(脈管、自己蛍光、mT)または結合されたチャネルおよび後方散乱光信号のオリジナル記録RAWデータの最大強度予測(MIP)。全血管系単独のMIPS (b–e) または膜標的トマト蛍光(mT) と結合した MIPS (f–i) イクレの自己発光除去後 (緑色, a).セグメント化された小地トマトカプセル(j–m)および小地トマト血管構造(赤)または総小地血管構造(緑)(n–q)の3Dnレンダリングを、移植後の指示された時点で行う。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
レシピエントとドナー組織の関与を観察することによってヒト膵島細胞移植プロセスを研究する方法を提示する。免疫不全マウス眼の前房にヒトの小島を移植する最小限の侵襲手術の後、マウスは手術後数分以内に迅速に回復する。手順は片目で行われます。一般に、5~7日以降、角膜は、生体内イメージングを行うのに十分に治癒する。
このプロトコルでは、ヒトの小子移植片の品質が重要です。ヒトの小地の質およびそれに伴う移植の結果は、ドナーの年齢、BMI、および単離プロセス、ならびに到着前後の小地培養の時間によって異なる可能性がある。臨床移植のために承認された臓器提供膵臓から処理されたヒト膵島および研究目的は、ドナーの同意を得て使用された。それらは、膵臓消化のプロセス後に得られ、他の12に記載の膵島の精製。単離されたマウス小島と同様に、これらの小島は、酵素消化工程14,15,15の間に虚血、機械的ストレス、地下タンパク質の喪失、およびイレット内皮細胞(ECs)の部分的な破壊などの多くの細胞攻撃を受ける。培養条件の改善や多数の高品質なヒト島の回復にもかかわらず、移植までの時間は依然として重要な要因です。培養の最初の日の間に、ヒトの島は、島内ECの有意な損失を示し、培養の6日間で、小さな内皮構造のみが検出され得る16。このイレット内皮細胞の喪失は、ヒト小島の移植を減少させる重要な要因となる可能性があり、ドナー島のECsは再血管化プロセス17において重要な担体である。
移植手順中に不妊手術を維持することは、免疫不全NODにおける眼の感染を避けるために重要である。ローザトマト。ラグ2-/- マウス。通常、移植手順は手袋、ラボコート、ヘッドカバー、口マスクを使用して清潔な条件で行われますが、バイオセーフティキャビネット内では行われません。使用される溶液はすべて滅菌濾過され、注射器、カニューレ、チューブ、ガーゼは70%エタノールですすがっています。ウェイクアップケージはオートクレーブされています。完全な無菌性は処置の間のマウスの手動処理のために保証されないが、このプロシージャの口の汚染か眼の伝染は問題ではなかった。
安定かつ適切な麻酔は、低フレームレートデータ取得中の眼球運動およびドリフトを低減するための重要かつ重要な因子であり、有効性は異なる麻酔薬18によって異なる可能性がある。光の下で、一般的なイオブルラン麻酔の下で、眼は時折ゆっくりと転がり、麻酔の深さを増加させる(1〜2%から)一般的に目の動きを減らすことができます。吸入可能な麻酔を使用することの明確な利点は、その迅速な効果と回復時間です。しかし、イオブルランの使用はインスリン分泌を変える可能性があることを指摘すべきである。
画像解析とセグメンテーション、または画像を複数の領域に分割することは困難であり、データ選択20において潜在的なバイアスの影響を受ける。セグメンテーションは、定量化のための「島の脈管構造」のようなオブジェクトを識別することを目的としています。ここで、強度閾値に基づく方法は、選択した領域(すなわち、「絶対強度」)または強度の違い(すなわち、「背景減算」)を見つけるために適用された。現在、蛍光顕微鏡法におけるセグメンテーションの汎用ソリューションはありません。1 つの方法は、さまざまな方法をサポートする商用ソフトウェアを試してみる方法です。バックグラウンドの強度の変動によりしきい値が失敗した場合、イメージ キャプチャ設定の小さな変更によってセグメンテーション結果が向上する可能性があります。
この方法の限界は、ヒト移植片がより迅速にレシピエント細胞に置き換えられ、実際にはマウスレシピエント内皮細胞によって完全に再構成されるという事実にある。これは、ヒト内皮細胞との相互作用を介して島のパレンチマに移行するヒト免疫細胞を養子に移した研究を目的としている場合、ヒト細胞相互作用の研究を妨げるだろう。しかし、マウスとヒトの両方の小細胞移植片において、同様の再血管化がレシピエントから生じ、種に特有の異なる解剖学的3D計画に従う。
ベータ細胞補充療法の成功率は改善し続けています。 それでも、 インビボで のイレット移植および生存率の評価において、適切な生体内イメージング技術の欠如により、様々な課題が未解決のままである。前眼室は有用な移植部位であり、細胞の分解能における小地形態、血管化パターン、β細胞機能、およびβ細胞死の研究のために、 インビボ での反復およびインビボイメージングをサポートする。
ここで報告されたACE移植部位におけるヒト島移植の移植過程を研究するためのプロトコルは、MRI 21、22、PET2223、SPECT24、または生物発光25のような他の代替縦方向プラットフォームで得られたものよりも21かなり高い解像度のヒト小島移植片の縦方向モニタリングを可能にする。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、スウェーデン研究評議会、戦略的研究地域Exodiab、Dnr 2009-1039、LUDC-IRC、ルンド、糖尿病フェルブンデット、バーン糖尿病フェルバンデットの王立生理学会への戦略研究DNR IRC15-0067スウェーデンの財団によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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