Summary
פרוטוקול זה נועד להפוך מדידות AFM לאוטומטיות על מאות תאים מיקרוביאליים. ראשית, מיקרואורגניזמים משותקים למיקרו-מבנים של חותמות PDMS ולאחר מכן מאלצים מדידות ספקטרוסקופיה להתבצע באופן אוטומטי על מאות תאים משותקים.
Abstract
השיטה המוצגת במאמר זה נועדה להפוך את ניסויי Bio-AFM לאוטומטיים ואת הקלטת עקומות הכוח. באמצעות שיטה זו, ניתן להקליט עקומות כוחות על 1000 תאים ב 4 שעות באופן אוטומטי. כדי לשמור על זמן ניתוח של 4 שעות, מספר עקומות הכוח לכל תא מצטמצם ל- 9 או 16. השיטה משלבת תוכנית מבוססת Jython ואסטרטגיה להרכבת תאים על בסיס דפוסים מוגדרים. התוכנית, מיושם על Bio-AFM מסחרי, יכול למרכז את הקצה על התא הראשון של המערך ולאחר מכן להעביר, באופן אוטומטי, מתא לתא תוך הקלטת עקומות כוח על כל תא. באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן לגשת לפרמטרים הביופיזיים של התאים כגון קשיחותם, תכונות הדבק שלהם וכו '. עם האוטומציה ומספר גדול של תאים מנותחים, אפשר לגשת להתנהגות של אוכלוסיית התא. זוהי פריצת דרך בתחום הביו-AFM שבו הנתונים תועדו עד כה על כמה עשרות תאים בלבד.
Introduction
עבודה זו מספקת מתודולוגיה לביצוע מדידות כוח אוטומטיות על מאות תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הוא גם מספק שיטה לשיתוק מיקרואורגניזמים על חותמת מיקרו-מבנה PDMS התואמת לניסויי AFM שנערכו בסביבה נוזלית.
Bio-AFM היא טכנולוגיה מיוחדת מאוד הגה עבור יישומים בביולוגיה ולאחר מכן משמש לחקר תאים חיים. זה דורש מהנדס מיומן שיכול לנתח תא אחד באותו הזמן. בתנאים אלה, מספר התאים השונים שניתן לנתח הוא קטן למדי, אופייני 5 עד 10 תאים ב 4-5 שעות. עם זאת, כמות מדידות כוח נרשם על תא אחד הם בדרך כלל גבוה מאוד והוא יכול בקלות להגיע 1000. לפיכך, הפרדיגמה הנוכחית של מדידות כוח AFM על תאים חיים היא לתעד מאות עקומות כוח (FCs) אבל על מספר מוגבל של תאים.
סטטיסטית, גישה זו מוטלת בספק, ומעלה את סוגיית הייצוג של המדגם. אכן, קשה, למשל, להעריך את ההטרוגניות של אוכלוסיית התאים על ידי מדידת תאים בודדים בלבד, גם אם נרשמות מאות מדידות על תאים מעטים אלה. עם זאת, על בסיס פרדיגמה זו נעשו התקדמות משמעותית בביופיזיקה, מיקרוביולוגיה וננו-רפואה1,2,3. ואכן, ניתוח ננומטר בקנה מידה של תאים בודדים סיפק מידע חדש על nanomechanics הסלולר, על הארגון של חלבונים transmembrane, או מנגנון הפעולה של תרופות מיקרוביאלית או נגד סרטן4,5,6,7. לאחרונה, עם זאת, מספר בדיקות ביומכניות תפוקה גבוהה שנערכו על תאים הופיעו8, מראה את העניין של הקהילה המדעית בשינוי פרדיגמה זו וגישה הטרוגניות אוכלוסיית התא. בדיקות אלה מסתמכות כולן על מערכות מיקרופלואידיות כדי לעוות תאים ולמדוד אופטית את העיוות שלהם תחת לחץ כדי להשיג מדד עקיף של גמישות פני השטח הכוללת שלהם8. עם זאת, בעיה חשובה בשיטות אלה היא שהן מונו-פרמטריות: ניתן לחקור רק גמישות תאים. יתר על כן, הם אינם מאפשרים מדידה של הפרמטרים המכניים של תאים חסידים, אשר יכול להיות מגביל למחקרים של תאי יונקים noncirculating או biofilms למשל.
גישות המערבות AFM פותחו על ידי הצוותים של S. Scheuring9 ו M. Favre10. Scheuring et al. תאים משותקים על דפוסי fibronectin9, מכריח תאים בודדים לקחת את הצורה של התבנית9. לאחר מכן צוות זה מיפה את המאפיינים המכניים של כמה תאים כדי להגדיר נתונים ממוצעים, המייצגים 14 עד 18 תאים. הפיתוח שבוצע על ידי Farve et al. שמטרתו מולטיפלקס המדידות על ידי מקבילות AFM cantilevers10. למיטב ידיעתנו, עבודה זו בכיוון מולטיפלקסים לא הובילה למדידות על תאים חיים.
גישה מעניינת המוצעת על ידי הצוות של Dujardin מציג AFM אוטומטי מסוגל לזהות תאים הדמיה אותם בתחתית בארות בהתאמה אישית. למרות שיטה זו אינה מאפשרת ניתוח של אוכלוסייה גדולה של תאים, זה מאפשר בדיקה אוטומטית של תנאים שונים בכל באר11.
המטרה שלנו בעבודה זו היא שאפתנית יותר שכן רצינו למדוד לפחות 1000 תאים כדי לגשת לא תא ממוצע, אבל, להיפך, את ההטרוגניות בין התאים. האסטרטגיה שפיתחנו כאן כדי לגשת להטרוגניות של אוכלוסיית התאים באמצעות AFM מבוססת על ניתוח של מאות תאים שעליהם נרשם מספר מוגבל של עקומות כוח. בהשוואה לגישה "הקלאסית" של רישום מספר רב של עקומות כוח על מספר מצומצם של תאים, גישה זו צריכה להיחשב כמשלים שכן היא אינה מספקת את אותו מידע. ואכן, בעוד השיטה האופיינית מאפשרת לאדם לחקור הטרוגניות משטח תא בודד, באמצעות הגישה שלנו, אנו מסוגלים לגשת הטרוגניות אוכלוסיית התא כולו. כדי להשיג מטרה זו, שילבנו שיטה שמשתקת ישירות מיקרואורגניזמים (כאן מיני השמרים קנדידה אלביקנס) לבארות של חותמת מיקרו-בנייה של PDMS12, ומפתחת תוכנית מקורית להעברת קצה AFM, באופן אוטומטי, מתא לתא13 ומדידת התכונות המכאניות של כל תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות תאים מיקרוביאלית
- להחיות תאים ממלאי גליצרול.
הערה: C. אלביקנים מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס במלאי גליצרול, על גולות.- בחרו שיש במלאי של -80 מעלות צלזיוס ושפשפו אותו על שמרי פפטון דקסטרוז (YPD) אגר. לגדל את התאים במשך 2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס, לפני טיפוח נוזלי.
- הכינו תרביות נוזליות.
- מלא צינור תרבות עם 5 מ"ל של מרק YPD סטרילי ולהוסיף מושבה אחת של C. אלביקנס תאים, גדל על צלחת אגר YPD.
- לגדל את התרבות בתנאים סטטיים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 20 שעות לפני הקציר על ידי צנטריפוגה (4000 x גרם,5 דקות). השלך את supernatant ולחסל כמו פסולת biohazard.
- לשטוף את כדורי 2x עם 10 מ"ל של חוצץ אצטט (8 מ"מ נתרן אצטט, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5.2). צנטריפוגה (4000 x גרם,5 דקות) בין שטיפה.
- Resuspend גלולה ב 2 מ"ל של מאגר אצטט ולהשתמש בפתרון זה עבור קיבוע תאים על חותמת PDMS.
הערה: לא ניתן לאחסן השעיה זו ויש להכין אותה טרי לסעיף 3.
2. הכנת בול PDMS
- הכנת עובש מאסטר סיליקון
- צייר את המיקרו-מבנים הרצויים באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD).
הערה: בארות תוכנן צריך להיות בגודל דומה לחיידק ללכוד. העיצוב אמור לספק מטריצה גדולה של בארות 100 x 100 ברשימה. עדיף לעשות כמה מערכים עם גדלים שונים במקצת סביב הגודל הממוצע של החיידק. - אם יש חדר נקי, בצע את שלבים 2 עד 12 של פרוטוקול12שפורסם בעבר . אחרת, עובש מאסטר סיליקון ניתן לרכוש ממתקני חדר נקי מסחרי.
- צייר את המיקרו-מבנים הרצויים באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD).
- יציקת חותמות PDMS
- הכן 55 גרם של פתרון pDMS prepolymer המכיל תערובת של 10 עד 1, יחס מסה, של אוליגומרים PDMS וחומר ריפוי (שולחן החומרים).
- מערבבים ומפרקים פתרון זה תחת ואקום (בטווח של 10-1 -10-2 ברים) עד שכל הבועות הלכודות יוסרו מתמיסת PDMS (5-10 דקות).
- יוצקים 20 גרם של הפתרון degassed על תבנית מאסטר סיליקון ו degas שוב (בטווח של10-1-10-2 ברים).
הערה: עובי הבול צריך להיות סביב 2-3 מ"מ. - כאשר כל הבועות מוסרות, מרושת PDMS ב 80 °C (60 °F) במהלך 1 שעה.
- חותכים את החותמת מיקרו מובנה PDMS עם אזמל (0.5 x 1.5 ס"מ2) בכיוון מקביל מערכי מיקרו מבנה גלוי.
- מקלפים את החותמת מתבנית אמן הסיליקון.
- החזירו את החותמת כדי להציג את המיקרו-מבנים שבצדה העליון והפקידו אותה על מגלשת זכוכית. הקפד לקבל את המיקרו-מבנים הפונים כלפי מעלה ממגלשת הזכוכית. יישר את המיקרו-מבנים שניתן לראות על החותמת עם הצד של שקופית הזכוכית, אשר ישמש מאוחר יותר כנקודת התייחסות עבור הליך אוטומציה AFM.
הערה: בשלב זה, חותמת PDMS מוכנה לשיתוק תאים. חותמות PDMS ניתן לאחסן על תבנית מאסטר סיליקון במשך מספר חודשים. כאשר כל PDMS מוסר מן התבנית הראשית, חותמת PDMS חדשה ניתן להשליך שוב על התבנית הראשית (כדי לשמור על עובש האב בטוח, אפשר לשכפל אותו פוליאוריתן)14.
3. הכנה לדוגמה
- קיבוע תאים
- צנטריפוגה (500 x g, 5 דקות) 600 μL של פתרון התא לשימוש חוזר כדי להפריד את המאגר מהתאים.
- פיפט 200 μL של supernatant משלב 3.1.1 על חותמת PDMS, ו degas תחת ואקום (בטווח של 10-1 -10-2 ברים) במשך כ 40 דקות.
הערה: שלב זה חשוב כדי לשפר את קיבוע התא בתוך בארות. מולקולות מקיר תא השמרים, הנמצאות בסופרנאטנט, מופקדות ככל הנראה על פני השטח של PDMS במהלך שלב הרטבה זה. מולקולות אלה, ככל הנראה, משפרות את הדבקות של התאים ותוממות לעלייה בקצב מילוי הבולים. - לאחר 40 דקות, עם פיפטה, להסיר את המאגר מפני השטח PDMS להפקיד, עם פיפטה, 200 μL של פתרון התא משלב 1.2.4 במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את התאים לתוך מיקרו מבנים של החותמת על ידי הרכבה convective / נימי. בשביל זה, באופן ידני להפיץ 200 μL של תאים השעיה על פני החותמת באמצעות שקופית זכוכית בשני הכיוונים עם זווית בין 30 ל 50 מעלות. ייתכן שיהיה צורך להעביר את שקופית הזכוכית מספר פעמים על החותמת כדי להשיג שיעור מילוי גבוה.
הערה: תיאור מלא של שיטה זו זמין13. - הסר את השעיית התא עם פיפטה. לשטוף את החותמת 3x עם 1 מ"ל של מאגר אצטט, pH 5.2 כדי להסיר את התאים שלא נלכדו.
- יבש את החלק האחורי של הבול באמצעות זרימת חנקן, על מנת להבטיח כי החותמת תדבק צלחת פטרי יבש.
- לבסוף להפקיד את חותמת PDMS מלא תאים בצלחת פטרי(שולחן החומרים)ולמלא אותו עם 2 מ"ל של חוצץ אצטט כדי לשמור על התאים במדיום נוזלי.
- הגדרת החותמת על במת AFM
- מרכז את הבמה ב- 0:0 בעת הפעלת פעולות AFM.
- כיול רגישות וקבוע האביב של הקנטיוור על זכוכית ובמים כמתואר ב Unsay ואח '15
- קח את צלחת פטרי עם החותמת ומניחים אותו במחזיק צלחת פטרי AFM.
- יישר את קצה החותמת בניצב למחזיק צלחת פטרי ציר Y.
הערה: זווית הטיה מקובלת היא מתחת ל-5° כפי שמודגם באיור 1. - הנח את ראש AFM על הבמה והיזהר כי מנועי צעד מורחבים מספיק כדי למנוע את הקצה לקרוס על החותמת.
4. הפעלת תוכנית AFM
הערה: תוכנית AFM מסופקת כחומר משלים (AutomatipSoftware2019.pdf). זה דורש JPK-Bruker AFM Nanowizard II או III מצויד במה ממונעת ותוכנה שולחנית JPK גרסה 4.3. התוכנית פותחה תחת Jython (גרסה המבוססת על פיתון 2.7)
- רכישת נתונים
- מרכז את קצה AFM על גבי הפינה השמאלית של 4.5 x 4.5 מיקרומטר2 בארות (המתאים לגודל התא) באמצעות מיקרוסקופ אופטי AFM. אם יש צורך בגודל טוב נוסף, מרכז בפינה השמאלית העליונה של בארות הרצוי.
- בצע מפת כוח של 64 x 64 (טווח Z = 4 מיקרומטר, מהירות קצה = 90 מיקרומטר·s-1, החל כוח 3 עד 5 nN) על שטח של 100 x 100 מיקרומטר². בחרו 'כפה מיפוי' מהתיבה הנפתחת 'מצב מדידה'. בלוח מיפוי הבקרה של הכוח קלט את הפרמטרים הבאים: Rel. Setpoint = 3 עד 5 nN; z אורך 4 מיקרומטר; תנועת Z: משך קבוע; זמן הארכה: 0.01 שניות; שלוחה מושהית:0; השהיית השהיה חוזרת: 0, מצב השהיה: כוח קבוע, קצב דגימה 2048 הרץ; לולאה סגורה Z בטלה את הסימון; רשת: בדוק תמונה מרובעת, מהיר 100 מיקרומטר, איטי: 100μm, X היסט: 0 מיקרומטר; היסט Y: 0 מיקרומטר; זווית רשת: 0 מעלות; פיקסלים: 64x64; יחס פיקסלים: 1:1
הערה: תוצאה אופיינית מוצגת באיור 2. תמונה זו תסייע למדוד ולאמת את גובה הצליל בין שתי בארות. - שים לב לקואורדינטות של מרכז החלק השמאלי העליון (W1) ושל החלק השמאלי התחתון היטב (המכונה W2 באיור 2). כדי לעשות זאת, לעשות קופסה מרובעת סביב הבאר. הקואורדינטות של מרכז התיבה מופיעות בלוח השמאלי של תוכנת AFM בתיבות קואורדינטות x,y.
- כדי לפתוח את תוכנת האוטומציה (Automatip_scan.py): בתוכנת שולחן העבודה JPK לחץ על מראש בתפריט הסרגל העליון ובחר פתח את הסקריפט. בחלון שנפתח בחר את הנתיב לכיוון קובץ ה- Script שסופק בנתונים משלימים (Automatip_scan.py).
- יישום ערכי קואורדינטות W1 ו- W2 במקטע התיבה קלט של קובץ ה- Script Jython (איור 3). הזן את קואורדינטות W1 בשורה המשתנה P1 239 של קובץ ה- Script ואת קואורדינטות W2 בשורה המשתנה P2 241.
הערה: הבארות שנבחרו כנקודות ציון ראשוניות (W1 ו- W2) אינן צריכות להיות קרובות מדי מקצה אזור הסריקה. אחרת אלגוריתם מרכוז לא היה לבצע כראוי כי זה צריך למדוד את הגובה על פני השטח PDMS בכל צד של הבאר. לדוגמה, ראו איור 4. - ייחס את ערך המגרש לשורת משתנה הצליל 245 של קובץ ה- Script.
- הזן את ממד הבאר בשורה המשתנה Ws 248. אפשרות זו ידועה בעיצוב תבניות הבאר וניתן לבדוק אותה באותה תמונה כמו זו המשמשת לאימות גובה הצליל (איור 2).
- כתוב את הנתיב לספריית השמירה בשורה 251 כדי לשמור את הנתונים במקום הרצוי.
- הגדר את הסכוםשור השורה המשתנה 254 לכפולת הרצון "n" של 100 מיקרומטר (זהו אזור הסריקה המרבי של AFM בו נעשה שימוש). ניתן לחשב את המספר הכולל של בארות שייבדקו באמצעות ערך זה והמגרש: אזור סריקה/גובה מרבי*n2.
הערה: בדוגמה של איור 3, ינותח 9 אזורים של 100 x 100 מיקרומטר2. - הגדר את מטריצת עקומות הכפייה, השורה והעמודה (3, 3 או 4, 4), שנרשמו לבאר בשורה המשתנה numScans 257.
הערה: בדוגמה של איור 3, מטריצה של 3 x 3 = 9 FCs תירשם עבור כל באר. - הפעל את התוכנית. לחץ על לחצן התחל.
הערה: התוכנית מבצעת תחילה באופן אוטומטי אלגוריתם מרכוז כדי לקבוע טוב יותר את מרכז בארות W1 ו- W2 (שלב 1). לאחר מכן הוא רוכש באופן אוטומטי את מטריצת Force Curves (FCs) בכל באר של אזור הסריקה הראשון (שלב 2). כאשר כל הבארות של אזור זה נבדקות, התסריט מעביר באופן אוטומטי את קצה AFM לבאר הראשונה של אזור הסריקה הבא. הקצה נסוג, שלב המיקרוסקופ עובר לאזור הבא, הקצה שוב מתקרב על החותמת ואת אלגוריתם מרכוז מבוצע שוב למרכז מחדש באופן אוטומטי על הבאר הראשונה (1') של אזור זה (שלב 3). האזור הראשון מוגדר על ידי המשתמש, השני, הוא בצד ימין וכו 'עד n הוא הגיע. n + 1 אזור הוא מתחת n, n +2 בצד שמאל של n +1, וכו 'עד 2n הוא הגיע. 2n +1 הוא מתחת 2n, ו 2n + 2 הוא בצד ימין על 2n, וכו '. באופן גלובלי, קצה serpentines דרך האזור הכולל. שלב 2 ו- 3 חוזרים על עצמם באופן אוטומטי עד לבדיקת המספר הכולל "n2" של אזורי סריקה. איור 5 מציג את תרשים הזרימה של התוכנית. זה לוקח ~ 4 שעות כדי להשלים את התוכנית.
- ניתוח נתונים
- בצע את סקריפט הפיתון "העתק קבצים" (Copy_files_L.py, המסופק בנתונים משלימים) כדי לארגן את קבצי FCs לתיקיה אחת. תסריט זה פותח עם פייתון 2.7 ומודול SciPy. השתמש בתוכנת Visual Studio Code כדי לפתוח את קובץ ה- Script של הפיתון. נתיב קלט לתיקיה הכללית (קו 67 של קובץ ה- Script המסופק בנתונים משלימים) והיכן הוא יאוחסן (קו 73).
- פתח את תוכנת עיבוד הנתונים של יצרן AFM כדי לנתח את עקומות הכפייה. בתפריט העליון קובץ, בחר פתח את 'אצווה של עקומות ספקטרוסקופיה.
- בחלון עיבוד האצווה, בחר את התהליך המסופק בנתונים משלימים (StiffnessProcess.jpk-proc-force). בחר את השלב האחרון של התהליך ולחץ על שמור והחל על הכל. כל עקומות הכוח יקבלו את אותו טיפול.
הערה: התהליך משתמש בכיול מקבצי FCs כדי להמיר את עקומות ההטיה לעקומות כוח המכוילות בניוטון; אלגוריתם החלקת נתונים מוחל (ממוצע של 3 נקודות רצופות); קו הבסיס מתורגם למנוחה על ציר האפס; נקודת המגע מנומקת ומועדון הכדורגל מויסט כדי למקם את נקודת המגע בקואורדינטות (0,0); הכיפוף של cantilever הוא מופחת ל- FCs, שיפוע הנסוג מצויד. בסוף הטיפול בנתונים, התוכנה מייצרת קובץ המכיל טבלה נותן עבור כל FCs: שמו, מודולוס צעיר, נקודת מגע, כוח הידבקות, מדרונות, וכו '. - חזור על שלבים 4.2.1 עד 4.2.3 עבור כל הניסויים. הקפד לשמור את הנתונים בתיקיות שונות (כלומר: "...\מטופלים\" ו- "...\untreated\")
- השתמש בסקריפט R שסופק בנתונים משלימים כדי להתוות היסטוגרמות ותווי תיבות ולבצע טיפולים סטטיסטיים של ANOVA.
- כדי לפתוח את קובץ ה- Script R (DataAnalisys.R), השתמש בתוכנת R studio וטען את הקבצים המכילים את המידע שחולץ באמצעות תוכנת עיבוד הנתונים ( .tsv).
- בחלון הסביבה השתמש בלחצן ייבוא ערכת נתונים, מהרשימה המוצגת בחר מתוך טקסט (קורא) ובחלון החדש בחר בלחצן דפדפן ומצא את קובץ ה- .tsv
- לאחר טעינת הקובץ, בחר את העמודות (נוקשות והדבקה) שייכללו לצורך הניתוח. כדי להפעיל את כל הקוד, הקש Ctrl+Alt+R.
הערה: קובץ ה- Script פועל עם 4 ערכות נתונים, שקול שני ניסויים הן בתאים שאינם מטופלים והן בתאים מטופלים. ניתן לבצע בלוקים של הסקריפט ולראות כיצד המשתנים משתנים בהתאם לפונקציות שבוצעו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו בפרוטוקול המתואר כדי לנתח את ההשפעה של caspofungin על המאפיינים הביופיזיים של הפתוגן האנושי האופורטוניסטי C. אלביקנס בצורת שמרים שלה. Caspofungin היא מולקולה נגד פטריות הזדמנות אחרונה בשימוש כאשר תרופות אחרות אינן יעילות בגלל מנגנוני ההתנגדות תאים לפתח לכיוון פטריות. מנגנון הפעולה שלה מבוסס על עיכוב של subunit Fks2 של fks1 /Fks2 המורכב אחראי על סינתזת ß גלוקן. כמו ß glucans הם מרכיב מרכזי של קיר התא פטרייתי16,17, ציפינו לשינוי של המאפיינים הביופיזיים של דופן התא: קשיחות הידבקות.
איור 6 מציג היסטוגרמות טיפוסיות המתקבלות כאשר כל הפרוטוקול המוצג לעיל מוחל. ההיסטוגרמה האדומה מייצגת את החדות הנוקשה המתועדת על 957 תאים מקומיים ואת הכחול על 574 תאים שטופלו בקספופוגין. התצפית המעניינת הראשונה היא ששתי ההיסטוגרמות מדגימות התפלגות דו-מודאלית של הערכים. תצפית זו אפשרית רק משום שמדדנו מאות תאים. על דגימות קטנות יותר, החוקרים בדרך כלל לצפות התפלגות אחת לפספס את ההטרוגניות האוכלוסייה. 17,18
התצפית השנייה נוגעת להשפעת הקספופונגין. זה באופן גלובלי מפחית את הנוקשות של התאים בעוד עדיין שתי תת-אוכלוסיות קיימות. בשלב אחרון הפרוטוקול המוצע מספק השוואת ANOVA בין התאים המקוריים והמטופלים כפי שהוצג באיור 7. זה מוכיח כי שני התנאים יש נוקשות שונה וכי הבדל זה הוא משמעותי מאוד (ערך p < 0.001). ערך זה הוא הגיע הודות למספר הגדול של תאים מנותחים ומספק ביטחון רב יותר בתוצאות שהושגו.
ההידבקות גם הוצאה מהנתונים שנרשמו באופן אוטומטי ומצאנו שכוח ההידבקות בין הקצה החשוף לתאים המקומיים היה של 0.64 ± 0.6 nN. במקרה זה נמצאו גם שתי אוכלוסיות משנה: הראשונה בעלת כוח הידבקות ממוצע של 0.7 ± 1.4 nN ואילו השנייה של 4.5 ± 1.5 nN. לטיפול בקספונגין היו השפעות בלתי צפויות על ההידבקות. בניסוי אחד לא נצפתה השפעה, אבל בניסוי אחר, caspofungin גרם לירידה בהדבקה לקצה וצמצום ההטרוגניות של הדבקת האוכלוסייה. תוצאות אלה מופקות Proa ואח'13, שם הם מוצגים בסך הכל.
איור 1: מיקום מקובל של החותמת המיקרו-מובנית על במת AFM.
זווית ההטיה בתמונות השמאליות (עד 5°) יכולה להיות מטופלת על ידי התוכנית, אך ההטיה מימין חשובה (10°). נתון זה השתנהמ- 13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונת AFM אופיינית של חותמות PDMS מלאות המציגות את הקואורדינטות ההתחלתיות כ- W1 ו- W2, גודל אזור הסריקה (Δ 2 ),זוויתההטיה (θ).
איור זה השתנה מ-13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מקטע קלט משתמש של קובץ ה- Script.
P1 ו- P2 מתייחסים לקואורדינטות של באר 1 (W1) ו- well 2 (W2) של איור 2. הפרמטרים האחרים הם המגרש ב- μm, גודל הבאר ב- μm (Ws), נתיב הספריה לשמירת הנתונים, השטח הריבועי הכולל שייבדק על ידי AFM האוטומטי (totalArea הוא האורך ב- μm של הצד של השטח המרובע הכולל) ומספר עקומות הכוח לבארות (numScans). כל היחידות נמצאות ב- μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונה אופטית המספקת דוגמה לבארות ראשוניות יקרות ערך (נקודות ירוקות).
הריבוע השחור מייצג את אזור הסריקה ואת הכתמים האדומים, בארות ראשוניות שכדאי להשליך. נתון זה השתנהמ- 13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תרשים זרימה של תוכנית המציג את 5 השלבים המבוצעים באופן אוטומטי על-ידי AFM. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: היסטוגרמות של ערכי הנוקשות החציוניים.
(A, B) הצג את התוצאות החציוניות לכל תא עבור תא שטופלו ב- caspofungin מקורי. נתון זה השתנהמ- 13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תווי תיבות המשווים בין מקוריים ומטופלים בתאי caspofungin.
3 כוכבים מייצגים משמעות של p<0.001. התיבה מייצגת 90% מהתוצאות, הקו המרכזי הוא הערך החציוני והפסים האנכיים מייצגים את הטווח של כל הנתונים. נתון זה השתנהמ- 13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: תלות של ערכים במיקום זמן.
היסטוגרמות במרכז הן הנתונים המקוריים המחולקים לקבוצות המשנה השונות המתאימות לאוכלוסיות המשנה שנוסדו (כחול/צהוב). (א,ב) הראה את נוכחותן של שתי אוכלוסיות המשנה בכל שעה בניסוי. (C,D)מציג את מיקומי ההסתגרות; בכל תנוחה ניתן לראות את נוכחותם של תת-האוכלוסיות (כחול/צהוב). ארגון קבוצת משנה נעשה באמצעות אלגוריתם k-means. נתון זה השתנהמ- 13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: האזור הבטוח.
אזור, בתוך הבאר PDMS, הוגדר כאזור שבו קצה הפירמידלי אינו נוגע בקצה הבאר תוך כדי הגעה לתחתית הבאר (במקרה של באר ריקה). איור זה השתנה מ-13. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
נתונים משלימים. נא לחץ כאן כדי לצמצם קבצים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיפור העיקרי שמספקת מתודולוגיה זו הוא עלייה משמעותית במספר התאים הנמדדים בזמן שנקבע. המקבילה היא הפחתה של מספר הנקודות הנמדדות לכל תא. משמעות הדבר היא כי שיטה זו אינה מיועדת לספק ניתוח מפורט של תא יחיד. השיטה חלה רק על תאים שיכולים להתאים לבארות של חותמת PDMS. החותמת היא רב-תכליתית למדי, בעוד הוא מכיל בארות של 1.5 x 1.5 מיקרומטר2 עד 6 x 6 מיקרומטר2. עדיין אי אפשר לשתק bacillus או תאים גדולים בהרבה. לא ניתן להשתמש בתצהיר הבול והתצהיר הנימי כדי לשתק תאי יונקים גדולים בהרבה (באורך של כ-100 מיקרומטר).
בהקשר זה, Peric et al.19 פיתחה מכשיר מיקרופלואידי חכם כדי לשתק bacillus כמו Escherichia coli ו bacillus subtilis. מכשיר זה מאפשר לשתק bacillus בתנוחות מוגדרות ובתנאים פיזיולוגיים. זה יהיה מאוד מעניין להתאים את התוכנה לגודל מסוים של מכשיר זה.
זיהום טיפ יכול גם להיות בעיה במערכת אוטומטית זו. במקרה של תאים מיקרוביאליים, זה לא כל כך נפוץ, אבל זה בעל חשיבות גבוהה במקרה של תאי יונקים. Dujardin et al.11 התייחסו לבעיה זו על ידי הוספת שלב ניקוי בפרוטוקול האוטומטי שלהם. שלב זה מורכב מבדיקת סכום הלייזר והפעלת הליך הניקוי אם הסכום נמוך מדי. הצעד הנקי מורכב לטבול את הקצה בבאר מלאה במים או אתנול.
שאלה שעולה באופן שיטתי מעבודת אוטומציה זו הייתה: "האם ההטרוגניות נובעת מהאבולוציה של התאים במהלך הניסוי?". כדי לענות על שאלה זו, התווינו את תוצאות הנוקשות כפונקציה של זמן כפי שהוצג באיור 8A,B. זה מראה בבירור כי ערכי נוקשות הטרוגנית נרשמים בכל עת במהלך הניסוי.
באותו הקשר עלתה שאלת מיקום הקצה במהלך המדד. זה יכול להיות אפשרי כי עקומות כוח נרשם על קצה התא יהיה נוקשות שונה מ FC נרשם בחלק העליון של התאים. כדי למנוע אי נוחות זו, הגדרנו את מה שקראנו לו האזור הבטוח. הוא מתואר באיור 9A,B ומייצג אזור בתוך הבארות שבו הקצה לא ייגע בקצוות הבאר במהלך מדידת הכוח. באמצעות "אזור בטוח" זה יכולנו להקליט FC רק על תאים בחלק העליון שלהם. כפי שמוצג באיור 8C,D מיקום הקצה בתוך האזור הבטוח אינו אחראי להטרוגניות של התוצאות כפי שמצאנו את שני הפנוטיפים עבור כל מיקום של הקצה, באזור הבטוח.
כדי לוודא שהערכים שנרשמו בכל עמדה הם הומוגניים התווינו את ערכי הנוקשות כפונקציה של המיקום כפי שמוצג באיור 9C,D. זה מראה כי ערכי נוקשות הטרוגנית נרשמים על כל מיקום בבאר, כלומר ההטרוגניות שנצפו אינה חפץ בשל מיקום הקצה בבארות.
הפרוטוקול המוצג במאמר זה מייצג פריצת דרך רעיונית ומתודולוגית בתחום AFM המיושמת במדעי החיים. כמויות גדולות של נתונים שנוצרו תואמים ניתוח אוטומטי אשר ללא ספק יאפשר סיווג של אוכלוסיות תאים על פי קריטריונים חדשים. היישום של פרוטוקול זה מערכי חלבון או סוכר הוא ריאלי לחלוטין ודורש רק כמה התאמות לשקול את המרווח בין תחומי עניין.
זהו אפוא פרוטוקול רב-תכליתי שהוא תוצאה של שיתוף פעולה בינתחומי חזק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו רוצים להכיר FONCYCYT של CONACYT (מקסיקו), משרד החוץ של צרפת ואת האוניברסיטה פריז 13, אם כי התמיכה הכספית של פרויקט ECOS-NORD שיתוף פעולה בינלאומי בשם ננו-מישוש לאבחון, מס '263337 (מקסיקו) ו MI5P02 (צרפת). AMR רוצה להודות על התמיכה הכספית של SIP-IPN באמצעות הפרויקט מס '20195489. SPC נתמכת על ידי מלגת דוקטורט מ- CONACYT (מס ' 288029) ו- IPN באמצעות הסכם cotutelle לקבלת תעודת דוקטורט כפולה (IPN-UPS). אד ו CFD הם חוקרים במרכז הלאומי דה לה Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
References
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
