Summary
El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.
Abstract
La modulación optogenética de las subpoblaciones neuronales en el cerebro ha permitido a los investigadores diseccionar los circuitos neuronales in vivo y ex vivo. Esto proporciona una premisa para determinar el papel de los tipos de neuronas dentro de un circuito neuronal y su importancia en la codificación de la información en relación con el aprendizaje. Del mismo modo, el método se puede utilizar para probar la importancia fisiológica de dos o más regiones cerebrales conectadas en animales despiertos y anestesiados. El estudio actual demuestra cómo las neuronas de glutamato VTA modulan la tasa de disparo de las neuronas piramidales putativas en el CA1 (hipocampo) de ratones anestesiados. Este protocolo emplea el etiquetado dependiente del virus adenoasociado (AAV) de las neuronas de glutamato VTA para el rastreo de los terminales presinápticos de glutamato VTA en las capas del hipocampo. La expresión de opsina controlada por la luz (canalrodopsina; hChR2) y proteína de fluorescencia (eYFP) albergada por el vector AAV permitió el rastreo anterógrado de los terminales de glutamato VTA y la fotoestimulación de los cuerpos celulares de las neuronas de glutamato VTA (en el VTA). Se colocaron electrodos de silicio agudo de alta impedancia en el CA1 para detectar respuestas de unidades múltiples y de una sola unidad a la fotoestimulación VTA in vivo. Los resultados de este estudio demuestran la distribución dependiente de capas de los terminales presinápticos de glutamato VTA en el hipocampo (CA1, CA3 y DG). Además, la fotoestimulación de las neuronas VTA glutamato aumentó la velocidad de disparo y estallido de las supuestas unidades piramidales CA1 in vivo.
Introduction
En la última década, se desarrolló una serie de herramientas genéticas para aumentar la especificidad de la modulación de tipo neuronal y el mapeo de redes neuronales complejas1. En particular, los virus neurotrópicos con una capacidad inherente para infectar y replicarse en las células neuronales se han desplegado para expresar o extirpar proteínas específicas en subclases de neuronas. Al albergar proteínas de fluorescencia o indicadores de actividad sináptica codificados genéticamente, los vectores AAV transfectados etiquetan y delinean las redes neuronales a través de las regiones cerebrales2,3. La elección de un promotor en el constructo AAV dirige la expresión del vector en tipos de neuronas con cierto nivel de especificidad (expresióndependiente del promotor). Sin embargo, a través de la recombinación de Cre-lox, los constructos AAV se despliegan con mayor especificidad para el etiquetado neuronal4,5,6,7. Cabe destacar que las opsinas microbianas fotoactivadas y las proteínas de fluorescencia empaquetadas en vectores AAV se pueden expresar en varios subtipos de neuronas8,y son ideales para imágenes, trazado de circuitos de tipo neuronal y fotomodulación9,10.
Las construcciones de AAV inyectadas estereotácticamente en una región del cerebro (o núcleo) impulsan la expresión de la proteína reportera en los terminales soma, dendrita y axones. La expresión neuronal de AAV que alberga un gen reportero (eYFP) facilita el etiquetado de los cuerpos celulares de las neuronas y el rastreo anatómico de las proyecciones hacia y desde otras regiones del cerebro11,12,13,14. Las construcciones AAV-eYFP que transportan opsina controlada por la luz (por ejemplo, hChR2), se pueden implementar como una herramienta para obtener imágenes6,15 y el rastreo fisiológico basado en la estimulación de proyecciones neuronales para apuntar a áreas cerebrales in vivo16. Dependiendo del serotipo AAV, la dirección del etiquetado neuronal puede ser anterógrada o retrógrada11,12. Estudios previos han establecido que AAV5 viaja anterógradamente en las neuronas12. Así, la fotoestimulación de cuerpos celulares que expresan hChR2 produce efectos presinápticos en otras partes del cerebro (diana)17.
Aquí, AAV (serotipo 5) con un promotor CaMKIIα se utilizó para expresar eYFP (reportero) y hChR2 (opsina) en neuronas glutamato VTA y proyecciones axonales. Los resultados de este estudio demuestran la distribución dependiente de capas de los terminales presinápticos VTA-glutamato en las regiones del hipocampo CA1, CA3 y DG. Además, la fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA aumentó las tasas de disparo in vivo de ca1 de varias unidades y unidades únicas en comparación con los valores basales. Este protocolo utiliza herramientas asequibles y software disponible comercialmente que puede aumentar la calidad de los datos obtenidos de los experimentos de rastreo de circuitos neuronales.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales y de manejo de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Louisiana.
1. Animal de experimentación
- Use ratones de 5 a 6 semanas de edad.
- Casa de 3 a 5 animales por jaula en condiciones estándar de 12 h alternando ciclo de luz y oscuridad. Los alimentos y el agua deben proporcionarse ad libitum.
2. Craneotomía y preparación animal
NOTA: Esta sección describe los procedimientos pre y perioperatorios para la craneotomía de ratón. Utilice aparatos estereotácticos estándar y coordenadas apropiadas (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML y Dorsoventral: DV). Consulte un atlas cerebral de ratón para determinar las coordenadas de la región cerebral de interés.
- Anestesiar ratones mediante inyección de cóctel intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg). Realice una prueba de pellizco del dedo del dedo deldo del día para garantizar la ausencia de sensibilidad antes del comienzo de la cirugía.
NOTA: Alternativamente, la anestesia isoflurano con una cámara nasal adecuada también se puede utilizar para este paso. - Fije suavemente la cabeza del animal en el aparato estereotáxico.
NOTA: Es importante manejar a los animales con precaución durante este proceso. Además, verifique la frecuencia respiratoria y otros signos vitales antes de proceder con la cirugía. Deje que el animal descanse durante ~ 7 minutos para reducir el estrés.- Coloque una almohadilla térmica en el marco estereotáxico de modo que el cuerpo del animal esté acostado sobre él. Esto ayudará a mantener la temperatura corporal y mantener al animal caliente durante todo el procedimiento. Conserve la almohadilla térmica para el cuidado postoperatorio y la recuperación.
- Use un cortapelos para eliminar el vello sobre el cuero cabelludo y limpie la piel con una solución de yodo.
- Aplique lidocaína tópica para bloquear la sensación en el cuero cabelludo.
- Use un bisturí para hacer una incisión en la línea media del cuero cabelludo que se extienda desde el frente hasta la región occipital.
- Limpie el área de la incisión con solución de yodo, luego exponga la calvaria.
NOTA: Se puede aplicar una pequeña cantidad de solución de peróxido de hidrógeno al 3% para eliminar el periostio de la calvaria. Esto aumentará la visibilidad de los puntos de referencia (bregma y lambda) y las suturas. - Usando un atlas estereotáctico cerebral de ratón, determine las coordenadas AP y ML en relación con el bregma.
- Para la inyección de VTA, coloque una jeringa de aguja de punta roma ultrafina (por ejemplo, jeringa Neuros) en las coordenadas AP: -3.08 mm / ML: 0.5 mm en relación con el bregma.
- Use una herramienta de perforación para perforar un orificio de 1 mm (craneotomía) en el cráneo en la coordenada MARCADA AP / ML.
NOTA: Este paso requiere un nivel significativo de precaución. Se debe aplicar una presión mínima durante la perforación para evitar que la broca aplaste el tejido cerebral. En el estudio actual, la broca fue de 0,8 mm y la velocidad de perforación se estableció en 15.000 rpm.
PRECAUCIÓN: Si se utilizó peróxido de hidrógeno en la limpieza de la incisión o la calvaria, asegúrese de la eliminación total de la solución o permita una sequedad completa antes de perforar.
3. Inyección de cóctel AAV
NOTA: Esta sección describe el proceso para la inyección de AAV en el VTA de ratones adultos C57BL/6 (23–27 g). El método descrito se puede utilizar para la inyección de AAV en cualquier región del cerebro utilizando un aparato estereotáctico estándar y las coordenadas apropiadas. Para demostrar este protocolo, eYFP y hChR2 se expresaron en neuronas glutamato VTA utilizando transfección mediada por AAV5 bajo un promotor CaMKIIα(Figura 1). La recombinación Cre-lox también se puede utilizar para este paso.
- Monte una jeringa con aguja ultrafina de punta roma (32 G; capacidad de 5 μL con una precisión de 100 nL) en un inyector. Fije el soporte de la jeringa en un micromanipulador.
NOTA: Para este procedimiento, se utilizó un soporte de jeringa manual, con calibración de 1.6 nL. También se puede utilizar un inyector automático. - Llene la jeringa con agua destilada doble para limpiar y probar el flujo de líquido.
- Descongelar las alícuotas del cóctel AAV (serotipo 5) sobre hielo. Los AAV se almacenan mejor a -80 ° C para mantener el título viral para una buena expresión.
- Llene la jeringa montada con 1.000 nL de solución AAV (10 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4). Dispense 10 nL de la solución AAV para confirmar el flujo del líquido antes de bajar la aguja a un sitio de inyección.
- Utilice un micromanipulador para bajar la aguja estereotácticamente a la profundidad deseada (coordenada DV). Después de bajar la aguja a la profundidad deseada, deje que la jeringa permanezca en su lugar durante 10 minutos antes de la inyección.
NOTA: Para este procedimiento, la aguja se bajó en el VTA a una profundidad (DV) de 4,5 mm desde la superficie pial del cerebro. Para otras áreas del cerebro, use la coordenada dorsoventral apropiada (consulte el atlas cerebral del ratón). - Inyecte 600–800 nL de AAV en el VTA. El volumen de inyección se puede ajustar dependiendo del tamaño del sitio objetivo.
- Entregue la solución AAV a una velocidad de 60 nL/min (intervalo de 3 min).
- Para expresar eYFP y hChR2 en neuronas y proyecciones de glutamato VTA, inyecte AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
NOTA: El método de recombinación Cre-lox también se puede utilizar dependiendo del objetivo del experimento. - Deje que la aguja permanezca en su lugar durante 15 minutos después de la inyección de AAV. Esto reducirá la difusión y el reflujo.
- Retire la aguja de la jeringa y luego suture la incisión para cerrar la herida.
- Administrar antibióticos y analgesia como parte de la atención postoperatoria. Coloque el ratón en una plataforma acolchada caliente y controle al animal hasta que esté despierto.
NOTA: Después de 3 semanas de inyección, la expresión de AAV se puede observar mediante la detección de fluorescencia de la proteína reportera (eYFP) en las secciones cerebrales de ratón. Además, los experimentos de fotoestimulación se pueden realizar después de 3 semanas(Figura 2).
4. Configuración para grabaciones neuronales in vivo con optogenética
NOTA: Esta sección describe los pasos para el registro neuronal agudo con el rastreo optogenético de un circuito cerebral (proyección de la neurona de glutamato VTA al CA1). Si es necesario, verifique el sistema (amplificador y conexiones) para detectar problemas de ruido eléctrico y conexión a tierra antes de comenzar este paso. Realizar este paso en una jaula de Faraday puede ayudar a eliminar el ruido eléctrico en la grabación.
- A las 3 semanas después de la inyección de AAV, anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de uretano (0,2 mg/kg).
PRECAUCIÓN: El uretano es cancerígeno y debe manipularse con precaución mientras se usa equipo de protección. Además, la administración de anestesia con uretano a esta concentración no es supervivencia. - Coloque la cabeza del animal en un marco estereotáctico como se describió anteriormente (paso 2.2, Figura 3A). Realizar una craneotomía para exponer la duramadre (Figura 3A). Utilice una herramienta de perforación (tamaño de broca: 0,8 mm, velocidad: 15.000 rpm) para extraer parte del hueso parietal.
- La craneotomía debe ser de aproximadamente 3 mm x 4 mm de ancho. Aplique gotas de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) sobre esta área para prevenir la sequedad.
- Bajo un microscopio de disección (digital), use una punta de aguja doblada (27 G) para extirpar la duramadre expuesta. Tenga cuidado de no separar la delicada cubierta pial y los tejidos corticales en esta área.
- Perforar un orificio en el hueso occipital (tamaño de la broca: 0,8 mm, velocidad: 10.000 rpm) para sujetar el tornillo de tierra (tornillo Phillips de cabeza de sartén; M0,6 x 2,0 mm).
- Conecte un cable de tierra de acero inoxidable.
NOTA: También se pueden utilizar otros tipos de cables(Figura 3b). - Para la fotoestimulación combinada (VTA) y la grabación neuronal (CA1), utilice un aparato estereotáxico multirraíl equipado con micromanipuladores ultrafinos (10 μm o 1 μm). Monte la fibra óptica y la sonda neuronal de grabación en un micromanipulador de rango de 10 μm y 1 μm de rango, respectivamente.
- Si es necesario, utilice un adaptador de sonda de etapa de cabeza(Figura 3c).
NOTA: En el protocolo actual, se equipó un escenario de cabeza de 32 canales con un adaptador para sostener un electrodo de grabación de 4canales (Figura 3d). El cable de tierra de acero inoxidable se soldó al puerto de conexión a tierra del adaptador.
- Si es necesario, utilice un adaptador de sonda de etapa de cabeza(Figura 3c).
- En coordenadas AP: -3.08 mm ML: 0.5 mm, baje la fibra óptica de 400 μm de diámetro en el VTA.
- Antes de bajar la fibra óptica, conecte la virola a un cable de fibra óptica (con férula de acero inoxidable o cerámica) conectado a una fuente LED acoplada a fibra.
NOTA: Asegúrese de que la intensidad de la luz y el enfoque se ajusten como desee. La elección de la fuente de luz LED debe corresponder a las opsinas a las que se dirige. Aquí, se utilizó un controlador LED de 470 nm (luz azul) para la fotoactivación hChR2(Figura 4a). - Para sincronizar el pulso de luz con la grabación neuronal, conecte el controlador LED y el puerto IN digital del controlador de grabación a un pulser lógico transistor-transistor (TTL)(Figura 4b). Esto se puede lograr utilizando un divisor BNC.
NOTA: El uso de un pulsador TTL proporciona la flexibilidad de configurar digitalmente la frecuencia y la duración deseadas del tren de impulsos. En el protocolo actual, se activaron pulsos de luz de 10 ms a 50 Hz18. Para el control TTL del controlador LED, cambie el controlador a "disparador". En este modo, la intensidad de la luz se puede regular girando la "perilla". La frecuencia de estimulación se puede ajustar para acomodar variables experimentales y puede variar de 1 a 100 Hz. Para el rastreo de circuitos neuronales, se recomienda una frecuencia de estimulación de >20 Hz. - Ajuste la perilla para determinar la intensidad efectiva que puede generar una respuesta sin producir artefactos fotoeléctricos. Si es necesario, reposicionar la fibra óptica para eliminar artefactos19.
NOTA: El controlador LED utilizado para el protocolo actual produce una potencia de luz de ~ 21.8 mW.
- Antes de bajar la fibra óptica, conecte la virola a un cable de fibra óptica (con férula de acero inoxidable o cerámica) conectado a una fuente LED acoplada a fibra.
5. Grabación neuronal
- Use una sonda neural aguda con un vástago de 15 a 50 μm de espesor, que mida al menos 5 mm de longitud.
NOTA: La grabación de estructuras cerebrales profundas requerirá sondas neuronales con un vástago más largo. En el estudio actual, se utilizó una sonda con una longitud de vástago de 20 mm. - Conecte el escenario del cabezal del preamplificador al controlador de grabación mediante un cable de interfaz periférica serie (SPI). Compruebe la iluminación de color de los LED en los puertos del controlador de grabación. Los LED verdes y amarillos indican el voltaje adecuado en la placa del amplificador conectado. El LED rojo indica un control de etapa de cabeza de software en funcionamiento(Figura 5b).
- Usando un micro-manipulador, coloque los sitios de contacto del electrodo en la capa de celda piramidal del CA1 (AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 a 1.2mm).
NOTA: La fibra óptica y el electrodo se pueden colocar en otras regiones del cerebro deseadas para la fotoestimulación y la grabación.
6. Configuración del amplificador y del filtro
- Conecte el sistema amplificador del controlador de grabación a un ordenador a través de un puerto USB 3.0. Conecte el escenario principal al amplificador mediante el cable SPI. Inicie el software del controlador. Si no se conecta correctamente, el sistema mostrará un mensaje de "dispositivo no encontrado".
- Haga clic en Ejecutar para ver la actividad en los canales. Cada forma de onda se traza como el voltaje (eje y) frente al tiempo (eje x). Dependiendo de la región de interés, ajuste las escalas de voltaje y tiempo para ajustar la visualización de la forma de onda.
- Si solo unos pocos canales están activos, deshabilite los canales no utilizados para reducir el tamaño del archivo en el disco de almacenamiento.
- Establezca la frecuencia de muestreo y las frecuencias de corte editando los parámetros de ancho de banda en el software de adquisición. Para la grabación de una sola unidad, establezca las frecuencias de corte superior e inferior en 300 Hz y 5.000 Hz respectivamente. Cambie la frecuencia de muestreo del amplificador a 30 kS/s.
NOTA: La elección de una frecuencia de muestreo alta producirá un tamaño de archivo más grande. - Antes de grabar, compruebe la integridad de los canales de electrodos midiendo la impedancia a 1.000 Hz. Esto se puede hacer iniciando la función en la interfaz de usuario (software del controlador). Un canal de trabajo debe tener un valor de impedancia que oscile entre 0,1 y 5 MΩ.
- Si una salida de audio (altavoz) está conectada al puerto ANALOG OUT, ajuste la ganancia y el silenciador para obtener un sonido de pico óptimo.
- Para mostrar el marcador de tren de pulsos TTL en la grabación de picos, habilite la visualización para el marcador DIGITAL IN. Para grabar la marca de tiempo del tren de pulsos, habilite la visualización del canal DIGITAL IN antes del experimento principal.
NOTA: Por lo general, hay más de un canal "DIGITAL IN" (1 o 2). Asegúrese de que el cable BNC del pulsador TTL esté conectado al puerto "DIGITAL IN" que está seleccionado para su visualización en el software del controlador de grabación. - Para ver en tiempo real la forma de onda del pico, abra la ventana del alcance del pico y establezca el umbral con el clic del mouse.
- Inspeccione el nivel de ruido monitoreando el cuadrado medio de la raíz (RMS en μV). Para una grabación de picos limpia, se prefiere que el umbral de picos neuronales sea de al menos 5x RMS.
- Una vez completada la configuración, seleccione el formato de salida del archivo.
NOTA: Aquí, el pico neuronal CA1 se registró en formato .rhd. También se pueden seleccionar otros formatos de archivo (.rhs y .dat) para que coincidan con los formatos de archivo permitidos por el software de análisis.
7. Grabación y ajustes optogenéticos in vivo
- Abra el software de control de pulsos (TTL) que muestra varios parámetros de pulso ajustables. Seleccione el puerto COM apropiado en el software. Establezca los parámetros de pulso ajustando la configuración de Tren y Grupo.
NOTA: La condición del pulso debe determinarse considerando las variables experimentales y el diseño. - En el software del controlador del amplificador, haga clic en Ejecutar para detectar picos neuronales en el hipocampo o en el área cerebral deseada. Si es necesario, ajuste la profundidad del electrodo para detectar neuronas viables y activas.
- Una vez que se detecta la actividad de voltaje extracelular, observe los picos de referencia durante 15 minutos y monitoree los signos vitales del animal. Además, pruebe el pulso de luz para detectar neuronas sensibles dentro de la región objetivo anatómica CA1 o deseada.
NOTA: Compruebe si hay artefactos fotoeléctricos y elimíne ajustando la intensidad de la luz o la posición de la fibra óptica. - Registre la actividad basal durante ~ 10 minutos antes de activar el pulso de luz a la frecuencia deseada (Figura 5a, b). Esto permitirá comparar las velocidades de disparo o ráfaga con y sin iluminación.
NOTA: En el estudio actual, la actividad basal se registró durante 10 minutos sin iluminación, seguida de la iluminación a 50 Hz(Película 1).
8. Análisis
- Convierta el archivo .rhd en formato de salidaNex 5.
- Nombre de archivo del proceso. Archivo Nex5 en un software de clasificación fuera de línea para detectar trenes ráster de una sola unidad y formas de onda(Figura 5a-b).
- Seleccione el canal deseado en la ventana desplegable.
NOTA: Los datos de picos grabados continuamente se pueden ver en una ventana separada de la OFSS. La escala de tiempo también se puede ajustar. Si se utiliza un tetrodo, el OFSS se puede configurar para ordenar los 4 canales como un tetrodo. - Establezca el nivel de voltaje para la extracción de la forma de onda de cruce de umbral.
PRECAUCIÓN: Use un mínimo de 5x RMS para la detección adecuada de picos. - Detecte formas de onda, luego realice la clasificación de picos utilizando el método de búsqueda de valles (automático) o K-means (semiautomático). Cuando sea necesario, combine unidades que ocupen regiones similares del espacio 3D-Análisis de componentes principales (PCA).
- Exportar ordenado . Archivos Nex5 para su posterior análisis (Figura 5c–d).
NOTA: Los resultados del análisis para el intervalo entre disparos, la velocidad de disparo y la velocidad de ráfaga se pueden exportar a otras plataformas de análisis.
- Seleccione el canal deseado en la ventana desplegable.
9. Detección de fluorescencia de la expresión de AAV
- Después de la grabación, eutanasia al animal en una cámara isoflurano.
- Realizar perfusión transcárdica con PBS de 10 mM (~10 mL), seguido de paraformaldehído tamponado con fosfato al 4% (PB-PFA, ~10 mL).
- Retire todo el cerebro intacto y fójelo en PB-PFA al 4% durante 48 h.
- Transfiera el cerebro fijo a PB-PFA al 4% que contiene 30% de sacarosa para la criopreservación a 4 °C. Después de 72 h, seccione el cerebro en un criostato y monte rodajas en un portaobjetos recubierto de gelatina.
NOTA: En el protocolo actual, se seleccionaron secciones que contienen la parte cerrada del hipocampo (rostral) para demostrar terminales etiquetados con AAV en el DG, CA3 y CA1.
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Representative Results
Rastreo anterógrado
La expresión de AAV se verificó mediante imágenes de inmunofluorescencia de la proteína reportera (eYFP) en el VTA de ratones C57BL/6 21 días después de la inyección(Figura 2). El etiquetado anterógrado exitoso de las proyecciones presinápticas de glutamato VTA en el hipocampo también se verificó mediante la detección de eYFP en las capas de DG, CA3 y CA1 (Figura 6a-d; Películas 2 y 3).
Las proyecciones de glutamato VTA al hipocampo modulan la actividad de CA1
La fotoestimulación de las neuronas VTA glutamato aumentó la actividad de las neuronas CA1 piramidales putativas. Esto es evidente como un aumento en los eventos de aumento durante la fase de encendido de la luz(Película 1)en comparación con la fase de apagado de la luz(Figura 5a-b). Para apoyar este resultado, la comparación estadística de las tasas de disparo de la red CA1 antes (luz apagada; línea de base) y después (luz ENCENDIDA) de la fotoestimulación reveló un aumento significativo para el período posterior a la estimulación(Figura 7a;p = 0,0002). El análisis posterior del tren ráster para detectar ráfagas (2-4 picos en <16 ms) también demuestra un aumento de la tasa de estallido para las neuronas piramidales putativas CA1 después de la fotoestimulación de glutamato VTA(Figura 7b;p = 0.0025). El análisis estadístico (prueba tde Student) se realizó con software estándar. Aquí, la velocidad de disparo o ráfaga de referencia (luz apagada) se comparó con los valores de luz ON (fotoestimulación).
Figura 1: Ilustración esquemática de la inyección de AAV-CaMKII-ChR2-eYFP en el VTA del ratón C57BL/6.
Etiquetado anterógrado de neuronas VTA y proyecciones axonales al hipocampo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de fluorescencia que muestran la expresión AAV-CaMKII-ChR2-eYFP en el VTA y la pista de fibra óptica.
Dk: núcleo de Darkschewitsch, scp: pedúnculo cerebeloso superior, VTA: área tegmental ventral, y RM: núcleo retromamilar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Demostración de la craneotomía, colocación de electrodos y colocación de fibra óptica.
(A) Incisión en la línea media que expone el cráneo (b: bregma, oc: hueso occipital). (B) Colocación del tornillo de tierra (gs) en el hueso occipital y alambre de tierra de acero inoxidable conectado (gw). (C) Posicionamiento estereotáctico de la cánula de fibra óptica (foc: cable de fibra óptica). (D) Posicionamiento estereotáctico de cánula de fibra óptica y vástago de sonda neural (foc: cable de fibra óptica, adp: adaptador, ms: manga de acoplamiento, prs: vástago de sonda, hs: etapa de cabeza). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Conexión dividida BNC para marcas de tiempo combinadas de pulsación de luz y amplificador (disparador).
(A) Demostración de la emisión de luz LED desde la punta de una cánula de fibra óptica. (B) Pulso TTL a través de un adaptador dividido BNC para controlar la grabación led y amplificador de sello de tiempo (ampl). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tren de picos grabado continuamente (datos sin procesar) con detección de una sola unidad.
(A) Captura de pantalla de grabación en bruto del hipocampo de un ratón anestesiado. (B) Iluminación fotográfica impulsada por TTL del VTA en la grabación raw. Las líneas azul claro demuestran las marcas de tiempo para los períodos Light ON (λ = 470nm) y la frecuencia de estimulación. (C–D) Tren de picos grabado continuamente y unidades neuronales derivadas de la clasificación de picos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de fluorescencia representativas que demuestran la expresión de AAV-CaMKII-ChR2-eYFP en el hipocampo.
(A) DG (GCL: capa celular granular, hil: hilus). (B) Parte del CA3 cerca de la DG (SL: estrato lacunoso, pyr: capa celular piramidal). (C) CA3 propiamente dicho. (D) CA1 (así: estrato oriens, pyr: capa celular piramidal, rad: estrato radiculata). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Comparación estadística de la velocidad de disparo antes y después de la fotoestimulación.
(A) Gráfico de barras que demuestra un aumento de la velocidad media de disparo (Hz) para las unidades neuronales piramidales putativas en el CA1 (***p = 0.0002) después de la iluminación fotográfica. (B) Gráfico de barras que demuestra un aumento de la velocidad de estallido de las neuronas CA1 putativas después de la fotoilución (**p = 0,0025). Barra de error: error estándar de media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Grabación de captura de pantalla del controlador del amplificador y el software del pulsador. La película muestra la grabación de línea de base (luz APAGADA) seguida de la fotoestimulación (luz ENCENDIDA, λ = 470 nm) que se indica con marcas de tiempo azules. Haga clic aquí para descargar este video.
Película 2 y Película 3: Ilustración 3D de terminales de glutamato VTA en el DG de un ratón. DAPI-azul: etiqueta nuclear en la capa de célula granular (GCL); eYFP-Green: Terminales AAV etiquetados-VTA en la DG hilus. Haga clic aquí para descargar estos videos.
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Discussion
En la última década, el diseño de las construcciones AAV ha avanzado significativamente. Como tal, se han incorporado más promotores específicos de neuronas en una serie de serotipos AAV para mejorar la especificidad de la transfección14. Al combinar genes para proteínas de fluorescencia, transportadores, receptores y canales iónicos, ahora existen bibliotecas de AAV para imágenes, neuromodulación y detección de actividad sináptica. En construcciones AAV disponibles comercialmente, una combinación de un fluoróforo codificado genéticamente y canales iónicos (opsina) permite un rastreo neuroanatómico y electrofisiológico combinado de los circuitos neuronales14,18,19. Del mismo modo, la selección de un promotor (o método de recombinación cre-lox) puede permitir el rastreo de proyecciones específicas de un tipo de neurona dentro de un circuito. En el estudio actual, este protocolo se implementó para la evaluación anatómica y electrofisiológica de las proyecciones neuronales de glutamato VTA al hipocampo (región CA1).
Circuito neuronal VTA-Hipocampo
El VTA es una parte de la vía mesocorticolímbica del mesencéfalo. Las proyecciones de VTA a las áreas cerebrales involucradas en el aprendizaje de recompensa y aversión se han demostrado ampliamente20,21,22,23,24,25. Mientras que el VTA contiene dopamina, glutamato y neuronas GABA, la población de neuronas dopaminérgicas es anatómicamente dominante. Una función importante del VTA en el aprendizaje de aversión y recompensa se atribuye a una proyección robusta de dopamina VTA al núcleo accumbens y al núcleo dorsal del rafe22,24,25,26,27,28. Aunque las neuronas VTA dopamina y glutamato se proyectan al hipocampo, la función de los terminales de glutamato VTA anatómicamente dominantes está menos estudiada en comparación con los terminales de dopamina VTA en el hipocampo29,30.
El protocolo actual describe el uso de una construcción AAV5 que alberga un fluoróforo (eYFP) y opsina controlada por luz (hChR2) para el mapeo de terminales VTA (glutamato) que expresan CaMKIIα en el hipocampo. Estudios previos han establecido que los terminales de glutamato VTA son anatómicamente dominantes en el hipocampo en comparación con los terminales de dopamina VTA29. Para demostrar los terminales presinápticos de glutamato VTA en el hipocampo, AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP se transfectó en cuerpos celulares neuronales VTA. Esto etiquetó los cuerpos celulares VTA neuronas de glutamato (dentro del VTA) y delineó los terminales de glutamato VTA dentro de las capas del hipocampo.
Aunque los terminales presinápticos de glutamato VTA inerven DG, CA3 y CA1, los resultados muestran variaciones dependientes de capas para estas tres regiones(Figura 6a-d). En la DG, los terminales de glutamato VTA etiquetados con AAV son anatómicamente dominantes en el hilio en comparación con la capa celular granular. En el CA3, los terminales de glutamato VTA son relativamente abundantes en el estrato lacunoso en comparación con la capa celular piramidal y el estrato oriens. Mientras que en el CA1, los terminales de glutamato VTA inervan significativamente las capas dendríticas (estrato oriens y radiatum) en comparación con la capa celular piramidal. El resultado de este estudio también demuestra que la fotoestimulación de los cuerpos celulares neuronales de glutamato VTA modula la actividad de la red neuronal CA1 in vivo. La fotoestimulación de las neuronas VTA glutamato condujo a un aumento significativo en la velocidad de disparo de CA1 y la velocidad de estallido durante la época de la fotoestimulación(Figura 7a-b). Esto concuerne con la distribución anatómica de los terminales de glutamato VTA en las capas dendríticas del CA1(Figura 6d)donde puede ejercer efectos sobre la codificación de la información del hipocampo. En apoyo de esta observación, otros estudios han demostrado que el VTA es un determinante primario de la codificación de la memoria de trabajo del hipocampo, y regula la selección de información que se almacenará en la memoria a largo plazo a través del bucle VTA-hipocampo22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Consideraciones técnicas
Para implementar con éxito este protocolo, la elección de las construcciones AAV debe determinarse en función del tipo de neurona a la que se dirigirá. El investigador debe identificar un promotor adecuado (un producto genético) que sea único para el tipo de neurona a la que se dirigirá. En el estudio actual, se utilizó un promotor de CaMKIIα para impulsar la expresión de eYFP y hChR2 en neuronas que expresan CaMKIIα. Sin embargo, también se puede utilizar un método de recombinación cre-lox. En este caso, se puede expresar un AAV5 de doble floxed en el VTA de ratones CaMKIIα-Cre. Los métodos de expresión basados en promotores y cre-lox también son aplicables a otros tipos de neuronas35,36,37.
El sistema debe ser revisado para detectar ruido eléctrico. Esto se puede hacer evaluando el RMS en el alcance del pico durante una sesión de grabación de prueba. Si es necesario, el sistema y el aparato estereotáctico deben alojarse en una jaula de Faraday, mientras que la conexión a tierra del amplificador está conectada a la jaula. Los sitios de contacto de electrodos se pueden organizar linealmente o un tetrodo. La elección del diseño de la sonda debe determinarse en función del objetivo del experimento. Una matriz lineal detecta neuronas a través de múltiples capas. Las sondas con varias especificaciones de espaciado (en micras) también están disponibles comercialmente. La longitud del vástago y la distancia entre los sitios de contacto de la sonda deben considerarse durante el procedimiento de registro y para el análisis. Cuando se completa la configuración, el pulso de luz debe verificarse durante una grabación de prueba para eliminar los artefactos fotoeléctricos. Esto también se puede optimizar ajustando la posición del electrodo en relación con la profundidad y la ubicación de la fibra óptica.
Limitaciones
Aunque CaMKIIα se expresa principalmente en las neuronas liberadoras de glutamato, la proteína también está presente en algunas poblaciones de neuronas dopaminérgicas que liberan glutamato. Por lo tanto, el uso de AAV5-CaMKIIα etiquetará principalmente las neuronas de glutamato y algunas neuronas de dopamina que expresan CaMKIIα. Los protocolos de fotoestimulación impulsados por LED son asequibles y se pueden ensamblar fácilmente. Sin embargo, es importante tener en cuenta que un protocolo de fotoestimulación impulsado por láser es más efectivo38,39,40. La solución de AAV inyectada en la misma región del cerebro para diferentes animales produce umbrales de expresión variables. Sin embargo, esperar 3 semanas o más después de la inyección puede reducir dicha variación al permitir una transfección óptima. La solución de AAV inyectada en una región del cerebro también puede difundirse a las áreas cerebrales circundantes. Observar el período de espera después de que se haya bajado la aguja, y entre las inyecciones en bolo puede reducir la difusión de la solución AAV desde el sitio de inyección.
En resumen, este método se puede utilizar para rastrear circuitos neuronales en los cerebros de roedores. Aunque el protocolo actual describe el rastreo de circuitos neuronales in vivo en ratones anestesiados, el procedimiento también se puede implementar para el registro crónico en ratones despiertos que se comportan.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo está financiado por CBS Bridging Grant otorgado a OOM. OOM, PAA y AS diseñaron el estudio y realizaron los experimentos. AS y PAA analizaron los resultados. OOM y PAA prepararon el manuscrito. Agradecemos al Dr. Karl Disseroth (Universidad de Stanford) por hacer que el AAV esté disponible para nuestro uso.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
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