Summary
Denne protokollen tar sikte på å automatisere AFM-målinger på hundrevis av mikrobielle celler. For det første blir mikrober immobilisert til PDMS-stempelmikrostrukturer, og deretter utføres kraftspektroskopimålinger automatisk på hundrevis av immobiliserte celler.
Abstract
Metoden som presenteres i denne artikkelen tar sikte på å automatisere Bio-AFM-eksperimenter og opptak av kraftkurver. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å registrere krefter kurver på 1000 celler på 4 timer automatisk. For å opprettholde en 4 timers analysetid reduseres antall kraftkurver per celle til 9 eller 16. Metoden kombinerer et Jython-basert program og en strategi for å sette sammen celler på definerte mønstre. Programmet, implementert på en kommersiell Bio-AFM, kan midtstille spissen på den første cellen i matrisen og deretter flytte, automatisk, fra celle til celle mens du registrerer kraftkurver på hver celle. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å få tilgang til de biofysiske parametrene til cellene som stivhet, deres limegenskaper, etc. Med automatiseringen og det store antallet celler analysert, kan man få tilgang til oppførselen til cellepopulasjonen. Dette er et gjennombrudd i Bio-AFM-feltet der data så langt har blitt registrert på bare noen få titalls celler.
Introduction
Dette arbeidet gir en metodikk for å utføre automatiske kraftmålinger på hundrevis av levende celler ved hjelp av et atomkraftmikroskop (AFM). Det gir også en metode for å immobilisere mikrober på et PDMS mikrostrukturert stempel som er kompatibelt med AFM-eksperimenter utført i et flytende miljø.
Bio-AFM er en svært spesialisert teknologi unnfanget for applikasjoner i biologi og deretter brukt til å studere levende celler. Det krever en opplært ingeniør som kan analysere en celle om gangen. Under disse forholdene er antall forskjellige celler som kan analyseres ganske lite, typisk 5 til 10 celler på 4-5 timer. Imidlertid er mengden kraftmålinger registrert på en enkelt celle vanligvis svært høy og kan lett nå 1000. Dermed er det nåværende paradigmet for AFM-kraftmålinger på levende celler å registrere hundrevis av kraftkurver (FCs), men på et begrenset antall celler.
Statistisk sett er denne tilnærmingen tvilsom, og reiser spørsmålet om utvalgets representativitet. Faktisk er det vanskelig for eksempel å evaluere heterogeniteten til en cellepopulasjon ved å måle bare noen få celler, selv om hundrevis av målinger er registrert på disse få cellene. Det er imidlertid på grunnlag av dette paradigmet at det er gjort store fremskritt innen biofysikk, mikrobiologi og nanomedisin1,2,3. Faktisk har nanometeranalyse på skalaen av enkeltceller gitt ny informasjon om cellulær nanomekanikk, om organisering av transmembranproteiner, eller virkningsmekanismen for antimikrobielle eller anticancer medisiner4,5,6,7. Nylig har imidlertid flere biomekaniske tester med høy gjennomstrømning utført på celler dukket opp8, som viser det vitenskapelige samfunnets interesse for å endre dette paradigmet og få tilgang til cellepopulasjonens heterogenitet. Disse testene er alle avhengige av mikrofluidiske systemer for å deformere celler og optisk måle deformasjonen under stress for å oppnå et indirekte mål på deres generelle overflateelastisitet8. Et viktig problem med disse metodene er imidlertid at de er monoparametriske: bare celleelastisitet kan undersøkes. Videre tillater de ikke måling av de mekaniske parametrene til tilhengerceller, noe som kan være begrensende for studier av ikke-sirklende pattedyrceller eller biofilmer for eksempel.
Tilnærminger som involverer AFM er utviklet av lagene s. Scheuring9 og M. Favre10. Scheuring et al. immobiliserte celler på fibronectin mønstre9, tvinger individuelle celler til å ta form av mønsteret9. Deretter kartla dette teamet de mekaniske egenskapene til noen få celler for å definere gjennomsnittlige data, representant for 14 til 18 celler. Utviklingen utført av Farve et al. rettet mot multipleksing av målingene ved å parallellisere AFM cantilevers10. Så vidt vi vet har dette arbeidet i multipleksingsretningen ikke ført til målinger på levende celler.
En interessant tilnærming foreslått av Dujardins team presenterer en automatisert AFM som er i stand til å identifisere celler og avbilde dem på bunnen av skreddersydde brønner. Selv om denne metoden ikke tillater analyse av en stor populasjon av celler, tillater den automatisk testing av forskjellige forhold i hver brønn11.
Vårt mål i dette arbeidet er mer ambisiøst siden vi ønsket å måle minst 1000 celler for å få tilgang til ikke en gjennomsnittlig celle, men tvert imot heterogeniteten mellom cellene. Strategien som vi utviklet her for å få tilgang til cellepopulasjons heterogenitet ved hjelp av AFM, er basert på analysen av hundrevis av celler som et begrenset antall kraftkurver registreres på. Sammenlignet med den "klassiske" tilnærmingen til å registrere et stort antall kraftkurver på et begrenset antall celler, bør denne tilnærmingen betraktes som komplementær siden den ikke gir samme informasjon. Faktisk, mens den typiske metoden tillater en å sondere individuell celleoverflate heterogenitet, ved hjelp av vår tilnærming, er vi i stand til å få tilgang til hele cellepopulasjonen heterogenitet. For å oppnå dette målet har vi kombinert en metode som direkte immobiliserer mikrober (her gjærarten Candida albicans) inn i brønnene til et PDMS mikrostrukturert stempel12, og utvikler et originalt program for å flytte AFM-spissen automatisk fra celle til celle13 og måle de mekaniske egenskapene til hver celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikrobiell cellekultur
- Gjenopplive celler fra en glyserol lager.
MERK: C. albicaner lagres ved -80 °C i glyserollagre, på klinkekuler.- Velg en marmor i -80 °C lager og gni den på gjær peptone dextrose (YPD) agar. Dyrk cellene i 2 dager ved 30 °C, før flytende dyrking.
- Forbered flytende kulturer.
- Fyll et kulturrør med 5 ml steril YPD-buljong og tilsett en enkelt koloni av C. albicansceller, dyrket på YPD-agarplaten.
- Dyrk kulturen i statiske forhold ved 30 °C i 20 timer før høsting ved sentrifugering (4000 x g, 5 min). Kast supernatanten og eliminer som biofareavfall.
- Vask pelletsene 2x med 10 ml acetatbuffer (8 mM natriumacetat, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, pH 5.2). Sentrifuge (4000 x g, 5 min) mellom vasker.
- Resuspend pellet i 2 ml acetatbuffer og bruk denne løsningen for celle immobilisering på PDMS-stempelet.
MERK: Denne fjæringen kan ikke lagres og bør tilberedes fersk til avsnitt 3.
2. FORBEREDELSE AV PDMS-stempel
- Silisium master mold forberedelse
- Tegn de ønskede mikrostrukturene ved hjelp av CAD-programvare (Computer Assisted Design).
MERK: Brønnene som er konstruert skal ha samme størrelse som mikroben som skal fanges. Designet skal gi en stor matrise med brønner 100 x 100 på listen. Det er best å lage flere matriser med litt forskjellige størrelser rundt mikrobens gjennomsnittlige størrelse. - Hvis et rent rom er tilgjengelig, følger du trinn 2 til 12 i den tidligere publiserte protokollen12. Ellers kan silisiummesterform kjøpes fra kommersielle rene romfasiliteter.
- Tegn de ønskede mikrostrukturene ved hjelp av CAD-programvare (Computer Assisted Design).
- Støping av PDMS-stempel
- Forbered 55 g PDMS prepolymerløsning som inneholder en blanding av 10 til 1, masseforhold, PDMS-oligomerer og herdemiddel (Materialliste).
- Bland og avfett denne løsningen under vakuum (i området 10-1-10-2 bar) til alle fanget bobler er fjernet fra PDMS-løsningen (5-10 min).
- Hell 20 g av den avgassede løsningen på silisiummesterformen og degas igjen (i området10-1-10-2 barer).
MERK: Stempeltykkelsen skal være rundt 2-3 mm. - Når alle boblene er fjernet, retikulerER du PDMS ved 80 °C i løpet av 1 time.
- Klipp det mikrostrukturerte PDMS-stempelet med en skalpell (0,5 x 1,5 cm2) i en retning som er parallell med de synlige mikrostrukturmatrisene.
- Skrell stempelet fra silisiummesterformen.
- Returner stempelet for å vise mikrostrukturene på oversiden og deponere det på en glasssklie. Sørg for at mikrostrukturene vender opp fra glasssklie. Juster mikrostrukturene som kan ses på stempelet med siden av glasssklie, som senere vil fungere som en referanse for AFM-automatiseringsprosedyren.
MERK: På dette stadiet er PDMS-stempelet klart for celle immobilisering. PDMS-stemplene kan lagres på silisiummasterformen i flere måneder. Når all PDMS fjernes fra hovedformen, kan et nytt PDMS-stempel kastes igjen på mesterformen (for å holde mesterformen trygg, er det mulig å gjenskape det i polyuretan)14.
3. Prøvepreparering
- Immobilisering av celler
- Sentrifuge (500 x g, 5 min) 600 μL av den resuspenderte celleløsningen for å skille bufferen fra cellene.
- Pipet 200 μL av supernatanten fra trinn 3.1.1 på PDMS-stempelet, og degas under vakuum (i området 10-1-10-2 barer) i ca. 40 minutter.
MERK: Dette trinnet er viktig for å forbedre celle immobiliseringen inne i brønnene. Molekyler fra gjærcelleveggen, tilstede i supernatanten, blir sannsynligvis avsatt på PDMS-overflaten under dette pre-fuktingstrinnet. Disse molekylene, mest sannsynlig, forbedrer vedheft av cellene og bidrar til økningen i stempelfyllingshastigheten. - Etter 40 min, med en pipette, fjern bufferen fra PDMS-overflaten og avleiringer, med en pipette, 200 μL av celleløsningen fra trinn 1.2.4 i 15 minutter ved romtemperatur.
- Plasser cellene i stempelets mikrostrukturer ved konvektiv/kapillær montering. For det sprer du manuelt 200 μL celler suspensjon over stempelet ved hjelp av et glasssklie i begge retninger med en vinkel mellom 30 og 50°. Det kan være nødvendig å passere glasssklie flere ganger på stempelet for å oppnå en høy fyllingsgrad.
MERK: En fullstendig beskrivelse av denne metoden er tilgjengelig13. - Fjern celleopphenget med en pipette. Vask stempelet 3x med 1 ml acetatbuffer, pH 5.2 for å fjerne cellene som ikke var fanget.
- Tørk baksiden av stempelet ved hjelp av nitrogenstrøm, for å sikre at stempelet holder seg til den tørre Petri-parabolen.
- Til slutt deponere PDMS-stempelet fylt med celler i en Petri-tallerken (Tabell over materialer) og fyll det med 2 ml acetatbuffer for å opprettholde cellene i flytende medium.
- Stille inn stempelet på AFM-scenen
- Midtstill scenen kl. 0:0 når du starter AFM-operasjoner.
- Kalibrer følsomhet og fjærkonstant av cantilever på glass og i vann som beskrevet i Unsay et al.15
- Ta Petri-retten med stempelet og legg den i AFM Petri-tallerkenholderen.
- Juster stempelkanten vinkelrett på Petri-tallerkenholderen Y-aksen.
MERK: En akseptabel vippevinkel er under 5° som vist i figur 1. - Plasser AFM-hodet på scenen og vær forsiktig med at steppermotorene er tilstrekkelig utvidet for å unngå at spissen krasjer på stempelet.
4. Kjøre AFM-programmet
MERK: AFM-programmet leveres som et tilleggsmateriale (AutomatipSoftware2019.pdf). Det krever en JPK-Bruker AFM Nanowizard II eller III utstyrt med et motorisert stadium og JPK stasjonær programvare versjon 4.3. Programmet er utviklet under Jython (versjon basert på python 2.7)
- Datainnsamling
- Midtstill AFM-spissen på toppen av venstre hjørne av brønnene på 4,5 x4,5 μm 2 (tilsvarende cellestørrelsen) ved hjelp av det optiske AFM-mikroskopet. Hvis en annen brønnstørrelse er nødvendig, midt på øverste venstre hjørne av de ønskede brønnene.
- Utfør et kraftkart på 64 x 64 (Z-område = 4 μm, spisshastighet = 90 μm·s-1, påført kraft 3 til 5 nN) over et område på 100 x 100 μm². Velg Tving tilordningsmodus fra rullegardinlisten Målmodus. I kraftkontrolltilordningspanelet legger du inn følgende parametere: Rel. Setpoint = 3 til 5 nN; z lengde 4 μm; Z-bevegelse: konstant varighet; forlenge tiden: 0.01s; ext. forsinkelse:0; Retr forsinkelse: 0, Forsinkelsesmodus: Konstant kraft, Samplingsfrekvens 2048 Hz; Z lukket sløyfe fjern merket; Rutenett: sjekk Firkantet bilde, Rask 100 μm, sakte: 100μm, X-forskyvning: 0 μm; Y-forskyvning: 0 μm; rutenettvinkel: 0 grader; Piksler: 64x64; bildepunktforhold: 1:1
MERK: Et typisk resultat vises i figur 2. Dette bildet vil bidra til å måle og verifisere tonehøyden mellom to brønner. - Legg merke til koordinatene til midten av brønnen øverst til venstre (W1) og nederst til venstre (referert til som W2 på figur 2). For å gjøre det, lag en firkantet boks rundt brønnen. Koordinaten til midten av boksen vises på venstre panel av AFM-programvaren i x,y koordinatbokser.
- For å åpne automatiseringsprogramvaren (Automatip_scan.py): I JPK-skrivebordsprogramvaren klikker du på forhånd i topplinjemenyen og velger åpne skriptet. I vinduet som åpnes, velger du banen til skriptfilen i Tilleggsdata (Automatip_scan.py).
- Implementer W1- og W2-koordinatverdier i Inndata -boksen i Jython-skriptet (Figur 3). Skriv inn W1-koordinatene i P1-variabellinje 239 i skriptet og W2-koordinatene i P2-variabellinjen 241.
MERK: Brønnene som velges som innledende koordinater (W1 og W2), bør ikke være for nær skanneområdekanten. Ellers vil ikke sentreringsalgoritmen fungere riktig fordi den må måle høyden på PDMS-overflaten på hver side av brønnen. Hvis du vil ha et eksempel, kan du se Figur 4. - Tilskrive verdileien til den avstandsvariable linje 245 i skriptet.
- Angi brønndimensjonen i ws variabel linje 248. Dette er kjent fra utformingen av brønnmønstrene og kan kontrolleres på samme bilde som det som brukes til å verifisere tonehøyden (figur 2).
- Skriv banen til lagringsmappen i linje 251 for å lagre dataene på ønsket sted.
- Sett totalarea variabel linje 254 til ønsket multiplum "n" på 100 μm (det vil være det maksimale skanneområdet til AFM som brukes). Totalt antall brønner som skal undersøkes kan beregnes ved hjelp av denne verdien og tonehøyden: maksimalt skanneområde/tonehøyde*n2.
MERK: I eksempelet på figur 3analyseres 9 områder på 100 x 100μm 2. - Angi kraftkurvematrisen, raden og kolonnen (3, 3 eller 4, 4), registrert per brønn i numScans variabel linje 257.
MERK: I eksempelet på figur 3registreres en matrise på 3 x 3 = 9 FCer for hver brønn. - Kjør programmet. Klikk på Start-knappen.
MERK: Programmet utfører først automatisk en sentreringsalgoritme for bedre å bestemme midten av W1- og W2-brønnene (trinn 1). Deretter får den automatisk matrisen Force Curves (FCs) på hver brønn i det første skanneområdet (trinn 2). Når alle brønnene i dette området er undersøkt, flytter skriptet automatisk AFM-spissen til den første brønnen i neste skanneområde. Spissen trekkes tilbake, mikroskopstadiet beveger seg til neste område, spissen nærmer seg igjen på stempelet og sentreringsalgoritmen utføres igjen for å midtstille automatisk på den første brønnen (1') i det området (trinn 3). Det første området er definert av brukeren, den andre, er til høyre etc. til n er nådd. n+1-området er under n, n+2 til venstre for n+1 osv. 2n +1 er under 2n, og 2n +2 er til høyre på 2n, etc. Globalt serpentinene gjennom det totale området. Trinn 2 og 3 gjentas automatisk til det totale antallet "n2" av skanneområder er undersøkt. Figur 5 viser flytskjemaet for programmet. Det tar ~ 4 timer å fullføre programmet.
- Dataanalyse
- Kjør pythonskriptet Kopier filer (Copy_files_L.py, som finnes i Supplerende data) for å organisere FCs-filene i én mappe. Dette skriptet ble utviklet med Python 2.7 og SciPy-modulen. Bruk Visual Studio Code-programvaren til å åpne pythonskriptet. Inndatabane til den generelle mappen (linje 67 i skriptet som leveres i tilleggsdata) og hvor den vil bli lagret (linje 73).
- Åpne AFM-produsentens databehandlingsprogramvare for å analysere kraftkurvene. Velg åpnespektroskopikurver påden øverste menyen Fil .
- I vinduet for satsvis behandling velger du prosessen som er angitt i Tilleggsdata (Stivhetsbehandling.jpk-proc-force). Velg det siste trinnet i prosessen, og klikk behold og bruk på alle. Alle kraftkurver vil få samme behandling.
MERK: Prosessen bruker kalibreringen fra FCs-filene til å konvertere avbøyningskurvene til kraftkurver kalibrert i Newton; En datautjevningsalgoritme brukes (gjennomsnitt på 3 påfølgende punkt); Grunnlinjen oversettes til hvile på nullaksen. kontaktpunktet er ekstrapolert og FC er forskjøvet for å plassere kontaktpunktet i koordinaten (0,0); bøyningen av cantilever trekkes fra FCene, tilbaketrekkingshellingen er montert. På slutten av databehandlingen genererer programvaren en fil som inneholder en tabell som gir for hver FCs: navnet, Young Modulus, kontaktpunkt, vedheftskraft, bakker, etc. - Gjenta trinn 4.2.1 til 4.2.3 for alle eksperimenter. Pass på at du lagrer dataene i forskjellige mapper (dvs.
- Bruk R-skriptet i Supplementary Data til å tegne inn histogrammer og boksplott og utføre ANOVA statistiske behandlinger.
- Hvis du vil åpne R-skriptet (DataAnalisys.R), bruker du R studioprogramvare og laster inn filene som inneholder informasjonen som er pakket ut med databehandlingsprogramvaren (TSV).
- I miljøvinduet bruker du Importer datasett-knappen, fra listen som vises, velg fra tekst (leser), og i det nye vinduet velger du Nettleser-knappen og finner TSV-filen.
- Når filen er lastet inn, velger du kolonnene (stivhet og vedheft) som skal inkluderes for analysen. Hvis du vil kjøre all koden, trykker du CTRL+ALT+R.
MERK: Skriptet fungerer med 4 datasett, vurder to eksperimenter som både har ubehandlede og behandlede celler. Det er mulig å utføre blokker av skriptet og se hvordan variablene endres i henhold til funksjonene som utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte den beskrevne protokollen til å analysere effekten av caspofungin på de biofysiske egenskapene til det opportunistiske menneskelige patogenet C. albicans i gjærformen. Caspofungin er en siste sjanse antifungal molekyl som brukes når andre stoffer er ineffektive på grunn av motstandsmekanismer celler utvikler mot antifungals. Virkningsmekanismen er basert på hemming av underenheten Fks2 av komplekse fks1 / Fks2 som er ansvarlig for ß glukansyntese. Som ß glukaner er en viktig komponent i soppcelleveggen16,17, forventet vi modifikasjon av celleveggens biofysiske egenskaper: stivhet og vedheft.
Figur 6 viser typiske histogrammer som oppnås når all protokollen ovenfor brukes. Det røde histogrammet representerer stivhetsrepartisjonen som er registrert på 957 innfødte celler og den blå på 574 caspofunginbehandlede celler. Den første interessante observasjonen er at begge histogrammer viser en bimodal fordeling av verdiene. Denne observasjonen er bare mulig fordi vi målte hundrevis av celler. På mindre prøver observerer forskere vanligvis en enkelt fordeling og savner befolkningens heterogenitet. 17,18
Den andre observasjonen gjelder effekten av caspofungin. Det reduserer cellenes stivhet globalt, mens det fortsatt finnes to delpopulasjoner. I et siste trinn gir den foreslåtte protokollen en ANOVA-sammenligning av de opprinnelige og behandlede cellene som presentert i figur 7. Det viser at de to forholdene har en annen stivhet og at denne forskjellen er svært signifikant (p-verdi < 0,001). Denne verdien nås takket være det store antallet celler som analyseres og gir større tillit til de oppnådde resultatene.
Vedheftet er også hentet ut fra de automatisk registrerte dataene, og vi fant ut at adhesjonskraften mellom bare spissen og innfødte celler var på 0,64 ± 0,6 nN. I dette tilfellet ble det også funnet to subpopulasjoner: den første har en gjennomsnittlig vedheftskraft på 0,7 ± 1,4 nN mens den andre av 4,5 ± 1,5 nN. Behandlingen med caspofungin hadde uforutsigbare effekter på vedheftet. I ett eksperiment ble det ikke observert noen effekt, men i et annet eksperiment induserte caspofungin en reduksjon i vedheftet til spissen og en reduksjon av populasjonens vedheft heterogenitet. Disse resultatene er hentet fra Proa et al.13, hvor de presenteres i totalitet.
Figur 1: Akseptabel plassering av det mikrostrukturerte stempelet på AFM-scenen.
Vippevinkelen på venstre bilde (opptil 5°) kan håndteres av programmet, men hellingen til høyre er viktig (10°). Dette tallet er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Typisk AFM-bilde av fylte PDMS-stempler som viser de første koordinatene som W1 og W2, størrelsen på skanneområdet (Δ2), vippevinkelen (θ).
Denne figuren er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Brukerinndatadelen av skriptet.
P1 og P2 refererer til koordinatene til brønn 1 (W1) og brønn 2 (W2) i figur 2. De andre parametrene er tonehøyden i μm, brønnstørrelsen i μm (Ws), katalogbanen for lagring av dataene, det totale kvadratområdet som vil bli undersøkt av den automatiserte AFM (totalArea er lengden i μm på siden av det totale kvadratområdet) og antall kraftkurver per brønn (numScans). Alle enheter er i μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Optisk bilde som gir et eksempel på verdifulle (grønne prikker) innledende brønner.
Den svarte firkanten representerer skanneområdet og de røde flekkene, innledende brønner som bedre bør kastes. Dette tallet er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Programflytskjema som viser de fem trinnene som utføres automatisk av AFM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Histogrammer av median stivhetsverdier.
(A, B) Vis medianresultatene per celle for opprinnelig og caspofunginbehandlet celle. Dette tallet er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Boksplott som sammenligner innfødte og behandlet med caspofunginceller.
De 3 stjernene representerer en betydning av p<0.001. Boksen representerer 90 % av resultatene, den sentrale linjen er medianverdien, og de loddrette stolpene representerer området for alle dataene. Dette tallet er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Tidsposisjonsavhengighet av verdier.
Histogrammer i midten er de opprinnelige dataene som er delt inn i de forskjellige undergruppene som tilsvarer delpopulasjonene som er grunnlagt (blå / gul). (A,B) Vis tilstedeværelsen av de to underpopulasjonene hver time i eksperimentet. (C,D) viser plasseringen av innrykk. På hver posisjon er det mulig å se tilstedeværelsen av delpopulasjonene (blå / gul). Undergruppeorganisasjon ble utført ved hjelp av k-middel-algoritmen. Dette tallet er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Det trygge området.
Et område, inne i PDMS-brønnen, er definert som området der pyramidespissen ikke berører brønnkanten mens den når brønnbunnen (i tilfelle en tom brønn). Denne figuren er endret fra13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende data. Klikk her for å ned disse filene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigste forbedringen fra denne metoden er en betydelig økning i antall målte celler på en bestemt tid. Motparten er en reduksjon av antall punkt målt per celle. Det betyr at denne metoden ikke er designet for å gi en detaljert analyse av en enkelt celle. Metoden gjelder bare for celler som får plass i brønnene i PDMS-stempelet. Stempelet er ganske allsidig, mens det inneholder brønner på 1,5 x 1,5 μm2 opp til 6 x 6 μm2. Likevel er det umulig å immobilisere bacillus eller mye større celler. Stempelet og kapillær konvektiv avsetning kan ikke brukes til å immobilisere pattedyrceller som er mye større (rundt 100 μm i lengde).
I denne sammenhengen utviklet Peric et al.19 en smart mikrofluidisk enhet for å immobilisere bacillus som Escherichia coli og bacillus subtilis. Denne enheten gjør det mulig å immobilisere bacillus ved definerte posisjoner og under fysiologiske forhold. Det ville være veldig interessant å tilpasse programvaren til den spesielle størrelsen på denne enheten.
Tipsforurensning kan også være et problem i dette automatiserte systemet. Når det gjelder mikrobielle celler, er det ikke så utbredt, men det er av høy betydning når det gjelder pattedyrceller. Dujardin et al.11 løste dette problemet ved å legge til et rengjøringstrinn i deres automatiserte protokoll. Dette trinnet består i å sjekke lasersummen og aktivere rengjøringsprosedyren hvis summen er for lav. Det rene trinnet består av å nedsenke spissen i en brønn fylt med vann eller etanol.
Et spørsmål som systematisk oppstår fra dette automatiseringsarbeidet har vært: "Kommer heterogeniteten fra utviklingen av cellene under eksperimentet?". For å svare på dette spørsmålet plottet vi inn stivhetsresultatene som en funksjon av tid som presentert i figur 8A,B. Det viser tydelig at heterogene stivhetsverdier registreres når som helst under eksperimentet.
I samme sammenheng dukket spørsmålet om spissposisjonen under tiltaket opp. Det kan være mulig at kraftkurver registrert på kanten av en celle ville ha en annen stivhet enn FC registrert på toppen av cellene. For å unngå denne ulempen definerte vi det vi kalte det trygge området. Den er avbildet i figur 9A,B og representerer et område inne i brønnene der spissen ikke berører brønnkantene under kraftmåling. Ved å bruke dette "trygge området" kunne vi bare spille inn FC på celler og på toppen av dem. Som vist i figur 8C,D er tuppposisjonen innenfor det sikre området ikke ansvarlig for heterogeniteten til resultatene, da vi fant begge fenotypene for hver posisjon av spissen, i det sikre området.
For å sikre at verdiene som registreres i hver posisjon er homogene, tegnet vi inn stivhetsverdiene som en funksjon av posisjonen som presentert i figur 9C,D. Den viser at heterogene stivhetsverdier registreres på hver posisjon i brønnen, noe som betyr at den observerte heterogeniteten ikke er en artefakt på grunn av spissposisjonen i brønnene.
Protokollen som presenteres i denne artikkelen representerer et konseptuelt og metodisk gjennombrudd innen AFM anvendt i livsvitenskap. De store datamengdene som genereres er kompatible med automatisk analyse som utvilsomt vil tillate klassifisering av cellepopulasjoner i henhold til nye kriterier. Anvendelsen av denne protokollen til protein- eller sukkerkjeder er helt mulig og krever bare noen få tilpasninger for å vurdere avstanden mellom interesseområder.
Det er derfor en allsidig protokoll som er et resultat av sterkt tverrfaglig samarbeid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne FONCYCYT fra CONACYT (Mexico), Frankrikes utenriksdepartement og Université Paris 13, selv om den økonomiske støtten til det internasjonale samarbeidet ECOS-NORD-prosjektet kalt Nano-palpation for diagnose, No. 263337 (Mexico) og MI5P02 (Frankrike). AMR vil takke den økonomiske støtten til SIP-IPN gjennom prosjektet Nr. 20195489. SPC støttes av et ph.d.-stipend fra CONACYT (nr. 288029) og IPN gjennom cotutelle-avtalen om å få dobbelt ph.d.-sertifikat (IPN-UPS). ED og CFD er forskere ved Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
References
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al. Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).
- Dague, E. Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells. Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).
- Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells. Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).
- Formosa, C., et al. Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain. Scientific Reports. 2, (2012).
- Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).
- Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
- Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales. ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).
- Favre, M., et al. Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology. Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).
- Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications. PLOS ONE. 14 (3), 0213853 (2019).
- Formosa, C., et al. Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies. Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).
- Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells. Nanoscale Horizons. , (2019).
- Foncy, J., et al. Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography. Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).
- Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (101), e52867 (2015).
- Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
- Formosa, C., et al. Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).
- El-Kirat-Chatel, S., et al. Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans. Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).
- Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy. Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).
