Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61365
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

Summary

פרוטוקול זה משתמש יזם פלורסנט-כתבים, מיקרוסקופית תא חי, וחילוץ הכללה בודדים בגישה גנטית קדימה מכוונת לזהות ולבודד מוטציות התפתחותיות של כלמידיה trachomatis.

Abstract

הפתוגן התוך תאי כלמידיה trachomatis עובר מחזור התפתחותי המורכב משתי צורות התפתחותיות מורפולוגית דיסקרטית. הגוף היסודי שאינו משוכפל (EB) יוזם זיהום של המחשב המארח. ברגע שנכנס, EB מבדיל לתוך הגוף reticulate (RB). לאחר מכן RB עובר סיבובים מרובים של שכפול, לפני ההבדיל בחזרה לטופס EB מדבק. מחזור זה חיוני להישרדות כלמידית ככישלון לעבור בין סוגי תאים מונע פלישה מארחת או שכפול.

מגבלות בטכניקות גנטיות בשל האופי התוך תאי המחייב של כלמידיה יש לעכב את הזיהוי של המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיתוח סוג התא. עיצבנו מערכת פלסמיד מקדם-כתב-יזם-חדשני, שבילוב עם מיקרוסקופית תאים חיים, מאפשרת הדמיה של החלפת סוג תא בזמן אמת. כדי לזהות גנים המעורבים ברגולציה של פיתוח סוג תא, מערכת יחצ"ן-כתב תא חי היה ממונף לפיתוח גישה גנטית קדימה על ידי שילוב mutagenesis כימי של זן הכתב הכפול, הדמיה ומעקב של כלמידיה עם קינטיקה התפתחותית שונה, ואחריו בידוד clonal של מוטציות. זרימת עבודה גנטית זו קדימה היא כלי גמיש שניתן לשנות לחקירה מכוונת למגוון רחב של מסלולים גנטיים.

Introduction

כלמידיה trachomatis (Ctr) הוא פתוגן תאי חובה המתקדם דרך מחזור התפתחותי דו-פאזי חיוני להישרדותווהתפשטותו 1. מחזור זה מורכב משתי צורות התפתחותיות, הגוף היסודי (EB) והגוף reticulate (RB). EB הוא שכפול לא יושר אבל מתווכת פלישה לתא באמצעות אפקט המושרה אנדוציטוזיס2. פעם אחת במארח, EB מתבגר RB משוכפל. RB מבצע סיבובים מרובים של שכפול לפני המרה בחזרה EB על מנת ליזום סיבובים הבאים של זיהום.

המערך המוגבל של כלים גנטיים הגביל את רוב המחקר הכלמידלי למחקרים ביוכימיים או לשימוש במערכות חלופיות. כתוצאה מכך, ההבררה של ויסות גנים ושליטה במחזור ההתפתחותי היהקשה 3,4. אחד האתגרים החשובים יותר בתחום הכלמידיאלי הוא מעקב זמני ברזולוציה גבוהה של מחזור התפתחותי כלמידיאלי וזיהוי החלבונים המעורבים בוויסותו. ביטוי גנים במהלך מחזור התפתחותי כלמידי בוצע באופן מסורתי על ידי הרסני "נקודת קצה" שיטות כולל RNAseq, qPCR, מיקרוסקופית תאקבוע 5,6. למרות ששיטות אלה סיפקו מידע רב ערך, הטכניקות המועסקות הן מייגעות ויש להןרזולוציה זמנית נמוכה 5,6.

בעשור האחרון, מניפולציה גנטית של Ctr התקדמה עם המבוא של טרנספורמציה פלסמיד ושיטות mutagenesis7,,8,9. עבור מחקר זה, מערכת מבוססת פלסמיד פותחה כדי לפקח על התפתחות כלמידיאל בהכללות בודדות בזמן אמת במהלך זיהום. נוצר טרנספורמטציה כלמידית שהביעה הן RB והן EB סוג ספציפי יחצ"ן ספציפי-כתב. הכתב הספציפי RB נבנה על ידי היתוך היזם של הגן RB מוקדם euo במעלה הזרם של קלובר חלבון פלורסנט. EUO הוא רגולטור שעתוק המדכא תת קבוצה של גנים הקשורים EB מאוחר10. היזם של hctB, אשר מקודד חלבון דמוי היסטון מעורב עיסוק גרעין EB, שוכפל ישירות במעלה הזרם של mKate2 (RFP) כדי ליצור את הכתב הספציפי EB11. עמוד השדרה של hctBנשף-mKate2 /euoהנשף-תלתן היה p2TK2SW27. מקדמי HCTB ו-euo הוגדלו מהדנ"א הגנומי CTR-L2. כל רצף מקדם כלל ~ 100 זוגות בסיס במעלה הזרם של אתר ההתחלה שעתוק חזוי עבור הגן הכלמידיאלי שצוין בתוספת 30 נוקלאוטיד הראשון (10 חומצות אמינו) של ORF בהתאמה. גרסאות FP פלורסנט הושגו באופן מסחרי כמו Ctr קודון אופטימיזציה בלוקים גנים משוכפלים במסגרת עם 30 נוקלאוטיד הראשון של כל גן כלמידיאלי יחצ"ן. המחסל של ה-INCD שוכפל ישירות במורד הזרם של mKate2. האמרגן-כתב השני הוכנס במורד הזרם של המחסל של ה-INCD. גן התנגדות אאמפיצילין(bla)ב p2TK2SW2 הוחלף בגן aadA (התנגדות ספקטינומיצין) מ pBam4. התוצאה הייתה המבנה הסופי p2TK2-hctBנשף-mKate2/euoנשף-תלתן (איור 1A) שהפך Ctr-L27. זן זה RB / EB כתב מותר להתבוננות של מחזור התפתחותי בתוך הכללות יחיד באמצעות מיקרוסקופי תא חי(איור 1B,C).

העסקת היזם-כתב שלנו מבנה בשילוב עם mutagenesis כימי, פרוטוקול הומצא כדי לעקוב ולבודד שיבוטים בודדים שהפגינו חריגות התפתחותיות מאוכלוסיות mutagenized של Ctr serovar L2. פרוטוקול זה מאפשר ניטור ישיר של הכללות כלמידיות בודדות, מעקב אחר פרופילי ביטוי גנים לאורך זמן, זיהוי שיבוטים כלמידיים המבטאים דפוס ביטוי גנים התפתחותי שונה, ובידוד מוחלט של כלמידיה מהכללות בודדות.

למרות פרוטוקול זה נוצר במיוחד לזיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות כלמידית, זה יכול להיות מותאם בקלות לחקור כל מספר של מסלולים גנטיים כלמידיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל קבצי ה- Script של פיתון המשמשים בפרוטוקול זה זמינים ב- Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. כתב מוטגניז כלמידיה

הערה: Ctr-L2-hctBהנשף-mKate2/euoהנשף-תלתן EBs היו מוטאגניים ישירות באמצעות אתיל מתנסולפונט (EMS) במדיה axenic CIP-1 כמו מדיה זו תומכת חילוף חומרים EB ותחזוקה של EBזיהומית 12.

  1. להפשיר מלאי כלמיד על קרח המכיל ~ 3 x 107 EBs טרנספורמציה עם p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover כתב plasmid וכדור ב >14,000 x g עבור 30 דקות ב 4 °C.
    הערה: אורגניזמים כלמידיה המשמשים לניסויים אלה היו 30% renografin צפיפות מטוהרת וקפוא ב -80 ° C ב 1x סוכרוז-פוספט-גלוטמט מאגר (SPG).
  2. השליכו את הסופרנטנט ופנסו מחדש את גלולת ה-EB ב-100 μL של מאגר CIP-1 עם sonication על קרח ב-10% כוח עבור 10 שניות. לחלק את 100 μL של השעיית EB לשני 50 μL aliquots עבור mutagenized וללעוג לדגימות שטופלו.
  3. הכן 20 מ"ג/מ"ל של פתרון EMS-CIP-1 בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מ"ל. כדי לעשות זאת, להוסיף 6.8 μL של EMS ב 375 μL נפח כולל.
  4. להוסיף 50 μL של פתרון EMS-CIP-1 לאחד aliquots כלמידיאל עבור mutagenesis ו 50 μL של CIP-1 רק אליקו כלמידיאל אחרים עבור mutagenesis מדומה.
    הערה: ריכוז EMS הסופי הוא 10 מ"ג/מ"ל. טטר כלמידיאל, ריכוז EMS, ואת זמן החשיפה בשימוש בפרוטוקול זה להוביל לירידה של כ 60-80% בצידים זיהומיים. רמה זו של הפחתה מתאימה ~ 5-20 נגעים DNA לכל הגנום כלמידיאלי8.
  5. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. ה-EBs המוגניים ישמשו ישירות להדבקת מונושכבות בסעיף 2.
    התראה: EMS הוא מסרטן ידוע. כל הציוד והחומרים באים במגע עם EMS חייב להיות ספוג 1 M NaOH במשך 24 שעות לפני ההשלכה, כפפות יש להשתמש בכל עת במהלך הפרוטוקול וניקוי של חומרי EMS.

2. הדמיה של Ctr מוטציה

  1. תרבות תא מארחת להדמיה ובידוד של Ctr מוטאגניים
    1. זרע צלחת 6 גם זכוכית תחתית עם 6 x 105 Cos-7 תאים (ATCC) לכל באר ב 2 מ"ל של מדיה מלאה (RPMI-1640 בתוספת עם 10% סרום לשור עוברי ו 10 מ"ג / מ"ל gentamicin). השתמש בצלחת התחתונה זכוכית זו להדמיה של Ctr mutagenized.
    2. זרע 24 צלחת פוליסטירן גם עם 1 x 105 Cos-7 תאים (ATCC) לכל באר 1 מ"ל מדיה מלאה. השתמש בצלחת פוליסטירן זה לדבקות מחדש של כלמידיה מבודדת של עניין.
    3. דגירה שתי הצלחות ב 5% CO2, 37 ° C עבור כ 18 שעות. ברגע תאים להגיע confluency, להחליף מדיה עם מדיה מלאה בתוספת 1 μg / מ"ל של ציקלוהקסמיד ותדגירה בן לילה.
  2. הדבקת תרבות התא המארח עם Ctr מוטאגניים
    1. להדביק 5 בארות של צלחת תחתית זכוכית עם ~ 6 x 105 של EBs mutagenized ב 1.5 מ"ל / גם קרח קר HBSS. כתוצאה מכך MOI של ~ 0.3 כמו ~ 70% שיעור התמותה צפוי עקב mutagenesis.
    2. להדביק את הבאר הנותרת עם ~ 2 x 105 מדומה mutagenized EBs ב 1.5 מ"ל / גם קרח קר HBSS. ללא mutagenesis, לצפות פחות תמותה, ולכן שליש אינוקולום משמש כדי להשיג את MOI של ~ 0.3.
      הערה: MOI של ~ 0.3 מבטיח כי תאים מארח נגועים EB יחיד ומאפשר את ההפרדה מספיק בין תאים נגועים לבידוד clonal.
    3. דגירה את הצלחת במשך 15 דקות, עם נדנדה, ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. לשטוף את התאים המארחים הנגועים עם מחממים מראש (37 °C) HBSS המכיל 1 מ"ג / מ"ל heparin ואחריו מיד שטיפה HBSS. חזור על שטיפה הפרין, מיד שטיפה 2x עם HBSS כדי להבטיח את ההפרין מוסר.
      הערה: הפרין מעכבת יכולה להפוך את האינטראקציות האלקטרוסטטיות המוקדמות בין התא המארח לבין13 13. ההפרין שוטפת את האי.בי.אס שטרם נכנסו לתאים המארחים, ומסנכרנת את הזיהום. בעת שטיפת תאים לעשות זאת בעדינות כדי למנוע את ניתור התאים מפני השטח של בארות. פתרונות HBSS ו-Heparin מכילים שאריות EMS שיורית ויש למצוא אותן בבקת המכילה 1 M NaOH למשך 24 שעות לפני ההשלכה.
    5. החלף את HBSS עם 4 מ"ל/באר של מדיית הדמיה טרום-מחממת (37°C) (מדיה מלאה, 1 μg/mL ציקלוהקסמיד, 20 mM HEPES, ואין פנול אדום).
    6. מלא את החללים הפנימיים עם H2O מחמם מראש (37°C) כדי לסייע בפקד הטמפרטורה ולהפחית את האידוי. דגירה את הצלחת ב 37 ° C אינקובטור עם 5% CO2 עבור 10 שעות.
  3. מיקרוסקופ להגדיר והדמיה
    הערה: הדמיית פלורסנט אוטומטית מרובת תאים חיים מרובת צבעים משמשת לאיסוף תמונות של זמן-לשגות כדי לזהות מוטנטים כלמידיים השונים בדינמיקה של ביטוי גנים התפתחותיים. פרוטוקול זה מנצל את חבילת התוכנה μManager קוד פתוח עבור בקרת מיקרוסקופ אוטומטית14.
    1. התחל את הגדרת מיקרוסקופ 10 שעות לאחר זיהום. הגדר את האינקובטור שלב מיקרוסקופ 5% CO2, 37 ° C. מניחים את 6 צלחת זכוכית גם הנגועה לתוך אינקובטור הבמה ולהכניס את thermistor המדגם לתוך interwell H2O.
    2. כיול שלב XY באמצעות תוסף הקרנת תוכן גבוה (HCS). לחץ על תוספים | כלי רכישה | HCS אתר מחולל בתוכנה בקרת מיקרוסקופ μManager (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
    3. בחר את תבנית לוח 6-באר וליצור רשימת מיקום הדמיה המורכבת 12 שדות תצוגה (FOV) לכל גם בתוך תוסף HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). פתח את רשימת מיקומי הבמה והתמקד באופן ידני והגדר את מיקום ה- Z המוקדם עבור כל FOV באמצעות התוסף בקרת במה (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). התאם את קואורדינטות ה- XY של כל FOV המכיל תאים חסרים או שאינו מכיל שכבת מונומרת אחידה.
      הערה: בשל הזמן שלוקח לכל תמונה ללכד, ניתן יהיה לקחת מספר מרבי של 72 FOV לכל מרווח זמן של 30 דקות.
    4. השתמש בעדשת מטרה של 20x להדמיה. הגדלה זו מאפשרת ~ 8 הכללות להיות תמונה לכל FOV תוך מתן הרזולוציה הרצויה.
    5. שמור את רשימת התפקידים כפי שישמש לאיתור הכללות של עניין לאחר ניתוח נתונים (JoVE61365_screenfile7).
    6. השתמש באפשרות מיקוד אוטומטי בתוכנה להדמיה, כדי להגדיר את המוקד להדמיה אוטומטית (JoVE61365_screenfile8).
    7. השתמש בבחירה ובערכים הבאים כדי להפיק את תוצאות המוקד העקביות ביותר באמצעות מיקוד אוטומטי מבוסס תמונה ב- μManager. בחלון מאפייני מיקוד אוטומטי, בחר OughtaFocus מהתפריט הנפתח והשתמש בהגדרות הבאות. SearchRange_350, אוטהפוקוס-Tolerance_: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: כן, צריךפוקוס-למקסם: חדים, צריךפוקוס-ערוץ: DIC.
      הערה: הפחתת חלון ההדמיה של המיקוד האוטומטי על-ידי הפחתת גורם החיתוך מאפשרת מיקוד אוטומטי עקבי יותר. בחירה באפשרות כן עבור OughtaFocus-ShowImages מאפשרת למשתמש להציג את תמונת הפוקוס האוטומטי.
    8. ללכוד את הקינטיות של מחזור התפתחותי על ידי הדמיה במשך 24 שעות עם מרווחי זמן 30 דקות (JoVE61365_screenfile9). הדמיה בין 12-36 HPI מבטיח כי כלמידיה משלים את המחזור ההתפתחותי, אך אינו lyse התא המארח.
    9. תמונה מונושכבות התא עם חשיפה של 250 ms בעוצמה של 4% ו 18% בערוצים GFP ו RFP,בהתאמה( JoVE61365_screenfile10 ). זהה את אות תלתן (GFP) על-ידי העירה ב- 470 ננ"מ עם מסנן פליטת bandpass 514/30 nm. זהה את אות mKate2 (RFP) על-ידי העירה ב- 595 ננ"מ ועם מסנן פליטת bandpass 641/75 ננ"מ.
      הערה: מזעור עוצמת העירור הוא קריטי למזעור פלואורופור פוטו-בלייע ופוטוטו-אקסיסיות לכלמידיה. עוצמת העירור המינימלית כדי ליצור תמונה נפתרה עם חשיפה של 200-300 ms צריכה להיקבע באופן אמפירי במחקרי פיילוט.
    10. לכוד פרוסות Z מרובות עם טווח מיקוד שמסתיים משני צדי פרוסת המיקוד. בניסוי זה, בהגדלה של פי 20, הושגה זו עם 4 פרוסות ב-10שלבים (JoVE61365_screenfile11).
    11. בחר יחסית Z להדמיה של פרוסות מרובות בחלון הרכישה. האפשרות Z יחסית משתמשת במיקום מישור Z שנשמר ברשימת מיקום ההדמיה כנקודת ההתחלה עבור מרווח הזמן הבא. הזן את ערכי היסט Z המתאימים עבור ערוצי הדמיה פלואורסצנטיים (JoVE61365_screenfile12).
      הערה: מערכת המיקוד המבוססת על תמונה אינה מושלמת ועל פני תקופת הדמיה של 24 שעות, הדבר מוביל להיסחף מיקוד. נמצא כי על ידי לכידת 3-4 Z מיקוד מטוסים עבור כל נקודת זמן תמונה בפוקוס נשמרה. היסט Z נדרש כדי לתקן את ההבדלים במטוסי המוקד בין ערוצי התמונה הפלורסנטיים לערוץ DIC. יהיה צורך בקביעה אמפירית של קיזוז ה-Z הזה.
    12. שמור תמונות על-ידי בחירת ספריית הבסיס ומתן שמות לניסוי. השתמש באפשרות קובץ מחסנית תמונות μManager כדי לשמור תמונות כקבצי מחסנית tiff (JoVE61365_screenfile13).
    13. רמת פרטים ניסיוניים בתיבה הערות רכישות בחלון רכישה מרובת D (JoVE61365_screenfile13). כלומר, ובכן A1: שליטה לא מטופלת. ובכן A2-3 ו B1-3: מוטנטים EMS. הדמיה: 12-36HPI. התחל את רכישת התמונה ב- 12 HPI.
      הערה: אם אתה משתמש ב- μManager, השאר את התוכנית, את ההתקנה הניסיונית ואת חומרת המיקרוסקופ הפועלת לאחר השלמת הניסוי. אתרי ההדמיה ייבחנו מחדש לבידוד הכללה לאחר השלמת ניתוח האוכלוסייה המוטגנית.

3. לזהות ולבודד כלמידיה מוטאגנית עם פנוטיפים התפתחותיים שהשתנו

  1. יצירת מחסנית תמונות בפוקוס
    1. חלץ את התמונה המורכזת ביותר מערימות ה- Z באמצעות נתוני התמונה השמורים המכילים 4 פרוסות Z לנקודת זמן. השתמשו באפשרות מדידת קורטוזיס (נתח | מידה) ב- ImageJ/FIJI כדי לזהות באופן אוטומטי את הפרוסה Z המוקד ביותר (ציון קורטוזיס הגבוה ביותר) וליצור מחסנית תמונה חדשה עם תמונות אלה רק במוקד. קובץ Script של Python נכלל כקובץ משלים (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) כדי להפוך תהליך זה לאוטומטי.
  2. לכמת ביטוי פלואורסנטי בהכללות בודדות
    הערה: כדי לכמת את הביטוי קינטיקה של שני הכתבים להשתמש ביישום ניתוח תמונה קוד פתוח ImageJ/FIJI ואת תוסף Trackmate15. Trackmate מזהה 'נקודות' (המתאימות להכללות במקרה זה) ועוקב אחריהם באמצעות מחסנית תמונה לשגות זמן המתעדת את המיקום X,Y ואת עוצמת האות עבור כל הכללה לאורךזמן (JoVE61365_screenfile14). מידע זה נשמר כקובץ CSV וייובא למחברת פיתון מותאמת אישית לצורך ניתוח.
    1. פתח את מחסנית התמונה המופחתת Z בפוקוס ב- ImageJ/FIJI באמצעות יבואן בפורמטים ביולוגיים על-ידי לחיצה על תוספים | ביופורמטים | ביו-פורמטים היבואן. בחר Hyperstack ו- Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
    2. חיסור את רקע התמונה על-ידי לחיצה על תהליך | חיסור רקע באמצעות רדיוס כדור מתגלגל של 50.0 פיקסלים ושפר את ניגודיות התמונה ל- 0.3% עבור פיקסלים רוויים (Process | שפר את הניגודיות). הכפל את ערכי התמונה ב- 10.0 (תהליך | מתמטיקה | להכפיל) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
    3. ב- מעקב (תוספים | מעקב | Trackmate), בחר קוטר בועה משוער של 48 פיקסלים (נקבע באופן אמפירי בהתבסס על גודל ההכללה בסוף ההדמיה). הפק רצועות הכללה לא מפוצלות על-ידי בחירת מרחק מרבי מקשר ומרחק מרבי של 8.0 פיקסלים ו- Gap-closing-frame gap של 1 ( JoVE61365_screenfile23 -JoVE61365_screenfile25).
      הערה: כדי לשפר את היכולת של Trackmate לזהות ולעקוב אחר הכללות לאורך כל המחזור ערוץ תמונה נפרד נוצר על ידי הוספת הנשף euo וערוצי הנשף hctBיחד באמצעות פונקציית מתמטיקה תמונה ImageJ / FIJI. לאחר מכן, ערוץ זה משמש את Trackmate כדי לזהות ולעקוב אחר הכללות לאורך זמן. ערכי הפלורסנט של נשף הסיום של האיחודהאירופי וערוצי הנשף של ה-HCTBנרשמים לאחר מכן בערוצים 2 ו-3.
    4. רצועות שיא הנורמות משך זמן רציף מינימלי: משך המסלול: 20 (JoVE61365_screenfile26). נתח את הרצועות ושמור את הנקודות בסטטיסטיקת מעקב כקובץ CSV (JoVE61365_screenfile27).
      הערה: תהליך זה הפך לאוטומטי באמצעות קובץ Script מותאם אישית של פיתון המסופק בנתונים המשלים (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
  3. זיהוי רצועות הכללה עם פרופילים התפתחותיים שהשתנו
    הערה: כדי לזהות הכללות המכילות Chlamydia עם פרופילים התפתחותיים שהשתנו, כל רצועה כוללת הודמית באמצעות מחברת פיתון. פריטים חזותיים אלה מאפשרים זיהוי של הכללות עם פרופילי ביטוי גנים קינטיים השונים מהאוכלוסייה שטופלה בלעג. מחברת פיתון המשמשת לזיהוי הכללות עם תכנות התפתחותי שונה מסופקת בנתונים המשלים (EMS_Screen-מארקדאון).
    1. יבא את נתוני מסלול ההכללה Import מנקודות ברצועות סטטיסטיקה CSV קבצים לתוך מסגרת נתונים Pandas באמצעות התא ייבוא במחברת פיתון EMS_Screen-Markdown.
    2. תקן את תוכנית הבסיס כל רצועה על-ידי חיסור הערך המינימלי של כל רצועה משאר ערכי הרצועה באמצעות התאים חיסור בסיסי. שמור את הערכים המתוצרים כקובץ מלפפון חמוץ באמצעות התא שמור כמלפפון חמוץ. פעולה זו תשמור לצמיתות את ערכי הערוץ לאחר חיסור בסיסי לאחזור מאוחר יותר.
      הערה: חיסור בסיסי מגדיר את עוצמת הפלורסנט ההתחלתית של כל הכללה לאפס.
    3. בטל עקבות מהכללות ליד קצות ה-FOV באמצעות התא 'קצוות מסנן' מכיוון שפרופילי הפלורסנט שלהם לא יילכדו במלואם; עקבות אלה עשויים להפיק פרופילים התפתחותיים חיוביים כוזבים.
    4. כיול ערכי המסגרת (totalFrames) מפרוסות התמונה לזמן (startTime, interval) ערכים עם תא הכיול של זמן-lapse באמצעות שעת ההתחלה הניסיונית ומרווח זמן ההדמיה. אל תכלול קריאת הכללה חלקית על-ידי סינון עקבות שאינן משתרעות במהלך 20 השעות האחרונות של הניסוי (16-36 HPI) באמצעות התא Track Duration Duration Filter.
    5. הפרד מסלולים למסגרות נתונים בודדות לפי מצב ניסיוני באמצעות התא הקצאת טיפול. סנן עבור הכללות המציגות צמיחה מספקת באמצעות התא מסנן לצמיחה. בתא מסנן לצמיחה, באופן אמפירי להגדיר את סף עוצמת פלואורסצינטי עבור ערוץ הנשף euoעל ידי שינוי הערכים בתוך שתי שורות הקוד האחרונות. זה יסנון את כלמידיה שלא גדלה.
      הערה: היה זהיר בעת הגדרת מסנני סף, אם המסנן נמוך מדי, קווי הפיזור וכתוצאה מכך יהיו רועשים, אך אם הסינון מוגדר מוטנטים חשובים מדי עשויים להתבטל.
    6. חשב את אחוז התמותה הנגרמת על ידי EMS על ידי חלוקת מספר מסלולים מוטאגנים / גם על ידי מספר מסלולים שטופלו בלעג / גם. הכפל את מספר הרצועות שטופלו בלעג על-ידי גורם דילול ראשוני של 3 כדי לחשב את מספר הרצועות שטופלו בלעג/באר. השתמש ברצועות הכללת ספירה וחשב תאי תמותה אחוזים כדי לבצע משימה זו.
    7. חשב את השעה לביטוי חצי-ממקסימום עבור כתבים מוקדמים ואיחור עבור כל רצועה באמצעות התא חשב. ערכים אלה ישמשו להשוואה בין אוכלוסיות מוטגניות וללעג לזיהוי מוטנטים התפתחותיים.
    8. בתוך תא העלילה חצי מקס להשתמש בחבילת התוויית bokeh כדי לדמיין את הזמן לביטוי חצי מקסימום של כל יזם, גרף זמן הנשף euoלביטוי חצי מקסימום נגד זה של נשף HCTB. זהה הכללות מאוכלוסיית המוטנטים שנופלות מחוץ לענן הפיזור שטופל בלעג באמצעות סייר זיהוי המסלול האינטראקטיבי של בוקה. שים לב לנקודות הציון של FOV ו-XY של הכללות הריבית (איור 2).
      הערה: בחר הכללות מועמדים שבאופן חזותי נופלות מחוץ לענן הבקרה כאימות והערכה סטטיסטית של כל שיבוט יבוצעו לאחר מכן.
    9. בתוך תא העלילה אנימציה לדמיין שינויים בביטוי קינטיות היזם באופן דינמי לאורך זמן על ידי גרפים את עוצמת הביטוי של נשף הסיום של האיחודהאירופי נגד נשף hctBבאמצעות כלי התוויית העלילה16. פונקציית הפיזור של Plotly משמשת להנפיש את ביטוי הגן לאורך זמן(וידאו 1).
    10. הדמיה של תמונה מגרף המונפש העלילתי בתא איתור הכללה, התוויית נשף הסיום של euo וביטוי נשף hctBבנקודת זמן ספציפית (כלומר 28 HPI) באמצעות חבילת bokeh(איור 3). זהה הכללות מאוכלוסיית המוטנטים כמתואר בשלב 3.3.8.
      הערה: ניתוח זה צריך להתבצע במהירות (<4 h) כמו הכללות עדיין מתרחבים ויתחילו lyse תאים מארחים ~ 48 שעות לאחר הזיהום.
  4. לבודד מוטנטים התפתחותיים מהכללות של עניין
    הערה: כדי לבודד כלמידיה מן הכללות שהיו נחושים להציג ויסות גנים שונה micromanipulator עם מחטי נימה הועסק. נקודות הציון של מזהה באר, FOV ו-X,Y של הכללות של עניין נקבעו באמצעות פריט חזותי של נתונים בסעיף 3.3.
    1. הכן מחטי ניים על ידי החזקת מרכז צינור נערך בלהבה ומושך את שני קצות צינור נערך עד שהוא נפרד. צור פתח במחט נמש משך על ידי שבירת הקצה משך על שקופית מיקרוסקופ. כדי לשבור את המחט, מניחים את הקצה הסגור על החלק הקפוא של שקופית המיקרוסקופ בזווית ולהפעיל לחץ.
      הערה: מפרטי צינור נימוי היו 1.0 מ"מ O.D., 0.5 מ"מ מספר זמן.
    2. ודא כי פתיחת המחט היא בערך בגודל של הכללה תחת מיקרוסקופ, 20x המטרה.
    3. Prepull ~ 25-30 מחטי נכי לבידוד של הכללות מועמדים (מחט אחת לכל הכללה).
    4. מלא את המיקרוב בשמן מינרלי כדי להבטיח שלא יהיו בועות אוויר.
    5. חבר מחט נכים מזכוכית למיקרו-מזרק וגרש שמן לקצה המחט, ומחק את כל בועות האוויר. מניחים את מחט הנתים בתקשורת מלאה ולמשוך את התקשורת באמצע הדרך. מילוי מחט נימה עם מדיה מונע זיהום שמן בבאר.
    6. באמצעות רשימת המיקום שנשמר ב- μManager מ- 2.3.5, העבר אל הבאר ואת FOV של הכללת עניין שזוהתה במחברת ההדמיה Python.
    7. השתמש ג'ויסטיק של micromanipulator כדי למצוא את מחט נימה לנקודות הציון XY של הכללת עניין.
    8. השתמש בערוץ 595 נארם excitation כדי לדמיין EBs עבור חילוץ ואת שלב / DIC לבן אור ערוץ עבור הדמיית מחט. לתמרן את מחט נמש להכללה, לקרוע את ההכללה ולאחר מכן למשוך את האי.בי.אס לתוך מחט נימות באמצעות microinjector.
    9. לגרש את EBs ממחט נמש לתוך באר אחת של 24 גם פוליסטירן צלחת מוכן בשלב 2.1.2. הסר את מחט נימים ולהחליף עם מחט נימים טריים לחילוץ הכללה הבאה. חזור על סעיף 3.4 עבור כל הכללות המועמדים.
      הערה: להרחבה ולהבטיח טיטר גבוה מספיק להדמיה מחדש, מוטציה דגירה מבודדת ב 5% CO2, 37 ° C אינקובטור עד רוב התאים המארח נגועים (~ 1 שבוע). בארות צריך להיות במעקב צמוד כמו מבודדים שונים עשויים להפגין שיעורי צמיחה שונים.
  5. מוטנט קציר מבודד
    1. על קרח, לשבש את המונו-שכבתית הנגועה על ידי גירוד עם קצה מיקרופיפט 1 מ"ל. להעביר את התקשורת, פסולת התא, ושחרר כלמידיה לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    2. גלולה כלמידיה על ידי צנטריפוגציה במשך 30 דקות ב 4 ° C, >14,000 x g. הסר את גלולת supernatant וssuspend ב 75 μL של קרח קר 1x SPG. Aliquot לתוך שלוש 1.5 מ"ל בורג כובע צינורות microcentrifuge. לאחסן ב -80 °C.

4. אימות של פנוטיפים מוטנטים מבודדים

  1. תרבות תא מארחת להדמיית מבודד מוטאגניים
    1. זרע 96 גם זכוכית תחתון צלחת עם 1.6 x10 4 Cos-7 תאים (ATCC) לכל באר ב 100 μL של מדיה מלאה. דגירה ב 5% CO2, 37 °C. התאים אמורים להגיע לתופף בעוד כ-24 שעות. לאחר תאים הם confluent, להחליף מדיה עם מדיה מלאה בתוספת 1 μg / mL cycloheximide, דגירה בן לילה.
  2. להדביק תאים עם מועמד מבודד לאימות פנוטיפיק
    1. להפשיר שיבוטים מוטנטים וכלמידיה פראית על קרח.
    2. בצלחת 96 באר מוכן, לבצע דילול סדרתי כפול של מבודד מוטציה, באמצעות עמודה אחת לכל מבודד (11 עמודות). התחל עם דילול ראשוני של 1:20 ב 100 μl HBSS.
      הערה: דילול טורי של כלמידיה מתבצע כדי להבטיח דגימות מוטנטים הם תמונה ב MOI < 1.
    3. להדביק את העמודה הנותרת (12th) עם כלמידיה wildtype ב MOI ~ 0.5.
      הערה: כלמידיה Wildtype משמשים כפקד להשוואה נגד מבודד mutagenized.
    4. דגירה במשך 15 דקות נדנדה ב 37 מעלות צלזיוס.
    5. לשטוף תאים מארחים נגועים עם מחממים מראש (37 °C) HBSS עם 1 מ"ג / מ"ל של הפרין ו HBSS כפי שצוין בסעיף 2.2.
    6. החלף ב- 200 μL לכל באר של מדיית הדמיה חנוכת מראש (37°C).
    7. מלא את החללים המשולבים ב- H2O המיוער מראש (37°C).
    8. דגירה ב 5% CO2,37 °C עבור 10 שעות.
  3. כיוונון מיקרוסקופ
    הערה: עיין בסעיף 2.3 עבור הגדרת מיקרוסקופ, סעיף זה יכיל רק את השינויים הדרושים בהתקנה.
    1. בחר את תבנית צלחת 96 באר מתוך תוסף HCS.
    2. באופן אמפירי לקבוע בארות המתאימות MOI < 1 עבור כל מוטנט לבודד. ביטוי תלתן תחת שליטה של מקדם euo הוא נצפה ב ~ 10 HPI מה שהופך את ההדמיה המוקדמת של הכללות אפשרי(איור 1B).
    3. בחר שלוש בארות לכל מבודד מוטציה התואמות ל- MOI < 1 וצור רשימת מיקומי הדמיה המורכבת משני FOV לבאר.
      הערה: ניתן לשים לב רק 72 תמונות לכל מרווח זמן עקב אילוצי חומרה, זה משווה לשלוש דילול (בארות) לכל זן באמצעות שני אתרי הדמיה לכל באר אם 12 דגימות הן תמונה.
    4. רמת את המחזור ההתפתחותי של כל מוטנט מבודד למשך 36 שעות במרווחי זמן של 30 דקות החל מ- 12 HPI.
    5. רטוט את הפרטים הניסיוניים בתיבה הערות רכישות. כלומר, איי.בי.סי1. ובכן ABC2: זן מוטציה 1, ABC3: זן מוטציה 2, וכו '... הדמיה: 12-48 HPI.
    6. התחל את רכישת התמונה ב- 12 HPI.

5. ניתוח נתונים לאימות מבודד

  1. יצירת ערימות תמונה בפוקוס וכמת ביטוי פלואורסקנציה בהכללות בודדות
    1. צור עקבות עוצמת פלורסנט עבור כל הכללה כפי שצוין בסעיף 3.1 - 3.2.
  2. אימות מבודד mutagenized Ctr
    הערה: כדי לאמת את הפרופילים ההתפתחותיים שהשתנו של מבודדים מוטנטים, פרופילי הביטוי שלהם מושווים לפרופיל הביטוי wildtype באמצעות מחברת Python. מחברת פיתון המשמשת לאימות שיבוטים מוטנטים עם תכנות התפתחותי שונה מסופקת בנתונים המשלים (clone_check-Markdown).
    1. יבא וסנן את נתוני מעקב ההכללה במחברת clone_check-Markdown Python כפי שנעשה בסעיף 3.3.
    2. חשב את ממוצע וסטיית התקן (STD) מהעקבות של כל אוכלוסיית בקרה מבודדת ו- wildtype באמצעות התא חשב ממוצע ו- STD.
    3. עם Graph Iso לעומת WT התא להתוויה השגיאה הרגילה והממושעת של הצבע (SEM) של כל שיבוט מוטציה מול פקד wildtype כדי לקבוע אם קינטיות ביטוי מוטציה מפוצלים מדגימת wildtype(איור 4).
    4. לקבוע אם אוכלוסיית המוטנטים המבודדת היא clonal על ידי התוויית עקבות מוטציה והשוויה אותם עקבות הכללה wildtype באמצעות חלקת פיזור כפי שנעשה בסעיף 3.3 (שלבים 3.3.7-3.3.10) (איור 2, איור 3). אם המבודד הוא אוכלוסייה מעורבת, העלילה תראה אוכלוסייה אחת שכבה עם wildtype ואוכלוסייה נפרדת שנייה מחוץ לענן פיזור wildtype. אם האוכלוסייה נראית מעורבת, ניתן לבודד מחדש את המוטנט באמצעות ההליך המקורי המתואר בסעיף 3.4.
      הערה: כדי לקבוע אם הפרופיל ההתפתחותי של מבודד שונה סטטיסטית מסוג wildtype יש להשוות את הקימורים עבור כל מבודד ל- wildtype באמצעות ANOVA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מוטגנזה EMS ישיר של זן כלמידיאל היזם-כתב שלנו הביא לירידה של ~75% בהדבקה. באמצעות פרוטוקול הדמיה תא חי המתואר, כ-600 הכללות נותינו ואותרו במשך תקופה של 24 שעות. הביטוי הפלורסנט קינטיקה של שני הכתבים בכל הכללה היה חזותי באמצעות סקריפטים ניידים פיתון מותאם אישית. שתי גישות הדמיה יושמו כדי לזהות מועמד mutagenized כלמידיה לבידוד. המתודולוגיה הראשונה (שלב 3.3.8) מדמיינת את הזמן לביטוי חצי-מקסימלי של מקדמי euo ו-HCTB מבודדים כלמידיים בודדים בחלקת פיזוראינטראקטיבית (איור 2). הכללות זוהו לבידוד אם הם נפלו מחוץ לענן הפיזור שטופל בלעג. שיבוטים של מועמדים נבחרו שנפלו ויזואלית מחוץ לענן הבקרה. אימות של כל שיבוט בוצע לאחר מכן. שיבוטים A3-6-67 ו B3-8-58 נבחרו לבידוד כפי שהם הפיקו זמנים קצרים יותר כדי ביטוי חצי מקסימום מן היזם euo וזמנים ארוכים יותר עבור hctB (איור 2).

שיטת ההדמיה השנייה לזיהוי הכללות עם קינטיקה שונה (שלבים 3.3.9-10) מזהה הכללות בודדות המבוססות על הדמיה של ביטוי גנים דינמי משני היזמים (וידאו 1). שוב, נבחרו שיבוטים של מועמדים עם דפוסי ביטוי הכללה דינמיים שהיו שונים באופן ניכר מהכללות שליטה. B3-6-62 נבחר בשל הצטברות פלורסנט מוגברת מיזם האיחוד האירופי בין 23 ו 29 HPI(וידאו 1). תמונה של גרף המונפש צולמה כדי לזהות את המיקום של הכללות עניין (איור 3).

באמצעות שתי שיטות ההדמיה זוהו בסך הכל 24 הכללות לבידוד. מתוך 24 מבודדים סה"כ, 10 הראו קינטיקה דיפרנציאלית בעת בדיקה חוזרת. מבודדים אלה נפלו לשלוש קטגוריות פנוטיפיות; 8 מבודדים הציגו ירידה בביטוי נשף האיחודהאירופי בכ- 24 HPI, בהתאם לזמן המרת RB-EB, כפי שהוכח על ידי שיבוט A3-6-67(איור 4A). שני השיבוטים הנותרים הציגו פרופילים פנוטיפיים ייחודיים, B3-8-58 מבודד גם הציג ביטוי נשף euo ירדבכ 24 HPI, עדיין עלייה כוללת בביטוי נשף hctB(איור 4B), בעוד B3-6-62 הביע רמות גבוהות של פלואורסצנס מיזם euo ואחריו אובדן פתאומי של ביטוי בשניהיזמים (איור 4C). ניתוח של המיקרוגרפים של תאים חיים עבור מוטציה B3-6-62 גילה כי ליזיס התא המארח התרחש בתאים נגועים מוטציה זו הרבה יותר מוקדם מאשר בתאים נגועים wildtype(וידאו 2).

Figure 1
איור 1: ניטור פיתוח סוג תא עם Ctr יחצ"ן-כתבים.
(א)סכמטי של מבנה היזם-כתב, p2TK2-hctBנשף mKate2 /euoנשף-תלתן. (ב)מיקרוגרף תא חי של euoprom-Clover ו hctBהנשף-mKate2 ביטוי ב Ctr ב 10 HPI (C) מיקרוגרף תא חי של Ctr המביע euoנשף-תלתן ו hctBנשף mKate2 ב 36 HPI. סרגל קנה מידה: 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 2
איור 2: זיהוי הנציג מבודד את A3-6.67 ו- B3-8-58 על-ידי הדמיה של הזמן לביטוי חצי-ממקסם עבור כל מקדם.
הגרף האינטראקטיבי משמש לזיהוי כלמידיה מוטאגנית המציגה פרופילי ביטוי השונים מענן פיזור הבקרה שטופל בלעג. כל נקודה בגרף מייצגת הכללה אחת. נקודות הכללה A3-6-67 ו-B3-8-58 מסומנות כאשר הן נופלות מחוץ לענן המדומה, שתיהן מציגות זמן קצר יותר לביטוי חצי-מקסימלי של מקדם האיחוד האירופי בשילוב עם זמן ארוך יותר לביטוי חצי-מקסימלי של hctB. הנשף euo:x-ציר, hctBהנשף: y-ציר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תמונה אינטראקטיבית לזיהוי מיקום הכללה.
הגרף המוצג הוא תמונה ב 28 HPI מתוך העלילה פיזור אנימציה (וידאו 1) והיה בשימוש לזיהוי FOV ו XY לתאם מיקום של הכללות של עניין. B3-6-62 מוצג כפי שהוא נבחר לבידוד מתוך עלילת פיזור אנימציה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אימות של מוטנט מייצג מבודד.
פרופילים התפתחותיים של מוטאגנים מבודדים A3-6, B3-8 ו- B3-6. (א)מוטציה A3-6 מציג הבעה נשף האיחודהאירופי ירידה ב ~ 24 HPI. (ב)המוטציה B3-8 מבודדת מציגה ירידה בביטוי הנשף של האיחוד האירופיבכ-24 HPI, אך עלייה כוללת בביטוי הנשף של HCTB. (ג)B3-6 לבודד תערוכות רמות גבוהות יותר של ביטוי נשף euoואחריו אובדן פתאומי של ביטוי בשני היזמים בכ 40 HPI. כל מדגם הוא הממוצע של האוכלוסייה שצוינה, n > 25. ענן מייצג SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 5
איור 5: זרימת עבודה לניתוח גנטי ישיר של היזם-כתב Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctBנשף-mKate2/euoהנשף-תלתן EBs היו מוטאגניים ישירות עם EMS במדיה axenic, CIP-1. EBs Mutagenized שימשו להדביק Cos-7 תא מונושכבות עבור הדמיה וניתוח ביטוי פלורסנט. כלמידיה המביעה דינמיקה התפתחותית שונה זוהתה על ידי הדמיה בגרפים אינטראקטיביים. הכללות עם פרופילים התפתחותיים שהשתנו היו מבודדים באמצעות מיקרו-מאניפולטור. הפנוטיפים של המבודדים אומתו עם ההתפלה מחדש. מבודדים מוטנטיים נתונים WGS לזהות נגעים DNA הקשורים פנוטיפים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

וידאו 1: זיהוי של כלמידיה מוטאגנית המציגה קינטיקה של ביטוי מפוצל באמצעות עלילת ביטוי גנים דינמית. ביטוי מקדם של euo ו hctB עבור הכללות בודדות היה התווה ודמיו לאורך זמן כדי לזהות כלמידיה mutagenized עם דינמיקת ביטוי שונה. B3-6-62 נבחר לבידוד כפי שהוא מציג ביטוי גבוה יותר של נשף euoבהשוואה לענן wildtype. הנשף euo:x-ציר, hctBהנשף: y-ציר. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2: המוטציה הייצוגית B3-6-62 גורמת לליזיס מוקדם של תאי מארח. מיקרוגרף של תאי טלפון חיים של תאי מארח נגועים B3-6-62 עוברים מוקדם (~ 40 HPI). אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

קבצים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח המנגנונים לשלוט מחזור התפתחותי כלמידיאלי כבר התעכב על ידי המגבלות של הכלים הגנטיים הזמינים כיום. העסקת היזם שלנו-כתב כלמידיה בשילוב עם מיקרוסקופ אוטומטי תא חי, מערכת נבנתה המאפשר ניטור של פיתוח סוג תא בהכללות בודדות על פני תקופה של 24 שעות. מערכת זו, בשילוב עם mutagenesis כימי ובידוד הכללה ישירה הקימה שיטה כדי לבחור במהירות וclonally כלמידיה המביעה פרופילים התפתחותיים שונה(איור 5).

EBs כלמידיאלי פעילים באופן מטבולית מחוץ למארח כאשר מסופקים עם תנאים יוניים תאיים מקוראנרגיה 5,12. חילוף החומרים הזה גרזן EB היה ממונף כדי mutagenize EBs מטוהר מחוץ לתאים המארחים. בפרוטוקול זה, חילוף חומרים EBs היו מוטאגן ישירות עם EMS. נצפתה כי טיפול EMS הפחית ביעילות את הכדאיות EB ויצר EBs שיצר קינטיקה התפתחותית משתנה כצפוי.

ההערכה היא כי פרוטוקול Mutagenesis EMS המתואר יוצר ~ 5-20 DNA שינויים / EB. זרימת העבודה של מיקרוסקופית תאים חיים המתוארת מסוגלת הדמיה ~ 8 הכללות לכל שדה תצוגה (FOV) ו 72 FOVs כל במרווח של 30 דקות. לכן, ההערכה היא כי ההשפעות של ~ 3000-10,000 מוטציות ניתן לדמיין לכל ריצה. ריצות מרובות (3-5) יביאו להדמיה חזותית של ההשפעות של 9,000-50,000 מוטציות. הגנום Ctr-L2 מקודד ~ 850 גנים, מציע פרוטוקול זה יגרום הדמיה של >10 מוטציות לכל גן. הערכות אלה מצביעות על כך שכיסוי הגנום, אם כי לא הושלם, אמור להספיק.

כוחו של פרוטוקול זה הוא היכולת לעקוב ולתיק את הביטוי קינטיקה של יחצ"נים-כתבים מרובים ברזולוציית הכללה אחת בזמן אמת כמעט. גנטיקה קדמית מסתמכת על פנוטיפים נצפים ובידוד מוחלט. שיטות קדם לגנטיקה קדימה בכלמידיה הסתמכו על תצפיות סטטיות ועל התצפיות עם כיסויי אגר8. עם המתודולוגיה שלנו, פעילות מקדם דינמי נרשם לאורך כל המחזור ההתפתחותי ולאחר מכן חזותי לזהות הכללות המכילות כלמידיה עם קינטיקה ביטוי גנים שונה. זיהוי הכללות מועמדים באמצעות פרמטרים מרובים (כלומר, הזמן לביטוי חצי-ממקסימום ועוצמת פלורסנט כוללת בנקודת זמן נתונה) תוצאה של בריכות מוטנטיות נפרדות המציגות קינטיקה התפתחותית שונה. כלמידיה אלה צפויים להיות מוטציות ייחודיות המשפיעות על הרגולציה של מסלולים גנטיים נפרדים. העובדה כי פרופילים אלה ניתן להקליט בשידור חי ודמיון לאחר כמה שעות מאפשר זמן לאתר ולבודד את הכללות עניין מן מונו שכבת הנגוע. למרות שהתמקדנו בדינמיקת ביטוי הגן במהלך הפיתוח, כתבים גנטיים חלופיים יכולים לשמש כדי לחקור מסלולים רגולטוריים אחרים.

בהתאם לנתבים הגנטיים נחקרים, יש לנקוט זהירות עם תוספת של ציקלוהקסמיד לתאים מארחים. למרות דגירה עם ציקלוהקסמיד משפר את מאפייני ההדמיה של המונו-שכבתית על ידי חסימת שכפול של התאים המארחים; אפקט זה מושג באמצעות עיכוב סינתזת חלבון מארח. עיכוב של סינתזת חלבון מארח דה נובו יכול להשפיע על התוצאות של המסך הגנטי בהתאם לשאלה שנשאלה.

פוטו-רעלים ופוטו-בליימינג הם מכשולים עיקריים במיקרוסקופ לטווח ארוך. כדי להתגבר על בעיות אלה, המאפיינים הספציפיים של כל חלבון פלורסנט צריך להיחשב לפני ניסויים. תלתן ו-mKate2 יש זמני התבגרות קצרים (20-30 מ ') הם פוטו-table, ומציגים תשואות קוונטיותגדולות יחסית 17,18. תכונות אלה מאפשרות הפחתה של עוצמת העירור וזמן החשיפה, ובכך מפחיתות את כמות הפוטוטו-אקסיסיטי והצילום שנגרמו. שלב / DIC לבן אור ערוץ הועסק למיקוד אוטומטי כמו ספקטרום זה של אור היה פחות פוטוטוקסי לכלמידיה.

עבור פרוטוקול זה, EMS שימש מוטגן כימי. EMS גורם מעברי G:C ל- A:T באמצעות אלקילציה גואנין19. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי לכלול mutagens חלופי שיכול לגרום סוגים אחרים של מוטציות גנומיות. לדוגמה, acridines הם מחלקה של תרכובות intercalating DNA אשר לגרום כופרים, הגדלת הסיכוי של משמרות מסגרת ולכן מוטציותnull 20.

עם התקדמות בטכניקות טרנספורמציה כלמידית, גנים שעברו מוטציה הקשורים קבוצות השלמה פנוטיפיק ניתן לדפוק באמצעות שיבוש גנים החדרה והשלמה גנטית לאימות של קישור פנוטיפ-פנוטיפ9. שחזור מוטנטים לחסום RB לפיתוח EB יכול להיות בעייתי כמו מוטציות של עניין עשוי לייצר כלמידיה שלא יכולים להחדיר מחדש תאים מארחים. ניתן לשנות טכניקה זו כדי לזהות גנים התפתחותיים על ידי אסוציאציות סטטיסטיות (GWAS). הגנומים של כלמידיה מהכללות מבודדות יכולים להיות ברצף ישיר ללא התרחבות ואימות. אופי התפוקה הגבוה של טכניקה זו יאפשר אסוציאציות סטטיסטיות. שוב, אימות של אסוציאציות אלה ניתן לבדוק באמצעות שיבוש גנים והשלמה9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אנדרס אומסלנד מאוניברסיטת וושינגטון על שסיפק את התקשורת הגרזן CIP-1. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01AI130072, R21AI135691 ו- R21AI113617. תמיכה נוספת סופקה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת איידהו והמרכז לאינטראקציות מורכבות מידול באמצעות מענק NIH שלהם P20GM104420.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well polystyrene plates Corning 3524 Cell culture growth for reinfection of isolates
6-well glass bottom plates Cellvis P06-1.5H-N Cell culture growth for imaging
96-well glass bottom plates Nunc 165305 Cell culture growth for imaging
Bold line CO2 Unit OKO Labs CO2 UNIT BL Stage incubator CO2 control
Bold line T Unit OKO Labs H301-T-UNIT-BL-PLUS Stage incubator temperature control
Borosilicate glass capillary tubes Sutter Instrument B1005010 Capillary tubes
BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) Semrock FF01-514/30-25 Fluoescent filter cube
BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) Semrock FF02-641/75-25 Fluoescent filter cube
CellTram Vario Eppendorf 5196000030 Microinjector
Chlamydia trachmatis serovar L2 ATCC VR-577 Chlamydia trachomatis
CIP-1 media In house NA Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5
mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and
CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.
Cos-7 cells (ATCC) ATCC CRL-1651 African green monkey kidney cell (host cells)
Cycloheximide MP Biomedicals 194527 Host cell growth inhibitor
Ethyl methanesulfonate, 99% Acros Organics AC205260100 Mutagen
Fetal Plex Gemini Bio-Products 100-602 Supplement for base growth media
Fiji/ImageJ https://imagej.net/Fiji NA Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 incubator Eppendorf CO1700100X Cell culture incubation
gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) Integrated DNA Technologies NA gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml Gibco 15710-064 Antibiotic for growth media
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Corning 21-020-CM Host cells rinse
Heparin sodium Amersham Life Science 16920 inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs
HEPES 1M GE Life Sciences SH30237.01 pH buffer for growth media
InjectMan Eppendorf 5179 000.018 Micromanipulator
Jupyter Notebook https://jupyter.org/ NA Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/
Lambda 10-3 Sutter Instrument LB10-3 Filter wheel controler
Oko Touch OKO Labs Oko Touch Interface to control the Bold line T and CO2 Unit
Prior XY stage Prior H107 Motorized XY microscope stage
PrismR Centrifuge Labnet C2500-R Temperature controlled microcentrifuge
Problot Hybridization oven Labnet H1200A Rocking Incubator for infection with Chlamydia
Proscan II Prior H30V4 XYZ microscope stage controler
Purifier Class 2 Biosafety Cabinet Labconco 362804 Cell culture work
RPMI-1640 (no phenol red) Gibco 11835-030 Base growth media for imaging
RPMI-1640 (phenol red) GE Life Sciences SH30027.01 Base growth media
scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) scopeLED F140 Excitation light
Sonic Dismembrator Model 500 Fisher Scientific 15-338-550 Sonicator, resuspending chlamydial pellet
Stage incubator OKO Labs H301-K-FRAME Cluster well plate incubation chamber
sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) In house NA Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)
T-75 Flasks Thermo Scientific 156499 Cell culture growth
TE 300 inverted microscope Nikon 16724 microscope
THOR LED Thor Labs LEDD1B White light
Trypsin Corning 25-052-CI Dislodges host cells from flask for seeding into plates
Zyla sCMOS Andor ZYLA-5.5-USB3 imaging camera
µManager 2.0gamma https://github.com/micro-manager/micro-manager NA Open sourse automated microscope control software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
  2. Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
  3. Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
  4. Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
  5. Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
  6. Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
  7. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
  8. Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  9. Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
  10. Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
  11. Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
  12. Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
  13. Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
  14. Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
  15. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  16. Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
  17. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  18. Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
  19. Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
  20. Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 160 גנטיקה קדימה מוטגנזה כימית פיתוח כלמידיאלי מיקרוסקופיה חיה מיקרוסקופיה אוטומטית כתבים פלורסנט
גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים <em>ב trachomatis כלמידיה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., … More

Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (160), e61365, doi:10.3791/61365 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter