Summary
Det aktuella protokollet visar en enkel metod för spårning av ventrala tegmental område (VTA) glutamat projektioner till hippocampus. Fotostimulering av VTA glutamat nervceller kombinerades med CA1 inspelning för att visa hur VTA glutamat terminaler modulerar CA1 förmodade pyramidal avfyrning hastighet in vivo.
Abstract
Optogenetisk modulering av neuronunderpopulationer i hjärnan har gjort det möjligt för forskare att dissekera neurala kretsar in vivo och ex vivo. Detta ger en förutsättning för att bestämma neurontypers roll inom en neural krets och deras betydelse i informationskodning i förhållande till lärande. På samma sätt kan metoden användas för att testa den fysiologiska betydelsen av två eller flera anslutna hjärnregioner hos vakna och sövda djur. Den aktuella studien visar hur VTA glutamat neuroner modulerar avfyrningshastigheten av förmodade pyramidala nervceller i CA1 (hippocampus) av sövda möss. Detta protokoll använder adeno-associerade virus (AAV)-beroende märkning av VTA glutamat nervceller för spårning av VTA presynaptic glutamat terminaler i lagren av hippocampus. Uttryck av ljusstyrd opsin (channelrhodopsin; hChR2) och fluorescensprotein (eYFP) som hyss av AAV-vektorn tillåten anterograde spårning av VTA glutamatterminaler och fotostimulering av VTA glutamat neuroncellkroppar (i VTA). Hög impedans akut kisel elektroder var placerade i CA1 för att upptäcka multi-unit och en enhet svar på VTA fotostimulering in vivo. Resultaten av denna studie visar den lagerberoende fördelningen av presynaptiska VTA glutamat terminaler i hippocampus (CA1, CA3 och DG). Dessutom ökade fototimuleringen av VTA glutamatneuroner avfyrnings- och spränghastigheten för förmodade CA1-pyramidenheter in vivo.
Introduction
Under det senaste decenniet utvecklades en rad genetiska verktyg för att öka specificiteten hos neuron-typ modulering, och kartläggning av komplexa neurala nätverk1. Särskilt neurotropa virus med en inneboende förmåga att infektera och replikera i neuronala celler har distribuerats för att uttrycka eller brinna specifika proteiner i neuron subtyper. När man hyser fluorescensproteiner eller genetiskt kodade synaptiska aktivitetsindikatorer, transfecterade AAV vektorer etikett och avgränsa neurala nätverk över hjärnregioner2,3. Valet av en promotor i AAV-konstruktionen styr uttrycket av vektorn i neurontyper med en viss specificitetsnivå(promotorberoende uttryck). Men genom Cre-lox rekombination, AAV konstruktioner distribueras med större specificitet för neuron märkning4,5,6,7. Observera, fotoaktiverade mikrobiella opsinsiner och fluorescensproteiner förpackade i AAV vektorer kan uttryckas i olika neuron subtyper8, och är idealiska för bildbehandling, neuron-typ kretsspårning och fotomodulering9,10.
AAV konstruerar stereotaktiskt injiceras i en hjärnregion (eller kärna) driver uttrycket av reporterproteinet i soma, dendrite och axons terminaler. Neuralt uttryck av AAV som hyser en reportergen (eYFP) underlättar märkning av neuroncellkroppar och anatomisk spårning av projektioner till och från andrahjärnregioner 11,12,13,14. AAV-eYFP-konstruktioner som bär ljusstyrd opsin (t.ex. hChR2), kan användas som ett verktyg föravbildning 6,15 och stimuleringsbaserad fysiologisk spårning av neurala projektioner för att rikta in sig på hjärnområden in vivo16. Beroende på AAV-serotypen kan neuronmärkningens riktning vara anterograde eller bakåtsträvande11,12. Tidigare studier har visat att AAV5 reser anterogradely i nervceller12. Således ger fotostimulering av cellkroppar som uttrycker hChR2 presynaptiska effekter någon annanstans i hjärnan (målet)17.
Här användes AAV (serotyp 5) med en CaMKIIα promotor för att uttrycka eYFP (reporter) och hChR2 (opsin) i VTA glutamat nervceller och axonal projektioner. Resultaten från denna studie visar den lagerberoende fördelningen av VTA-glutamat presynaptiska terminaler i CA1, CA3 och DG hippocampal regioner. Dessutom ökade fotostimuleringen av VTA glutamatneuroner CA1 multi-unit och en enhet eldningshastigheter in vivo jämfört med baslinjevärden. Detta protokoll använder prisvärda verktyg och kommersiellt tillgänglig programvara som kan öka kvaliteten på data som erhållits från neurala kretsspårningsexperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella och djurhanteringsförfaranden godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Louisiana State University School of Veterinary Medicine.
1. Försöksdjur
- Använd 5–6 veckor gamla möss.
- Hus 3-5 djur per bur under standardförhållanden på 12 h alternerande ljus och mörk cykel. Mat och vatten bör tillhandahållas ad libitum.
2. Kraniotomi och djurberedning
OBS: I det här avsnittet beskrivs pre- och peri-operative procedurer för mus craniotomy. Använd standard stereotaktisk apparat och lämpliga koordinater (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML och Dorsoventral: DV). Se en mushjärna atlas för att bestämma koordinaterna för hjärnans region av intresse.
- Söv möss med intraperitoneal ketamin (100 mg/kg)/xylazin (10 mg/kg) cocktailinjektion. Utför ett tå nyptest för att säkerställa frånvaron av känsla innan operationen påbörjas.
OBS: Alternativt kan Isofluranes anestesi med lämplig näskammare också användas för detta steg. - Fixera försiktigt djurets huvud på stereotaxiska apparaten.
OBS: Det är viktigt att hantera djur med försiktighet under denna process. Kontrollera också andningshastigheten och andra vitala värden innan du fortsätter med kirurgi. Låt djuret vila i ~ 7 min för att minska stress.- Placera en värmeplatta på den stereotaxiska ramen så att djurets kropp ligger på den. Detta hjälper till att upprätthålla kroppstemperaturen och hålla djuret varmt men ut proceduren. Behåll värmedynan för postoperativ vård och återhämtning.
- Använd en klippare för att ta bort hår över hårbotten och rengör huden med en jodlösning.
- Applicera tokiskt lidokain för att blockera känsel i hårbotten.
- Använd en skalpell för att göra ett mellanlinjeskalpssnitt som sträcker sig från frontalen till occipitalregionen.
- Rengör snittområdet med jodlösning och exponera sedan calvaria.
OBS: En liten mängd 3% väteperoxidlösning kan appliceras för att avlägsna periosteum från calvaria. Detta kommer att öka synligheten för landmärken (bregma och lambda) och suturer. - Använd en mushjärnesterotaktisk atlas, bestäm AP- och ML-koordinater i förhållande till bregman.
- För VTA-injektion, placera en ultrafin trubbig nålspruta (t.ex. Neuros spruta) vid koordinaterna AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm i förhållande till knägman.
- Använd ett borrverktyg för att borra ett 1 mm hål (craniotomy) i skallen vid den markerade AP/ML-koordinaten.
OBS: Detta steg kräver en betydande försiktighetsnivå. Minimalt tryck bör appliceras under borrning för att förhindra att borrkrosset krossar hjärnvävnaden. I den aktuella studien var borrkrona 0,8 mm och borrhastigheten inställd på 15 000 varv/min.
VARNING: Om väteperoxid användes vid rengöring av snittet eller kalvarian, se till att lösningen helt avlägsnas eller låt torkan vara helt torr innan du borrar.
3. AAV cocktail injektion
OBS: I det här avsnittet beskrivs processen för AAV-injektion i VTA hos vuxna C57BL/6 möss (23–27 g). Den beskrivna metoden kan användas för AAV injektion i alla hjärn regioner med hjälp av standard stereotaktisk apparat och lämpliga koordinater. För att demonstrera detta protokoll uttrycktes eYFP och hChR2 i VTA glutamatneuroner med hjälp av AAV5-medierad transfection under en CaMKIIα-promotor (figur 1). Cre-lox rekombination kan också användas för detta steg.
- Montera en spruta med ultrafin trubbig nål (32 G; 5 μL kapacitet med 100 nL noggrannhet) på en injektor. Fäst spruthållaren på en mikromanipulator.
OBS: För denna procedur användes en manuell spruthållare, med 1,6 nL kalibrering. En automatiserad injektor kan också användas. - Fyll sprutan med dubbelt destillerat vatten för att rengöra och testa flödet av vätska.
- Tina alikvoter av AAV (serotyp 5) cocktail på is. AAV förvaras bäst vid -80 °C för att bibehålla viral titer för gott uttryck.
- Fyll den monterade sprutan med 1 000 nL AAV-lösning (10 mM i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7.4). Dispensera 10 nL av AAV-lösningen för att bekräfta vätskan innan nålen sänks till ett injektionsställe.
- Använd en mikromanipulator för att sänka nålen stereotaktiskt i önskat djup (DV-koordinat). Efter att nålen har sänkts till önskat djup, låt sprutan sitta kvar i 10 minuter före injektion.
OBS: För denna procedur sänktes nålen i VTA på ett djup (DV) av 4,5 mm från hjärnans pial yta. För andra hjärnområden, använd lämplig dorsoventral koordinat (se mushjärnatlasen). - Injicera 600–800 nL AAV i VTA. Injektionsvolymen kan justeras beroende på målställets storlek.
- Leverera AAV-lösningen med en hastighet av 60 nL/min (3 minuters intervall).
- För att uttrycka eYFP och hChR2 i VTA glutamat nervceller och projektioner, injicera AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
OBS: Cre-lox rekombinationsmetod kan också användas beroende på experimentens mål. - Låt nålen sitta kvar i 15 minuter efter AAV-injektionen. Detta minskar diffusion och återflöde.
- Dra ut sprutnålen och suturera sedan snittet för att stänga såret.
- Administrera antibiotika och smärtstillande medel som en del av den postoperativa vården. Placera musen på en varm vadderad plattform och övervaka djuret tills det är vaken.
OBS: Efter 3 veckors injektion kan AAV-uttryck observeras genom fluorescensdetektering av reporterprotein (eYFP) i mushjärnsektioner. Dessutom kan fototimuleringsexperiment utföras efter 3 veckor (figur 2).
4. Ställ in för neurala in vivo-inspelningar med optogenetik
OBS: Detta avsnitt beskriver stegen för akut neural inspelning med optogenetisk spårning av en hjärnkrets (VTA glutamat neuronprojektion till CA1). Kontrollera vid behov systemet (förstärkare och anslutningar) för elektriska ljud- och jordningsproblem innan du börjar detta steg. Att utföra detta steg i en Faraday-bur kan hjälpa till att eliminera elektriskt brus i inspelningen.
- Vid 3 veckor efter AAV injektion, bedöva möss genom intraperitoneal uretan injektion (0,2 mg/kg).
VARNING: Uretan är cancerframkallande och måste hanteras försiktigt när du bär skyddsutrustning. Att administrera uretananeestesi vid denna koncentration är också icke-överlevnad. - Anbringa djurets huvud på en stereotaktisk ram enligt beskrivningen tidigare (steg 2.2, figur 3A). Utför en kraniotomi för att exponera duran (figur 3A). Använd ett borrverktyg (bitstorlek: 0,8 mm, hastighet: 15 000 varv/min) för att ta bort en del av parietalbenet.
- Craniotomy bör vara ca 3 mm x 4mm bred. Applicera droppar konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) över detta område för att förhindra torrhet.
- Använd en böjd nålspets (27 G) för att punktskatta den exponerade duran under ett dissekeringsmikroskop (digital). Var försiktig så att du inte drar isär det känsliga pialhöljet och närvävnaderna i detta område.
- Borra ett hål i occipitalbenet (bitstorlek: 0,8 mm, hastighet: 10 000 varv/min) för att hålla markskruven (panhuvudets Phillipsskruv; M0,6 x 2,0 mm).
- Anslut en jordtråd i rostfritt stål.
OBS: Andra typer av ledningar kan också användas (figur 3b). - För kombinerad fototimulering (VTA) och neural inspelning (CA1), använd en stereotaxisk apparat med flera skenor utrustade med ultrafina (10 μm eller 1 μm) mikromanipulatorer. Montera den optiska fibern och registrera neural sond på 10 μm-räckvidd respektive 1 μm-räckviddsmikromanipulator.
- Använd vid behov en huvudstegsondadapter (figur 3c).
OBS: I det nuvarande protokollet var en 32-kanalig huvudsteg utrustad med en adapter för att hålla en 4-kanalig inspelningselektrod (Figur 3d). Den rostfria jordtråden löddes till adapterns markanslutningsport.
- Använd vid behov en huvudstegsondadapter (figur 3c).
- Vid koordinering AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, sänk optikfibern med 400 μm diameter i VTA.
- Innan du sänker optikfibern, anslut ferrule till en fiberoptisk kabel (med rostfritt stål eller keramisk ferrule) kopplad till en fiberkopplad LED-källa.
OBS: Se till att ljusintensiteten och fokus ställs in efter önskemål. Valet av LED-ljuskälla bör motsvara de opsiner som riktas. Här användes en LED-drivrutin på 470 nm (blått ljus) för hChR2-fotoaktivering (Figur 4a). - Om du vill synkronisera ljuspulsen med den neurala inspelningen ansluter du LED-drivrutinen och inspelningsstyrenhetens digitala IN-port till en TTL-pulser (Transistor-transistor logic)(figur 4b). Detta kan uppnås med hjälp av en BNC-splitter.
OBS: Användningen av en TTL-pulser ger flexibiliteten att digitalt ställa in önskad pulstågsfrekvens och varaktighet. I det nuvarande protokollet utlöstes 10 ms ljuspulser vid 50 Hz18. För TTL-kontroll av LED-drivrutinen växlar du drivrutinen till "trigger". I detta läge kan ljusintensiteten regleras genom att vrida på "ratten". Stimuleringsfrekvensen kan justeras för att rymma experimentella variabler och kan variera från 1 till 100 Hz. För neural kretsspårning rekommenderas en stimuleringsfrekvens på >20 Hz. - Justera ratten för att bestämma den effektiva intensiteten som kan generera ett svar utan att producera fotoelektriska artefakter. Om det behövs, flytta den optiska fibern för att eliminera artefakter19.
OBS: LED-drivrutinen som används för det aktuella protokollet ger en ljuseffekt på ~ 21,8 mW.
- Innan du sänker optikfibern, anslut ferrule till en fiberoptisk kabel (med rostfritt stål eller keramisk ferrule) kopplad till en fiberkopplad LED-källa.
5. Neural inspelning
- Använd en akut neural sond med ett 15–50 μm tjockt skaft som mäter minst 5 mm i längd.
Obs: Inspelning från djupa hjärnstrukturer kommer att kräva neurala sonder med ett längre skaft. I den aktuella studien användes en sond med 20 mm skaftlängd. - Anslut förförstärkarens huvudsteg till inspelningsstyrenheten via en SPI-kabel (Serial Peripheral Interface). Kontrollera lysdiodernas färgbelysning på inspelningsstyrenhetens portar. Gröna och gula lysdioder indikerar korrekt spänning på det anslutna förstärkarkortet. Röd lysdiod indikerar en fungerande bild-huvudstegkontroll(figur 5b).
- Placera elektrodkontaktplatserna i CA1:s pyramidala cellskikt (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 till 1,2 mm) med hjälp av en mikromanipulatör.
OBS: Den optiska fibern och elektroden kan placeras i andra önskade hjärnregioner för fototimulering och inspelning.
6. Inställningar för förstärkare och filter
- Anslut förstärkarsystemet för inspelningsstyrenheten till en dator via en USB 3.0-port. Anslut huvudsteget till förstärkaren med spi-kabeln. Starta styrenhetens programvara. Om systemet inte är korrekt anslutet visas meddelandet "enheten hittades inte".
- Klicka på Kör om du vill visa aktivitet i kanalerna. Varje vågform ritas som spänning (y-axel) kontra tid (x-axel). Beroende på intresseområde justerar du spännings- och tidsskalor för att justera vågformsdisplayen.
- Om bara ett fåtal kanaler är aktiva inaktiverar du oanvända kanaler för att minska filstorleken på lagringsdisken.
- Ställ in samplingsfrekvensen och brytfrekvenserna genom att redigera bandbreddsparametrar på förvärvsprogrammet. För inspelning med en enhet ställer du in de övre respektive nedre brytfrekvenserna på 300 Hz respektive 5 000 Hz. Ändra förstärkarens samplingshastighet till 30 kS/s.
OBS: Om du väljer en hög samplingshastighet får du en större filstorlek. - Kontrollera elektrodkanalernas integritet innan du spelar in genom att mäta impedans vid 1 000 Hz. Detta kan göras genom att starta funktionen i användargränssnittet (styrenhetsprogram). En arbetskanal ska ha ett impedansvärde som sträcker sig från 0,1 till 5 MΩ.
- Om en ljudutgång (högtalare) är ansluten till ANALOG OUT-porten justerar du förstärkning och ljuddämpare för optimalt spikljud.
- Om du vill visa TTL-pulstågsmarkören i spikinspelningen aktiverar du displayen för digital IN-markören. Om du vill spela in pulstågstidsstämpeln aktiverar du digital in-kanaldisplayen före huvudexperimentet.
OBS: Det finns vanligtvis mer än en "DIGITAL IN" kanal (1 eller 2). Se till att BNC-kabeln från TTL-pulsern är ansluten till "DIGITAL IN"-porten som är vald för visning i inspelningsstyrenhetens programvara. - Om du vill visa vågformen i realtid öppnar du fönstret för spikomfång och anger tröskelvärde med musklicket.
- Inspektera ljudnivån genom att övervaka Rotgenomföringstorget (RMS i μV). För ren spikinspelning är det att föredra att neurala spiktröskeln är minst 5x RMS.
- När installationen är klar väljer du filutmatningsformatet.
OBS: Här registrerades CA1 neural spik i .rhd-format. Andra filformat (.rhs och .dat) kan också väljas för att matcha de filformat som är tillåtna av analysprogramvaran.
7. Optogenetisk inspelning och inställningar in vivo
- Öppna pulsregleringsprogramvaran (TTL) som visar olika justerbara pulsparametrar. Välj lämplig COM-port på programvaran. Ställ in pulsparametrar genom att justera inställningarna för Tåg och Grupp.
OBS: Pulstillståndet bör bestämmas genom att överväga experimentella variabler och design. - Klicka på Kör på förstärkarstyrenhetens programvara för att upptäcka neurala spikar i hippocampus eller önskat hjärnområde. Justera vid behov elektroddjupet för att upptäcka livskraftiga och aktiva nervceller.
- När extracellulär spänningsaktivitet har upptäckts, observera baslinjetoppar i 15 min och övervaka djurets vitala ämnen. Testa också ljuspulsen för att upptäcka responsiva nervceller inom CA1 eller önskad anatomisk målregion.
OBS: Kontrollera om det finns fotoelektriska artefakter och eliminera genom att justera ljusintensiteten eller fiberläget. - Registrera baslinjeaktiviteten i ~10 min innan ljuspulsen utlöses med önskad frekvens (bild 5a,b). Detta möjliggör jämförelse av avfyrnings- eller spränghastigheter med och utan belysning.
OBS: I den aktuella studien registrerades baslinjeaktivitet i 10 minuter utan belysning, följt av belysning vid 50 Hz (Film 1).
8. Analys
- Konvertera RHD-filen till Nex5-utdataformat.
- Bearbeta filnamn. Nex5 fil i en offline sortering programvara för att upptäcka en enhet raster tåg och vågformer (Figur 5a-b).
- Välj önskad kanal i listrutan.
OBS: De kontinuerligt registrerade spikdata kan ses på ett separat fönster i OFSS. Tidsskalan kan också justeras. Om en tetrod används kan OFSS ställas in för att sortera de 4 kanalerna som en tetrode. - Ställ in spänningsnivån för tröskelkorsning vågformsutsugning.
VARNING: Använd minst 5x RMS för korrekt spikdetektering. - Identifiera vågformer och utför sedan spiksortering med metoden valley-seeking (automatic) eller K-means (halvautomatisk). Vid behov sammanfogar enheter som upptar liknande regioner i pca-utrymmet (3D-Principal Component Analysis).
- Exportera sorterad . Nex5 filer för vidare analys (Figur 5c-d).
ANALYSRESULTAT för mellanpikeintervallet, avfyrningshastigheten och spränghastigheten kan exporteras till andra analysplattformar.
- Välj önskad kanal i listrutan.
9. Fluorescensdetektering av AAV-uttryck
- Efter inspelningen avlivar du djuret i en isoflurankammare.
- Utför transkardiell perfusion med 10 mM PBS (~ 10 ml), följt av 4% fosfatbuffrad paraformaldehyd (PB-PFA, ~ 10 ml).
- Ta bort hela hjärnan intakt och fixa den i 4% PB-PFA i 48 h.
- Överför den fasta hjärnan till 4% PB-PFA som innehåller 30% sackaros för kryopreservation vid 4 °C. Efter 72 h, dela upp hjärnan i en kryostat och montera skivor på en gelatinbelagd rutschkana.
OBS: I det aktuella protokollet valdes avsnitt som innehåller den slutna delen av hippocampus (rostral) ut för att demonstrera AAV-märkta terminaler i GD, CA3 och CA1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spårning av anterograde
AAV uttryck kontrollerades av immunofluorescens imaging av reporter protein (eYFP) i VTA av C57BL/6 möss 21 dagar efter injektion (Figur 2). Framgångsrik anterograde märkning av presynaptic VTA glutamat projektioner i hippocampus verifierades också av eYFP detektion i lagren av DG, CA3 och CA1 (Figur 6a-d; Film 2 och 3).
VTA glutamatprojektioner till hippocampus modulerar CA1-aktivitet
Fotostimulering av VTA glutamat nervceller ökade aktiviteten av förmodade pyramidal CA1 nervceller. Detta är uppenbart som en ökning av spikningshändelser under ljuset ON-fasen (Film 1) jämfört med ljuset OFF-fasen (Figur 5a-b). För att stödja detta resultat visade statistisk jämförelse av CA1-nätverkets avfyrningshastigheter före (ljus OFF; baslinje) och efter (lätt PÅ) ljusstimulering en betydande ökning för perioden efter stimulering (figur 7a; p = 0,0002). Efterföljande analys av rastertåget för att upptäcka sprängningar (2-4 spikar i <16 ms) visar också en ökad burst-hastighet för CA1 förmodade pyramidala nervceller efter VTA glutamatfotostimulering (Figur 7b; p = 0,0025). Statistisk (Studentens t-test) analys utfördes med standardprogramvara. Här jämfördes utgångsvärdet (ljus OFF) avfyrnings- eller spränghastigheten med ljus PÅ -värden (fotostimulering).
Bild 1: Schematisk illustration av AAV-CaMKII-ChR2-eYFP injektion i VTA av C57BL/6 mus.
Anterograde märkning av VTA nervceller och axonal projektioner till hippocampus. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Fluorescensbilder som visar AAV-CaMKII-ChR2-eYFP-uttryck i VTA och optisk fiberbana.
Dk: kärnan i Darkschewitsch, scp: överlägsen cerebellar peduncle, VTA: ventralt tegmental område och RM: retromamillary kärnan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Demonstration av kraniotomi, elektrodplacering och optisk fiberplacering.
A)Mittlinjen snitt exponera kraniet (b: bregma, oc: occipital ben). B)Placering av jordskruven (gs) i occipitalbenet och ansluten marktråd i rostfritt stål (gw). (C) Stereotaktisk positionering av optisk fiber kanyl (foc: fiberoptic kabel). (D) Stereotaktisk positionering av optisk fiber kanyl och neural sondskaft (foc: fiberoptisk kabel, adp: adapter, ms: parningshylsa, prs: sondskaft, hs: huvudsteg). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: BNC-delningsanslutning för kombinerade tidsstämplar för ljuspulsering och förstärkare (trigger).
(A) Demonstration av LED-ljusemission från spetsen på en optisk fiber kanyl. (B) TTL puls genom en BNC split adapter för att styra LED och tidsstämpelförstärkare (ampl) inspelning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Kontinuerligt inspelat spiktåg (rådata) med en enhetsdetektering.
(A) Screengrab av rå inspelning från hippocampus av en bedövad mus. (B) TTL-driven fotobelysning av VTA i den råa inspelningen. Ljusblå linjer visar tidsstämplarna för Ljus PÅ (λ = 470nm) perioder och stimuleringsfrekvens. (C–D) Kontinuerligt registrerade spik tåg och neuron enheter härleds genom spik sortering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Representativa fluorescensbilder som visar uttrycket av AAV-CaMKII-ChR2-eYFP i hippocampus.
A)GD (GCL: granulatcellsskikt, hil: hilus). B)Del av CA3 nära GD (SL: stratum lacunosum, pyr: pyramidalcellsskikt). C)Ca3 korrekt. (D)CA1 (så: stratum oriens, pyr: pyramidalcellsskikt, rad: stratum radiculata). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Statistisk jämförelse av avfyrningshastigheten före och efter fototimulering.
(A) Stapeldiagram som visar en ökad genomsnittlig avfyrningshastighet (Hz) för förmodade pyramidala neuronenheter i CA1 (***p = 0,0002) efter fotobelysning. (B) Stapeldiagram som visar en ökad spränghastighet för förmodade CA1-nervceller efter fotobelysning (**p = 0,0025). Felfält: standardfel av medelvärde. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Film 1: Screengrab inspelning av förstärkarens styrenhet och pulser programvara. Filmen visar baslinjeinspelning (ljus OFF) följt av fotostimulering (ljus PÅ, λ = 470 nm) som indikeras med blå tidsstämplar. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Film 2 och film 3: 3D-illustration av VTA glutamatterminaler i en muss DG. DAPI-blå: kärnetikett i det granulära cellskiktet (GCL). eYFP-Green: AAV-märkta VTA-terminaler i GD Hilus. Klicka här för att ladda ner dessa videor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under det senaste decenniet har utformningen av AAV-konstruktioner utvecklats avsevärt. Som sådan har mer neuronspecifika promotors införlivats i en rad AAV serotyper för förbättrad transfection specificitet14. Genom att kombinera gener för fluorescensproteiner, transportörer, receptorer och jonkanaler finns nu bibliotek av AAV för avbildning, neuromodulering och synaptisk aktivitetsdetektering. I kommersiellt tillgängliga AAV-konstruktioner möjliggör en kombination av en genetiskt kodad fluorfor och jonkanaler (opsin) en kombinerad neuroanatomisk och elektrofysiologisk spårning av neuralakretsar 14,18,19. På samma sätt kan valet av en promotor (eller cre-lox rekombinationsmetod) möjliggöra spårning av en neurontypspecifika projektioner inom en krets. I den aktuella studien, detta protokoll distribuerades för anatomiska och elektrofysiologiska bedömning av VTA glutamat neurala projektioner till hippocampus (CA1 regionen).
VTA-Hippocampus neural krets
VTA är en del av midbrain mesocorticolimbic vägen. VTA-projektioner till hjärnområden som är involverade i belöning och aversionsinlärning har visats omfattande20,21,22,23,24,25. Medan VTA innehåller dopamin, glutamat och GABA nervceller, dopamin neuron befolkningen är anatomiskt dominerande. En viktig funktion av VTA i aversion och belöning lärande tillskrivs en robust VTA dopamin projektion till kärnan accumbens och dorsala raphe kärnan22,24,25,26,27,28. Även om VTA dopamin och glutamat nervceller projekt till hippocampus, funktionen av anatomiskt dominerande VTA glutamat terminaler studeras mindre jämfört med VTA dopamin terminaler i hippocampus29,30.
Det nuvarande protokollet beskriver användningen av en AAV5 konstruktion som hyser en fluorophore (eYFP) och ljusstyrd opsin (hChR2) för kartläggning av CaMKIIα-uttrycker VTA (glutamat) terminaler i hippocampus. Tidigare studier har visat att VTA glutamat terminaler är anatomiskt dominerande i hippocampus jämfört med VTA dopamin terminaler29. För att demonstrera VTA glutamat presynaptic terminaler i hippocampus, AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP transfected till VTA neuronal cell organ. Detta märkt cellkropparna VTA glutamat nervceller (inom VTA) och skisserade VTA glutamat terminaler inom lagren av hippocampus.
Även om VTA glutamat presynaptic terminaler innervate DG, CA3 och CA1, visar resultaten lagerberoende variationer för dessa tre regioner (Figur 6a-d). I DG är AAV märkta VTA glutamat terminaler anatomiskt dominerande i hilus jämfört med granulat cell skiktet. I CA3 är VTA glutamat terminaler relativt rikliga i stratum lacunosum jämfört med pyramidal cell lager och stratum oriens. Medan I CA1, VTA glutamat terminaler avsevärt innervate de dendritiska skikten (stratum oriens och radiatum) jämfört med pyramidal cell skiktet. Resultatet av denna studie visar också att fotostimulering av VTA glutamat neuronala cellkroppar modulerar aktiviteten i CA1 neurala nätverket in vivo. Fotostimulering av VTA glutamatneuroner ledde till en betydande ökning av CA1-avfyrningshastigheten och spränghastigheten under fotostimuleringsepoken (Figur 7a-b). Detta överensstämmer med den anatomiska fördelningen av VTA glutamat terminaler i de dendritiska lagren av CA1 (Figur 6d) där det kan utöva effekter på hippocampal information kodning. Till stöd för denna observation har andra studier visat att VTA är en primär determinant för hippocampal arbetsminneskodning och reglerar valet av information som ska lagras i långtidsminne genom VTA-hippocampus-slingan22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Tekniska överväganden
För att framgångsrikt implementera detta protokoll bör valet av AAV-konstruktioner bestämmas baserat på den neurontyp som ska riktas. Forskaren måste identifiera en lämplig promotor (en genprodukt) som är unik för den neurontyp som ska riktas. I den aktuella studien användes en CaMKIIα-promotor för att driva uttrycket av eYFP och hChR2 i CaMKIIα som uttrycker nervceller. En cre-lox rekombinationsmetod kan dock också användas. I detta fall kan en dubbel floxed AAV5 uttryckas i VTA av CaMKIIα-Cre möss. Promotorn och cre-lox baserade uttrycksmetoder är också tillämpliga på andra neurontyper35,36,37.
Systemet bör kontrolleras med avseende på elektriskt brus. Detta kan göras genom att utvärdera RMS i spikomfång under en provinspelningssession. Vid behov bör systemet och stereotaktisk apparat inrymtas i en Faraday-bur, medan förstärkarplatsen är ansluten till buret. Elektrodkontaktplatser kan ordnas linjärt eller en tetrod. Valet av sonddesign bör bestämmas utifrån experimentens syfte. En linjär matris upptäcker nervceller över flera lager. Sonder med olika avståndsspecifikationer (i mikron) finns också kommersiellt tillgängliga. Skaftets längd och avstånd mellan sondens kontaktplatser bör beaktas under inspelningsförfarandet och för analysen. När installationen är klar måste ljuspulsen kontrolleras under en provinspelning för att eliminera fotoelektriska artefakter. Detta kan också optimeras genom att justera elektrodens position i förhållande till optiskt fiberdjup och placering.
Begränsningar
Även om CaMKIIα uttrycks främst i glutamatfrisättande nervceller, proteinet finns också i vissa populationer av dopaminneuroner som samfrisättning glutamat. Således, med hjälp av AAV5-CaMKIIα kommer mestadels att märka glutamat nervceller och vissa dopamin nervceller som uttrycker CaMKIIα. LED-drivna fototimuleringsprotokoll är överkomliga och kan enkelt monteras. Det är dock viktigt att notera att ett laserdrivet fototimuleringsprotokoll är effektivare38,39,40. AAV-lösning injiceras i samma hjärnregion för olika djur ger olika uttryckströsklar. Att vänta i 3 veckor eller mer efter injektionen kan dock minska en sådan variation genom att möjliggöra optimal transfection. AAV-lösning injiceras i en hjärnregion kan också spridas till omgivande hjärnområden. Observera väntetiden efter att nålen har sänkts, och mellan bolusinjektioner kan minska diffusionen av AAV-lösningen från injektionsstället.
Sammanfattningsvis kan denna metod användas för att spåra neurala kretsar i gnagarnas hjärnor. Även om det nuvarande protokollet beskriver in vivo neural kretsspårning i bedövade möss, kan förfarandet också distribueras för kronisk inspelning i vakna beter sig möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av CBS Bridging Grant som tilldelas OOM. OOM, PAA och AS utformade studien och utförde experimenten. AS och PAA analyserade resultaten. OOM och PAA utarbetade manuskriptet. Vi tackar Dr. Karl Disseroth (Stanford University) för att ha gjort AAV tillgängligt för vår användning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G.
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H.
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S.
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V.
