Summary
Este protocolo describe la preparación, las pruebas biotribológicas y el análisis de cilindros osteocondrales que se deslizan contra el material del implante metálico. Las medidas de resultados incluidas en este protocolo son la actividad metabólica, la expresión génica y la histología.
Abstract
Los defectos osteocondrales en pacientes de mediana edad pueden tratarse con implantes metálicos focales. Desarrollados por primera vez para defectos en la articulación de la rodilla, los implantes ahora están disponibles para el hombro, la cadera, el tobillo y la primera articulación metatarsalfalángica. Al tiempo que proporciona reducción del dolor y mejora clínica, se observan cambios degenerativos progresivos del cartílago opuesto en muchos pacientes. Los mecanismos que conducen a este daño no se entienden completamente. Este protocolo describe un experimento tribológico para simular un emparejamiento de metal sobre cartílago y un análisis exhaustivo del cartílago articular. El material de implante metálico se prueba contra cilindros osteocondrales bovinos como modelo para el cartílago articular humano. Mediante la aplicación de diferentes cargas y velocidades de deslizamiento, las condiciones de carga fisiológicas pueden ser imitadas. Para proporcionar un análisis exhaustivo de los efectos sobre el cartílago articular, la histología, la actividad metabólica y el análisis de la expresión génica se describen en este protocolo. La principal ventaja de las pruebas tribológicas es que los parámetros de carga se pueden ajustar libremente para simular condiciones in vivo. Además, se pueden utilizar diferentes soluciones de prueba para investigar la influencia de la lubricación o agentes proinflamatorios. Mediante el uso de análisis de expresión génica para genes específicos del cartílago y genes catabólicos, se podrían detectar cambios tempranos en el metabolismo de los condrocitos articulares en respuesta a la carga mecánica.
Introduction
El tratamiento de los defectos osteocondrales es exigente y requiere cirugía en muchos casos. Para las lesiones osteocondriales focales en pacientes de mediana edad, los implantes metálicos focales son una opción viable, especialmente después del fracaso del tratamiento primario, como la estimulación de la médula ósea (BMS) o la implantación de condrocitos autólogos (ACI)1. Los reemplazos parciales de superficie se pueden considerar procedimientos de salvamento que pueden reducir el dolor y mejorar el rango de movimiento2. Estos implantes se componen típicamente de una aleación CoCrMo y están disponibles en diferentes tamaños y configuraciones de desplazamiento para que coincida con la anatomía normal3. Mientras que inicialmente desarrollado para defectos en el cóndí femoral medial en la rodilla, tales implantes están ahora disponibles y en uso para la cadera, tobillo, hombro, y codo4,5,6. Para un resultado satisfactorio, es crucial evaluar la alineación mecánica de las articulaciones y la condición del cartílago opuesto. Además, se ha demostrado que la correcta implantación sin protuberancia del implante es fundamental7.
Los estudios clínicos demostraron excelentes resultados a corto plazo en términos de reducción del dolor y mejora de la función en pacientes de mediana edad para varios lugares5,6,8. En comparación con la implantación de aloinjertos, los implantes metálicos focales permiten un rodamiento de peso temprano. Sin embargo, el cartílago articular opuesto mostró un desgaste acelerado en un número considerable de pacientes9,10. Por lo tanto, incluso con la colocación adecuada, en muchos casos la degeneración del cartílago nativo parece inevitable, mientras que los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Cambios degenerativos similares se han observado después de la hemiarthroplastia bipolar de la cadera11 y se incrementan con la actividad y la carga12.
Los experimentos tribológicos ofrecen la posibilidad de estudiar estos emparejamientos in vitro y simular diferentes situaciones de carga que ocurren en condiciones fisiológicas13. El uso de pasadores osteocondrales ofrece un modelo de geometría simple para investigar la tribología del cartílago articular que se desliza contra el cartílago nativo o cualquier material de implante14 y podría utilizarse en modelos de simulación de articulaciones enteras15. Los emparejamientos de metal sobre cartílago muestran un desgaste acelerado del cartílago, una interrupción de la matriz extracelular y una menor viabilidad celular en la zona superficial en comparación con un emparejamiento de cartílago sobre cartílago16. El daño al cartílago se produjo principalmente en forma de delaminación entre las zonas superficial y media17. Sin embargo, los mecanismos que conducen a la degeneración del cartílago no se entienden completamente. Este protocolo proporciona un análisis exhaustivo de la actividad biosintética del cartílago articular. Mediante la determinación de la actividad metabólica y los niveles de expresión génica de los genes catabólicos, se pudieron identificar indicaciones tempranas para la descomposición del cartílago. La ventaja de los experimentos tribológicos in vitro es que los parámetros de carga se pueden ajustar para imitar diversas condiciones de carga.
Por lo tanto, el siguiente protocolo es adecuado para simular un emparejamiento de metal sobre cartílago, que representa un modelo experimental de hemiarthroplastia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de cilindros metálicos
- Analizar las varillas cilíndricas de cobalto-cromo-molibdeno (CoCrMo) cumpliendo con las especificaciones estándar para los implantes quirúrgicos para su composición química utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM) con espectroscopia de rayos X dispersiva de energía por protocolo del fabricante para confirmar los valores proporcionados.
NOTA: La composición elemental de la aleación CoCrMo utilizada para este experimento es 65% Co, 28% Cr, 5% Mo y 2% otros. - Humedezca las muestras con papel de molienda de carburo de silicio a partir de un tamaño de grano de 500. Utilice papel de molienda en orden creciente hasta un tamaño de grano de 4000.
- Pulir el cilindro con pasta de 3 y 1 m para lograr una rugosidad superficial que se encuentra dentro del nivel de tolerancia de los requisitos de acabado superficial para implantes quirúrgicos metálicos (ISO 5832-12:2019) e implantes de reemplazo total y parcial de articulaciones (ISO 21534:2007).
NOTA: La rugosidad media de la superficie se determina mediante un microscopio confocal. - Corte las varillas CoCrMo (o de 6 mm) a cilindros con una longitud de 10 mm.
2. Cosecha de cilindros osteocondrales
- Utilice las articulaciones de asfixia bovina de animales esqueléticamente maduros (de 18 a 24 meses de edad en el momento del sacrificio) y manténgalos contenidos y enfriados hasta la disección dentro de las 24 h después del sacrificio.
NOTA: Las articulaciones se compran al carnicero local. La articulación permanece cerrada hasta la disección. - Para cosechar tapones osteocondral cilíndricos en condiciones asépticas, desinfecte la rodilla y realice una artrototomía y exponga el cóndí femoral medial.
NOTA: La disección debe realizarse con precaución para no dañar la superficie articular. - Inspeccione la superficie articular en busca de daños macroscópicos.
NOTA: Deseche la muestra si el cartílago carece de su aspecto blanquecino, liso y brillante o si hay ampollas, fisuras o defectos más grandes. - Alinee el tubo de corte perpendicular a la superficie articular del área de soporte de peso y conduzca el dispositivo hacia el cartílago y el hueso subcondral por golpes firmes con un martillo. A una profundidad de penetración de 15 mm, gire el dispositivo en el sentido de las agujas del reloj con un movimiento repentino.
- Retire el dispositivo, inserte la perilla blanca y atornille hasta que el extremo inferior del enchufe osteocondral sea visible.
- Marque la orientación anteroposterior de las muestras con un marcador estéril para organizar el cilindro osteocondral en consecuencia durante la prueba.
NOTA: La red de colágeno tridimensional y su compleja arquitectura facilitan las propiedades mecánicas únicas del cartílago articular y deben tenerse en cuenta en la orientación de las muestras. - Enjuague la muestra con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar la sangre y el tejido graso.
- Repita los pasos mencionados anteriormente para cosechar el número deseado de tapones osteocondrales (8 mm de diámetro, 15 mm de longitud).
NOTA: Típicamente, 9 a 12 cilindros osteocondral se pueden cosechar de la zona de cojinete de peso en el cóndí femoral medial. - Colocar las muestras en el medio modificado de Eagle de Dulbecco que contenga un 10% de suero bovino fetal, complementado con antibióticos (penicilina 200 U/ml; estreptomicina 0,2 mg/ml) y anfotericina B 2,5 g/ml y almacenarlas a 4 oC hasta que se realicen pruebas para mantener la viabilidad.
- Analizar los tapones osteocondrales de control inmediatamente después de la cosecha para establecer valores basales (ver sección de análisis).
3. Pruebas tribológicas
- Realice los experimentos utilizando un tribómetro alternativo disponible comercialmente con una configuración de cilindro en placa. Los requisitos para el dispositivo son la carga vertical y la carga ajustable y la velocidad de deslizamiento. Además, una célula líquida permite realizar las pruebas en una solución lubricante.
- Determine la presión de contacto en el sistema CoCrMo-on-cartilage utilizando una película de medición de presión. Coloque la película de medición de presión en la interfaz y aplique la carga estática durante 30 s para determinar la presión de contacto inicial, el tamaño del contacto y la forma. Debido a la convexidad del cilindro metálico y el cartílago articular, el área de contacto inicial tiene una forma elíptica en esta configuración.
NOTA: La película de medición de presión reacciona a la presión aplicada mostrando la decoloración roja de las zonas donde se alcanza o supera la presión umbral. Para 1 N de carga, la presión de contacto se determinó alrededor de 2 MPa en comparación visual con las presiones de contacto definidas. - Fije los cilindros osteocondrales en el soporte de la muestra inferior con el marcado alineado con la dirección deslizante, y monte los cilindros CoCrMo en la celda de carga superior.
- Añadir la solución de prueba (PBS con ácido hialurónico de 3 g/L) a la célula líquida que resulta en sumergir el cilindro osteocondral y cubrir la interfaz deslizante metal-cartílago.
- Establezca los parámetros de prueba (fuerza normal prescrita, carrera y velocidad de deslizamiento), que luego se aplican y mantienen durante toda la prueba.
NOTA: La longitud del trazo del movimiento alternativo debe establecerse de acuerdo con el área de contacto para crear un área de contacto de migración (MCA). Para tapones de 8 mm de diámetro, una carrera de 2 mm permite una adecuada rehidratación del cartílago. - Inicie el deslizamiento recíproco del cilindro CoCrMo contra el cartílago articular sumergido en la solución lubricante con los parámetros de carga establecidos.
- Supervise el coeficiente de fricción (COF) durante los experimentos.
NOTA: El COF se evalúa automáticamente, pero se puede calcular utilizando la ecuación μ-F/W (μ - coeficiente de fricción; F - fuerza de fricción; W - carga normal aplicada por el sistema). - Finalice el experimento después del período de prueba deseado.
- Retire el tapón osteocondral del portacáneo, enjuáguelo con PBS y guárdelo en medio hasta un análisis biológico posterior (ver más abajo).
- Sumerja las muestras de control en la solución de ensayo a temperatura ambiente durante la duración de la prueba y analice junto con las muestras que han sido expuestas a la carga mecánica.
4. Análisis
NOTA: Cilindro osteocondral se analizan para la actividad metabólica y la expresión génica para investigar la actividad biológica; la histología se realiza para estudiar la integridad de la superficie del cartílago y la matriz subyacente.
- Histología
- Para el análisis histológico, sumerja los tapones osteocondral en una solución de formaldehído tamponado del 4% a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento.
- Enjuague las muestras con PBS y colóquelas en un recipiente de plástico.
- Agregue un exceso de la solución descalcificador lista para usar para que todas las muestras estén cubiertas.
- Aplicar agitación constante durante 4 semanas para una descalcificación completa.
- Después de la descalcificación, incrustar las muestras en glicoles y resinas solubles en agua y almacenarlas a 80 oC.
- Obtener secciones de 6 m mediante la criocciones transversales a la zona de contacto.
- Posteriormente, prepare las muestras para la tinción Safranin O y la contramancha Fastgreen utilizando el protocolo de un fabricante.
- Capture imágenes histológicas utilizando un microscopio y procese utilizando un software de procesamiento de imágenes.
- Actividad metabólica
NOTA: La actividad metabólica de los condrocitos en el cartílago articular se investiga con un ensayo toxicológico ex vivo basado en XTT.- Enjuague el tapón osteocondral usando PBS y coloque la muestra en un plato de Petri.
- Coloque una placa de 24 pozos en una escala y cero la escala.
- Cortar el cartílago del injerto osteocondral con un bisturí en una sola pieza.
- Bisect el cartílago en dos piezas iguales para que el área de contacto se distribuya por igual en ambas piezas de cartílago y picar una mitad a 1 mm3 piezas. La segunda mitad se utiliza para el análisis de la expresión génica.
- Transfiera el cartílago picado en un pozo de la placa preparada de 24 pozos y determine el peso del tejido.
- Repita los pasos mencionados anteriormente para cada muestra y agregue 1 ml de medio de crecimiento a cada pozo de la placa.
- Añadir la solución XTT (490 ml de reactivo de etiquetado XTT y 10 l de reactivo de activación) de acuerdo con las instrucciones y la mezcla del fabricante.
- Incubar la placa a 37oC y 5% deCO2 durante 4 h.
- Después de la incubación, retire el sobrenadante y transfiéralo a un tubo de 5 ml.
- Extraiga el producto de tetrazolium añadiendo 0,5 ml de dimetilsólfóxido (DMSO) al tejido del cartílago en la placa de 24 pocillos y aplique agitación continua durante 1 h a temperatura ambiente.
- Quite la solución DMSO y a lagúlela con la solución XTT recopilada anteriormente.
- Transfiera 100 l de la muestra en triplicados en una placa de 96 pocillos en un lector de placas y mida la absorbancia a una longitud de onda de 492 nm y una longitud de onda de referencia a 690 nm.
- Normalice los valores de absorbancia resultantes al peso húmedo de cada muestra y realice análisis utilizando software.
- Análisis de expresión génica
- Aislamiento de ARN
NOTA: El aislamiento del ARN se lleva a cabo utilizando un kit comercial(Tabla de Materiales) deacuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante con pequeñas modificaciones.- Mince la segunda mitad del tejido del cartílago obtenido del tapón osteocondral en trozos pequeños.
- Transfiéralos a un tubo que contenga perlas cerámicas y 300 l de tampón de lísis (que contiene un 1% β-mercaptoetanol).
NOTA: Las muestras se pueden congelar en nitrógeno líquido hasta su posterior procesamiento. - Descongelar las muestras durante 2 min y utilizar el lyser comercial para la homogeneización del tejido. Aplicar 6500 rpm durante 20 s (paso de homogeneización) cuatro veces con una fase de enfriamiento de 2 min después de cada carrera (a 4 oC utilizando el dispositivo de enfriamiento delyser comercial) para interrumpir completamente el tejido.
- Añadir 20 l de proteinasa K y 580 l de agua libre de RNase a cada tubo e incubarlos a 55 oC durante 30 min.
- Centrifugar las muestras durante 3 min a 10.000 x g y transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml.
- Añadir 0,5 volúmenes de etanol al 90% a cada tubo y mezclar.
- Transfiera 700 l de la muestra a una columna de unión de ARN colocada en un tubo de recogida de 2 ml y centrífuga a 8.000 x g para 15 s.
- Deseche el flujo y repita el paso de centrifugación para el lysate completo.
- Agregue 350 l de buffer RW1 a la columna, centrifugar a 8.000 x g para 15 s y deseche el flujo a través.
- Mezcle 10 ml de solución de DNase en stock y 70 l de RDD de búfer. Añadir la solución a la membrana de purificación de ARN e incubarla a temperatura ambiente durante 15 min.
- Agregue 350 l de Tampón RW1 a la columna y centrífuga a 8.000 x g para 15 s. Deseche el flujo a través.
- Añadir 500 l de Tampón RPE y centrífuga a 8.000 x g para 15 s. Deseche el flujo a través.
- Añadir 500 l de Tampón RPE a la columna de purificación de ARN y centrífuga a 8.000 x g durante 2 min.
- Coloque la columna en un tubo de recogida de 1,5 ml y añada 30 l de agua sin RNase. Centrífuga a 8.000 g g durante 1 min.
- Conservar el ARN aislado a -80 oC hasta la síntesis de ADNr.
- Síntesis de ADNC
NOTA: Para sintetizar ADN complementario (ADNc) del ARN mensajero (ARNm) se utilizó un kit comercial (Tabla de materiales). Se añadió ARN de bacteriófago MS2 para estabilizar el ARN aislado durante la síntesis de ADNr.- Descongelar y mezclar los reactivos. La composición de una sola reacción se muestra en la Tabla 1.
- Añadir 16 l de muestra de ARN al volumen para una sola reacción (14 l).
- Realizar la síntesis de ADNC en un ciclor térmico utilizando los siguientes parámetros: 10 min a 25oC (primer annealing), 60 min a 50oC (síntesis de ADN), 5 min a 85oC (desnaturalización) y 5 min a 20oC (fase de enfriamiento).
- Almacene el ADNC a -20 oC hasta la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR).
- RT-qPCR
NOTA: Para RT-qPCR de muestras bovinas, las imprimaciones y sondas se diseñaron utilizando software qPCR comercial en tiempo real (por ejemplo, IDT) para los genes GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate deshidrogenase), COL2A1 (Collagen type 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Collagen type 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) y MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Las imprimaciones bovinas y las sondas de doble enfriamiento fueron proporcionadas por IDT. Los reactivos utilizados para una sola reacción para evaluar la eficiencia y la expresión génica se muestran en la Tabla 2.- Dispensar la mezcla maestra de una sola reacción (9 l) a cada pocero de una placa PCR de 96 pocillos y añadir 1 l de ADNc a cada reacción. Realizar pruebas para cada muestra en triplicados.
- Cierre la placa PCR con aceite de sellado y centrífuga a 877 x g durante 10 min a 4oC.
- Realice RT-qPCR utilizando un ciclor térmico de precisión con el siguiente protocolo: 95 oC durante 10 min, 45 ciclos de amplificación (95 oC para 10 s, recocido para 30 s, síntesis de cDNA) y 37 oC durante 30 s.
NOTA: Se requieren temperaturas de recocido específicas para cada imprimación. - Utilice GAPDH junto con los genes diana para confirmar la eficiencia.
- Utilice el software proporcionado para calcular la eficiencia de cada gen.
- Normalice los valores del umbral de ciclo (CT) a la expresión del gen de referencia GAPDH y utilice el método de LA CT para la cuantificación.
- Aislamiento de ARN
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El área de contacto y la presión de contacto deben confirmarse mediante una película de medición de presión(Figura 1). La condición de carga fisiológica se puede confirmar comparando con las impresiones de referencia para las presiones de contacto definidas. Durante las pruebas, el coeficiente de fricción se controla constantemente. Con un área de contacto de migración, se puede mantener un bajo coeficiente de fricción durante al menos 1 h (Figura 2). Utilizando la tinción de Safranin O se puede determinar la composición y la estructura de la matriz extracelular (Figura 3). La intensidad de la tinción de Safranin O es proporcional al contenido de proteoglicano. Fast Green contrarresta los sitios que no son de colágeno y proporciona un claro contraste con la tinción Safranin O. El contenido de proteoglicano varía según la superficie articular, pero debe ser uniforme en toda la sección del tejido en las muestras basales (Figura 3A). Las muestras de control sumergidas en la solución de prueba muestran la extracción de GAGs, que se pueden contrarrestar mediante carga mecánica(Figura 3B, 3C). La actividad metabólica de los condrocitos articulares bovinos es independiente del lugar de cosecha, pero muestra un aumento con la carga mecánica en comparación con los controles descargados(Figura 4). Los niveles de expresión génica de genes específicos del cartílago (COL2A1, ACAN) aumentan con condiciones de carga fisiológica, mientras que los genes catabólicos (COL1A1 y MMP13) están regulados hacia arriba con área de contacto estacionaria (Figura 5).
| Volumen (l) | |
| Transcriptor RT Reacciones Buffer 5x conc. | 6 |
| Protector Inhibidor RNase 40U/l | 0.75 |
| Mezcla de desoxinucleótido 10 mM cada uno | 3 |
| Hexamer Al azar Primer 600 m | 3 |
| Transcriptor Reverse Transcriptase 20 U/l | 0.75 |
| ARN MS2 (0,8 g/l) | 0.375 |
| Agua destilada sin nucleasas | 0.125 |
| Volumen total | 14 |
Tabla 1: Reactivos para una sola reacción para la síntesis de ADNr.
| Volumen (l) | |
| FastStart Probe Master 2X | 5 |
| Sonda de hidrólisis 2,5 m | 1 |
| PrimerGAPDH izquierdo 5 m | |
| Primer derecho GAPDH 5 m | |
| Agua destilada sin nucleasas | 3 |
| Total Master Mix | 9 |
Tabla 2: Reactivos para la mezcla maestra para un solo PCR.
Figura 1: Medición dela ressure P del área de contacto inicial en la interfaz metal-cartílago antes de la prueba. Debido a la convexidad del cilindro metálico y la superficie articular y sus propiedades elásticas, el área de contacto inicial es elíptica. Durante el deslizamiento, esta área de contacto inicial se mueve con una carrera de 2 mm, lo que resulta en un área más grande que está expuesta a la carga mecánica; barra de escala de 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Coeficiente de fricción dependiente del tiempo (duración 1 hora) para siete muestras analizadas a una velocidad de deslizamiento de 8 mm/s y 1 N de carga (presión de contacto de 2 MPa). Cada línea de color representa el COF de un cilindro osteocondral. La variabilidad observada está dentro de los límites de las muestras biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Secciones histológicas de muestras osteocondrales bovinas teñidas con Safranin-O y Fast Green. (A) Las muestras de línea base muestran un alto contenido de GAG en todo el cartílago articular. (B) Muestra de control sumergida en solución de ensayo sin carga mecánica muestran menos tinción Safranin-O en la zona media, indicando una extracción de proteoglicanos. (C) Las muestras probadas muestran un mayor contenido de GAG en comparación con los controles, lo que indica estimulación mecánica; barra de escala de 250 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Actividad metabólica de los condrocitos articulares bovinos después de las pruebas tribológicas con diferentes variaciones y controles de carga. La línea de puntos horizontal representa los niveles de línea base. La prueba no paramétrica Kruskal-Wallis se realizó para la comparación entre grupos de prueba seguidos de la prueba post hoc de Dunn en caso de importancia. *p < 0.05. Esta cifra ha sido modificada de Stotter et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Expresión génica de genes específicos del cartílago después de pruebas tribológicas con diferentes condiciones de carga y controles. COL2A1-colágeno tipo 2; ACAN-aggrecan; COL1A1- colágeno tipo 1; Matriz MMP13 metaloproteinasa 13. Los niveles de expresión se normalizaron al gen de limpieza GAPDH (glicerilhído 3-fosfato deshidrogenasa). Las líneas de puntos horizontales representan niveles de expresión de línea base. La prueba no paramétrica Kruskal-Wallis se realizó para la comparación entre grupos de prueba seguidos de la prueba post hoc de Dunn en caso de importancia. *p < 0.05. Esta cifra ha sido modificada de Stotter et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los implantes metálicos focales representan un procedimiento de rescate para defectos osteocondrales, especialmente en pacientes de mediana edad y después de un tratamiento primario fallido. Aunque los estudios clínicos demostraron resultados prometedores a corto plazo, una complicación observada es el daño al cartílago nativo opuesto,10. Los estudios de cadáveres y biomecánicos muestran evidencia clara de que la implantación adecuada con posicionamiento plano o ligeramente empotrada mantiene las presiones de contacto naturales19. Los experimentos tribológicos ofrecen la posibilidad de probar varios emparejamientos de cartílago in vitro. En tales condiciones de carga, la lubricación, los emparejamientos de materiales y la duración pueden ajustarse según se desee.
El cartílago bovino está disponible en gran cantidad en el matadero local. La celularidad y la estructura zonal son muy similares a los cónciles femorales humanos20. Sin embargo, el contenido de proteoglicano es específico del sitio, mientras que los niveles de expresión génica han demostrado ser uniformes sobre la superficie articular. En este protocolo, los tapones osteocondral fueron cosechados del área del cojinete de peso. El grosor del cartílago, la arquitectura del colágeno y las propiedades tribológicas resultantes muestran diferencias regionales sobre la superficie articular16. La limitación del uso de tapones osteocondral en una configuración de carga no confinada con una red de colágeno interrumpida y la presurización de fluidos cambiada en comparación con modelos de articulaciones enteras deben ser considerados.
En la mayoría de los estudios tribológicos, PBS solo se utiliza como solución de prueba para generar datos más robustos. PBS es una solución tampón con osmolaridad isotónica y ayuda a mantener un pH constante durante los experimentos biológicos. El uso de PBS con ácido hialurónico proporciona lubricación límite y fricción reducida21. En consecuencia, el líquido sinovial reduce el coeficiente de fricción y mejora la presurización del fluido en comparación con la solución salina22. El coeficiente de fricción depende de varias propiedades del sistema, demostradas por la clásica curva Stribeck. La curva Stribeck relaciona el coeficiente de fricción y la viscosidad, la velocidad y la carga y presenta los regímenes básicos de lubricación: límite, lubricación mixta e hidrodinámica. La lubricación de límites se puede obtener solo con PBS como fluido lubricante, pero los parámetros de carga tendrían que ajustarse en consecuencia. El COF entregado a partir de las pruebas son valores medios sobre el accidente cerebrovascular. Por lo tanto, se puede suponer que se producen diferentes condiciones de lubricación durante el ciclo. Durante el estancamiento en la posición de inversión, las condiciones límite podrían ser prevalecientes, mientras que la lubricación mixta podría ser predominante durante el deslizamiento. Sobre la base de la duración absoluta durante el ciclo de deslizamiento, este último habría tenido más influencia en el valor medio de COF.
Para investigar las condiciones fisiológicas que ocurren en las articulaciones durante las actividades diarias, las condiciones de carga se pueden ajustar en consecuencia en el software del tribómetro. Se deben utilizar mediciones sensibles a la presión para confirmar las presiones de contacto deseadas. Las presiones de contacto femorbiales notificadas oscilan entre 1 MPa durante el pie y hasta 10 MPa durante el descenso23. Con un rejuvenecimiento focal, las presiones del implante son ligeramente elevadas en comparación con las articulaciones sanas24. Las velocidades de deslizamiento relativas notificadas durante el ciclo de marcha se notifican hasta 100 mm/s con altas variaciones durante las diferentes fases. Esto significa que los movimientos relativos de las articulaciones superan las velocidades que se pueden aplicar en esta configuración tribológica. Para imitar las condiciones cinemáticas naturales y las presiones de contacto en articulaciones de rodilla sanas, las condiciones de carga varían de 1 a 10 MPa de presión de contacto y de 5 a 100 mm/s de velocidad de deslizamiento. Sin embargo, mientras que las cargas altas se pueden aplicar en esta configuración experimental, el rango de velocidades de deslizamiento es limitado. También se pueden simular condiciones de carga patológicas, tanto sobrecarga como cargas inadecuadas. Las bajas velocidades de deslizamiento o la carga estática equivalen a la inmovilización, mientras que las cargas más altas representan estimulación mecánica no fisiológica.
Como la digestión enzimática puede afectar la expresión de genes específicos del cartílago, en este protocolo se describe una homogeneización de tejido nozymático. Durante la síntesis de ADNc, además de las instrucciones, se añade ARN de bacteriófago MS2 para fines de estabilización. Los niveles de expresión génica, pero no las proteínas, se analizaron para detectar los primeros cambios en la actividad biosintética de los condrocitos articulares. Además de las secciones histológicas y la actividad metabólica, estos ensayos proporcionan información completa sobre los efectos de la carga mecánica en el cartílago articular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por la empresa de la empresa, la empresa.m.b, la empresa, la empresa, la que ha sido financiada por la empresa de la empresa. y el gobierno provincial de la Baja Austria a través de las Llamadas de Ciencias de la Vida (ID de Proyecto: LSC15-019) y por el Programa COMET austriaco (Proyecto K2 XTribology, Subvención No 849109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | A-2942-100ML | |
| buffered formaldehyde solution 4% | VWR | 97131000 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) | Roche Diagnostics | 11465015001 | XTT-based ex vivo toxicology assay |
| CoCrMo raw material | Acnis International | CoCrMo rods 6mm in diameter | |
| CryoStar NX70 Cryostat | Thermo Fischer Scientific | cryosectioning device | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sidma-Aldrich Chemie | D 2438-10ML | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | medium | |
| fetal bovine serum | Gibco | ||
| Hyaluronic acid | Anika Therapeutics Inc. | component of lubricating solution | |
| iCycler | BioRad | thermal cycler | |
| Leica microscope DM?1000 | Leica | microscope for histology | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Diagnostics | ||
| LightCycler 96 | Roche Diagnostics | thermal cycler for PCR | |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche Diagnostics | 3358941001 | |
| Osteochondral Autograft Transfer System (OATS) | Arthrex Inc. | cutting tube for harvesting osteochondral cylinders | |
| osteosoft | Merck | 1017279010 | decalcifier-solution |
| Penicillin /Streptomycin | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | P4333-100ML | |
| phosphate?buffered saline | Sigma?Aldrich Chemie GmbH | PBS | |
| Prescale Low Pressure | Fujifilm | pressure indicating film | |
| RNeasy Fibrous Tissue Kit | QIAGEN | 74404 | |
| Synergy 2 | BioTek Instruments | plate reader | |
| Tetra?Falex MUST | Falex Tribology | Tribometer | |
| Tissue? Tek O.C.T. | SAKURA | 4583 | embedding formulation |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche Diagnostics | 40897030001 | |
| β-mercaptoethanol | Sidma-Aldrich Chemie | M3148 |
References
- Zengerink, M., Struijs, P. A. A. A., Tol, J. L., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 18 (2), 238-246 (2009).
- Aurich, M., et al. Behandlung osteochondraler Läsionen des Sprunggelenks: Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Klinische Geweberegeneration der DGOU. Zeitschrift fur Orthopadie und Unfallchirurgie. 155 (1), 92-99 (2017).
- Van Bergen, C. J. A., Zengerink, M., Blankevoort, L., Van Sterkenburg, M. N., Van Oldenrijk, J., Van Dijk, C. N. Novel metallic implantation technique for osteochondral defects of the medial talar dome. Acta Orthopaedica. 81 (4), 495-502 (2010).
- Sweet, S. J., Takara, T., Ho, L., Tibone, J. E. Primary Partial Humeral Head Resurfacing. The American Journal of Sports Medicine. 43 (3), 579-587 (2015).
- Becher, C., et al. Minimum 5-year results of focal articular prosthetic resurfacing for the treatment of full-thickness articular cartilage defects in the knee. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 131 (8), 1135-1143 (2011).
- Lea, M. A., Barkatali, B., Porter, M. L., Board, T. N. Osteochondral Lesion of the Hip Treated with Partial Femoral Head Resurfacing. Case Report and Six-Year Follow-up. HIP International. 24 (4), 417-420 (2018).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Paessler, H. H., Skrbensky, G. Effects of a contoured articular prosthetic device on tibiofemoral peak contact pressure: a biomechanical study. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 16 (1), 56-63 (2007).
- Malahias, M. -A., Chytas, D., Thorey, F. The clinical outcome of the different HemiCAP and UniCAP knee implants: A systematic and comprehensive review. Orthopedic Reviews. 10 (2), (2018).
- Dhollander, A. A. M., et al. The use of a prosthetic inlay resurfacing as a salvage procedure for a failed cartilage repair. Knee Surgery, Sports Traumatology. 23 (8), 2208-2212 (2014).
- Van Bergen, C. J. A. A., van Eekeren, I. C. M. M., Reilingh, M. L., Sierevelt, I. N., van Dijk, C. N. Treatment of osteochondral defects of the talus with a metal resurfacing inlay implant after failed previous surgery. Bone and Joint Journal. 95 (12), 1650-1655 (2013).
- Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Kim, Y. S. Y. -H. H. Y. -S., Hwang, K. -T. T., Choi, I. -Y. Y. The cartilage degeneration and joint motion of bipolar hemiarthroplasty. International Orthopaedics. 36 (10), 2015-2020 (2012).
- Moon, K. H., et al. Degeneration of Acetabular Articular Cartilage to Bipolar Hemiarthroplasty. Yonsei Medical Journal. 49 (5), 716-719 (2008).
- Wimmer, M. A., Pacione, C., Laurent, M. P., Chubinskaya, S. In vitro wear testing of living cartilage articulating against alumina. Journal of Orthopaedic Research. , (2016).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Simple geometry tribological study of osteochondral graft implantation in the knee. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 232 (3), 249-256 (2018).
- Bowland, P., Ingham, E., Fisher, J., Jennings, L. M. Development of a preclinical natural porcine knee simulation model for the tribological assessment of osteochondral grafts in vitro. Journal of Biomechanics. 77, 91-98 (2018).
- Trevino, R. L., et al. Establishing a live cartilage-on-cartilage interface for tribological testing. Biotribology. 9, 1-11 (2017).
- Oungoulian, S. R., et al. Wear and damage of articular cartilage with friction against orthopedic implant materials. Journal of Biomechanics. 48 (10), 1957-1964 (2015).
- Stotter, C., et al. Effects of Loading Conditions on Articular Cartilage in a Metal-on-Cartilage Pairing. Journal of Orthopaedic Research. 37 (12), 2531-2539 (2019).
- Becher, C., Huber, R., Thermann, H., Tibesku, C. O., von Skrbensky, G. Tibiofemoral contact mechanics with a femoral resurfacing prosthesis and a non-functional meniscus. Clinical biomechanics. 24 (8), Bristol, Avon. 648-654 (2009).
- Temple, D. K., Cederlund, A. A., Lawless, B. M., Aspden, R. M., Espino, D. M. Viscoelastic properties of human and bovine articular cartilage: a comparison of frequency-dependent trends. BMC Musculoskeletal Disorders. , 1-8 (2016).
- Caligaris, M., Ateshian, G. A. Effects of sustained interstitial fluid pressurization under migrating contact area, and boundary lubrication by synovial fluid, on cartilage friction. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (10), 1220-1227 (2008).
- Burris, D. L., Ramsey, L., Graham, B. T., Price, C., Moore, A. C. How Sliding and Hydrodynamics Contribute to Articular Cartilage Fluid and Lubrication Recovery. Tribology Letters. 67 (2), 1-10 (2019).
- Mamat, N., Nor, M. Numerical measurement of contact pressure in the tibiofemoral joint during gait. International Conference on Biomedical Engineering (ICoBE). , 27-28 (2012).
- Manda, K., Ryd, L., Eriksson, A. Finite element simulations of a focal knee resurfacing implant applied to localized cartilage defects in a sheep model. Journal of Biomechanics. 44 (5), 794-801 (2011).
