Summary
Denne protokollen beskriver bruken av flowcytometri for å identifisere endringene i immuncellesammensetning, cytokinprofil og kjemokinprofil i lungemiljøet etter forbigående okklusjon av cerebri cerebralis, en murine modell av iskemisk hjerneslag.
Abstract
Immuncelleutvidelse, aktivering og handel til lungene, som styres av ekspresjon av flere cytokiner og kjemokiner, kan endres ved alvorlig hjerneskade. Dette fremgår av det faktum at lungebetennelse er en viktig årsak til dødelighet hos pasienter som har lidd av iskemisk slag. Målet med denne protokollen er å beskrive bruken av flerfarget flowcytometrisk analyse for å identifisere 13 typer immunceller i lungene til mus, inkludert alveolære makrofager, interstitielle makrofager, CD103+ eller CD11b+ dendrittiske celler (DCs), plasmacytoide DCer, eosinofiler, monocytter/monocytt-avledede celler, nøytrofiler, lymfoid-avledede T- og B-celler, NK-celler og NKT-celler, etter iskemisk slaginduksjon ved forbigående okklusjon av cerebrali cerebrial arterie. Videre beskriver vi fremstilling av lungehomogenater ved hjelp av en perlehomogeniseringsmetode, for å bestemme ekspresjonsnivåene av 13 forskjellige cytokiner eller kjemokiner samtidig ved multipleksperlearrayer kombinert med flowcytometrisk analyse. Denne protokollen kan også brukes til å undersøke pulmonal immunrespons i andre sykdomsinnstillinger, for eksempel smittsom lungesykdom eller allergisk sykdom.
Introduction
Lungene er et barriereorgan, utsatt for det ytre miljø og mottar derfor stadig immunologiske utfordringer som patogener og allergener1. Aktivering av lungeboende immunceller og infiltrasjon av immunceller fra periferien er nødvendig for å fjerne patogener fra lungemiljøet. I tillegg opprettholder lungeboende immunceller toleranse for kommensale bakterier, noe som tyder på at disse cellene spiller en rolle i patogenclearance og opprettholder homeostase1. Alveolære og interstitielle makrofager er blant de lungebosatte sentinelimmuncellene som registrerer patogener via mønstergjenkjenningsreseptorer og fjerner disse patogenene ved fagocytose2. Lungeboende dendrittiske celler bygger bro over den medfødte og adaptive immunresponsen gjennom antigenpresentasjon3. I tillegg produserer aktiverte lokale medfødte immunceller cytokiner og kjemokiner som forsterker den inflammatoriske responsen og stimulerer infiltrasjon av immunceller som monocytter, nøytrofiler og lymfocytter i lungene1. Iskemisk hjerneslag har vist seg å modifisere systemisk immunitet og føre til økt følsomhet for lungeinfeksjon; Imidlertid har få studier evaluert lungekammeret etter iskemisk slag, selv om noen studier har undersøkt det under inflammatoriske tilstander 4,5,6,7,8,9. Målet med metodene beskrevet her er samtidig å bestemme lungepatologi, immuncellesammensetning og nivåene av cytokin og kjemokinuttrykk i lungene for å evaluere endringer i lungekammeret og vurdere potensielle endringer i lungeimmunresponsen etter iskemisk angrep.
Beskrevet her er en protokoll for å oppnå enkeltcellesuspensjoner fra lungene til musene for å identifisere 13 typer immunceller. Denne protokollen er basert på vevsfordøyelse med kollagenase D uten behov for en automatisert vevdissosiator. I tillegg utviklet vi en protokoll for å forberede vevshomogenater som kan brukes til å bestemme ekspresjonsnivåene til 13 forskjellige cytokiner eller kjemokiner ved hjelp av flowcytometribaserte multipleksperlearrayer. Denne protokollen ble vellykket brukt til å undersøke effekten av iskemisk slag på lungeimmunitet og kan også brukes i andre sykdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller og prosedyrer som ble utført ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved West Virginia University. Musene ble plassert under spesifikke patogenfrie forhold i vivariumet ved West Virginia University.
1. Fremstilling av løsninger
- Forbered perfusjonsbuffer (fosfatbufret saltvann, PBS). Bruk omtrent to 10 ml aliquots iskald PBS per mus.
- Klargjør lungecellemedium/FACS-buffer. FACS-buffer inneholder PBS supplert med 1% føtalt bovint serum (FBS). Hold mediet kaldt for hele prosessen med lungeeksisjon og overføring. Klargjør ca. 8 ml per lungeprøve. Forbered fersk medium / FACS-buffer før eksperimentene.
- Forbered dissosiasjonsbuffer for enkeltcelleisolasjon. Buffer inneholder 1 mg / ml kollagenase D og 200 μg / ml DNase I i Hanks bufrede saltløsning (HBSS). Tilbered fersk fra stamløsningen (100 mg/ml kollagenase D og 10 mg/ml DNase I) før forsøkene. Omtrent 6 ml per lungeprøve er nødvendig. Sørg for at bufferen når romtemperatur før bruk.
- Forbered homogeniseringsbuffer for homogenisering av lungevev. Buffer inneholder PBS og 1x proteinase og fosfatasehemmercocktail (lager = 100x). Forbered deg på nytt før forsøkene. Hold bufferen kald under hele homogeniseringsprosessen. Omtrent 200 μL av bufferen er tilstrekkelig til å homogenisere en enkelt høyre lungelapp.
2. Forbigående okklusjon av cerebrihjernen i midten (tMCAO)
MERK: Prosedyrer for tMCAO via monofilamentinnsetting i arteria cerebri media ble dokumentert i detalj tidligerekl. 10. I disse forsøkene ble 8- til 12 uker gamle mannlige C57BL / 6J-mus, som veide 25-30 g, brukt.
- Kort sagt, administrer 2 mg/kg meloksikam subkutant til musene før kirurgi. Bedøve musene dypt i et induksjonskammer ved bruk av 5% isofluran. Bekreft dyp bedøvelse ved hjelp av tå-pinch-metoden. Opprettholde anestesi med 1-2% isofluran under operasjonen ved hjelp av en nesekegle. Hold kroppstemperaturen på 36,5 - 38 °C gjennom hele prosedyren ved å plassere et varmt teppe under musene. Alle kirurgiske verktøy skal autoklavsteriliseres en dag før operasjonen.
- Barber og forbered huden på ventralhalsen ved bruk av 70% etanol etterfulgt av klorhexidinskrubb. Administreres subkutant 2 mg/kg bupivakain over snittområdet før første snitt foretas. Bruk øyesalve til å dekke øynene for å forhindre tørrhet. Lag et midtlinjehalssnitt. Trekk forsiktig til side bløtvev rundt luftrøret.
- Identifiser venstre felles halspulsåren og den eksterne halspulsåren.
- Påfør en midlertidig sutur (størrelse 6/0) til den vanlige halspulsåren for å stoppe blodstrømmen. Gjør et snitt i den eksterne halspulsåren.
- Sett inn et silikongummibelagt monofilament (størrelse 6-0) inn i den eksterne halspulsåren, og før deretter monofilamentet til den midterste hjernearterien. La monofilamentet ligge i arteria cerebri media i 60 minutter (okklusjon).
- Overvåk hastigheten på blodstrømmen ved hjelp av laserdopplerflytmetri. En reduksjon i strømningshastigheten til den midterste hjernearterien som er > 80% indikerer en vellykket okklusjon.
- Etter 60 minutters okklusjon, fjern monofilamentet slik at reperfusjonen kan oppstå. Lukk snittet.
- I humbug-opererte mus, utfør trinn 2.1-2.6 uten innsetting av monofilamentet. I disse musene bør blodstrømmen forbli stabil under hele prosedyren.
- Overvåk musene daglig og mål de nevrologiske underskuddene ved hjelp av standard scoring kriterier11. 0 – ingen nevrologiske utfall; 1 - trekker inn kontralateral forepaw når den løftes av halen; 2- sirkler til det kontralaterale når det løftes av halen; 3- faller til kontralateral mens du går; 4 – går ikke spontant eller er komatøs; 5 - død.
- Gi subkutane injeksjoner av vanlig saltvann og smertestillende middel (meloksikam, 2 mg/kg) hver 24. time i 3 dager etter operasjonen.
- Isoler lungene 24 og 72 timer etter tMCAO for nedstrømsanalysen.
3. Høsting av lungevevet
- Bedøve musen dypt ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon av 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin. Bekreft dyp bedøvelse ved hjelp av tå-pinch-metoden.
- For å utføre hele kroppen transkardial perfusjon12, fest musen til kirurgisk plattform og våt pels med 70% etanol for å redusere pelsfordelingen i kroppshulen. Bruk fin disseksjonssaks for å lage et tverrgående snitt i den kaudale magen og deretter et midtlinjeinnsnitt av bukhinnen, og stopp ved brysthulen før du gjennomborer membranen.
- Ikke skjær gjennom muskelen/skjul deg inn i bukhulen og ikke fortsett snittet forbi magen.
- Stopp snittet så snart brysthulen er nådd før du punkterer membranen. Pass på at du ikke skader hjertet og lungene som kan kompromittere perfusjonskvaliteten eller cellegjenoppretting
- Ved hjelp av fin disseksjonssaks gjør du et midtlinjesnitt av bukhinnen som stopper ved brysthulen før du gjennomborer membranen.
- Ta tak i musen i den distale enden av brystbenet ved hjelp av tang og løft oppover mens du skjærer gjennom membranen, og vær sikker på ikke å skade hjertet, lungene eller vaskulaturen. Når organene er synlige, gjør et snitt gjennom ribbe buret og skille og pin tilbake ribbe saken slik at hjertet og lungene er fullt eksponert.
- Lag forsiktig et lite snitt i høyre atrium nær aortabuen. Dette vil tjene som utstrømning for perfusjonen.
- Umiddelbart etter, stikk forsiktig en 25 G x 5/8 nål festet til en sprøyte fylt med 10 ml kald PBS inn i den distale øvre overflaten av venstre ventrikel. Vær forsiktig så du ikke setter inn gjennom ventrikulær septum i høyre ventrikel. Nålen skal knapt settes inn i venstre ventrikel.
MERK: Hvis ventrikkelseptum er gjennomboret, vil væske rush ut fra musens nese. Dette vil redusere perfusjonskvaliteten og resultere i celletap. - Om ønskelig kan en klemme brukes til å holde nålen sikkert på plass i venstre ventrikel under perfusjonen.
- Jevnt, men forsiktig skyv 10 ml kald PBS inn i hjertet. Musevev skal begynne å perfusere og fjerne blodet når væske kommer ut fra høyre atrium.
- Trykk en andre aliquot på 10 ml PBS til tilstrekkelig blodclearance har skjedd. Leveren vil ha et lysebrunt utseende og lungene vil gå over fra en rødaktig rosa til for det meste hvit i fargen.
- Ved hjelp av tang og fin disseksjonssaks, fjern forsiktig alle omkringliggende vev, inkludert hjerte, luftrør, spiserør, tymus, bindevev, lymfeknuter og store bronkier.
- Skill individuelle lungelapper og legg i en petriskål på is som inneholder en 1-2 ml aliquot av kaldt lungecellemedium.
4. Homogenisering av lungevev for multipleksperlearrayer ved bruk av perlehomogenisator
- Forkjøl et 2 ml konisk skrukorkrør inneholdende 3 sterile 2,3 mm zirkonium/silikaperler. Tilsett 200 μL kald homogeniseringsbuffer til røret.
- Vei loben, overfør loben til det forkjølte koniske røret som inneholder perlene og homogeniseringsbufferen.
MERK: Omtrent 50-100 mg vev homogenisert i 200 μL buffer vil være tilstrekkelig for å påvise cytokin og kjemokinuttrykk i prøven.- Homogeniser loben ved hjelp av en perlebasert homogenisator (se materialtabell) ved 4000 o / min i 2 minutter.
- Sørg for at vevet er fullstendig homogenisert. Øk tiden om nødvendig.
- Etter homogenisering sentrifugerer røret i en forkjølt (4 °C) mikrosentrifuge ved 15 870 x g i 3 minutter.
- Overfør supernatantene til et forkjølt 1,5 ml mikrorør.
- Legg prøven direkte på is for umiddelbar bruk, eller oppbevar prøven ved -80 °C for fremtidig bruk. Unngå flere fryse-tine-sykluser.
5. Lungevevsdissosiasjon og enkeltcelleisolasjon
- Hell lungecellemediet av, av de gjenværende lungelappene for å unngå fortynning av dissosiasjonsbufferen. Sett deretter forsiktig inn en 1 ml sprøyte med 25G og 5/8 kanyle som inneholder 1 ml dissosiasjonsbuffer i lungevevvet.
- Injiser små fraksjoner (ca. 1/4til 1/5th) av dissosiasjonsbufferen i hver lungelapp og blås forsiktig opp.
MERK: Det meste av bufferen vil skynde seg ut kort tid etter oppblåsing ettersom loben har blitt skåret ut. - Gjenta injeksjonen av dissosiasjonsbuffer 1-2x.
- Inkuber lungelobene med dissosiasjonsbuffer i 2 minutter ved romtemperatur.
- Finhakk lungelappene i små biter ved hjelp av fin disseksjonssaks.
- Overfør de hakkede lungestykkene med dissosiasjonsbufferen til et 15 ml sentrifugerør. Tillegg med ekstra dissosiasjonsbuffer til totalt 6 ml. Vortex kraftig i 1 min.
- Inkuber prøven i 45 minutter ved 37 °C. Vortex kraftig hver 7-8 min.
- Etter 45 min inkubasjon, vortex prøven kraftig i 1 min for optimale resultater.
- Dissosiere prøven ytterligere ved å passere gjennom en 100 μm cellesil for å fjerne rest, uønsket bindende og interstitielt vev.
- Sentrifuge prøven i 10 min ved 380 x g, kast supernatanten.
- Tilsett 5 ml kaldt lungecellemedium i prøven. Resuspender cellepelleten ved forsiktig vortexing.
- Sentrifuge prøven i 10 min ved 380 x g, kast supernatanten.
- Tilsett 1 ml kaldt lungecellemedium. Resuspender cellepelleten ved forsiktig vortexing.
- Pass gjennom en 100 μm celle sil, og telle celler.
6. Flow cytometrisk analyse for lunge immuncelle nisje
- Frø 1-2 x 106 celler/antistoff satt inn i en 96 brønn rund bunnplate (3 sett totalt). Sentrifuge cellene i 3 min ved 830 x g. Kast supernatanter.
- Resuspender cellepelleten i 50 μL kald PBS som inneholder fikserbar levende / død flekk. Forbered flekken i henhold til produsentens instruksjoner.
- Inkuber cellene ved 4 °C i 20 minutter beskyttet mot lys. Sentrifuge cellene i 3 min ved 830 x g. Kast supernatanter.
- Resuspender cellepelleten med 25 μL kald FACS-buffer inneholdende 5 μg/ml anti-mus CD16/32 antistoff. Inkuber ved 4 °C i 10-15 min.
- Tilsett 25 μL kald FACS-buffer som inneholder antistoffkombinasjoner oppført i tabell 1 til cellene. Bland med forsiktig pipettering.
MERK: Totalt volum av FACS-buffer for antistofffarging er 50 μL. Derfor, når du forbereder en hovedblanding av antistoffer i 25 μL, bør konsentrasjonen av antistoffer være dobbelt så stor som den endelige konsentrasjonen. - Inkuber cellene ved 4 °C i 20 minutter beskyttet mot lys. Sentrifuge cellene i 3 min ved 830 x g. Kast supernatanter.
- Resuspender cellene med 100 μL kald FACS-buffer. Sentrifuge cellene i 3 min ved 830 x g. Kast supernatanter.
- Resuspender cellene med 100 μL kald FACS-buffer. Overfør til et polystyren rundbunnet 5 ml FACS-rør som inneholder 150 μL ekstra FAC-buffer. Analyser prøven umiddelbart ved hjelp av et flowcytometer.
MERK: Cellefiksering ved hjelp av følgende trinn gjør det mulig å analysere prøver senere. - Etter trinn 6.7., resuspender prøven med 100 μL 1% paraformaldehyd i PBS.
- Inkuber prøven ved 4 °C i 15 minutter beskyttet mot lys. Sentrifuge cellene i 3 min ved 830 x g. Kast supernatanter.
- Resuspender cellene med 100 μL kald FACS-buffer. Sentrifuge cellene i 3 min ved 830 x g. Kast supernatanter.
- Resuspender cellene med 100 μL kald FACS-buffer. Oppbevar cellene ved 4 °C, beskyttet mot lys. Analyser prøven innen 72 timer.
7. Multipleksperlearrayer for cytokin- og kjemokindeteksjon
MERK: Kommersielt tilgjengelige proinflammatoriske kjemokin- og inflammasjonsmultiplekspaneler (se Materialfortegnelse) ble brukt til å bestemme uttrykket av kjemokiner og cytokiner i lungene etter tMCAO-induksjon i henhold til produsentprotokollen, som er beskrevet i detalj13.
- Kort fortalt tine analyttene på is hvis de ble lagret ved -80 °C etter vevshomogenisering. Sentrifuge prøven ved 590 x g i 2 minutter ved 4 °C før bruk for å fjerne restvev.
- Generer en standardkurve ved å serielt fortynne standardcocktailen (C7) som har en kjent konsentrasjon på 10 ng / ml i 7 standarder (C1-6) med den siste standarden som analysebuffer alene (C0).
- Når alle reagenser har varmet opp til romtemperatur, tilsett 25 μL av hver standard og 25 μL analysebuffer til en V bunn 96 brønnplate.
- Til hver prøvebrønn tilsettes 25 μL lungehomogenat (analytt) og 25 μL analysebuffer til en V bunn 96 brønnplate
- Vortex de forhåndsbelagte perlene kraftig, tilsett deretter 25 μL forhåndsbelagte perler til hver av standard- og prøvebrønnene.
- Forsegl platen og beskytt mot lys ved å dekke med folie. Rist tallerkenen ved 110 o / min i 2 timer ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 230 x g i 5 min. Tilsett 200 μL vaskebuffer ved 1x (lageroppløsning er 20x, fortynn til 1x med vann). Inkuber i 1 min.
- Sentrifuge ved 230 x g i 5 min. Resuspender standarden og prøven med 25 μL deteksjonsantistoffer.
- Forsegl og dekk platen for å beskytte mot lys. Rist tallerkenen ved 110 o / min i 1 time ved romtemperatur.
- Tilsett 25 μL streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) til hver standard og prøvebrønn.
- Forsegl og dekk platen for å beskytte mot lys. Rist ved 110 o / min i 30 minutter ved romtemperatur.
- Spinn platen ved 230 x g i 5 min. Resuspender standarden og prøvene i 1x vaskebuffer.
- Overfør til et godt merket polystyren rundbunnet 5 ml FACS-rør som inneholder en ytterligere 150 μL 1x vaskebuffer.
- Bestem PE-signalfluorescensintensiteten for standardene og prøvene ved hjelp av et flowcytometer.
- Konstruer en standardkurve for hvert kjemokin og cytokin ved å bruke gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av PE mot de forhåndsbestemte konsentrasjonene.
- Bestem konsentrasjonen av hvert kjemokin og cytokin ved hjelp av standardkurven og MFI fra hver prøve. Multiplex-panelet gir dataanalyseprogramvare som kan brukes til å bestemme konsentrasjonen av hver analytt. Vekten av apikal / overlegen lobe brukes til å bestemme konsentrasjonen av cytokiner eller kjemokin per milligram vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi rapporterte nylig at iskemisk slaginduksjon hos mus endrer immuncellesammensetningen i lungene11. Spesielt økte forbigående cerebral iskemi prosentandelen av alveolære makrofager, nøytrofiler og CD11b + DCs, mens de reduserte prosentandelen av CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler, NK-celler og eosinofiler i lungekammeret. Videre korresponderte cellulær forandring med signifikant reduserte nivåer av flere kjemokiner i lungene. Beskrevet her er en metode for isolering og identifisering av forskjellige immuncellepopulasjoner i lungekammeret. Representative resultater vist her var fra mus som hadde gjennomgått tMCAO-induksjon og en humbugoperasjon.
Vi identifiserte 13 ulike populasjoner av immunceller i lungene (L1-L13) ved hjelp av 3 sett antistoffkombinasjoner med hvert sett med 5-7 antistoffer (figur 1). Døde celler ble ekskludert ved hjelp av en LIVE / DEAD-flekk i hvert sett. Antistoffer og markører for å skille mellom ulike immuncelletyper er listet opp i tabell 1. Alveolære og interstitielle makrofager, CD103+ DC, CD11b+ DCer og eosinofiler ble identifisert i sett 1 (figur 1A,B). Proinflammatoriske monocytter og nøytrofiler ble identifisert i sett 2 (figur 1C). Under inflammatoriske responser migrerer monocytter til stedet for betennelse, hvor disse cellene skiller seg ut i monocytt-avledede antigenpresenterende celler (mo-APCs)14. Nedregulering av Ly6C og CCR2 er karakteristisk for monocyttdifferensiering, som kan evalueres ved hjelp av sett 215. CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, B-celler, plasmacytoide DCer, NK-celler og NKT-celler ble identifisert ved bruk av sett 3 (figur 1D).
For å bestemme kvaliteten på vår enkeltcelleisolasjonsprotokoll, sammenlignet vi antall levedyktige celler og CD45+ immunceller isolert ved hjelp av den manuelle metoden med cellene isolert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig vevdissosiator (se Materialtabell), som ofte brukes til å isolere celler fra vev 16,17,18,19,20 . I sistnevnte protokoll ble lungelappene overført til et dissosiatorspesifikt rør (se materialtabell) etter injeksjon av dissosiasjonsbufferen, og vevet ble fordøyd ved hjelp av 37C_m_LDK_1-programmet. Det totale antallet levedyktige celler, prosentandel av CD45+-celler og det totale antallet CD45+-celler som ble oppnådd, var sammenlignbare mellom de to metodene (figur 2A-C). Prosentandelen av celledød blant CD45+-celler som brukte begge protokollene var ~ 10% (figur 2D). Disse resultatene tyder på at protokollen som presenteres her tillater cellegjenoppretting med høyt utbytte og kvalitet uten hjelp av en automatisert vevdissosiator.
En kommersielt tilgjengelig multipleksanalyse kombinert med flowcytometrisk analyse ble brukt til å bestemme konsentrasjonen av 13 kjemokiner ved bruk av 25 μL prøve (figur 3). To ulike størrelser perler ble først identifisert av FSC/SSC (figur 3A). Hver perle er belagt med 6-7 primære antistoffer, som kan skilles ved fluorescensintensitet i APC-kanalen (figur 3B). Nivået av kjemokiner i prøven er proporsjonalt med fluorescensintensiteten i PE-kanalen, som kan bestemmes av MFI (figur 3C). Ved å sammenligne MFI-verdien for hvert kjemokin med standardkurven konstruert med kjente konsentrasjoner av kjemokin, kan konsentrasjonen i prøven (per mg vev) bestemmes.
Figur 1: Identifisering av 13 immuncelletyper fra lungene etter vevsfordøyelse med kollagenase D etter iskemisk hjerneslag. Lungevev ble skåret ut 24 timer etter tMCAO eller humbugoperasjon, immunceller i lungene ble analysert ved flowcytometri, definert ved overflatemarkører listet opp i tabell 1. (A) I antistoffsett 1 ble CD45+ levedyktige celler (*) først inngjerdet på Siglec F og CD11b for å identifisere de alveolære makrofagene (L1), som uttrykte CD11c og MHC II, og eosinofiler (L2), som ikke uttrykte CD11c og MHC II. (B) Celler i Siglec F-populasjonen (**) i A ble deretter inngjerdet for å bestemme uttrykket av CD103 og CD11b. CD103+ CD11b- (***). Celler ble videre inngjerdet for å bestemme uttrykket av CD11c og MHC II. CD103+ DC-er uttrykte både CD11c og MHC II (L3), men uttrykte ikke CD64. CD11b hi-populasjonen (****) ble videre inngjerdet for å bestemme uttrykket av CD64 og MHC II. CD11b+ DCer uttrykte MHC II, men ikke CD64 (L4), mens interstitielle makrofager (L5) uttrykte begge markørene. (C) I antistoffsett 2 ble CD45+ levedyktige celler i A inngjerdet for å bestemme ekspresjonen av CD11b og Ly6C. Ly6C hi-celler (*) representerte de udifferensierte monocyttene som opprettholdt et høyt nivå av CCR2-ekspresjon (L6, midtre plott), mens Ly6C lave celler (**) inneholdt en blandet populasjon av differensierende monocytter som var Ly6G- (L6, høyre plott) og Ly6G + nøytrofiler (L7). (D) I antistoffsett 3 ble CD45+ levedyktige celler i A gated for å bestemme ekspresjonen av CD11c og B220 for å identifisere B-celler (L8) og plasmacytoid DCs (L9). CD11c- og B220-populasjonen (*) ble deretter inngjerdet for å bestemme uttrykket av CD4 og CD8 for å identifisere CD4 + T-celler (L10) og CD8 + T-celler (L11). CD4- CD8-populasjonen (**) ble videre inngjerdet for å bestemme ekspresjonen av NK1.1 og TCRb for å identifisere NK-celler (L12) og NKT-celler (L13). Vist er representative plott fra 12 C57BL / 6J mus etter tMCAO og humbug drift. Deler av figuren er gjengitt fra tidligere publisert litteratur11 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sammenligning mellom manuell dissosiasjonsmetode og bruk av vevsdissosiator for isolering av enkeltceller fra lungene. (AC) Totalt antall celler, prosentandelen CD45+-celler og totalt antall CD45+-celler ble sammenlignet. Vist er kombinerte resultater fra 3 uavhengige eksperimenter. NS: ikke statistisk signifikant. (D) Representative plott for å bestemme prosentandelen av døde CD45+-celler etter isolasjon. Vist er representative tomter fra 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Iskemisk hjerneslag undertrykker produksjonen av flere kjemokiner i lungene. (AC) Representative plott som viser bestemmelsen av nivået av 13 kjemokiner i lungene ved multipleksperlearray. (A) FSC/SSC gate ble brukt til å identifisere perler A og B med forskjellig størrelse. (B) Primære antistoffer belagt på perlene kan skilles ved fluorescensintensitet i APC-kanalen. (C) Nivået av kjemokiner i prøven var proporsjonalt med fluorescensintensiteten i PE-kanalen. Vist er representative plott fra 12 C57BL/6J mus etter humbugoperasjon. (D) Lungevev ble homogenisert 24 timer etter tMCAO eller humbugoperatio. Nivået på 13 kjemokiner i lungene til individuelle dyr ble bestemt av multipleksperlearray. Data som vises er kombinerte resultater fra tre uavhengige forsøk med n = 11-12 dyr per gruppe. *, P < 0,05; **, P < 0,01; , P < 0,001. NS, ikke statistisk annerledes. Deler av figuren er gjengitt fra tidligere publisert litteratur11 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antistoff | Klon | Type immunceller | Befolkning | Uttrykk for overflatemarkør |
| CD45-FITC | 30-F11 | Alveloar makrofager | L1 | CD45+ Siglec F+ CD11b- |
| Siglec F-PE | E50-2440 | Eosinofiler | L2 | CD45+ Siglec F+ CD11b+ |
| CD11c-Percp/Cy5.5 | N418 | CD103+ DC-er | L3 | CD45+ Siglec F- CD11b- CD103+ CD11c+ MHC II+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | CD11b+ DC-er | L4 | CD45 + Siglec F- CD11b hei CD103- CD64- MHC II + |
| CD64-APC | X54-5/7.1 | Interstitielle makrofager | L5 | CD45 + Siglec F- CD11b hei CD103- CD64 + MHC II + |
| CD103-BV421 | 2E7 | |||
| MHC II-BV510 | M5/114.15.2 | |||
| Live/dead-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Monocytter/moDCs | L8 | CD45+ CD11b hei Ly6C hi/int CCR2+/- Ly6G- |
| Ly6C-PE | HK1.4 | Nøytrofile | L9 | CD45+ CD11b hei Ly6C int CCR2- Ly6G+ |
| CD11b-PE/Cy7 | M1/70 | |||
| CCR2-BV421 | SA203G11 | |||
| Ly6G-BV510 | 1A8 | |||
| Live/dead-APC/Cy7 | ||||
| CD45-FITC | 30-F11 | Plasmacytoid DCs | L6 | CD45+ B220+ CD11c+ |
| CD8-PE | 53-6.7 | B-celler | L7 | CD45+ B220+ CD11c- |
| NK1.1-Percp/Cy5.5 | PK136 | CD4+ T-celler | L10 | CD45+ B220- CD11c- CD4+ CD8- |
| CD11c-PE/Cy7 | N418 | CD8+ T-celler | L11 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8+ |
| APC-B220 | RA3-6B2 | NK-celler | L12 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb- |
| CD4-BV421 | GK1.5 | NKT-celler | L13 | CD45+ B220- CD11c- CD4- CD8- NK1.1+ TCRb+ |
| TCRb-BV510 | H57-597 | |||
| Live/dead-APC/Cy7 |
Tabell 1: Overflatemarkører og antistoffkombinasjoner for bestemmelse av immunceller isolert fra lungene etter tMCAO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene beskrevet her tillater identifisering av lungeimmuncelletyper og ekspresjon av kjemokiner eller cytokiner i samme mus. Hvis en histopatologisk studie er ønsket, kan en individuell lobe fjernes og festes for det formålet før du går videre til enkeltcelleisolasjonstrinnene. En begrensning ved denne metoden er at denne tilnærmingen kanskje ikke er egnet i noen sykdomsinnstillinger hvis endringen i immuncellesammensetningen og ekspresjonen av kjemokiner og / eller cytokiner forventes å være ulikt fordelt mellom forskjellige lungelapper. For eksempel viser noen bakterier, som Mycobacterium tuberculosis, en forkjærlighet for å infisere visse lober i lungen21. I dette tilfellet kan det være nødvendig med en sammenligning mellom lober.
Konsentrasjonen, inkubasjonstiden og temperaturen til enkeltcelleisolasjonsprotokollen fra lungene påvirker kritisk utvinningen av immuncellene fra lungene. Kvaliteten på kollagenase D er avgjørende for å oppnå optimale resultater og bør testes hvis en annen kilde til kollagenase D brukes. Over-fordøyelse av vev resulterer i en økning av celledød; mens underfordøyelse av vevet forårsaker lavt utbytte av immunceller, spesielt makrofager og DC.
Vi brukte 3 antistoffkombinasjoner for å bestemme 13 immuncellepopulasjoner i lungene, hvor hvert sett inneholdt 5-7 antistoffer og en LIVE/DEAD-flekk. Antistoffer i hvert sett kan kombineres dersom antall celler oppnådd fra prøvene er begrenset. Et stort problem som oppstår når antall antistoffer økes, er imidlertid at kompensasjonen av fluorescenssignalet på flowcytometeret kan være utfordrende, spesielt når man skiller celler fra myelogen linage under inflammatoriske forhold. Ytterligere antistoffcocktailer kan brukes til å identifisere andre medfødte immunceller i enkeltcellesuspensjonen, for eksempel medfødte lymfoide celler og γδ T-celler, som bidrar til immunresponsen i lungene22,23. Siden en lungelapp er tatt for multipleksmatrisen, kan det nøyaktige antallet av hver celletype i lungene ikke definitivt bestemmes og sammenlignes, og dette utgjør en begrensning av denne metoden. For å løse dette kan et definert antall celler isoleres fra lungene til humbug og tMCAO-induserte mus. I dette tilfellet kan det absolutte antallet av hver immuncelletype sammenlignes nøyaktig mellom de to gruppene. I tillegg tillater denne metoden ikke lokalisering av immuncellene i lungen som skal bestemmes. Dette kan oppnås ved å utføre immunhistokjemi på lungeseksjoner.
Avslutningsvis ble denne protokollen brukt til å undersøke effekten av iskemisk hjerneslag i lungeimmunitet, men den kan også brukes til å studere andre sykdomsmodeller, som infeksjon og allergier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipend P20 GM109098 og innovasjonsprisprogrammet fra Praespero til Edwin Wan. Flowcytometri-eksperimenter ble utført i WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, som støttes av NIH-tilskudd S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 og P20 GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
