Summary
Questo protocollo descrive la preparazione, i test biotribologici e l'analisi dei cilindri osteocondriali che scivolano contro il materiale implantare metallico. Le misure di risultato incluse in questo protocollo sono l'attività metabolica, l'espressione genica e l'istologia.
Abstract
I difetti osteocondrali nei pazienti di mezza età potrebbero essere trattati con impianti metallici focali. Sviluppati per la prima volta per difetti nell'articolazione del ginocchio, gli impianti sono ora disponibili per la spalla, l'anca, la caviglia e la prima articolazione metatarsalfalangeale. Pur fornendo riduzione del dolore e miglioramento clinico, in molti pazienti si osservano cambiamenti degenerativi progressivi della cartilagine opposta. I meccanismi che portano a questo danno non sono pienamente compresi. Questo protocollo descrive un esperimento tribologico per simulare un accoppiamento metallo su cartilagine e un'analisi completa della cartilagine articolare. Il materiale implantare metallico viene testato contro i cilindri osteocondriali bovini come modello per la cartilagine articolare umana. Applicando carichi diversi e velocità di scorrimento, le condizioni fisiologiche di carico possono essere imitate. Per fornire un'analisi completa degli effetti sulla cartilagine articolare, l'istologia, l'attività metabolica e l'analisi dell'espressione genica sono descritti in questo protocollo. Il principale vantaggio dei test tribologici è che i parametri di carico possono essere regolati liberamente per simulare condizioni in vivo. Inoltre, potrebbero essere utilizzate diverse soluzioni di prova per indagare l'influenza della lubrificazione o degli agenti pro-infiammatori. Utilizzando l'analisi dell'espressione genica per geni specifici della cartilagine e geni catabolici, potrebbero essere rilevati primi cambiamenti nel metabolismo dei condrociti articolari in risposta al carico meccanico.
Introduction
Il trattamento dei difetti osteocondrali è impegnativo e richiede un intervento chirurgico in molti casi. Per le lesioni osteocondrali focali nei pazienti di mezza età, gli impianti metallici focali sono un'opzione praticabile, specialmente dopo il fallimento del trattamento primario, come la stimolazione del midollo osseo (BMS) o l'impianto di condrociti autologi (ACI)1. Le sostituzioni parziali della superficie possono essere considerate procedure di recupero che possono ridurre il dolore e migliorare la gamma dimovimento 2. Questi impianti sono tipicamente composti da una lega CoCrMo e sono disponibili in diverse dimensioni e configurazioni offset per adattarsi alla normale anatomia3. Sebbene inizialmente sviluppati per difetti sul condilo femorale mediale nel ginocchio, tali impianti sono ora disponibili e in uso per l'anca, la caviglia, la spalla e ilgomito 4,5,6. Per un risultato soddisfacente, è fondamentale valutare l'allineamento meccanico delle articolazioni e le condizioni della cartilagine opposta. Inoltre, l'impianto corretto senza sporgenza dell'impianto ha dimostrato di essere fondamentale7.
Studi clinici hanno dimostrato eccellenti risultati a breve termine in termini di riduzione del dolore e miglioramento della funzione nei pazienti di mezza età per varielocalità5,6,8. Rispetto all'impianto di allografto, gli impianti metallici focali consentono il cuscinetto di peso precoce. Tuttavia, la cartilagine articolare opposta ha mostrato un'usura accelerata in un numeroconsiderevole di pazienti 9,10. Quindi, anche con un corretto posizionamento, in molti casi la degenerazione della cartilagine nativa sembra inevitabile, mentre i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Simili cambiamenti degenerativi sono stati osservati dopo l'emiartroplastica bipolare dell'anca11 e sono aumentati con l'attività e ilcarico 12.
Gli esperimenti tribologici offrono la possibilità di studiare tali accoppiamenti in vitro e simulare diverse situazioni di carico che si verificano in condizioni fisiologiche13. L'uso di perni osteocondrali offre un semplice modello geometrico per indagare la tribologia della cartilagine articolare che scivola contro la cartilagine nativao qualsiasi materiale implantare 14 e potrebbe essere ulteriormente utilizzato in interi modelli di simulazionearticolare 15. Gli abbinamenti metallo su cartilagine mostrano un'usura accelerata della cartilagine, disturbi della matrice extracellulare e una ridotta vitalità cellulare nella zona superficiale rispetto a un accoppiamento cartilagineo-cartilagine16. Danni alla cartilagine si sono verificati principalmente sotto forma di delaminazione tra le zone superficiali e centrali17. Tuttavia, i meccanismi che portano alla degenerazione della cartilagine non sono pienamente compresi. Questo protocollo fornisce un'analisi completa dell'attività biosintetica della cartilagine articolare. Con la determinazione dell'attività metabolica e dei livelli di espressione genica dei geni catabolici, potrebbero essere identificate le prime indicazioni per la rottura della cartilagine. Il vantaggio degli esperimenti tribologici in vitro è che i parametri di carico possono essere regolati per imitare varie condizioni di carico.
Pertanto, il seguente protocollo è adatto per simulare un accoppiamento metallo su cartilagine, che rappresenta un modello sperimentale di emiartroplastica.
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Protocol
1. Preparazione di cilindri metallici
- Analizza le aste cilindriche cobalto-cromo-molibdeno (CoCrMo) che soddisfano le specifiche standard per gli impianti chirurgici per la loro composizione chimica utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) con spettroscopia a raggi X dispersiva di energia per protocollo del produttore per confermare i valori forniti.
NOTA: La composizione elementare della lega CoCrMo utilizzata per questo esperimento è 65% Co, 28% Cr, 5% Mo e 2% altri. - Macinare a umido i campioni con carta da macinazione in carburo di silicio a partire da una granulometria di 500. Utilizzare carta da macinazione in ordine crescente fino a una granulometria di 4000.
- Lucidare il cilindro con pasta da 3 μm e 1 μm per ottenere una rugosità superficiale che rientra nel livello di tolleranza dei requisiti di finitura superficiale per gli impianti chirurgici metallici (ISO 5832-12:2019) e impianti di sostituzione totale e parziale delle articolazioni (ISO 21534:2007).
NOTA: La rugosità media della superficie viene determinata utilizzando un microscopio confocale. - Tagliare le aste CoCrMo (Ø di 6 mm) ai cilindri con una lunghezza di 10 mm.
2. Raccolta di cilindri osteocondrali
- Utilizzare le articolazioni soffocanti dei bovini di animali maturi skeletally (di età compresa tra 18 e 24 mesi al momento del sacrificio) e conservarle contenute e raffreddate fino alla dissezione entro 24 ore dal sacrificio.
NOTA: I giunti vengono acquistati dal macellaio locale. Il giunto rimane chiuso fino alla dissezione. - Per raccogliere tappi osteocondrali cilindrici in condizioni asettiche, disinfettare il ginocchio ed eseguire un'artrotomia ed esporre il condilo femorale mediale.
NOTA: La dissezione deve essere eseguita con cautela per non danneggiare la superficie articolare. - Ispezionare la superficie articolare alla ricerca di danni macroscopici.
NOTA: Scartare il campione se la cartilagine manca del suo aspetto biancastro, liscio e lucido o se c'è vesciche, fessure o difetti più grandi. - Allineare il tubo di taglio perpendicolare alla superficie articolare dell'area portante e guidare il dispositivo nella cartilagine e nell'osso subcondrale con colpi sodi con un martello. A una profondità di penetrazione di 15 mm, ruotare il dispositivo in senso orario con un movimento improvviso.
- Rimuovere il dispositivo, inserire la manopola bianca e avvitarla fino a quando non è visibile l'estremità inferiore della spina osteocondrale.
- Contrassegnare l'orientamento anteroposterior dei campioni con un marcatore sterile al fine di disporre di conseguenza il cilindro osteocondrale durante il test.
NOTA: La rete tridimensionale di collagene e la sua complessa architettura facilitano le proprietà meccaniche uniche della cartilagine articolare e devono essere considerate nell'orientamento dei campioni. - Risciacquare il campione con soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) per lavare via sangue e tessuto adiposo.
- Ripetere i passaggi sopra menzionati per raccogliere il numero desiderato di spine osteocondrali (8 mm di diametro, 15 mm di lunghezza).
NOTA: In genere, da 9 a 12 cilindri osteocondriali possono essere raccolti dall'area portante del peso sul condilo femorale mediale. - Posizionare i campioni nel mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale, integrato con antibiotici (penicillina 200 U/mL; streptomicina 0,2 mg/mL) e anfotericina B 2,5 μg/mL e conservarli a 4 °C fino alle prove per mantenere la vitalità.
- Analizzare le spine osteocondrali di controllo immediatamente dopo la raccolta per stabilire i valori di base (vedere la sezione di analisi).
3. Prove tribologicalhe
- Eseguire gli esperimenti utilizzando un tribometro alternativo disponibile in commercio con una configurazione cilindro su piastra. I requisiti per il dispositivo sono il carico verticale e il carico regolabile e la velocità di scorrimento. Inoltre, una cella liquida consente di eseguire i test in una soluzione lubrificante.
- Determinare la pressione di contatto nel sistema CoCrMo-on-cartilage utilizzando una pellicola di misurazione della pressione. Posizionare la pellicola di misurazione della pressione sull'interfaccia e applicare il carico statico per 30 s per determinare la pressione di contatto iniziale, le dimensioni e la forma del contatto. A causa della convessità del cilindro metallico e della cartilagine articolare, l'area di contatto iniziale ha una forma ellittica in questa configurazione.
NOTA: La pellicola di misurazione della pressione reagisce alla pressione applicata mostrando lo scolorimento rosso delle zone in cui la pressione di soglia viene raggiunta o superata. Per 1 N di carico, la pressione di contatto è stata determinata intorno a 2 MPa mediante confronto visivo con pressioni di contatto definite. - Fissare i cilindri osteocondriali sul supporto del campione inferiore con la marcatura allineata con la direzione di scorrimento e montare i cilindri CoCrMo sulla cella di carico superiore.
- Aggiungere la soluzione di prova (PBS con acido ialuronico 3 g/L) nella cella liquida che si traduce nell'immersione del cilindro osteocondrale e nella copertura dell'interfaccia scorrevole metallo-cartilaginea.
- Impostare i parametri di prova (forza normale prescritta, corsa e velocità di scorrimento), che vengono quindi applicati e mantenuti durante la prova.
NOTA: la lunghezza del tratto del movimento alternativo deve essere impostata in base all'area di contatto per creare un'area di contatto migratoria (MCA). Per spine di 8 mm di diametro, una corsa di 2 mm consente un'adeguata reidratazione della cartilagine. - Avviare lo scorrimento reciproco del cilindro CoCrMo contro la cartilagine articolare immersa nella soluzione lubrificante con i parametri di carico impostati.
- Monitorare il coefficiente di attrito (COF) durante gli esperimenti.
NOTA: Il COF viene valutato automaticamente ma può essere calcolato usando l'equazione μ=F/W (μ - coefficiente di attrito; F - forza di attrito; W - carico normale applicato dal sistema). - Terminare l'esperimento dopo il periodo di test desiderato.
- Rimuovere la spina osteocondrale dal portacampioni, sciacquarla con PBS e conservarla in mezzo fino a ulteriori analisi biologiche (vedi sotto).
- Immergere i campioni di controllo nella soluzione di prova a temperatura ambiente per tutta la durata del test e analizzare insieme a campioni che sono stati esposti al carico meccanico.
4. Analisi
NOTA: Il cilindro osteocondrale viene analizzato per l'attività metabolica e l'espressione genica per indagare l'attività biologica; l'istologia viene eseguita per studiare l'integrità della superficie della cartilagine e la matrice sottostante.
- Istologia
- Per l'analisi istologica, immergere le spine osteocondrali in una soluzione di formaldeide tamponata al 4% a temperatura ambiente fino a un'ulteriore lavorazione.
- Risciacquare i campioni con PBS e metterli in un recipiente di plastica.
- Aggiungere un eccesso della soluzione decalcificatore pronta all'uso in modo che tutti i campioni siano coperti.
- Applicare agitazione costante per 4 settimane per la completa decalcificazione.
- Dopo la decalcificazione, incorporare i campioni in glicoli solubili in acqua e resine e conservarli a -80 °C.
- Ottenere sezioni da 6 μm criosezione trasversale all'area di contatto.
- Successivamente, preparare i campioni per la colorazione Safranin O e la controsofferta Fastgreen utilizzando il protocollo di un produttore.
- Acquisire immagini istologiche utilizzando un microscopio e un processo utilizzando il software di elaborazione delle immagini.
- Attività metabolica
NOTA: L'attività metabolica dei condrociti nella cartilagine articolare viene studiata con un saggio tossicologico ex vivo a base di XTT.- Risciacquare la spina osteocondrale utilizzando PBS e posizionare il campione in una piastra di Petri.
- Posizionare una piastra di 24 pozze di pozzo su una scala e azzerare la scala.
- Tagliare la cartilagine dall'innesto osteocondrale con un bisturi in un unico pezzo.
- Bisect la cartilagine in due pezzi uguali in modo che l'area di contatto sia equamente distribuita su entrambi i pezzi di cartilagine e tritare da metà a 1 mm³ pezzi. La seconda metà è usata per l'analisi dell'espressione genica.
- Trasferire la cartilagine tritata in un pozzo della piastra preparata a 24 pozzetti e determinare il peso del tessuto.
- Ripetere i passaggi sopra menzionati per ogni campione e aggiungere 1 mL di mezzo di crescita ad ogni pozzo della piastra.
- Aggiungere la soluzione XTT (490 μL di reagente di etichettatura XTT e 10 μL di reagente di attivazione) secondo le istruzioni e la miscela del produttore.
- Incubare la piastra a 37 °C e 5% CO2 per 4 ore.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il supernatante e trasferirlo in un tubo da 5 ml.
- Estrarre il prodotto tetrazolico aggiungendo 0,5 mL di dimetil solfossido (DMSO) al tessuto cartilagineo nella piastra da 24 po' e applicare un'agitazione continua per 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione DMSO e raggrupparla con la soluzione XTT raccolta in precedenza.
- Trasferire 100 μL del campione in triplicati in una piastra da 96 po' su un lettore di piastre e misurare l'assorbanza ad una lunghezza d'onda di 492 nm e una lunghezza d'onda di riferimento a 690 nm.
- Normalizzare i valori di assorbanza risultanti al peso umido di ogni campione ed eseguire analisi utilizzando il software.
- Analisi dell'espressione genica
- Isolamento dell'RNA
NOTA: L'isolamento dell'RNA viene effettuato utilizzando un kit commerciale(Tabella dei materiali)secondo le istruzioni fornite dal produttore con piccole modifiche.- Tritare la seconda metà del tessuto cartilagineo ottenuto dalla spina osteocondrale in piccoli pezzi.
- Trasferirli in un tubo contenente perline di ceramica e 300 μL di Lysis Buffer (contenente l'1% β-mercaptoetanolo).
NOTA: I campioni possono essere congelati in azoto liquido fino a un'ulteriore lavorazione. - Scongelare i campioni per 2 minuti e utilizzare il liscime commerciale per l'omogeneizzazione del tessuto. Applicare 6500 giri/min per 20 s (fase di omogeneizzazione) quattro volte con una fase di raffreddamento di 2 minuti dopo ogni corsa (a 4 °C utilizzando il dispositivo di raffreddamento del liscigatore commerciale) per interrompere completamente il tessuto.
- Aggiungere 20 μL di proteinasi K e 580 μL di acqua priva di RNasi ad ogni tubo e incubarli a 55 °C per 30 min.
- Centrifugare i campioni per 3 minuti a 10.000 x g e trasferire il supernatante in un tubo da 1,5 ml.
- Aggiungere 0,5 volumi di etanolo al 90% ad ogni tubo e mescolare.
- Trasferire 700 μL del campione in una colonna di legame RNA posta in un tubo di raccolta da 2 ml e centrifugare a 8.000 x g per 15 s.
- Scartare il flusso e ripetere il passaggio di centrifugazione per il lisato completo.
- Aggiungere 350 μL di Buffer RW1 alla colonna, centrifugare a 8.000 x g per 15 s e scartare il flusso.
- Mescolare 10 μL di soluzione stock di DNasi e 70 μL di Buffer RDD. Aggiungere la soluzione alla membrana di purificazione dell'RNA e incubarla a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Aggiungere 350 μL di Buffer RW1 alla colonna e centrifugare a 8.000 x g per 15 s. Scartare il flusso.
- Aggiungere 500 μL di Tampone RPE e centrifuga a 8.000 x g per 15 s. Scartare il flusso.
- Aggiungere 500 μL di Buffer RPE alla colonna di purificazione dell'RNA e centrifugare a 8.000 x g per 2 min.
- Posizionare la colonna in un tubo di raccolta da 1,5 ml e aggiungere 30 μL di acqua priva di RNasi. Centrifuga a 8.000 x g per 1 min.
- Conservare l'RNA isolato a -80 °C fino alla sintesi del cDNA.
- sintesi cDNA
NOTA: Per sintetizzare dna complementare (cDNA) dall'RNA messaggero (mRNA) è stato utilizzato un kit commerciale (Table of Materials). L'RNA del batteriofago MS2 è stato aggiunto per stabilizzare l'RNA isolato durante la sintesi del cDNA.- Scongelare e mescolare i reagenti. La composizione per una singola reazione è illustrata nella tabella 1.
- Aggiungere 16 μL di campione di RNA al volume per una singola reazione (14 μL).
- Eseguire la sintesi di cDNA in un ciclore termico utilizzando i seguenti parametri: 10 min a 25 °C (ricottura del primer), 60 min a 50 °C (sintesi del DNA), 5 min a 85 °C (denaturazione) e 5 min a 20 °C (fase di raffreddamento).
- Conservare cDNA a -20 °C fino alla reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR).
- RT-qPCR
NOTA: Per RT-qPCR di campioni bovini, primer e sonde sono stati progettati utilizzando software qPCR commerciale in tempo reale (ad es. IDT) per i geni GAPDH (Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi), COL2A1 (Collagene tipo 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Collagene tipo 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinasi-1) e MMP-13 (Matrix Metalloproteinasi-13). I primer bovini e le sonde doppie tempra sono stati forniti dall'IDT. I reagenti utilizzati per una singola reazione per valutare l'efficienza e l'espressione genica sono esposti nella tabella 2.- Distribuire la miscela principale di una singola reazione (9 μL) ad ogni pozzo di una piastra PCR da 96 po 'e aggiungere 1 μL di cDNA ad ogni reazione. Eseguire test per ogni campione in triplicati.
- Chiudere la piastra PCR utilizzando olio di tenuta e centrifuga a 877 x g per 10 min a 4 °C.
- Eseguire RT-qPCR utilizzando un ciclore termico di precisione con il seguente protocollo: 95 °C per 10 min, 45 cicli di amplificazione (95 °C per 10 s, ricottura per 30 s, sintesi cDNA) e 37 °C per 30 s.
NOTA: Sono necessarie temperature di ricottura specifiche per ogni primer. - Utilizzare GAPDH insieme ai geni bersaglio per confermare l'efficienza.
- Utilizzare il software fornito per calcolare l'efficienza di ogni gene.
- Normalizzare i valori della soglia di ciclo (CT) all'espressione del gene di riferimento GAPDH e utilizzare il metodo ΔΔCT per la quantificazione.
- Isolamento dell'RNA
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Representative Results
L'area di contatto e la pressione di contatto devono essere confermate utilizzando una pellicola di misurazione della pressione (Figura 1). Le condizioni fisiologiche di carico possono essere confermate confrontandole con le impronte di riferimento per pressioni di contatto definite. Durante il test, il coefficiente di attrito viene monitorato costantemente. Con un'area di contatto migratoria, è possibile mantenere un basso coefficiente di attrito per almeno 1 h (Figura 2). Utilizzando safranina O è possibile determinare la composizione e la struttura della matrice extracellulare (Figura 3). L'intensità della colorazione Safranin O è proporzionale al contenuto di proteoglicano. Fast Green contrasta i siti non collagene e fornisce un chiaro contrasto con la colorazione Safranin O. Il contenuto di proteoglicano varia sulla superficie articolare, ma deve essere uniforme in tutta la sezione tissutale nei campioni di base (figura 3A). I campioni di controllo immersi nella soluzione di prova mostrano l'estrazione di GAG, che può essere contrastatamediante carico meccanico (figura 3B, 3C). L'attività metabolica dei condrociti articolari bovini è indipendente dal sito di raccolta, ma mostra un aumento del carico meccanico rispetto ai controlli scaricati(figura 4). I livelli di espressione genica dei geni specifici della cartilagine (COL2A1, ACAN) aumentano con le condizioni fisiologiche di carico, mentre i geni catabolici (COL1A1 e MMP13) sono upregolati con l'area di contatto stazionaria (Figura 5).
| Volume (μl) | |
| Transcriptor RT Reactions Buffer 5x conc. | 6 |
| Inibitore della RNasi protettore 40U/μl | 0.75 |
| Mix deossinucleotide 10 mM ciascuno | 3 |
| Primer hexamer casuale 600 μM | 3 |
| Transcriptor Reverse Transcriptase 20 U/μl | 0.75 |
| RNA MS2 (0,8 μg/μl) | 0.375 |
| Acqua distillata priva di nucleasi | 0.125 |
| Volume totale | 14 |
Tabella 1: Reagenti per una singola reazione per la sintesi di cDNA.
| Volume (μl) | |
| Master sonda FastStart 2X | 5 |
| Sonda idrolisi 2,5 μM | 1 |
| PrimerGAPDH sinistro 5 μM | |
| Primer destro GAPDH 5 μM | |
| Acqua distillata priva di nucleasi | 3 |
| Mix master totale | 9 |
Tabella 2: Reagenti per il Master Mix per un singolo PCR.
Figura 1: Misurazione dellaassicurazione Pdell'area di contatto iniziale nell'interfaccia metallo-cartilagine prima della prova. A causa della convessità del cilindro metallico e della superficie articolare e delle sue proprietà elastiche, l'area di contatto iniziale è ellittica. Durante lo scorrimento, questa area di contatto iniziale si muove con una corsa di 2 mm, risultando in un'area più ampia esposta al carico meccanico; barra di scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Coefficiente di attrito dipende dal tempo (durata 1 ora) per sette campioni testati a velocità di scorrimento di 8 mm/s e 1 N di carico (pressione di contatto di 2 MPa). Ogni linea colorata rappresenta il COF di un cilindro osteocondrale. La variabilità osservata è entro i limiti per i campioni biologici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sezioni istologiche di campioni osteocondrali bovini macchiati di Safranin-O e Fast Green. (A) I campioni di base mostrano un elevato contenuto di GAG in tutta la cartilagine articolare. (B) Il campione di controllo immerso in una soluzione di prova senza carico meccanico mostra una minore colorazione Safranin-O nella zona centrale, indicazione di un'estrazione di proteoglicani. (C) I campioni testati mostrano un contenuto di GAG più elevato rispetto ai comandi, indicando la stimolazione meccanica; barra di scala = 250 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Attività metabolica dei condrociti articolari bovini dopo prove tribologicalhe con diverse variazioni e controlli di carico. La linea tratteggiata orizzontale rappresenta i livelli di linea di base. Il test non parametrico Kruskal-Wallis è stato eseguito per il confronto tra gruppi di test seguito dal test post hoc di Dunn in caso di significatività. *p < 0,05. Questa cifra è stata modificata da Stotter etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Espressione genica di geni specifici della cartilagine dopo test tribologici con diverse condizioni di carico e controlli. COL2A1=collagene tipo 2; ACAN=aggrecan; COL1A1= collagene di tipo 1; MMP13= matrice metalloproteinasi 13. I livelli di espressione sono stati normalizzati al gene delle pulizie GAPDH (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi). Le linee tratteggiate orizzontali rappresentano i livelli di espressione di base. Il test non parametrico Kruskal-Wallis è stato eseguito per il confronto tra gruppi di test seguito dal test post hoc di Dunn in caso di significatività. *p < 0,05. Questa cifra è stata modificata da Stotter etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli impianti metallici focali rappresentano una procedura di recupero per difetti osteocondrali, specialmente nei pazienti di mezza età e dopo un trattamento primario fallito. Sebbene gli studi clinici hanno dimostrato risultati promettenti a breve termine, una complicanza osservata è il danno alla cartilagine nativaopposta 10. Studi catastali e biomeccanici mostrano chiare prove che un corretto impianto con posizionamento piatto o leggermente incassato mantiene pressioni di contatto naturali19. Gli esperimenti tribologici offrono la possibilità di testare vari accoppiamenti cartilaginei in vitro. In tali condizioni, le condizioni di carico, la lubrificazione, gli accoppiamenti dei materiali e la durata potrebbero essere regolati come desiderato.
La cartilagine bovina è disponibile in alta quantità presso il mattatoio locale. La cellularità e la struttura zonale sono molto simili ai condili femorali umani20. Tuttavia, il contenuto di proteoglicano è specifico del sito, mentre i livelli di espressione genica si sono dimostrati uniformi sulla superficie articolare. In questo protocollo, le spine osteocondrali sono state raccolte dall'area del cuscinetto del peso. Lo spessore della cartilagine, l'architettura del collagene e le conseguenti proprietà tribologica mostrano differenze regionali sulla superficiearticolare 16. È necessario considerare la limitazione dell'utilizzo di spine osteocondrali in una configurazione di carico non definita con una rete di collagene interrotta e una pressurizzazione dei fluidi modificata rispetto a interi modelli articolari.
Nella maggior parte degli studi tribologici, pbs da solo viene utilizzato come soluzione di test per generare dati più robusti. Pbs è una soluzione tampone con osmolarità isotonica e aiuta a mantenere un pH costante durante gli esperimenti biologici. L'utilizzo di PBS con acido ialuronico fornisce lubrificazione al contorno e attritoridotto 21. Di conseguenza, il fluido sinoviale riduce il coefficiente di attrito e migliora la pressurizzazione del fluido rispetto allasoluzione salina 22. Il coefficiente di attrito dipende da varie proprietà del sistema, dimostrate dalla classica curva di Stribeck. La curva di Stribeck mette in relazione il coefficiente di attrito e la viscosità, la velocità e il carico e presenta i regimi di lubrificazione di base: lubrificazione limite, mista e idrodinamica. La lubrificazione al contorno può essere ottenuta solo con PBS come fluido lubrificante, ma i parametri di carico dovrebbero essere regolati di conseguenza. Il COF fornito dai test sono valori medi rispetto alla corsa. Pertanto, si può presumere che durante il ciclo si verifichino diverse condizioni di lubrificazione. Durante lo stallo in posizione di inversione, potrebbero prevalere condizioni limite, mentre la lubrificazione mista potrebbe essere predominante durante lo scorrimento. Sulla base della durata assoluta durante il ciclo di scorrimento, quest'ultimo avrebbe avuto una maggiore influenza sul valore medio del COF.
Per studiare le condizioni fisiologiche che si verificano nelle articolazioni durante le attività quotidiane, le condizioni di carico possono essere regolate di conseguenza nel software tribometrico. Le misurazioni sensibili alla pressione devono essere utilizzate per confermare le pressioni di contatto desiderate. Le pressioni di contatto femorotibiali segnalate variano tra 1 MPa durante la salita e fino a 10 MPa durante la corsa in discesa23. Con un resurfacing focale, le pressioni dell'impianto sono leggermente elevate rispetto alle articolazionisane 24. Le velocità di scorrimento relative riportate durante il ciclo dell'andatura sono riportate fino a 100 mm/s con elevate variazioni durante le diverse fasi. Ciò significa che i movimenti relativi delle articolazioni superano le velocità che possono essere applicate in questa configurazione tribologica. Per imitare le condizioni cinematiche naturali e le pressioni di contatto nelle articolazioni sane del ginocchio, le condizioni di carico variano da 1 a 10 MPa di pressione di contatto e da 5 a 100 mm / s di velocità di scorrimento. Tuttavia, mentre carichi elevati possono essere applicati in questa configurazione sperimentale, la gamma di velocità di scorrimento è limitata. Potrebbero anche essere simulate condizioni patologiche di carico, sia sovraccarico che carichi inadeguati. Basse velocità di scorrimento o carico statico equivalgono all'immobilizzazione, mentre carichi più elevati rappresentano una stimolazione meccanica non fisiologica.
Poiché la digestione enzimatica può influenzare l'espressione di geni specifici della cartilagine, in questo protocollo è descritta un'omogeneizzazione dei tessuti non enzimatici. Durante la sintesi del cDNA, oltre alle istruzioni, l'RNA del batteriofago MS2 viene aggiunto per scopi di stabilizzazione. I livelli di espressione genica, ma non le proteine, sono stati analizzati per rilevare i primi cambiamenti nell'attività biosintetica dei condrociti articolari. Oltre alle sezioni istologiche e all'attività metabolica, questi saggi forniscono informazioni complete sugli effetti del carico meccanico sulla cartilagine articolare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da NÖ Forschungs- und Bildungsges.m.b.H. e il governo provinciale della Bassa Austria attraverso i Life Science Calls (Project ID: LSC15-019) e dal Programma AUSTRIACO COMET (Progetto K2 XTribology, Grant n. 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
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