Summary
L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.
Abstract
La modulazione optogenetica delle sotto-popolazioni neuronali nel cervello ha permesso ai ricercatori di sezionare circuiti neurali in vivo ed ex vivo. Ciò fornisce una premessa per determinare il ruolo dei tipi di neuroni all'interno di un circuito neurale e il loro significato nella codifica delle informazioni relative all'apprendimento. Allo stesso modo, il metodo può essere utilizzato per testare il significato fisiologico di due o più regioni cerebrali collegate in animali svegli e anestetizzati. Il presente studio dimostra come i neuroni del glutammato VTA modulano il tasso di attivazione dei neuroni piramidali putativi nel CA1 (ippocampo) dei topi anestetizzati. Questo protocollo utilizza l'etichettatura dipendente dal virus adeno-associato (AAV) dei neuroni del glutammato VTA per il tracciamento dei terminali presinaptici del glutammato VTA negli strati dell'ippocampo. L'espressione di opsina controllata dalla luce (channelrhodopsin; hChR2) e proteina di fluorescenza (eYFP) ospitata dal vettore AAV ha permesso il tracciamento anterogrado dei terminali del glutammato VTA e la fotostimolazione dei corpi delle cellule neuronali del glutammato VTA (nel VTA). Elettrodi di silicio acuto ad alta impedenza sono stati posizionati nel CA1 per rilevare risposte multi-unità e singola unità alla fotostimolazione VTA in vivo. I risultati di questo studio dimostrano la distribuzione dipendente dallo strato dei terminali presinaptici del glutammato VTA nell'ippocampo (CA1, CA3 e DG). Inoltre, la fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA ha aumentato il tasso di attivazione e scoppio delle presunte unità piramidali CA1 in vivo.
Introduction
Nell'ultimo decennio, è stata sviluppata una serie di strumenti genetici per aumentare la specificità della modulazione di tipo neuronale e la mappatura di reti neurali complesse1. In particolare, i virus neurotropici con una capacità intrinseca di infettare e replicarsi nelle cellule neuronali sono stati utilizzati per esprimere o ablare proteine specifiche in sottotipi di neuroni. Quando ospitano proteine di fluorescenza o indicatori di attività sinaptica geneticamente codificati, i vettori AAV trasfettate etichettano e delineano le reti neurali attraverso le regioni del cervello2,3. La scelta di un promotore nel costrutto AAV dirige l'espressione del vettore in tipi di neuroni con un certo livello di specificità (espressionepromotore-dipendente). Tuttavia, attraverso la ricombinazione Cre-lox, i costrutti AAV vengono distribuiti con maggiore specificità per l'etichettatura dei neuroni4,5,6,7. Da notare, le ossine microbiche fotoattivate e le proteine di fluorescenza confezionate in vettori AAV possono essere espresse in vari sottotipi di neuroni8e sono ideali per l'imaging, il tracciamento del circuito di tipo neuronale e la fotomodulazione9,10.
I costrutti AAV iniettati stereotassicamente in una regione del cervello (o nucleo) guidano l'espressione della proteina reporter nei terminali soma, dendrite e assoni. L'espressione neurale di AAV che ospita un gene reporter (eYFP) facilita l'etichettatura dei corpi cellulari neuronali e il tracciamento anatomico delle proiezioni da e verso altre regioni del cervello11,12,13,14. I costrutti AAV-eYFP che trasportano l'opsina controllata dalla luce (ad esempio, hChR2), possono essere utilizzati come strumento per l'imaging6,15 e il tracciamento fisiologico basato sulla stimolazione delle proiezioni neurali per indirizzare le aree cerebrali in vivo16. A seconda del sierotipo AAV, la direzione dell'etichettatura dei neuroni può essere anterograda o retrograda11,12. Studi precedenti hanno stabilito che AAV5 viaggia anterogradamente nei neuroni12. Pertanto, la fotostimolazione dei corpi cellulari che esprimono hChR2 produce effetti presinaptici altrove nel cervello (target)17.
Qui, AAV (sierotipo 5) con un promotore CaMKIIα è stato utilizzato per esprimere eYFP (reporter) e hChR2 (opsina) nei neuroni del glutammato VTA e nelle proiezioni assonali. I risultati di questo studio dimostrano la distribuzione dipendente dallo strato dei terminali presinaptici VTA-glutammato nelle regioni ippocampali CA1, CA3 e DG. Inoltre, la fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA ha aumentato i tassi di attivazione di CA1 multi-unità e singola unità in vivo rispetto ai valori basali. Questo protocollo utilizza strumenti a prezzi accessibili e software disponibili in commercio che possono aumentare la qualità dei dati ottenuti da esperimenti di tracciamento dei circuiti neurali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sperimentali e di manipolazione degli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Louisiana State University School of Veterinary Medicine.
1. Animale da esperimento
- Utilizzare topi di 5-6 settimane.
- Ospitare 3-5 animali per gabbia in condizioni standard di 12 ore alternando luce e buio. Cibo e acqua dovrebbero essere forniti ad libitum.
2. Craniotomia e preparazione animale
NOTA: Questa sezione descrive le procedure pre- e peri-operatorie per la craniotomia del topo. Utilizzare apparecchi stereotassica standard e coordinate appropriate (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML e Dorsoventral: DV). Fare riferimento a un atlante del cervello del topo per determinare le coordinate per la regione del cervello di interesse.
- Anestetizzare i topi mediante iniezione di cocktail intraperitoneale ketamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg). Eseguire un test del pizzico della dita del piede per garantire l'assenza di sensazione prima dell'inizio dell'intervento chirurgico.
NOTA: In alternativa, l'anestesia isoflurano con una camera nasale appropriata può essere utilizzata anche per questo passaggio. - Fissare delicatamente la testa dell'animale sull'apparato stereotassico.
NOTA: è importante maneggiare gli animali con cautela durante questo processo. Inoltre, controllare la frequenza respiratoria e altri elementi vitali prima di procedere con l'intervento chirurgico. Lasciare riposare l'animale per ~ 7 minuti per ridurre lo stress.- Posizionare una piastra riscaldante sul telaio stereotassico in modo tale che il corpo dell'animale sia sdraiato su di esso. Ciò contribuirà a mantenere la temperatura corporea e mantenere l'animale caldo durante la procedura. Conservare la piastra riscaldante per la cura e il recupero postoperatorio.
- Utilizzare un clipper per rimuovere i peli sul cuoio capelluto e pulire la pelle con una soluzione di iodio.
- Applicare lidocaina topica per bloccare la sensazione sul cuoio capelluto.
- Utilizzare un bisturi per fare un'incisione del cuoio capelluto della linea mediana che si estende dalla regione frontale a quella occipitale.
- Pulire l'area di incisione con soluzione di iodio, quindi esporre la calvaria.
NOTA: Una piccola quantità di soluzione di perossido di idrogeno al 3% può essere applicata per rimuovere il periosteo dalla calvaria. Ciò aumenterà la visibilità dei punti di riferimento (bregma e lambda) e delle suture. - Utilizzando un atlante stereotassico cerebrale di topo, determinare le coordinate AP e ML relative al bregma.
- Per l'iniezione di VTA, posizionare una siringa ad ago a punta smussata ultrafine (ad es. Siringa Neuros) alle coordinate AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm rispetto al bregma.
- Utilizzare uno strumento di perforazione per praticare un foro di 1 mm (craniotomia) nel cranio alla coordinata AP/ML contrassegnata.
NOTA: questo passaggio richiede un livello significativo di cautela. Una pressione minima deve essere applicata durante la perforazione per evitare che la punta del trapano schiacci il tessuto cerebrale. Nel presente studio, la punta del trapano era di 0,8 mm e la velocità del trapano era impostata a 15.000 giri / min.
ATTENZIONE: Se il perossido di idrogeno è stato utilizzato nella pulizia dell'incisione o della calvaria, garantire la rimozione totale della soluzione o consentire la completa secchezza prima della perforazione.
3. Iniezione di cocktail AAV
NOTA: Questa sezione descrive il processo di iniezione di AAV nel VTA di topi adulti C57BL/6 (23-27 g). Il metodo descritto può essere utilizzato per l'iniezione di AAV in qualsiasi regione del cervello utilizzando apparecchi stereotassica standard e coordinate appropriate. Per dimostrare questo protocollo, eYFP e hChR2 sono stati espressi nei neuroni del glutammato VTA utilizzando la trasfezione mediata da AAV5 sotto un promotore CaMKIIα (Figura 1). La ricombinazione Cre-lox può essere utilizzata anche per questo passaggio.
- Montare una siringa con ago a punta smussata ultrafine (32 G; capacità di 5 μL con precisione di 100 nL) su un iniettore. Fissare il supporto della siringa su un micromanipolatore.
NOTA: per questa procedura è stato utilizzato un supporto per siringa manuale, con calibrazione da 1,6 nL. È inoltre possibile utilizzare un iniettore automatico. - Riempire la siringa con acqua a doppio distillato per pulire e testare il flusso del fluido.
- Aliquote di disgelo del cocktail AAV (sierotipo 5) su ghiaccio. Gli AAV sono meglio conservati a -80 °C per mantenere il titolo virale per una buona espressione.
- Riempire la siringa montata con 1.000 nL di soluzione AAV (10 mM in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4). Erogare 10 nL della soluzione AAV per confermare il flusso del liquido prima di abbassare l'ago in un sito di iniezione.
- Utilizzare un micromanipolatore per abbassare l'ago stereotassicamente nella profondità desiderata (coordinata DV). Dopo aver abbassato l'ago alla profondità desiderata, lasciare che la siringa rimanga in posizione per 10 minuti prima dell'iniezione.
NOTA: Per questa procedura, l'ago è stato abbassato nel VTA ad una profondità (DV) di 4,5 mm dalla superficie piale del cervello. Per altre aree del cervello, utilizzare la coordinata dorsoventrale appropriata (fare riferimento all'atlante del cervello del topo). - Iniettare 600-800 nL di AAV nel VTA. Il volume dell'iniezione può essere regolato in base alle dimensioni del sito target.
- Fornire la soluzione AAV alla velocità di 60 nL/min (intervallo di 3 min).
- Per esprimere eYFP e hChR2 nei neuroni e nelle proiezioni del glutammato VTA, iniettare AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
NOTA: il metodo di ricombinazione Cre-lox può essere utilizzato anche a seconda dell'obiettivo dell'esperimento. - Lasciare che l'ago rimanga in posizione per 15 minuti dopo l'iniezione di AAV. Ciò ridurrà la diffusione e il riflusso.
- Prelevare l'ago della siringa e quindi suturare l'incisione per chiudere la ferita.
- Somministrare antibiotici e analgesia come parte delle cure post-operatorie. Posiziona il mouse su una calda piattaforma imbottita e monitora l'animale fino a quando non è sveglio.
NOTA: Dopo 3 settimane di iniezione, l'espressione di AAV può essere osservata mediante il rilevamento a fluorescenza della proteina reporter (eYFP) nelle sezioni cerebrali del topo. Inoltre, gli esperimenti di fotostimolazione possono essere eseguiti dopo 3 settimane (Figura 2).
4. Configurazione per registrazioni neurali in vivo con optogenetica
NOTA: Questa sezione descrive i passaggi per la registrazione neurale acuta con il tracciamento optogenetico di un circuito cerebrale (proiezione del neurone glutammato VTA al CA1). Se necessario, controllare il sistema (amplificatore e connessioni) per problemi di rumore elettrico e messa a terra prima di iniziare questo passaggio. L'esecuzione di questo passaggio in una gabbia di Faraday può aiutare a eliminare il rumore elettrico nella registrazione.
- A 3 settimane dopo l'iniezione di AAV, anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di uretano (0,2 mg/kg).
ATTENZIONE: L'uretano è cancerogeno e deve essere maneggiato con cautela mentre si indossano indumenti protettivi. Inoltre, la somministrazione di anestesia con uretano a questa concentrazione non è sopravvivenza. - Apporre la testa dell'animale su un telaio stereotassico come descritto in precedenza (passo 2.2, Figura 3A). Eseguire una craniotomia per esporre la dura (Figura 3A). Utilizzare uno strumento di foratura (dimensione della punta: 0,8 mm, velocità: 15.000 giri / min) per rimuovere parte dell'osso parietale.
- La craniotomia dovrebbe essere larga circa 3 mm x 4 mm. Applicare gocce di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) su quest'area per prevenire la secchezza.
- Sotto un microscopio di dissezione (digitale), utilizzare una punta dell'ago piegata (27 G) per asportare la dura esposta. Fare attenzione a non separare la delicata copertura piale e i tessuti corticali in quest'area.
- Forare un foro nell'osso occipitale (dimensione della punta: 0,8 mm, velocità: 10.000 giri / min) per tenere la vite di terra (vite Phillips a testa di padella; M0,6 x 2,0 mm).
- Collegare un filo di terra in acciaio inossidabile.
NOTA: è possibile utilizzare anche altri tipi di fili (Figura 3b). - Per la fotostimolazione combinata (VTA) e la registrazione neurale (CA1), utilizzare un apparecchio stereotassico multi-rail dotato di micromanipolatori ultra-fini (10 μm o 1 μm). Montare la fibra ottica e la sonda neurale di registrazione rispettivamente su micromanipolatori da 10 μm e 1 μm.
- Se necessario, utilizzare un adattatore per sonda di testa (Figura 3c).
NOTA: Nel protocollo attuale, uno stadio principale a 32 canali era dotato di un adattatore per contenere un elettrodo di registrazione a 4 canali (Figura 3d). Il filo di terra in acciaio inossidabile è stato saldato alla porta di collegamento a terra dell'adattatore.
- Se necessario, utilizzare un adattatore per sonda di testa (Figura 3c).
- Alle coordinate AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, abbassare la fibra ottica di 400 μm di diametro nel VTA.
- Prima di abbassare la fibra ottica, collegare la ghiera a un cavo in fibra ottica (con ghiera in acciaio inossidabile o ceramica) collegato a una sorgente LED accoppiata a fibre.
NOTA: assicurarsi che l'intensità della luce e la messa a fuoco siano impostate come desiderato. La scelta della sorgente luminosa a LED dovrebbe corrispondere alle opsin prese di mira. Qui, un driver LED a 470 nm (luce blu) è stato utilizzato per la fotoattivazione hChR2 (Figura 4a). - Per sincronizzare l'impulso luminoso con la registrazione neurale, collegare il driver LED e la porta IN digitale del controller di registrazione a un pulsatore TTL (Transistor-Transistor Logic) (Figura 4b). Questo può essere ottenuto utilizzando uno splitter BNC.
NOTA: l'uso di un pulsatore TTL offre la flessibilità di impostare digitalmente la frequenza e la durata del treno di impulsi desiderate. Nel protocollo attuale, gli impulsi luminosi da 10 ms sono stati attivati a 50 Hz18. Per il controllo TTL del driver LED, commutare il driver su "trigger". In questa modalità, l'intensità della luce può essere regolata ruotando la "manopola". La frequenza di stimolazione può essere regolata per adattarsi alle variabili sperimentali e potrebbe variare da 1 a 100 Hz. Per il tracciamento del circuito neurale, si raccomanda una frequenza di stimolazione di >20 Hz. - Regolare la manopola per determinare l'intensità effettiva che può generare una risposta senza produrre artefatti fotoelettrici. Se necessario, riposizionare la fibra ottica per eliminare gli artefatti19.
NOTA: il driver LED utilizzato per il protocollo corrente produce una potenza luminosa di ~21,8 mW.
- Prima di abbassare la fibra ottica, collegare la ghiera a un cavo in fibra ottica (con ghiera in acciaio inossidabile o ceramica) collegato a una sorgente LED accoppiata a fibre.
5. Registrazione neurale
- Utilizzare una sonda neurale acuta con un gambo spesso 15-50 μm, che misura almeno 5 mm di lunghezza.
NOTA: la registrazione da strutture cerebrali profonde richiederà sonde neurali con un gambo più lungo. Nel presente studio è stata utilizzata una sonda con una lunghezza del gambo di 20 mm. - Collegare lo stadio della testa del preamplificatore al controller di registrazione tramite un cavo SPI (Serial Peripheral Interface). Controllare l'illuminazione a colori dei LED sulle porte del controller di registrazione. I LED verdi e gialli indicano la tensione corretta sulla scheda amplificatore collegata. Il LED rosso indica un controllo dello stadio della testa del software funzionante (Figura 5b).
- Utilizzando un micropolatore, posizionare i siti di contatto dell'elettrodo nello strato di cella piramidale del CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: da +1,1 a 1,2 mm).
NOTA: la fibra ottica e l'elettrodo possono essere posizionati in altre regioni cerebrali desiderate per la fotostimolazione e la registrazione.
6. Impostazioni dell'amplificatore e del filtro
- Collegare il sistema di amplificazione del controller di registrazione a un computer tramite una porta USB 3.0. Collegare lo stadio principale all'amplificatore utilizzando il cavo SPI. Avviare il software del controller. Se non collegato correttamente, il sistema visualizzerà un messaggio "dispositivo non trovato".
- Fare clic su Esegui per visualizzare l'attività sui canali. Ogni forma d'onda viene tracciata come tensione (asse y) rispetto al tempo (asse x). A seconda della regione di interesse, regolare la tensione e le scale temporali per regolare la visualizzazione della forma d'onda.
- Se sono attivi solo pochi canali, disabilitare i canali inutilizzati per ridurre le dimensioni del file sul disco di archiviazione.
- Impostare la frequenza di campionamento e le frequenze di taglio modificando i parametri della larghezza di banda sul software di acquisizione. Per la registrazione a singola unità, impostare le frequenze di taglio superiore e inferiore rispettivamente su 300 Hz e 5.000 Hz. Modificare la frequenza di campionamento dell'amplificatore a 30 kS/s.
NOTA: la scelta di una frequenza di campionamento elevata produrrà una dimensione del file maggiore. - Prima di registrare, controllare l'integrità dei canali dell'elettrodo misurando l'impedenza a 1.000 Hz. Questo può essere fatto avviando la funzione nell'interfaccia utente (software del controller). Un canale di lavoro dovrebbe avere un valore di impedenza compreso tra 0,1 e 5 MΩ.
- Se un'uscita audio (altoparlante) è collegata alla porta ANALOG OUT, regolare il guadagno e il silenziatore per un suono di picco ottimale.
- Per visualizzare il marcatore del treno di impulsi TTL nella registrazione del picco, abilitare la visualizzazione per il marcatore DIGITAL IN. Per registrare il timestamp del treno di impulsi, abilitare la visualizzazione del canale DIGITAL IN prima dell'esperimento principale.
NOTA: di solito c'è più di un canale "DIGITAL IN" (1 o 2). Assicurarsi che il cavo BNC dell'pulsatore TTL sia collegato alla porta "DIGITAL IN" selezionata per la visualizzazione nel software del controller di registrazione. - Per la visualizzazione in tempo reale della forma d'onda spike, aprire la finestra spike scope e impostare la soglia con il clic del mouse.
- Ispezionare il livello di rumore monitorando il Root Mean Square (RMS in μV). Per la registrazione pulita del picco, è preferibile che la soglia del picco neurale sia almeno 5x RMS.
- Una volta completata l'installazione, selezionare il formato di output del file.
NOTA: Qui, il picco neurale CA1 è stato registrato in formato .rhd. Altri formati di file (.rhs e .dat) possono anche essere selezionati per corrispondere ai formati di file consentiti dal software di analisi.
7. Registrazione e impostazioni optogenetiche in vivo
- Aprire il software di controllo degli impulsi (TTL) che visualizza vari parametri di impulso regolabili. Selezionare la porta COM appropriata sul software. Impostare i parametri dell'impulso regolando le impostazioni Treno e Gruppo.
NOTA: la condizione dell'impulso deve essere determinata considerando le variabili sperimentali e il design. - Nel software del controller dell'amplificatore, fare clic su Esegui per rilevare i picchi neurali nell'ippocampo o nell'area cerebrale desiderata. Se necessario, regolare la profondità dell'elettrodo per rilevare i neuroni vitali e attivi.
- Una volta rilevata l'attività di tensione extracellulare, osservare i picchi basali per 15 minuti e monitorare i parametri vitali dell'animale. Inoltre, testare l'impulso luminoso per rilevare i neuroni reattivi all'interno del CA1 o della regione bersaglio anatomica desiderata.
NOTA: verificare la disponibilità di artefatti fotoelettrici ed eliminarli regolando l'intensità della luce o la posizione della fibra ottica. - Registrare l'attività di base per ~ 10 minuti prima di attivare l'impulso luminoso alla frequenza desiderata (Figura 5a,b). Ciò consentirà il confronto delle velocità di sparo o scoppio con e senza illuminazione.
NOTA: Nel presente studio, l'attività di base è stata registrata per 10 minuti senza illuminazione, seguita dall'illuminazione a 50 Hz (Filmato 1).
8. Analisi
- Converti il file .rhd nel formato di outputNex 5.
- Nome file di processo. Nex5 in un software di smistamento offline per rilevare treni raster e forme d'onda a singola unità (Figura 5a–b).
- Selezionare il canale desiderato dalla finestra a discesa.
NOTA: i dati di picco registrati continuamente possono essere visualizzati in una finestra separata dell'OFSS. Anche la scala temporale può essere regolata. Se viene utilizzato un tetrodo, l'OFSS può essere impostato per ordinare i 4 canali come tetrodo. - Impostare il livello di tensione per l'estrazione della forma d'onda di attraversamento della soglia.
ATTENZIONE: utilizzare un minimo di 5 RMS per il corretto rilevamento dei picchi. - Rileva le forme d'onda, quindi esegui lo smistamento dei picchi utilizzando il metodo di ricerca della valle (automatico) o K-means (semiautomatico). Se necessario, unire unità che occupano regioni simili dello spazio PCA (3D-Principal Component Analysis).
- Esporta ordinato . Nex5 per ulteriori analisi (Figura 5c–d).
NOTA: i risultati dell'analisi per l'intervallo interspike, la velocità di sparo e la velocità di scoppio possono essere esportati in altre piattaforme di analisi.
- Selezionare il canale desiderato dalla finestra a discesa.
9. Rilevazione della fluorescenza dell'espressione di AAV
- Dopo la registrazione, eutanasizzare l'animale in una camera isoflurano.
- Eseguire la perfusione transcardica con PBS 10 mM (~10 mL), seguita da paraformaldeide tamponata con fosfato al 4% (PB-PFA, ~10 mL).
- Rimuovere l'intero cervello intatto e fissarlo in PB-PFA al 4% per 48 ore.
- Trasferire il cervello fisso in PB-PFA al 4% contenente il 30% di saccarosio per la crioconservazione a 4 °C. Dopo 72 ore, sezionare il cervello in un criostato e montare le fette su un vetrino rivestito di gelatina.
NOTA: Nel protocollo attuale, le sezioni contenenti la parte chiusa dell'ippocampo (rostrale) sono state selezionate per dimostrare i terminali etichettati AAV nel DG, CA3 e CA1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tracciatura anterograda
L'espressione di AAV è stata verificata mediante imaging a immunofluorescenza della proteina reporter (eYFP) nel VTA di topi C57BL/6 21 giorni dopo l'iniezione (Figura 2). Il successo dell'etichettatura anterograda delle proiezioni di glutammato VTA presinaptico nell'ippocampo è stato verificato anche dal rilevamento eYFP negli strati di DG, CA3 e CA1(Figura 6a-d; Film 2 e 3).
Le proiezioni di glutammato VTA all'ippocampo modulano l'attività di CA1
La fotostimolazione dei neuroni glutammato VTA ha aumentato l'attività dei presunti neuroni CA1 piramidali. Ciò è evidente come un aumento degli eventi di spiking durante la fase ON della luce (Film 1) rispetto alla fase OFF della luce (Figura 5a-b). A sostegno di questo risultato, il confronto statistico dei tassi di attivazione della rete CA1 prima (light OFF; baseline) e dopo (light ON) fotostimolazione ha rivelato un aumento significativo per il periodo post-stimolazione (Figura 7a; p = 0,0002). La successiva analisi del treno raster per rilevare i burst (2-4 picchi in <16 ms) dimostra anche un aumento del tasso di scoppio per i neuroni piramidali putativi CA1 dopo la fotostimolazione del glutammato VTA (Figura 7b; p = 0,0025). L'analisi statistica (Student's t-test) è stata eseguita con software standard. Qui, la velocità di sparo o scoppio della linea di base (light OFF) è stata confrontata con i valori di light ON (fotostimolazione).
Figura 1: Illustrazione schematica dell'iniezione AAV-CaMKII-ChR2-eYFP nel VTA del mouse C57BL/6.
Etichettatura anterograda dei neuroni VTA e proiezioni assonali all'ippocampo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini a fluorescenza che mostrano l'espressione AAV-CaMKII-ChR2-eYFP nel VTA e la traccia in fibra ottica.
Dk: nucleo di Darkschewitsch, scp: peduncolo cerebellare superiore, VTA: area tegmentale ventrale e RM: nucleo retromamillare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dimostrazione della craniotomia, del posizionamento degli elettrodi e del posizionamento delle fibre ottiche.
(A) Incisione della linea mediana che espone il cranio (b: bregma, oc: osso occipitale). (B) Posizionamento della vite di terra (gs) nell'osso occipitale e del filo di terra in acciaio inossidabile collegato (gw). (C) Posizionamento stereotassico della cannula in fibra ottica (foc: cavo in fibra ottica). (D) Posizionamento stereotassico della cannula della fibra ottica e del gambo della sonda neurale (foc: cavo in fibra ottica, adp: adattatore, ms: manicotto di accoppiamento, prs: gambo della sonda, hs: stadio di testa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Connessione BNC split per timestamp combinati di pulsazione luminosa e amplificatore (trigger).
(A) Dimostrazione dell'emissione luminosa a LED dalla punta di una cannula in fibra ottica. (B) Impulso TTL attraverso un adattatore split BNC per controllare la registrazione di LED e amplificatore di timestamp (ampl). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Treno spike registrato in continuo (dati grezzi) con rilevamento di una singola unità.
(A) Screengrab di registrazione grezza dall'ippocampo di un topo anestetizzato. (B) Illuminazione fotografica basata su TTL del VTA nella registrazione raw. Le linee azzurre dimostrano i timestamp per i periodi light ON (λ = 470nm) e la frequenza di stimolazione. (C–D) Treno di picchi e unità neuronali registrati continuamente derivati dallo smistamento dei picchi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini rappresentative di fluorescenza che dimostrano l'espressione di AAV-CaMKII-ChR2-eYFP nell'ippocampo.
(A) DG (GCL: strato cellulare granulare, hil: hilus). (B) Parte del CA3 vicino al DG (SL: strato lacunoso, pir: strato cellulare piramidale). (C) CA3 propriamente detto. (D) CA1 (quindi: strato oriens, pir: strato cellulare piramidale, rad: strato radiculata). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Confronto statistico della velocità di sparo prima e dopo la fotostimolazione.
( A ) Graficoabarre che mostra un aumento della velocità media di sparo (Hz) per le presunte unità neuronali piramidali nel CA1 (***p = 0,0002) dopo la fotoilluminazione. (B) Grafico a barre che mostra un aumento del tasso di scoppio per i neuroni CA1 putativi dopo la fotoilluminazione (**p = 0,0025). Barra di errore: errore standard di media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Filmato 1: Registrazione Screengrab del controller dell'amplificatore e del software del pulser. Il filmato mostra la registrazione di base (luce OFF) seguita dalla fotostimolazione (luce ON, λ = 470 nm) che è indicata con timestamp blu. Clicca qui per scaricare questo video.
Movie 2 e Movie 3: illustrazione 3D dei terminali di glutammato VTA nel DG di un mouse. DAPI-blue: etichetta nucleare nello strato cellulare granulare (GCL); eYFP-Green: terminali VTA etichettati AAV nella DG hilus. Clicca qui per scaricare questi video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Negli ultimi dieci anni, la progettazione dei costrutti AAV è progredita in modo significativo. Come tale, più promotori neuronali specifici sono stati incorporati in una serie di sierotipi AAV per una migliore specificità della trasfezione14. Combinando geni per proteine di fluorescenza, trasportatori, recettori e canali ionici, esistono ora librerie di AAV per l'imaging, la neuromodulazione e il rilevamento dell'attività sinaptica. Nei costrutti AAV disponibili in commercio, una combinazione di un fluoroforo geneticamente codificato e canali ionici (opsina) consente un tracciato neuroanatomico ed elettrofisiologico combinato dei circuiti neurali14,18,19. Allo stesso modo, la selezione di un promotore (o metodo di ricombinazione cre-lox) può consentire il tracciamento di proiezioni specifiche di un tipo neuronale all'interno di un circuito. Nel presente studio, questo protocollo è stato utilizzato per la valutazione anatomica ed elettrofisiologica delle proiezioni neurali del glutammato VTA all'ippocampo (regione CA1).
Circuito neurale VTA-Ippocampo
Il VTA fa parte della via mesocorticolimbica del mesencefalo. Le proiezioni VTA alle aree cerebrali coinvolte nell'apprendimento della ricompensa e dell'avversione sono state ampiamente dimostrate20,21,22, 23,24,25. Mentre il VTA contiene dopamina, glutammato e neuroni GABA, la popolazione di neuroni della dopamina è anatomicamente dominante. Una delle principali funzioni del VTA nell'avversione e nell'apprendimento della ricompensa è attribuita a una robusta proiezione della dopamina VTA al nucleo accumbens e al nucleo del rafe dorsale22,24,25,26,27,28. Sebbene i neuroni della dopamina e del glutammato VTA proiettino verso l'ippocampo, la funzione dei terminali anatomicamente dominanti del glutammato VTA è meno studiata rispetto ai terminali della dopamina VTA nell'ippocampo29,30.
L'attuale protocollo descrive l'uso di un costrutto AAV5 che ospita un fluoroforo (eYFP) e un'opsina controllata dalla luce (hChR2) per la mappatura dei terminali VTA (glutammato) che esprimono CaMKIIα nell'ippocampo. Studi precedenti hanno stabilito che i terminali del glutammato VTA sono anatomicamente dominanti nell'ippocampo rispetto ai terminali della dopamina VTA29. Per dimostrare i terminali presinaptici del glutammato VTA nell'ippocampo, AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP è stato trasfettato in corpi cellulari neuronali VTA. Questo ha etichettato i corpi cellulari dei neuroni del glutammato VTA (all'interno del VTA) e ha delineato i terminali del glutammato VTA all'interno degli strati dell'ippocampo.
Sebbene i terminali presinaptici del glutammato VTA innervano DG, CA3 e CA1, i risultati mostrano variazioni dipendenti dallo strato per queste tre regioni (Figura 6a-d). Nel DG, i terminali di glutammato VTA etichettati AAV sono anatomicamente dominanti nell'ilo rispetto allo strato cellulare granulare. Nel CA3, i terminali del glutammato VTA sono relativamente abbondanti nello strato lacunoso rispetto allo strato cellulare piramidale e allo strato oriens. Mentre nel CA1, i terminali del glutammato VTA innervano significativamente gli strati dendritici (strato oriens e radiatum) rispetto allo strato cellulare piramidale. Il risultato di questo studio dimostra anche che la fotostimolazione dei corpi delle cellule neuronali del glutammato VTA modula l'attività della rete neurale CA1 in vivo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA ha portato ad un aumento significativo della velocità di attivazione e della velocità di scoppio di CA1 durante l'epoca della fotostimolazione (Figura 7a-b). Ciò concorda con la distribuzione anatomica dei terminali del glutammato VTA negli strati dendritici del CA1 (Figura 6d) dove può esercitare effetti sulla codifica delle informazioni ippocampali. A sostegno di questa osservazione, altri studi hanno dimostrato che il VTA è un determinante primario della codifica della memoria di lavoro ippocampale e regola la selezione delle informazioni da conservare nella memoria a lungo termine attraverso il ciclo VTA-ippocampo22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Considerazioni tecniche
Per implementare con successo questo protocollo, la scelta dei costrutti AAV dovrebbe essere determinata in base al tipo di neurone da prendere di mira. Il ricercatore deve identificare un promotore adatto (un prodotto genico) che è unico per il tipo di neurone da prendere di mira. Nel presente studio, un promotore CaMKIIα è stato utilizzato per guidare l'espressione di eYFP e hChR2 nei neuroni che esprimono CaMKIIα. Tuttavia, è possibile utilizzare anche un metodo di ricombinazione cre-lox. In questo caso, un AAV5 a doppio floxed può essere espresso nel VTA dei topi CaMKIIα-Cre. I metodi di espressione basati su promoter e cre-lox sono applicabili anche ad altri tipi di neuroni35,36,37.
Il sistema deve essere controllato per il rumore elettrico. Questo può essere fatto valutando l'RMS nell'ambito spike durante una sessione di registrazione di prova. Se necessario, il sistema e l'apparato stereotassico devono essere alloggiati in una gabbia di Faraday, mentre la messa a terra dell'amplificatore è collegata alla gabbia. I siti di contatto degli elettrodi possono essere disposti linearmente o un tetrodo. La scelta del design della sonda dovrebbe essere determinata in base all'obiettivo dell'esperimento. Un array lineare rileva i neuroni su più livelli. Sono disponibili in commercio anche sonde con varie specifiche di spaziatura (in micron). La lunghezza e la distanza del gambo tra i siti di contatto della sonda devono essere considerate durante la procedura di registrazione e per l'analisi. Al termine della configurazione, l'impulso luminoso deve essere controllato durante una registrazione di prova per eliminare gli artefatti fotoelettrici. Questo può anche essere ottimizzato regolando la posizione dell'elettrodo rispetto alla profondità e alla posizione della fibra ottica.
Limitazioni
Sebbene CaMKIIα sia espresso principalmente nei neuroni che rilasciano glutammato, la proteina è presente anche in alcune popolazioni di neuroni della dopamina che co-rilasciano glutammato. Pertanto, l'uso di AAV5-CaMKIIα etichetterà principalmente i neuroni del glutammato e alcuni neuroni della dopamina che esprimono CaMKIIα. I protocolli di fotostimolazione guidati da LED sono convenienti e possono essere facilmente assemblati. Tuttavia, è importante notare che un protocollo di fotostimolazione guidato da laser è più efficace38,39,40. La soluzione di AAV iniettata nella stessa regione del cervello per animali diversi produce soglie di espressione variabili. Tuttavia, attendere 3 settimane o più dopo l'iniezione può ridurre tale variazione consentendo una trasfezione ottimale. La soluzione di AAV iniettata in una regione del cervello può anche diffondersi nelle aree cerebrali circostanti. Osservare il periodo di attesa dopo che l'ago è stato abbassato e tra le iniezioni in bolo può ridurre la diffusione della soluzione AAV dal sito di iniezione.
In sintesi, questo metodo può essere utilizzato per tracciare circuiti neurali nel cervello dei roditori. Sebbene l'attuale protocollo descriva il tracciamento del circuito neurale in vivo nei topi anestetizzati, la procedura può anche essere implementata per la registrazione cronica in topi che si comportano da svegli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è finanziato dalla CBS Bridging Grant assegnata a OOM. OOM, PAA e AS hanno progettato lo studio ed eseguito gli esperimenti. AS e PAA hanno analizzato i risultati. OOM e PAA hanno preparato il manoscritto. Ringraziamo il Dr. Karl Disseroth (Stanford University) per aver reso l'AAV disponibile per il nostro uso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G.
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H.
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S.
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V.
