Summary
Ce protocole décrit l’utilisation de la cytométrie en flux pour identifier les changements dans la composition des cellules immunitaires, le profil des cytokines et le profil de chimiokine dans l’environnement pulmonaire après une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne, un modèle murin d’AVC ischémique.
Abstract
L’expansion, l’activation et le trafic des cellules immunitaires vers les poumons, qui sont contrôlés par l’expression de cytokines et de chimiokines multiples, peuvent être altérés par une lésion cérébrale grave. Ceci est démontré par le fait que la pneumonie est une cause majeure de mortalité chez les patients qui ont souffert d’un AVC ischémique. L’objectif de ce protocole est de décrire l’utilisation de l’analyse cytométrique en flux multicolore pour identifier 13 types de cellules immunitaires dans les poumons de souris, y compris les macrophages alvéolaires, les macrophages interstitiels, les cellules dendritiques (DC) CD103+ ou CD11b+, les DC plasmacytoïdes, les éosinophiles, les monocytes / cellules dérivées de monocytes , les neutrophiles, les cellules T et B dérivées de lymphoïdes, les cellules NK et les cellules NKT, après induction d’un AVC ischémique par occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne. De plus, nous décrivons la préparation d’homogénats pulmonaires à l’aide d’une méthode d’homogénéisation des billes, afin de déterminer les niveaux d’expression de 13 cytokines ou chimiokines différentes simultanément par des réseaux de billes multiplex couplées à une analyse cytométrique en flux. Ce protocole peut également être utilisé pour étudier la réponse immunitaire pulmonaire dans d’autres contextes pathologiques, tels que les maladies pulmonaires infectieuses ou les maladies allergiques.
Introduction
Les poumons sont un organe barrière, exposés à l’environnement extérieur et, par conséquent, subissent constamment des défis immunologiques tels que des agents pathogènes et des allergènes1. L’activation des cellules immunitaires résidentes des poumons et l’infiltration des cellules immunitaires de la périphérie sont nécessaires pour éliminer les agents pathogènes de l’environnement pulmonaire. De plus, les cellules immunitaires résidentes des poumons maintiennent une tolérance aux bactéries commensales, ce qui suggère que ces cellules jouent un rôle dans l’élimination des agents pathogènes et le maintien de l’homéostasie1. Les macrophages alvéolaires et interstitiels font partie des cellules immunitaires sentinelles résidentes des poumons qui détectent les agents pathogènes via les récepteurs de reconnaissance des formes et éliminent ces agents pathogènes par phagocytose2. Les cellules dendritiques résidentes des poumons comblent la réponse immunitaire innée et adaptative par la présentation de l’antigène3. De plus, les cellules immunitaires innées locales activées produisent des cytokines et des chimiokines qui amplifient la réponse inflammatoire et stimulent l’infiltration de cellules immunitaires telles que les monocytes, les neutrophiles et les lymphocytes dans les poumons1. Il a été démontré que l’AVC ischémique modifie l’immunité systémique et entraîne une susceptibilité accrue à l’infection pulmonaire; Cependant, peu d’études ont évalué le compartiment pulmonaire à la suite d’un AVC ischémique, bien que certaines études l’aient examiné lors de conditions inflammatoires 4,5,6,7,8,9. L’objectif des méthodes décrites ici est de déterminer simultanément la pathologie pulmonaire, la composition des cellules immunitaires et les niveaux d’expression des cytokines et des chimiokines dans les poumons afin d’évaluer les altérations du compartiment pulmonaire et d’évaluer les altérations potentielles de la réponse immunitaire pulmonaire à la suite d’un accident ischémique.
Décrit ici est un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires des poumons des souris pour identifier 13 types de cellules immunitaires. Ce protocole est basé sur la digestion tissulaire avec la collagénase D sans avoir besoin d’un dissociateur tissulaire automatisé. De plus, nous avons développé un protocole pour préparer des homogénats tissulaires qui peuvent être utilisés pour déterminer les niveaux d’expression de 13 cytokines ou chimiokines différentes à l’aide de réseaux de billes multiplex basés sur la cytométrie en flux. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier les effets de l’AVC ischémique sur l’immunité pulmonaire et peut également être utilisé dans d’autres modèles de maladies.
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Protocol
Tous les protocoles et procédures effectués ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Virginie-Occidentale. Les souris ont été logées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques dans le vivarium de l’Université de Virginie-Occidentale.
1. Préparation des solutions
- Préparer un tampon de perfusion (solution saline tamponnée au phosphate, PBS). Utilisez environ deux aliquotes de 10 mL de PBS glacé par souris.
- Préparer le milieu cellulaire pulmonaire/tampon FACS. Le tampon FACS contient du PBS complété par 1% de sérum fœtal bovin (FBS). Conservez le froid moyen pendant tout le processus d’excision et de transfert pulmonaire. Préparer environ 8 mL par échantillon pulmonaire. Préparer un nouveau tampon milieu/FACS avant les expériences.
- Préparer un tampon de dissociation pour l’isolement d’une seule cellule. Buffer contient 1 mg/mL de collagénase D et 200 μg/mL de DNase I dans la solution de sel tamponné de Hank (HBSS). Préparer frais à partir de la solution mère (100 mg/mL de collagénase D et 10 mg/mL de DNase I) avant les expériences. Environ 6 mL par échantillon pulmonaire sont nécessaires. Assurez-vous que le tampon atteint la température ambiante avant l’utilisation.
- Préparer un tampon d’homogénéisation pour l’homogénéisation des tissus pulmonaires. Buffer contient du PBS et 1x cocktail de protéinases et d’inhibiteurs de phosphatase (stock = 100x). Préparez-vous fraîchement avant les expériences. Gardez le tampon froid pendant tout le processus d’homogénéisation. Environ 200 μL du tampon sont suffisants pour homogénéiser un seul lobe droit des poumons.
2. Occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (tMCAO)
REMARQUE : Les procédures pour le tMCAO par insertion de monofilament dans l’artère cérébrale moyenne ont été documentées en détail précédemment10. Dans ces expériences, des souris mâles C57BL/6J âgées de 8 à 12 semaines, pesant entre 25 et 30 g, ont été utilisées.
- En bref, administrer par voie sous-cutanée 2 mg / kg de méloxicam aux souris avant la chirurgie. Anesthésier profondément les souris dans une chambre d’induction en utilisant de l’isoflurane à 5%. Confirmer l’anesthésie profonde à l’aide de la méthode du pincement des orteils. Maintenir l’anesthésie avec 1-2% d’isoflurane pendant la chirurgie à l’aide d’un cône nasal. Maintenez la température corporelle entre 36,5 et 38 °C tout au long de la procédure en plaçant une couverture chaude sous les souris. Tous les outils chirurgicaux doivent être stérilisés en autoclave un jour avant la chirurgie.
- Raser et préparer la peau du cou ventral en utilisant de l’éthanol à 70% suivi d’un gommage à la chlorhexidine. Administrer par voie sous-cutanée 2 mg/kg de bupivacaïne sur la zone d’incision avant de faire la première incision. Utilisez une pommade pour les yeux pour couvrir les yeux afin de prévenir la sécheresse. Faites une incision médiane du cou. Écartez doucement les tissus mous autour de la trachée.
- Identifier l’artère carotide commune gauche et l’artère carotide externe.
- Appliquez une suture temporaire (taille 6/0) sur l’artère carotide commune pour endiguer le flux sanguin. Faites une incision dans l’artère carotide externe.
- Insérez un monofilament recouvert de caoutchouc de silicone (taille 6-0) dans l’artère carotide externe, puis avancez le monofilament vers l’artère cérébrale moyenne. Laisser le monofilament dans l’artère cérébrale moyenne pendant 60 min (occlusion).
- Surveillez le débit sanguin à l’aide de la débitmétrie Doppler laser. Une réduction du débit vers l’artère cérébrale moyenne qui est > 80% indique une occlusion réussie.
- Après les 60 min d’occlusion, retirez le monofilament pour permettre la reperfusion. Fermez l’incision.
- Chez les souris manipulées de manière simulée, effectuez les étapes 2.1 à 2.6 sans insérer le monofilament. Chez ces souris, le débit sanguin doit rester stable pendant toute la procédure.
- Surveiller les souris quotidiennement et mesurer les déficits neurologiques en utilisant les critères de notation standard11. 0 – pas de déficit neurologique; 1 – rétracte la patte avant controlatérale lorsqu’elle est soulevée par la queue; 2- cercles jusqu’à la controlatérale lorsqu’ils sont soulevés par la queue; 3- tomber au controlatéral en marchant; 4 – ne marche pas spontanément ou est comateux; 5 – mort.
- Fournir des injections sous-cutanées de solution saline et analgésique normale (méloxicam, 2 mg / kg) toutes les 24 heures pendant 3 jours après la chirurgie.
- Isoler les poumons 24 et 72 heures après tMCAO pour l’analyse en aval.
3. Prélèvement des tissus pulmonaires
- Anesthésier profondément la souris par injection intrapéritonéale (i.p.) de 100 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine. Confirmer l’anesthésie profonde à l’aide de la méthode du pincement des orteils.
- Pour effectuer la perfusion transcardique du corpsentier 12, épinglez la souris à la plate-forme chirurgicale et mouillez la fourrure avec de l’éthanol à 70% pour réduire la distribution de la fourrure dans la cavité corporelle. Utilisez des ciseaux à dissection fine pour faire une incision transversale dans l’abdomen caudal, puis une incision médiane du péritoine, en s’arrêtant à la cavité thoracique avant de percer le diaphragme.
- Ne coupez pas à travers le muscle / ne vous cachez pas dans la cavité péritonéale et ne continuez pas l’incision au-delà de l’abdomen.
- Arrêtez l’incision dès que la cavité thoracique a été atteinte avant de perforer le diaphragme. Veillez à ne pas endommager le cœur et les poumons qui pourraient compromettre la qualité de la perfusion ou la récupération cellulaire
- À l’aide de ciseaux à dissection fine, une incision médiane du péritoine s’arrête à la cavité thoracique avant de percer le diaphragme.
- Saisissez la souris par l’extrémité distale du sternum à l’aide d’une pince et soulevez-la vers le haut tout en coupant à travers le diaphragme en étant certain de ne pas endommager le cœur, les poumons ou le système vasculaire. Une fois que les organes sont visibles, faites une incision à travers la cage thoracique et séparez et épinglez le boîtier thoracique afin que le cœur et les poumons soient complètement exposés.
- Faites soigneusement une petite incision dans l’oreillette droite près de l’arc aortique. Cela servira d’écoulement pour la perfusion.
- Immédiatement après, insérez délicatement une aiguille de 25 G x 5/8 fixée à une seringue remplie de 10 ml de PBS froid dans la surface supérieure distale du ventricule gauche. Prenez soin de ne pas insérer à travers le septum ventriculaire dans le ventricule droit. L’aiguille doit être à peine insérée dans le ventricule gauche.
REMARQUE: Si le septum ventriculaire est percé, le liquide s’écoulera du nez de la souris. Cela diminuera la qualité de la perfusion et entraînera une perte cellulaire. - Si vous le souhaitez, une pince peut être utilisée pour maintenir l’aiguille solidement en place dans le ventricule gauche pendant la perfusion.
- Poussez régulièrement mais doucement 10 ml de PBS froid dans le cœur. Le tissu de souris devrait commencer à perfuser et à éliminer le sang lorsque le liquide sort de l’oreillette droite.
- Poussez une deuxième partie aliquote de 10 mL de PBS jusqu’à ce que le sang soit suffisamment clair. Le foie aura un aspect brun clair et les poumons passeront d’un rose rougeâtre à une couleur principalement blanche.
- À l’aide de pinces et de ciseaux à dissection fine, retirez soigneusement tous les tissus environnants, y compris le cœur, la trachée, l’œsophage, le thymus, le tissu conjonctif, les ganglions lymphatiques et les grosses bronches.
- Séparer les lobes pulmonaires individuels et placer les lobes dans une boîte de Petri sur de la glace contenant une partie aliquote de 1 à 2 ml de milieu cellulaire pulmonaire froid.
4. Homogénéisation du tissu pulmonaire pour les réseaux de billes multiplex à l’aide d’un homogénéisateur de billes
- Prérefroidir un tube à vis conique de 2 ml contenant 3 billes de zircone/silice stériles de 2,3 mm. Ajouter 200 μL de tampon d’homogénéisation à froid dans le tube.
- Peser le lobe, transférer le lobe dans le tube conique pré-refroidi contenant les billes et le tampon d’homogénéisation.
REMARQUE : Environ 50 à 100 mg de tissu homogénéisé dans 200 μL de tampon seront suffisants pour détecter l’expression de cytokines et de chimiokines dans l’échantillon.- Homogénéiser le lobe à l’aide d’un homogénéisateur à base de billes (voir le tableau des matériaux) à 4 000 tr/min pendant 2 min.
- Assurez-vous que le tissu est complètement homogénéisé. Augmentez le temps si nécessaire.
- Après homogénéisation, centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse prérefroidie (4 °C) à 15 870 x g pendant 3 min.
- Transférer les surnageants dans un microtube prérefroidi de 1,5 mL.
- Placer l’échantillon directement sur la glace pour une utilisation immédiate ou conserver l’échantillon à -80 °C pour une utilisation ultérieure. Évitez les cycles multiples de gel-dégel.
5. Dissociation du tissu pulmonaire et isolement unicellulaire
- Versez le milieu cellulaire pulmonaire des lobes pulmonaires restants pour éviter la dilution du tampon de dissociation. Ensuite, insérez délicatement une seringue de 1 mL avec une aiguille 25G et 5/8 contenant 1 mL du tampon de dissociation dans le tissu pulmonaire.
- Injecter de petites fractions (environ 1/4ème à 1/5ème) du tampon de dissociation dans chaque lobe pulmonaire et gonfler doucement.
REMARQUE: La majeure partie du tampon se précipitera peu de temps après le gonflage car le lobe a été excisé. - Répéter l’injection de tampon de dissociation 1-2x.
- Incuber les lobes pulmonaires avec un tampon de dissociation pendant 2 min à température ambiante.
- Hamincer finement les lobes pulmonaires en petits morceaux à l’aide de ciseaux à dissection fine.
- Transférer les morceaux de poumon hachés avec le tampon de dissociation dans un tube centrifuge de 15 mL. Compléter avec un tampon de dissociation supplémentaire jusqu’à un total de 6 mL. Vortex vigoureusement pendant 1 min.
- Incuber l’échantillon pendant 45 min à 37 °C. Vortex vigoureusement toutes les 7-8 minutes.
- Après 45 min d’incubation, vortex l’échantillon vigoureusement pendant 1 min pour des résultats optimaux.
- Dissocier davantage l’échantillon en passant à travers une crépine cellulaire de 100 μm pour éliminer les tissus conjonctifs résiduels, indésirables et interstitiels.
- Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 380 x g, éliminer le surnageant.
- Ajouter 5 mL de milieu cellulaire pulmonaire froid à l’échantillon. Remettez en suspension la pastille cellulaire par vortex doux.
- Centrifuger l’échantillon pendant 10 min à 380 x g, éliminer le surnageant.
- Ajouter 1 mL de milieu cellulaire pulmonaire froid. Remettez en suspension la pastille cellulaire par vortex doux.
- Passez à travers une passoire cellulaire de 100 μm et comptez les cellules.
6. Analyse cytométrique en flux pour la niche des cellules immunitaires pulmonaires
- Semer 1-2 x 106 cellules/anticorps dans une plaque inférieure ronde de 96 puits (3 ensembles au total). Centrifuger les cellules pendant 3 min à 830 x g. Jetez les surnageants.
- Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 50 μL de PBS froid contenant une coloration vivante/morte réparable. Préparez la tache conformément aux instructions du fabricant.
- Incuber les cellules à 4 °C pendant 20 min à l’abri de la lumière. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 830 x g. Jetez les surnageants.
- Remettez en suspension la pastille cellulaire avec 25 μL de tampon FACS froid contenant 5 μg/mL d’anticorps anti-souris CD16/32. Incuber à 4 °C pendant 10-15 min.
- Ajouter 25 μL de tampon FACS froid contenant les combinaisons d’anticorps énumérées dans le tableau 1 aux cellules. Mélanger par pipetage doux.
REMARQUE: Le volume total du tampon FACS pour la coloration des anticorps est de 50 μL. Par conséquent, lors de la préparation d’un mélange maître d’anticorps dans 25 μL, la concentration d’anticorps doit être le double de la concentration finale. - Incuber les cellules à 4 °C pendant 20 min à l’abri de la lumière. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 830 x g. Jetez les surnageants.
- Remettez les cellules en suspension avec 100 μL de tampon FACS froid. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 830 x g. Jetez les surnageants.
- Remettez les cellules en suspension avec 100 μL de tampon FACS froid. Transvaser dans un tube FACS à fond rond en polystyrène de 5 mL contenant 150 μL de tampon FAC supplémentaire. Analysez immédiatement l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux.
REMARQUE: La fixation des cellules à l’aide des étapes suivantes permet d’analyser les échantillons ultérieurement. - Après l’étape 6.7., remettre l’échantillon en suspension avec 100 μL de paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS.
- Incuber l’échantillon à 4 °C pendant 15 min à l’abri de la lumière. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 830 x g. Jetez les surnageants.
- Remettez les cellules en suspension avec 100 μL de tampon FACS froid. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 830 x g. Jetez les surnageants.
- Remettez les cellules en suspension avec 100 μL de tampon FACS froid. Stocker les cellules à 4 °C, à l’abri de la lumière. Analysez l’échantillon dans les 72 heures.
7. Réseaux de billes multiplex pour la détection de cytokines et de chimiokines
REMARQUE : Des panels de chimiokines pro-inflammatoires et de multiplex sur l’inflammation disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) ont été utilisés pour déterminer l’expression des chimiokines et des cytokines dans les poumons après l’induction de tMCAO conformément au protocole du fabricant, qui a été décrit en détail13.
- En bref, décongelez les analytes sur la glace s’ils ont été stockés à -80 °C après homogénéisation des tissus. Centrifuger l’échantillon à 590 x g pendant 2 min à 4 °C avant utilisation pour éliminer tout tissu résiduel.
- Générer une courbe étalon en diluant en série le cocktail standard (C7) qui est à une concentration connue de 10 ng/mL en 7 étalons (C1-6), le dernier étalon étant le tampon de dosage seul (C0).
- Une fois que tous les réactifs ont été réchauffés à température ambiante, ajouter 25 μL de chaque étalon et 25 μL de tampon d’essai sur une plaque de fond V de 96 puits.
- À chaque puits d’échantillonnage, ajouter 25 μL d’homogénat pulmonaire (analyte) et 25 μL de tampon d’essai dans une plaque de fond V de 96 puits.
- Vortex vigoureux les billes préenduites, puis ajouter 25 μL de billes pré-enduites à chacun des puits standard et échantillons.
- Scellez la plaque et protégez-la de la lumière en la recouvrant de papier d’aluminium. Agiter la plaque à 110 tr/min pendant 2 h à température ambiante.
- Centrifuger à 230 x g pendant 5 min. Ajouter 200 μL de tampon de lavage à 1x (la solution mère est de 20x, diluer à 1x avec de l’eau). Incuber pendant 1 min.
- Centrifuger à 230 x g pendant 5 min. Remettez en suspension l’étalon et l’échantillon avec des anticorps de détection de 25 μL.
- Scellez et couvrez la plaque pour la protéger de la lumière. Agiter la plaque à 110 tr/min pendant 1 h à température ambiante.
- Ajouter 25 μL de streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) à chaque étalon et bien prélever.
- Scellez et couvrez la plaque pour la protéger de la lumière. Agiter à 110 tr/min pendant 30 min à température ambiante.
- Faire tourner la plaque à 230 x g pendant 5 min. Remettez en suspension l’étalon et les échantillons dans 1x tampon de lavage.
- Transférer dans un tube FACS de 5 ml en polystyrène bien étiqueté contenant 150 μL supplémentaires de 1x tampon de lavage.
- Déterminer l’intensité de fluorescence du signal PE pour les étalons et les échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux.
- Construire une courbe standard pour chaque chimiokine et cytokine en utilisant l’intensité de fluorescence moyenne (ICM) de l’EP par rapport aux concentrations prédéterminées.
- Déterminer la concentration de chaque chimiokine et cytokine à l’aide de la courbe standard et de l’IMF de chaque échantillon. Le panel multiplex fournit un logiciel d’analyse de données qui peut être utilisé pour déterminer la concentration de chaque analyte. Le poids du lobe apical/supérieur est utilisé pour déterminer la concentration de cytokines ou de chimiokines par milligramme de tissu.
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Representative Results
Nous avons récemment rapporté que l’induction d’un AVC ischémique chez la souris modifie la composition des cellules immunitaires des poumons11. Plus précisément, l’ischémie cérébrale transitoire a augmenté les pourcentages de macrophages alvéolaires, de neutrophiles et de DC CD11b +, tout en diminuant les pourcentages de cellules T CD4+, de cellules T CD8+, de cellules B, de cellules NK et d’éosinophiles dans le compartiment pulmonaire. De plus, l’altération cellulaire correspondait à une diminution significative des niveaux de chimiokines multiples dans les poumons. Décrit ici est une méthode pour l’isolement et l’identification de différentes populations de cellules immunitaires dans le compartiment pulmonaire. Les résultats représentatifs présentés ici provenaient de souris ayant subi une induction de tMCAO et une opération fictive.
Nous avons identifié 13 populations différentes de cellules immunitaires dans les poumons (L1-L13) en utilisant 3 ensembles de combinaisons d’anticorps, chaque ensemble contenant 5 à 7 anticorps (Figure 1). Les cellules mortes ont été exclues en utilisant une coloration LIVE/DEAD dans chaque ensemble. Les anticorps et les marqueurs permettant de distinguer différents types de cellules immunitaires sont énumérés dans le tableau 1. Des macrophages alvéolaires et interstitiels, des DC CD103+, des DC CD11b+ et des éosinophiles ont été identifiés dans l’ensemble 1 (Figure 1A,B). Les monocytes pro-inflammatoires et les neutrophiles ont été identifiés dans l’ensemble 2 (Figure 1C). Au cours des réponses inflammatoires, les monocytes migrent vers le site de l’inflammation, où ces cellules se différencient en cellules présentatrices d’antigènes dérivés de monocytes (mo-APCs)14. La régulation négative de Ly6C et CCR2 est caractéristique de la différenciation des monocytes, qui peut être évaluée à l’aide de l’ensemble 2à 15. Les lymphocytes T CD4+, les lymphocytes T CD8+, les lymphocytes B, les DC plasmacytoïdes, les lymphocytes NK et les lymphocytes NKT ont été identifiés à l’aide de l’ensemble 3 (figure 1D).
Pour déterminer la qualité de notre protocole d’isolement unicellulaire, nous avons comparé le nombre de cellules viables et de cellules immunitaires CD45+ isolées à l’aide de la méthode manuelle avec les cellules isolées à l’aide d’un dissociateur tissulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux), qui est souvent utilisé pour isoler les cellules des tissus 16,17,18,19,20 . Dans ce dernier protocole, les lobes pulmonaires ont été transférés dans un tube spécifique au dissociateur (voir le tableau des matériaux) après l’injection du tampon de dissociation, et le tissu a été digéré à l’aide du programme 37C_m_LDK_1. Le nombre total de cellules viables, le pourcentage de cellules CD45+ et le nombre total de cellules CD45+ obtenues étaient comparables entre les deux méthodes (figure 2A-C). Le pourcentage de mort cellulaire parmi les cellules CD45+ utilisant les deux protocoles était de ~ 10 % (figure 2D). Ces résultats suggèrent que le protocole présenté ici permet une récupération cellulaire avec un rendement et une qualité élevés sans l’aide d’un dissociateur tissulaire automatisé.
Un test multiplex disponible dans le commerce couplé à une analyse cytométrique en flux a été utilisé pour déterminer la concentration de 13 chimiokines en utilisant 25 μL d’échantillon (Figure 3). Deux tailles différentes de billes ont d’abord été identifiées par le FSC/SSC (figure 3A). Chaque bille est recouverte de 6-7 anticorps primaires, qui peuvent être distingués par l’intensité de fluorescence dans le canal APC (Figure 3B). Le niveau de chimiokines dans l’échantillon est proportionnel à l’intensité de fluorescence dans le canal PE, qui pourrait être déterminée par MFI (Figure 3C). En comparant la valeur de l’IMF de chaque chimiokine avec la courbe standard construite avec les concentrations connues de chimiokine, la concentration dans l’échantillon (par mg de tissu) peut être déterminée.
Figure 1 : Identification de 13 types de cellules immunitaires dans les poumons après la digestion tissulaire avec la collagénase D après un AVC ischémique. Les tissus pulmonaires ont été excisés 24 heures après une opération tMCAO ou simulée, les cellules immunitaires dans les poumons ont été analysées par cytométrie en flux, définie par les marqueurs de surface énumérés dans le tableau 1. (A) Dans l’ensemble d’anticorps 1, les cellules viables CD45+ (*) ont d’abord été fermées sur Siglec F et CD11b pour identifier les macrophages alvéolaires (L1), qui exprimaient CD11c et CMH II, et les éosinophiles (L2), qui n’exprimaient pas CD11c et CMH II. (B) Les cellules de la population Siglec F- (**) dans A ont ensuite été fermées pour déterminer l’expression de CD103 et CD11b. CD103+ CD11b- (***). Les cellules ont ensuite été fermées pour déterminer l’expression de CD11c et du CMH II. Les CD CD103+ exprimaient à la fois CD11c et CMH II (L3), mais n’exprimaient pas CD64. La population de CD11b hi (****) a ensuite été fermée pour déterminer l’expression de CD64 et du CMH II. Les CD CD11b+ exprimaient le CMH II mais pas CD64 (L4), tandis que les macrophages interstitiels (L5) exprimaient les deux marqueurs. (C) Dans l’ensemble d’anticorps 2, les cellules viables CD45+ dans A ont été sélectionnées pour déterminer l’expression de CD11b et Ly6C. Les cellules Ly6C hi (*) représentaient les monocytes indifférenciés qui maintenaient un niveau élevé d’expression de CCR2 (L6, graphique du milieu), tandis que les cellules faibles de Ly6C (**) contenaient une population mixte de monocytes différenciateurs qui étaient Ly6G- (L6, graphique de droite) et Ly6G + neutrophiles (L7). (D) Dans l’ensemble d’anticorps 3, les cellules CD45+ viables dans A ont été fermées pour déterminer l’expression de CD11c et B220 afin d’identifier les cellules B (L8) et les DC plasmacytoïdes (L9). La population CD11c et B220- (*) a ensuite été fermée pour déterminer l’expression de CD4 et CD8 afin d’identifier les lymphocytes T CD4+ (L10) et les lymphocytes T CD8+ (L11). La population CD4-CD8- (**) a ensuite été contrôlée pour déterminer l’expression de NK1.1 et TCRb afin d’identifier les cellules NK (L12) et les cellules NKT (L13). Les tracés représentatifs de 12 souris C57BL/6J après tMCAO et opération simulée sont montrés. Certaines parties de la figure ont été réimprimées à partir de la littérature publiée précédemment11 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison entre la méthode de dissociation manuelle et l’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour isoler des cellules individuelles des poumons. (A-C) Le nombre total de cellules, le pourcentage de cellules CD45+ et le nombre total de cellules CD45+ ont été comparés. Les résultats combinés de 3 expériences indépendantes sont présentés. NS : non statistiquement significatif. (D) Des graphiques représentatifs pour déterminer le pourcentage de cellules CD45+ mortes après isolement. Les graphiques représentatifs de 3 expériences indépendantes sont présentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’AVC ischémique supprime la production de chimiokines multiples dans les poumons. (A-C) Tracés représentatifs montrant la détermination du niveau de 13 chimiokines dans les poumons par réseau de billes multiplexes. (A) La porte FSC/SSC a été utilisée pour identifier les billes A et B de tailles différentes. (B) Les anticorps primaires enrobés sur les billes pouvaient être distingués par l’intensité de fluorescence dans le canal APC. (C) Le niveau de chimiokines dans l’échantillon était proportionnel à l’intensité de fluorescence dans le canal PE. Les tracés représentatifs de 12 souris C57BL/6J après une opération fictive sont montrées. (D) Les tissus pulmonaires ont été homogénéisés 24 heures après l’oMCAO ou l’opération simulée. Le niveau de 13 chimiokines dans les poumons d’animaux individuels a été déterminé par réseau de billes multiplex. Les données présentées sont les résultats combinés de trois expériences indépendantes avec n = 11-12 animaux par groupe. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. NS, pas statistiquement différent. Certaines parties de la figure ont été réimprimées à partir de la littérature publiée précédemment11 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Anticorps | Clone | Type de cellules immunitaires | Population | Expression de marqueur de surface |
| CD45-FITC | 30-F11 | Macrophages alvéolaires | L1 | CD45+ Siglec F+ CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 | Éosinophiles | L2 | CD45+ Siglec F+ CD11b+ |
| CD11c-Percp/Cy5.5 | N418 | CD103+ CC | L3 | CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | CD11b+ CC | L4 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64- MHC II+ |
| CD64-APC | X54-5/7.1 | Macrophages interstitiels | L5 | CD45+ Siglec F- CD11b hi CD103- CD64+ MHC II+ |
| CD103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| Live/dead-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Monocytes/moDCs | L8 | CD45+ CD11b hi Ly6C hi/int CCR2+/- Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1.4 | Neutrophiles | L9 | CD45+ CD11b hi Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1A8 | |||
| Live/dead-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Plasmacytoïdes DC | L6 | CD45+ B220+ CD11c+ |
| CD8-PE | 53-6.7 | Cellules B | L7 | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | Lymphocytes T CD4+ | L10 | CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | N418 | Lymphocytes T CD8+ | L11 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+ |
| APC-B220 | RA3-6B2 | Cellules NK | L12 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| CD4-BV421 | GK1.5 | Cellules NKT | L13 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| TCRb-BV510 | N° H57-597 | |||
| Live/dead-APC/Cy7 |
Tableau 1 : Marqueurs de surface et combinaisons d’anticorps pour la détermination des cellules immunitaires isolées des poumons après tMCAO.
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Discussion
Les protocoles décrits ici permettent l’identification des types de cellules immunitaires pulmonaires et l’expression de chimiokines ou de cytokines chez la même souris. Si une étude histopathologique est souhaitée, un lobe individuel peut être enlevé et fixé à cette fin avant de procéder aux étapes d’isolement de la cellule unique. L’une des limites de cette méthode est que cette approche peut ne pas convenir à certains contextes de maladie si l’on s’attend à ce que le changement dans la composition des cellules immunitaires et l’expression des chimiokines et / ou des cytokines soient inégalement répartis entre les différents lobes des poumons. Par exemple, certaines bactéries, comme Mycobacterium tuberculosis, montrent une prédilection pour infecter certains lobes du poumon21. Dans ce cas, une comparaison entre les lobes peut être nécessaire.
La concentration, le temps d’incubation et la température du protocole d’isolement d’une seule cellule des poumons ont un impact critique sur la récupération des cellules immunitaires des poumons. La qualité de la collagénase D est essentielle pour obtenir des résultats optimaux et doit être testée si une source différente de collagénase D est utilisée. La surdigestion des tissus entraîne une augmentation de la mort cellulaire; alors que la sous-digestion des tissus entraîne un faible rendement des cellules immunitaires, en particulier des macrophages et des DC.
Nous avons utilisé 3 combinaisons d’anticorps pour déterminer 13 populations de cellules immunitaires dans les poumons, chaque ensemble contenant 5 à 7 anticorps et une coloration VIVANTE/MORTE. Les anticorps de chaque ensemble peuvent être combinés si le nombre de cellules obtenues à partir des échantillons est limité. Cependant, un problème majeur qui se pose lorsque le nombre d’anticorps est augmenté est que la compensation du signal de fluorescence sur le cytomètre de flux peut être difficile, en particulier lors de la distinction des cellules de la lignée myéloïde dans des conditions inflammatoires. Des cocktails d’anticorps supplémentaires peuvent être utilisés pour identifier d’autres cellules immunitaires innées dans la suspension unicellulaire, telles que les cellules lymphoïdes innées et les cellules T γδ, qui contribuent à la réponse immunitaire dans les poumons22,23. Étant donné qu’un lobe du poumon est prélevé pour le réseau multiplex, le nombre exact de chaque type de cellule dans les poumons ne peut pas être déterminé et comparé définitivement, ce qui constitue une limitation de cette méthode. Pour résoudre ce problème, un nombre défini de cellules peut être isolé des poumons de souris fictives et induites par tMCAO. Dans ce cas, le nombre absolu de chaque type de cellule immunitaire peut être comparé avec précision entre les deux groupes. De plus, cette méthode ne permet pas de déterminer la localisation des cellules immunitaires dans les poumons. Cela peut être accompli en effectuant une immunohistochimie sur des sections pulmonaires.
En conclusion, ce protocole a été utilisé pour étudier l’effet de l’AVC ischémique sur l’immunité pulmonaire, mais il peut également être utilisé pour étudier d’autres modèles de maladies, telles que l’infection et les allergies.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention P20 GM109098 des NIH et le programme Innovation Award de Praespero à Edwin Wan. Des expériences de cytométrie en flux ont été réalisées dans le WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, qui est soutenu par les subventions NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 et P20 GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
