Summary
Este protocolo utiliza promotores-repórteres fluorescentes, microscopia de células vivas e extração de inclusão individual em uma abordagem genética direcionada para identificar e isolar mutantes de desenvolvimento da Clamídia trachomatis.
Abstract
O patógeno bacteriano intracelular Chlamydia trachomatis passa por um ciclo de desenvolvimento composto por duas formas de desenvolvimento morfologicamente discretas. O corpo elementar não replicativo (EB) inicia a infecção do hospedeiro. Uma vez dentro, o EB se diferencia no corpo reticulado (RB). O RB então passa por várias rodadas de replicação, antes de diferenciar de volta à forma infecciosa EB. Este ciclo é essencial para a sobrevivência do clamídia, pois a falha no alternamento entre os tipos de células evita a invasão ou a replicação do hospedeiro.
Limitações nas técnicas genéticas devido à natureza intracelular obrigatória da Clamídia têm dificultado a identificação dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do tipo celular. Projetamos um novo sistema plasmídeo duplo promotor-repórter que, em conjunto com a microscopia de células vivas, permite a visualização da troca do tipo celular em tempo real. Para identificar genes envolvidos na regulação do desenvolvimento do tipo celular, o sistema promotor-repórter de células vivas foi aproveitado para o desenvolvimento de uma abordagem genética avançada, combinando mutagênese química da cepa de dois repórteres, imagem e rastreamento da Clamídia com cinética de desenvolvimento alterada, seguida pelo isolamento clonal de mutantes. Este fluxo de trabalho genético avançado é uma ferramenta flexível que pode ser modificada para interrogatório direcionado em uma ampla gama de vias genéticas.
Introduction
Clamídia trachomatis (Ctr) é um patógeno intracelular obrigatório que progride através de um ciclo de desenvolvimento bifásico que é essencial para sua sobrevivência e proliferação1. Este ciclo consiste em duas formas de desenvolvimento, o corpo elementar (EB) e o corpo reticulado (RB). O EB é replicação incompetente, mas media a invasão celular através da endocitose induzida por efeito2. Uma vez no host, o EB amadurece para o RB replicativo. O RB realiza várias rodadas de replicação antes de converter de volta para o EB, a fim de iniciar rodadas subsequentes de infecção.
A matriz limitada de ferramentas genéticas restringiu a maior parte da pesquisa clamídica a estudos bioquímicos ou ao uso de sistemas substitutos. Como consequência, a elucidação da regulação genética e o controle do ciclo de desenvolvimento tem sido difícil3,4. Um dos desafios mais importantes no campo clamídico é o rastreamento temporal de alta resolução do ciclo de desenvolvimento clamídico e a identificação das proteínas envolvidas em sua regulação. A expressão genética durante o ciclo de desenvolvimento da clamídia tem sido tradicionalmente realizada por métodos destrutivos de "ponto final", incluindo RNAseq, qPCR e microscopia celular fixa5,,6. Embora esses métodos tenham fornecido informações inestimáveis, as técnicas empregadas são laboriosas e têm baixa resolução temporal5,6.
Na última década, a manipulação genética da CTR progrediu com a introdução da transformação plasmida e dos métodos para mutagênese7,,8,,9. Para este estudo, foi desenvolvido um sistema baseado em plasmídeos para monitorar o desenvolvimento clamídia em inclusões individuais em tempo real ao longo de uma infecção. Foi criado um transformador clamídial que expressou um promotor-repórter específico do tipo RB e EB. O repórter específico da RB foi construído fundindo o promotor do antigo gene RB euo upstream da proteína fluorescente Clover. EuO é um regulador transcricional que reprime um subconjunto de genes associados ao EBtardios 10. O promotor do hctB, que codifica uma proteína semelhante a histona envolvida na condensação nucleóide EB, foi clonado diretamente a montante de mKate2 (RFP) para criar o repórter específico do EB11. A espinha dorsal do hctBprom-mKate2/euoprom-Clover foi p2TK2SW27. Os promotores hctB e euo foram amplificados a partir do DNA genômico Ctr-L2. Cada sequência de promotor consistia de ~100 pares base a montante do local de início de transcrição previsto para o gene clamídico especificado mais os primeiros 30 nucleotídeos (10 aminoácidos) do respectivo ORF. As variantes fluorescentes fp foram obtidas comercialmente como blocos genéticos otimizados pelo códon ctr e clonadas em quadro com os primeiros 30 nucleotídeos de cada gene e promotor clamídial. O exterminador incD foi clonado diretamente rio abaixo de mKate2. O segundo promotor-repórter foi inserido a jusante do exterminador do incD. O gene de resistência à ampicilina(bla) em p2TK2SW2 foi substituído pelo gene aadA (resistência à espectroicina) do pBam4. Isso resultou na construção final p2TK2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover (Figura 1A) que foi transformada em Ctr-L27.hctB Esta cepa de repórter RB/EB permitiu a observação do ciclo de desenvolvimento dentro de inclusões únicas utilizando microscopia de células vivas (Figura 1B,C).
Empregando nossa construção promotor-repórter em combinação com mutagênese química, um protocolo foi criado para rastrear e isolar clones individuais que exibiam anormalidades no desenvolvimento de populações mutagenizadas de Ctr serovar L2. Este protocolo permite o monitoramento direto de inclusões croniaxias individuais, o rastreamento dos perfis de expressão genética ao longo do tempo, a identificação de clones clamídias que expressam um padrão de expressão genética de desenvolvimento alterado e isolamento clonal da Clamídia a partir de inclusões individuais.
Embora este protocolo tenha sido criado especificamente para a identificação de genes envolvidos no desenvolvimento clamídia, ele poderia ser facilmente adaptado para interrogar qualquer número de vias genéticas clamídias.
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Protocol
Todos os scripts Python usados neste protocolo estão disponíveis no Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. Mutagenize Reporter Chlamydia
NOTA: Ctr-L2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover EBs foram diretamente mutagenizados usando metanosetano etílico (EMS) na mídia axenic CIP-1, pois esta mídia suporta metabolismo EB e manutenção de EBivity infect12.hctB
- Descongele um caldo clamídia no gelo contendo ~3 x 107 EBs transformados com o p2TK2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover reporter plasmid e pelota em >14.000 x g por 30 min a 4 °C.hctB
NOTA: Os organismos de clamídia utilizados para esses experimentos foram 30% de densidade de reenxerina purificada e congelada a -80 °C em 1x sucrose-fosfato-glutamato tampão (SPG). - Descarte o supernascimento e resuspenque a pelota EB em 100 μL de tampão CIP-1 com sônica no gelo a 10% de potência para 10 s. Divida os 100 μL de suspensão EB em duas alíquotas de 50 μL para amostras tratadas mutagenizadas e simuladas.
- Prepare 20 mg/mL de solução EMS-CIP-1 em um tubo de microcentrifuge separado de 1,5 mL. Para isso, adicione 6,8 μL de EMS em volume total de 375 μL.
- Adicione 50 μL da solução EMS-CIP-1 em uma das alíquotas clamídicos para mutagênese e 50 μL de CIP-1 apenas para a outra alíquota clamídial para mutagênese simulada.
NOTA: A concentração final do EMS é de 10 mg/mL. O titer clamídia, a concentração de EMS e o tempo de exposição utilizado neste protocolo levam a uma redução de aproximadamente 60-80% na prole infecciosa. Esse nível de redução corresponde a ~5-20 lesões de DNA por genoma clamídial8. - Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Os EBs mutagenizados serão usados diretamente para infectar monocamadas na seção 2.
ATENÇÃO: O EMS é um cancerígeno conhecido. Todos os equipamentos e materiais que entram em contato com a EMS devem ser embebidos em 1 M NaOH por 24 horas antes do descarte, as luvas devem ser usadas o tempo todo durante o protocolo e limpeza dos materiais EMS.
2. Imagem do Mutant Ctr
- Cultura celular hospedeira para imagem e isolamento de CTR mutagenizado
- Semente uma placa de fundo de vidro de 6 x 105 Células Cos-7 (ATCC) por poço em 2 mL de mídia completa (RPMI-1640 suplementada com soro bovino fetal de 10% e 10 mg/mL gentamicina). Use esta placa inferior de vidro para a imagem de Ctr mutagenizado.
- Semente uma placa de poliestireno de 24 poços com 1 x 105 células Cos-7 (ATCC) por poço em mídia completa de 1 mL. Use esta placa de poliestireno para reinfecção de clamídia isolada de interesse.
- Incubar ambas as placas a 5% de CO2, 37 °C por aproximadamente 18 h. Uma vez que as células atinjam a confluência, substitua a mídia por mídia completa complementada com 1 μg/mL de cicloheximida e incubar durante a noite.
- Infectando a cultura celular hospedeira com CTR mutagenizado
- Infecte 5 poços da placa de fundo de vidro com ~6 x 105 de EBs mutagenizados em HBSS frio de 1,5 mL/poço. Isso resultará no MOI de ~ 0,3 como ~70% de taxa de mortalidade é esperado devido à mutagênese.
- Infecte o poço restante com ~2 x 105 EBs simulados mutagenizados em HBSS frios de 1,5 mL/bem. Sem mutagênese, espere menos mortalidade, assim um terço do inóculo é usado para alcançar o MOI de ~0,3.
NOTA: O MOI de ~0,3 garante que as células hospedeiras sejam infectadas por um único EB e permite a separação suficiente entre células infectadas para isolamento clonal. - Incubar a placa por 15 min, com balanço, a 37 °C.
- Lave as células hospedeiras infectadas com HBSS pré-armado (37 °C) contendo heparina de 1 mg/mL seguida imediatamente por uma lavagem HBSS. Repita a lavagem da heparina, enxaguando imediatamente 2x com HBSS para garantir que a heparina seja removida.
NOTA: A heparina inibe e pode reverter as interações eletrostáticas precoces entre a célula hospedeira e os EBs13. As lavagens de heparina removem EBs que ainda não entraram nas células hospedeiras, sincronizando a infecção. Ao lavar as células fazem isso suavemente para evitar a desalojar as células da superfície dos poços. As soluções HBSS e heparina contêm EMS residuais e devem ser colocadas em um béquer contendo 1 M NaOH por 24 h antes do descarte. - Substitua o HBSS por 4 mL/poço de mídia de imagem pré-armada (37 °C) (mídia completa, cicloheximida de 1 μg/mL, HEPES de 20 mM e sem vermelho fenol).
- Encha os espaços interwell com prewarmed (37 °C) desionizado H2O para ajudar no controle de temperatura e reduzir a evaporação. Incubar a placa a 37 °C incubadora com 5% de CO2 por 10 h.
- Microscópio configurado e imagem
NOTA: Imagens fluorescentes automatizadas multicoloridas de células vivas são usadas para coletar imagens de lapso de tempo para identificar mutantes clamídigos que diferem na dinâmica de expressão genética do desenvolvimento. Este protocolo utiliza o pacote de software μManager de código aberto para controle automatizado de microscópio14.- Inicie a configuração do microscópio 10 h após a infecção. Coloque a incubadora do estágio do microscópio em 5% de CO2,37 °C. Coloque a placa inferior de vidro infectada 6 bem na incubadora do estágio e insira o oritmisador de amostra no interwell H2O.
- Calibrar o estágio XY usando o plugin de triagem de alto conteúdo(HCS). Clique em Plugins | Ferramentas de aquisição | Gerador de local do HCS no software de controle de microscópio μManager(JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
- Selecione o modelo de placa de 6 poços e gere uma lista de posição de imagem composta por 12 campos de exibição (FOV) por poço dentro do plugin HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Abra a Lista de Posições do Palco e concentre-se manualmente e defina a posição Z inicial para cada FOV usando o plugin de controle de palco (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Ajuste as coordenadas XY de qualquer FOV que tenha células ausentes ou não contenha uma monocamada uniforme.
NOTA: Devido ao tempo que leva para cada imagem ser capturada, um número máximo de 72 FOV pode ser tomado por intervalo de 30 minutos. - Use uma lente objetiva de 20x para imagem. Esta ampliação permite que ~8 inclusões sejam imagens por FOV enquanto ainda fornecem a resolução desejada.
- Salvar a lista de posições, pois esta será usada para localizar as inclusões de interesse após análise de dados(JoVE61365_screenfile7).
- Use a opção Auto Focus no software de imagem, para definir o foco para imagens automatizadas (JoVE61365_screenfile8).
- Use as seguintes seleções e valores para produzir os resultados de foco mais consistentes usando o foco automático baseado em imagem no μManager. Na janela de propriedades De foco Automático selecione ShouldaFocus no menu suspenso e use as seguintes configurações. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Yes, ShouldaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
NOTA: Reduzir a janela de imagem de foco automático diminuindo o fator de cultura permite um foco automático mais consistente. A seleção de Sim para ShouldaFocus-ShowImages permite que o usuário visualize a imagem de foco automático. - Capture a cinética do ciclo de desenvolvimento por imagem por 24h com intervalos de tempo de 30 minutos(JoVE61365_screenfile9). A imagem entre 12-36 HPI garante que a Clamídia complete o ciclo de desenvolvimento, mas não lise a célula hospedeira.
- Imagem das monocamadas celulares com exposição de 250 ms a 4% e 18% de intensidade nos canais GFP e RFP, respectivamente(JoVE61365_screenfile10). Detecte o sinal de Clover (GFP) por excitação a 470 nm com um filtro de emissões de bandpass de 514/30 nm. Detecte o sinal mKate2 (RFP) por excitação a 595 nm e com um filtro de emissões de bandpass de 641/75 nm.
NOTA: Minimizar a intensidade de excitação é fundamental para minimizar o fotobleaching fluorohore e fototoxicidade para clamídia. A intensidade mínima de excitação para gerar uma imagem resolvida com uma exposição de 200-300 ms deve ser determinada empiricamente em estudos piloto. - Capture várias fatias Z com uma gama de focos que termina em ambos os lados da fatia em foco. Neste experimento, com ampliação de 20x, isso foi alcançado com 4 fatias a passos de 10 μm(JoVE61365_screenfile11).
- Selecione Relativo Z para obter várias fatias na janela de aquisição. A opção Z relativa usa o local do plano Z salvo na lista de posição de imagem como ponto de partida para o intervalo da próxima vez. Insira os valores apropriados de deslocamento Z para canais de imagem de fluorescência(JoVE61365_screenfile12).
NOTA: O sistema de foco baseado em imagem é imperfeito e durante um período de imagem de 24 horas isso leva ao foco de deriva. Descobriu-se que capturando aviões focais de 3-4 Z para cada ponto de tempo uma imagem em foco foi mantida. Z-offset é necessário para corrigir as diferenças nos planos focais entre os canais de imagem fluorescentes e o canal DIC. A determinação empírica deste Z-offset será necessária. - Salve imagens selecionando o diretório raiz e nomeando o experimento. Use a opção de arquivo de pilha de imagens μManager para salvar imagens como arquivos de pilha de tiff(JoVE61365_screenfile13).
- Registo os detalhes experimentais na caixa de Comentários de Aquisições na janela Aquisição MultiD(JoVE61365_screenfile13). ou seja, bem A1: controle não tratado. Bem A2-3 e B1-3: Mutantes EMS. Imagem: 12-36HPI. Inicie a aquisição de imagem em 12 HPI.
NOTA: Se estiver usando o μManager, deixe o programa, a configuração experimental e o hardware do microscópio em execução após o experimento estiver concluído. Os locais de imagem serão revisitados para isolamento de inclusão assim que a análise da população mutagenizada for concluída.
3. Identificar e isolar clamídia mutagenizada com fenótipos de desenvolvimento alterados
- Criando uma pilha de imagens em foco
- Extrair a imagem mais em foco das pilhas Z usando os dados de imagem salvos que contém fatias de 4 Z por ponto de tempo. Use a opção de medição de kurtose (Analisar | Meça) em ImageJ/FIJI para identificar automaticamente a fatia Z mais focada (maior pontuação de kurtose) e criar uma nova pilha de imagens com apenas essas imagens em foco. Um script Python é incluído como um arquivo suplementar (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) para automatizar esse processo.
- Quantificar a expressão da fluorescência em inclusões individuais
NOTA: Para quantificar a cinética de expressão dos dois repórteres, utilize o aplicativo de análise de imagem de código aberto ImageJ/FIJI e o plugin Trackmate15. Trackmate identifica 'pontos' (correspondentes a inclusões neste caso) e os segue através de uma pilha de imagens de lapso de tempo registrando a localização X,Y e intensidade do sinal para cada inclusão ao longo do tempo(JoVE61365_screenfile14). Essas informações são salvas como um arquivo CSV e serão importadas em um notebook Python personalizado para análise.- Abra a pilha de imagens reduzidas Z em Foco no ImageJ/FIJI usando o Bio-formats Importer clicando em Plugins | Bioformiagens | Importador de bioformiagens. Selecione Hyperstack e Composto (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
- Subtraia o fundo da imagem clicando em Process | Subtrair fundo usando um raio de bola rolando de 50,0 pixels e melhorar o contraste de imagem para 0,3% para pixels saturados (Processo | Melhorar o contraste). Multiplique os valores da imagem por 10.0 (Processo | Matemática | )(JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
- In Trackmate (Plugins | Rastreamento | Trackmate), selecione um diâmetro de bolha estimado de 48 pixels (empiricamente determinado com base no tamanho da inclusão no final da imagem). Produza faixas de inclusão não fragmentadas selecionando uma distância máxima de Linking e uma distância máxima de fechamento gap de 8,0 pixels e gap max frame gap de 1 ( JoVE61365_screenfile23- JoVE61365_screenfile25).
NOTA: Para melhorar a capacidade do Trackmate de identificar e rastrear inclusões durante todo o ciclo, um canal de imagem separado é criado adicionando os canais de baile euoprom e hctBjuntos usando a função matemática de imagem no ImageJ/FIJI. Este canal é então usado pelo Trackmate para identificar e seguir inclusões ao longo do tempo. Os valores fluorescentes dos canais de baile euoe hctBsão então registrados nos canais 2 e 3. - Faixas de registro que cumprem duração mínima contínua: Duração da faixa: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analise as faixas e salve as estatísticas de faixas como um arquivo CSV(JoVE61365_screenfile27).
NOTA: Este processo foi automatizado usando um script Python personalizado que é fornecido nos dados suplementares(TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
- Identifique faixas de inclusão com perfis de desenvolvimento alterados
NOTA: Para identificar inclusões que contenham Chlamydia com perfis de desenvolvimento alterados, cada faixa de inclusão foi visualizada usando o notebook Python. Essas visualizações permitem a identificação de inclusões com perfis de expressão genética cinética que diferem da população tratada simulada. O notebook Python utilizado para identificação de inclusões com programação de desenvolvimento alterada é fornecido nos dados suplementares (EMS_Screen-Markdown).- Importe os dados de faixa de inclusão dos spots em guias de estatísticas CSV arquivos para o quadro de dados Pandas usando a célula import no EMS_Screen-Markdown Python Notebook.
- A linha de base corrige cada faixa subtraindo o valor mínimo de cada faixa do resto dos valores da faixa usando as células subtraídas da linha de base. Salve os valores resultantes como um arquivo de picles usando a célula Salvar como Picles. Isso salvará permanentemente os valores do canal após a subtração da linha de base para recuperação posterior.
NOTA: A subtração da linha de base define a intensidade fluorescente inicial de cada inclusão a zero. - Elimine traços de inclusões próximas às bordas do FOV usando a célula Filter Edges, pois seus perfis fluorescentes podem não ser totalmente capturados; esses traços podem produzir perfis de desenvolvimento falsos positivos.
- Calibrar os valores de quadro(totalFrames) das fatias de imagem para o tempo(startTime, intervalo) com a célula de calibração time-lapse usando o tempo de início experimental e o intervalo de tempo de imagem. Exclua leituras parciais de inclusão filtrando traços que não se estendem ao longo das últimas 20 horas do experimento (16-36 HPI) usando a célula Filtro de Duração da Faixa.
- Faixas separadas em quadros de dados individuais por condição experimental com a célula de tratamento de atribuição. Filtrar para inclusões que exibem crescimento suficiente usando a célula Filter for Growth. Na célula Filter for Growth, empiricamente, defina o limiar de intensidade de fluorescência para o canal de baile euoalterando os valores dentro das duas últimas linhas de código. Isso filtrará a Clamídia que não cresceu.
NOTA: Tenha cuidado ao definir filtros de limiar, se o filtro estiver muito baixo, as parcelas de dispersão resultantes serão ruidosas, mas se a filtragem for definida como mutantes importantes demais, podem ser eliminados. - Calcule a porcentagem de mortalidade causada pelo EMS dividindo o número de faixas mutagenizadas/bem pelo número de faixas/bem tratadas por simulação. Multiplique o número de faixas tratadas simuladas pelo fator de diluição inicial de 3 para calcular o número de faixas/bem tratadas por simulação. Use as faixas de inclusão da contagem e calcule as células de mortalidade por porcentagem para realizar essa tarefa.
- Calcule o tempo para a expressão semi-máxima para repórteres precoces e tardios para cada faixa usando a célula Calcular. Esses valores serão usados para comparar populações mutagenizadas e simuladas para identificar mutantes do desenvolvimento.
- Dentro da célula Half-Max Plot use o pacote de plotagem bokeh para visualizar o tempo para a expressão meia-máxima de cada promotor, grafando o tempo de baile euopara a expressão semi-máxima contra a do baile hctB. Identifique inclusões da população mutante que está fora da nuvem de dispersão tratada simulada usando o explorador de identificação de faixa interativo bokeh. Anote as coordenadas FOV e XY das inclusões de interesse(Figura 2).
NOTA: Escolha as inclusões dos candidatos que se desentemem visualmente fora da nuvem de controle como verificação e avaliação estatística de cada clone será realizada posteriormente. - Dentro da célula De Plot Animado visualizar mudanças na cinética de expressão do promotor dinamicamente através do tempo, grafando as intensidades de expressão do euoprom contra o baile hctBusando a ferramenta ploting Plotly16. A função de dispersão do Plotly é usada para animar a expressão genética ao longo do tempo(Vídeo 1).
- Visualize um instantâneo do gráfico animado Plotly na célula Localizador de Inclusão, plotando a expressão do baile euoprom e hctBem um ponto de tempo específico (ou seja, 28 HPI) usando o pacote bokeh(Figura 3). Identificar inclusões da população mutante conforme descrito na etapa 3.3.8.
NOTA: Esta análise precisa ser realizada rapidamente (<4 h) à medida que as inclusões ainda estão se expandindo e começará a lise células hospedeiras ~48 h após a infecção.
- Isolar mutantes do desenvolvimento de inclusões de interesse
NOTA: Para isolar a Clamídia das inclusões determinadas a exibir regulação genética alterada foi empregado um micromanípulador com agulhas capilares. As coordenadas Well ID, FOV e X,Y de inclusões de interesse foram determinadas usando a visualização de dados na seção 3.3.- Prepare agulhas capilares segurando o centro do tubo capilar em uma chama e puxando ambas as extremidades do tubo capilar até que ele se separe. Crie uma abertura na agulha capilar puxada quebrando a ponta puxada em um slide de microscópio. Para quebrar a agulha, coloque a ponta fechada na porção fosda do microscópio deslize em um ângulo e aplique pressão.
NOTA: As especificações do tubo capilar foram de 1,0 mm de O.D., 0,5 mm de I.D. - Verifique se a abertura da agulha é aproximadamente do tamanho de uma inclusão sob um microscópio, objetivo de 20x.
- Prepull ~25-30 agulhas capilares para isolamento de inclusões de candidatos (uma agulha por inclusão).
- Encha o microinjetor com óleo mineral garantindo que não haja bolhas de ar.
- Coloque uma agulha capilar de vidro no microinjetor e expela óleo na ponta da agulha, expurgada de bolhas de ar. Coloque a agulha capilar em mídia completa e desenhe a mídia no meio do caminho. Encher a agulha capilar com mídia evita a contaminação do óleo no poço.
- Usando a lista de posição salva no μManager a partir da etapa 2.3.5, migram para o poço e FOV de uma inclusão de interesse identificada no notebook de visualização Python.
- Use o joystick do micromanipulador para localização da agulha capilar às coordenadas XY da inclusão de interesse.
- Use o canal de excitação de 595 nm para visualizar EBs para extração e o canal de luz branca fase/DIC para visualização da agulha. Manobrar a agulha capilar até a inclusão, romper a inclusão e, em seguida, desenhar os EBs na agulha capilar usando o microinjetor.
- Expulse os EBs da agulha capilar em um único poço da placa de poliestireno preparada 24 bem preparada na etapa 2.1.2. Remova a agulha capilar e substitua por uma agulha capilar fresca para a próxima extração de inclusão. Repita a seção 3.4 para todas as inclusões dos candidatos.
NOTA: Para expansão e para garantir um título suficiente para re-imagem, incubar isolados mutantes em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C até que a maioria das células hospedeiras sejam infectadas (~1 semana). Os poços devem ser monitorados de perto, pois diferentes isolados podem apresentar diferentes taxas de crescimento.
- Prepare agulhas capilares segurando o centro do tubo capilar em uma chama e puxando ambas as extremidades do tubo capilar até que ele se separe. Crie uma abertura na agulha capilar puxada quebrando a ponta puxada em um slide de microscópio. Para quebrar a agulha, coloque a ponta fechada na porção fosda do microscópio deslize em um ângulo e aplique pressão.
- Isolados mutantes da colheita
- No gelo, interrompa a monocamada infectada raspando com uma ponta de micropipette de 1 mL. Transfira a mídia, os detritos celulares e liberte a Clamídia em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Chlamydia de pelota por centrifugação por 30 min a 4 °C, >14.000 x g. Remova a pelota supernasce e resuspend em 75 μL de 1x SPG gelado. Alíquota em três tubos de microcentrifuge de tampa de parafuso de 1,5 mL. Armazenar a -80 °C.
4. Verificação de fenótipos isolados mutantes
- Cultura celular hospedeira para isolados mutagenizados por imagem
- Semente uma placa inferior de vidro de 96 poços com 1,6 x 104 células Cos-7 (ATCC) por poço em 100 μL de mídia completa. Incubar a 5% de CO2, 37 °C. As células devem atingir confluência em aproximadamente 24 h. Depois que as células estiverem confluentes, substitua a mídia por mídia completa complementada com cicloheximida de 1 μg/mL, incubar durante a noite.
- Infectar células com isolados candidatos para verificação fenotípica
- Descongelar clones mutantes e clamídia selvagem no gelo.
- Na placa 96 bem preparada, realize uma diluição serial dupla de isolados mutantes, utilizando uma coluna por isolação (11 colunas). Comece com uma diluição inicial de 1:20 em 100 μl HBSS.
NOTA: A diluição serial da Clamídia é realizada para garantir que amostras mutantes sejam imagens em um MOI < 1. - Infecte a coluna restante (12ª) com clamídia selvagem em MOI ~0,5.
NOTA: O tipo selvagem clamídia é usado como um controle para comparação com isolados mutagenizados. - Incubar por 15 min balançando a 37 °C.
- Lave células hospedeiras infectadas com HBSS pré-armado (37 °C) com 1 mg/mL de heparina e HBSS conforme especificado na seção 2.2.
- Substitua por 200 μL por poço de mídia de imagem pré-armada (37 °C).
- Encha os espaços interwell com prewarmed (37 °C) desionizado H2O.
- Incubar a 5% de CO2, 37 °C para 10 h.
- Configuração do microscópio
NOTA: Consulte a seção 2.3 para a configuração do microscópio, esta seção conterá apenas as modificações de configuração necessárias.- Selecione o modelo de placa de 96 poços do plugin HCS.
- Determinar empiricamente poços correspondentes a um MOI < 1 para cada isolado mutante. A expressão do trevo sob controle do promotor euo é observável em ~10 HPI tornando possível a visualização precoce das inclusões(Figura 1B).
- Selecione três poços por isolado mutante que correspondam a um MOI < 1 e gere uma lista de posição de imagem composta por dois FOV por poço.
NOTA: Apenas 72 imagens podem ser tiradas por intervalo de tempo devido a restrições de hardware, isso equivale a três diluições (poços) por cepa usando dois locais de imagem por poço se 12 amostras forem imagens. - Regisso ciclo de desenvolvimento de cada mutante isolado por 36 h a 30 minutos de intervalos a partir de 12 HPI.
- Registo os detalhes experimentais na caixa de Comentários de Aquisições. i. e., Bem ABC1: controle do tipo selvagem. Bem ABC2: Tensão mutante 1, ABC3: Tensão mutante 2, etc... Imagem: 12-48 HPI.
- Inicie a aquisição de imagem em 12 HPI.
5. Análise de dados para verificação de isolados
- Criar pilhas de imagens em foco e quantificar a expressão de fluorescência em inclusões individuais
- Gerar traços de intensidade fluorescente para cada inclusão conforme especificado na seção 3.1 - 3.2.
- Verificar isolados mutagenizados do CTR
NOTA: Para verificar os perfis de desenvolvimento alterados de isolados mutantes, seus perfis de expressão são comparados com o perfil de expressão wildtype usando o notebook Python. O notebook Python usado para verificação de clones mutantes com programação de desenvolvimento alterada é fornecido nos dados suplementares (clone_check-Markdown).- Importe e filtre os dados de rastreamento de inclusão no notebook clone_check-Markdown Python, como feito na seção 3.3.
- Calcule o desvio médio e padrão (DST) a partir dos traços de cada população isolada e selvagem usando a célula De cálculo média e DST.
- Com o gráfico iso vs WT plotar o erro médio e padrão da média (SEM) de cada clone mutante contra o controle do tipo selvagem para determinar se a cinética de expressão mutante é divergente da amostra do tipo selvagem(Figura 4).
- Determine se a população mutante isolada é clonal, traçando os traços mutantes e comparando-os com traços de inclusão do tipo selvagem usando um gráfico de dispersão feito na seção 3.3 (etapas 3.3.7-3.3.10) (Figura 2, Figura 3). Se o isolado for uma população mista, o enredo mostrará uma população sobrepondo-se com tipo selvagem e uma segunda população distinta fora da nuvem de dispersão do tipo selvagem. Se a população parecer mista, o mutante pode ser re-isolado usando o procedimento original descrito na seção 3.4.
NOTA: Para determinar se o perfil de desenvolvimento de um isolado é estatisticamente diferente do tipo selvagem, as curvas para cada isolado devem ser comparadas ao tipo selvagem usando ANOVA.
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Representative Results
Mutagênese ems direta de nossa cepa de clamídial promotor-repórter resultou em uma redução de ~75% na infectividade. Usando o protocolo de imagem de células vivas descrito, ~600 inclusões foram imagens e rastreadas durante um período de 24 horas. A cinética de expressão fluorescente de ambos os repórteres em cada inclusão foi visualizada usando scripts personalizados de notebook Python. Duas abordagens de visualização foram implementadas para identificar o candidato mutagenizado Clamídia para isolamento. A primeira metodologia (passo 3.3.8) visualiza o tempo para a expressão semi-máxima dos promotores de Euo e HCTB a partir de isolados de clamírios individuais em um gráfico de dispersão interativo(Figura 2). As inclusões foram identificadas para isolamento se caíssem fora da nuvem de dispersão tratada simulada. Clones candidatos foram escolhidos que visualmente caiu fora da nuvem de controle. A verificação de cada clone foi realizada posteriormente. Clones A3-6-67 e B3-8-58 foram selecionados para isolamento, pois produziram tempos mais curtos para expressão semi-máxima do promotor euo e tempos mais longos para hctB (Figura 2).
O segundo método de visualização para identificação de inclusões com cinética alterada (etapas 3.3.9-10) identifica inclusões individuais com base na visualização da expressão genética dinâmica dos dois promotores (Vídeo 1). Mais uma vez, foram escolhidos clones candidatos com padrões dinâmicos de expressão de inclusão visivelmente distintos das inclusões de controle. A B3-6-62 foi escolhida devido ao aumento do acúmulo fluorescente do promotor euo entre 23 e 29 HPI (Vídeo 1). Um instantâneo do gráfico animado foi levado para identificar a localização das inclusões de interesse(Figura 3).
Utilizando os dois métodos de visualização, foram identificadas 24 inclusões para isolamento. Dos 24 isolados totais, 10 apresentaram cinética diferencial após o reteste. Estes isolados caíram em três categorias fenotípicas; 8 isolados exibidos diminuíram a expressão do baile euoem ~24 HPI, correspondendo ao tempo de conversão RB-EB, como demonstrado pelo clone A3-6-67(Figura 4A). Os dois clones restantes exibiam perfis fenotípicos únicos, o isolado B3-8-58 também exibiu diminuição da expressão do baile euoem ~24 HPI, mas um aumento geral na expressão do baile hctB(Figura 4B),enquanto b3-6-62 expressou níveis aumentados de fluorescência do promotor de euo seguido por uma perda repentina de expressão em ambos os promotores(Figura 4C). A análise dos micrografos de células vivas para mutantes B3-6-62 revelou que a lise celular hospedeira ocorreu em células infectadas por esse mutante muito antes do que em células infectadas por tipo selvagem(Vídeo 2).
Figura 1: Monitorando o desenvolvimento do tipo celular com os promotores-repórteres da CTR.
(A) Esquema da construção promotor-repórter, p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover. (B) Micrografia de células vivas de euoprom-Clover e hctBprom-mKate2 expressão em Ctr a 10 HPI(C) Micrografia de células vivas de Ctr expressando euoprom-Clover e hctBprom-mKate2 a 36 HPI. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação de representativo isola A3-6-67 e B3-8-58 por visualização do tempo para expressão semi-máxima para cada promotor.
O gráfico interativo é usado para identificar clamídia mutagenizada exibindo perfis de expressão que diferem da nuvem de dispersão de controle tratada simulada. Cada ponto no gráfico representa uma única inclusão. Os pontos de inclusão A3-6-67 e B3-8-58 são destacados à medida que estão fora da nuvem tratada simulada, ambos exibindo menor tempo para expressão semi-máxima do promotor euo em combinação com maior tempo para expressão semi-máxima de hctB. euoprom: x-axis, hctBprom: y-axis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Instantâneo interativo para identificação do local de inclusão.
O gráfico apresentado é um instantâneo de 28 HPI do gráfico de dispersão animado(Vídeo 1) e foi usado para identificar a localização coordenada FOV e XY de inclusões de interesse. B3-6-62 é mostrado como ele foi escolhido para isolamento da trama de dispersão animada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Verificação de isolados mutantes representativos.
Perfis de desenvolvimento de isolados mutagenizados A3-6, B3-8 e B3-6. (A) O mutante A3-6 exibe uma expressão de baile euodiminuída em ~24 HPI. (B) O isolado mutante B3-8 exibe uma diminuição da expressão do baile euoem ~24 HPI, mas um aumento geral na expressão do baile hctB. (C) O isolado B3-6 exibe níveis aumentados de expressão de euoprom seguido de uma súbita perda de expressão em ambos os promotores em ~40 HPI. Cada amostra é a média da população especificada, n > 25. Nuvem representa SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fluxo de trabalho para análise genética direcionada do promotor-repórter Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover EBs foram diretamente mutagenizados com EMS em mídia axenic, CIP-1.hctB Os EBs mutagenizados foram utilizados para infectar monocamadas de células Cos-7 para análise de imagens e expressões fluorescentes. A clamídia expressando dinâmica de desenvolvimento alterada foi identificada por visualização em gráficos interativos. As inclusões com perfis de desenvolvimento alterados foram isoladas por meio de um micromanipulador. Os fenótipos dos isolados foram verificados após reinfecção. Isolados mutantes são submetidos ao WGS para identificar lesões de DNA associadas a fenótipos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Identificação de clamídia mutagenizada exibindo cinética de expressão divergente usando um enredo dinâmico de expressão genética. A expressão promotora de euo e hctB para inclusões individuais foi plotada e visualizada ao longo do tempo para identificar clamídia mutagenizada com dinâmica de expressão alterada. A B3-6-62 foi escolhida para o isolamento, pois exibe maior expressão de euoprom em comparação com a nuvem de tipo selvagem. euoprom: x-axis, hctBprom: y-axis. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Representante mutante B3-6-62 causa lise prematura de células hospedeiras. Micrografo de células vivas de B3-6-62 infectados por células hospedeiras sofrem lise prematura (~40 HPI). Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
A dissecação dos mecanismos que controlam o ciclo de desenvolvimento da clamídial tem sido dificultada pelas limitações das ferramentas genéticas atualmente disponíveis. Empregando nossa clamídia promotora-repórter em conjunto com microscopia automatizada de células vivas, foi construído um sistema que permite o monitoramento do desenvolvimento do tipo celular em inclusões individuais durante um período de 24 horas. Este sistema, em combinação com mutagênese química e isolamento direto da inclusão estabeleceu um método para selecionar rapidamente e clonalmente clamídia expressando perfis de desenvolvimento alterados(Figura 5).
Os EBs clamídias são metabolicamente ativos fora do hospedeiro quando fornecidos com condições iônicas intracelulares e uma fonte de energia5,12. Este metabolismo axenic EB foi alavancado para mutagenizar EBs purificados fora das células hospedeiras. Neste protocolo, os EBs metabolizadores foram diretamente mutagenizados com EMS. Observou-se que o tratamento emS reduziu efetivamente a viabilidade do EB e gerou EBs que produziam cinética variáveis de desenvolvimento como esperado.
Estima-se que o protocolo de mutagenese emS descrito gera ~5-20 alterações de DNA/EB. O fluxo de trabalho de microscopia de células vivas descrito é capaz de imagens ~8 inclusões por campo de visão (FOV) e 72 FOVs cada em um intervalo de 30 minutos. Portanto, estima-se que os efeitos de ~3000-10.000 mutações podem ser visualizados por corrida. Múltiplas corridas (3-5) resultarão na visualização dos efeitos de 9.000-50.000 mutações. O genoma Ctr-L2 codifica ~850 genes, sugerindo que este protocolo resultará na visualização de >10 mutações por gene. Essas estimativas indicam que a cobertura do genoma, embora não esteja completa, deve ser suficiente.
A força deste protocolo é a capacidade de rastrear e registrar a cinética de expressão de vários promotores-repórteres na resolução de inclusão única em quase tempo real. A genética avançada depende de fenótipos observáveis e isolamento clonal. Métodos passados para genética avançada na Clamídia se baseavam em observações estáticas e plaquing com sobreposiçõesde ágar 8. Com nossa metodologia, a atividade dinâmica do promotor é registrada ao longo do ciclo de desenvolvimento e, em seguida, visualizada para identificar inclusões que contêm Clamídia com cinética de expressão genética alterada. Identificar as inclusões dos candidatos usando múltiplos parâmetros (ou seja, o tempo para a expressão semi-máxima e intensidade fluorescente total em um determinado ponto de tempo) resulta em piscinas mutantes distintas que exibem cinéticas diferentes do desenvolvimento. Estas Clamídias provavelmente têm mutações únicas que afetam a regulação de vias genéticas separadas. O fato de que esses perfis podem ser gravados ao vivo e visualizados após algumas horas permite tempo para localizar e isolar as inclusões de interesse da monocamada infectada. Embora tenhamos focado na dinâmica da expressão genética durante o desenvolvimento, repórteres de genes alternativos podem ser usados para sondar outros caminhos regulatórios.
Dependendo das vias genéticas que estão sendo interrogadas, deve-se tomar cuidado com a adição de cicloheximida às células hospedeiras. Embora a incubação com cicloheximida melhore as características de imagem da monocamada bloqueando a replicação das células hospedeiras; este efeito é alcançado através da inibição da síntese proteica hospedeira. A inibição da síntese de proteínas hospedeiras de novo pode influenciar os resultados da tela genética dependendo da pergunta feita.
Fototoxicidade e fotobleaching são grandes obstáculos na microscopia de lapso de tempo a longo prazo. Para superar essas questões, as características específicas de cada proteína fluorescente devem ser consideradas antes da experimentação. O trevo e o mKate2 têm curtos tempos de maturação (20-30 m) são fotostíveis, e exibem rendimentos quânticos relativamente grandes17,18. Essas qualidades permitem a redução da intensidade de excitação e do tempo de exposição, reduzindo assim a quantidade de fototoxicidade e fotobleaching incorridos. O canal de luz branca de fase/DIC foi empregado para autofoco, pois este espectro de luz era menos fototóxico para clamídia.
Para este protocolo, o EMS foi usado como mutagênico químico. EMS faz transições G:C para A:T via alquilação guanina19. No entanto, este protocolo pode ser expandido para incluir mutagens alternativas que podem induzir outros tipos de mutações genômicas. Por exemplo, as acridinas são uma classe de compostos intercalantes de DNA que induzem indels, aumentando a chance de mudanças de quadros e, portanto, mutações nulas20.
Com os avanços nas técnicas de transformação clamídia, genes mutantes associados a grupos de complementação fenotípica podem ser eliminados através de interrupção genética insercional e complementação genética para verificação da ligação genótipo-fenótipo9. Recuperar mutantes que bloqueiam o desenvolvimento de RB para EB pode ser problemático, pois mutações de interesse podem produzir clamídia que não pode reinfectar células hospedeiras. Essa técnica pode ser modificada para identificar genes de desenvolvimento por associações estatísticas (GWAS). Os genomas da Clamídia de inclusões isoladas podem ser diretamente sequenciados sem expansão e verificação. A natureza de alto rendimento desta técnica tornaria as associações estatísticas possíveis. Novamente, a verificação dessas associações pode ser testada através de interrupção genética e complementação9.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Anders Omsland da Universidade Estadual de Washington por fornecer a mídia axenic CIP-1. Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R01AI130072, R21AI135691 e R21AI113617. O apoio adicional foi fornecido por fundos de startup da Universidade de Idaho e do Center for Modeling Complex Interactions através de sua bolsa NIH P20GM104420.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
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