Summary
يصف البروتوكول الطرق التجريبية للحصول على مستقر مجمع الهيستوتكية الرئيسية (MHC) الفئة الأولى من خلال β المحتملة2-ميكروغلوبولين (β2م) استبدالات من أنواع مختلفة. دراسة المقارنة الهيكلية من MHC I استقرت بواسطة homologous و heterologousβ 2م تم التحقيق.
Abstract
يلعب مجمع التحلل الرئيسي (MHC) دورًا محوريًا في عرض ببتيد المستضد والاستجابات المناعية للخلايا التائية ضد الأمراض المعدية وتطور الورم. الهجين MHC I معقدة مع β2-ميكروغلوبولين (β2م) يمكن أن تستقر في المختبر. هذا هو وسيلة مجدية لدراسة MHC I من الثدييات، عندما β homologous2متر غير متوفر. وفي الوقت نفسه، يشار إلى أن الثدييات βاستبدال 2م لا يؤثر بشكل كبير على عرض الببتيد. ومع ذلك، هناك ملخص محدود فيما يتعلق بالمنهجية والتكنولوجيا ل MHC الهجين I معقدة مع β2-microglobulin (β2م). هنا، يتم عرض طرق لتقييم جدوى استبدال β2م في دراسة MHC الأول. وتشمل هذه الأساليب إعداد بنيات التعبير؛ (أ) تنقية هيئات الإدماج وإعادة تجمّع مجمع MHC؛ تحديد حرارة البروتين. الكريستال الفحص وتحديد الهيكل. تقدم هذه الدراسة توصية لفهم وظيفة وهيكل MHC I ، وهي مهمة أيضًا لتقييم استجابة الخلايا التائية أثناء الأمراض المعدية والعلاج المناعي للورم.
Introduction
يوجد مجمع التحلل (MHC) الرئيسي في جميع الفقاريات وهو مجموعة من الجينات التي تحدد المناعة التي تتوسطها الخلايا لمسببات الأمراض المعدية. MHC الفئة الأول يعرض الببتيدات الذاتية، مثل المكونات الفيروسية المنتجة على عدوى الفيروس، لمستقبلات الخلايا T (TCR) على سطح CD8+ الخلايا T للتوسط مناعة الخلوية والمشاركة في تنظيم المناعة1. توفر دراسة هيكلية من MHC I ملزمة الببتيدات معلومات حول الزخارف ملزمة الببتيد وميزات العرض من قبل جزيئات MHC الأول، الذي يلعب أدوارا حيوية في تقييم الاستجابات المناعية CD8+ T الخلية وتطوير اللقاحات.
منذ التبلور الأول والتصميم الهيكلي للجزيئية MHC I بواسطة Bjorkman et al.2، عزز تحليل البنية البلورية لجزيئات MHC I بشكل كبير فهم كيفية ربط الببتيدات بجزيئات MHC I ، ويساعد على فهم تفاعل السلاسل الخفيفة مع السلاسل الثقيلة والببتيدات. وأشارت سلسلة من الدراسات المتابعة أنه على الرغم من أن الجينات ترميز سلسلة الضوء لا يرتبط مع MHC، سلسلة الضوء هو بروتين رئيسي لتجميع جزيئات MHC الأول3،4. يتفاعل مع المجالات الثلاثة من جزيئات الفئة MHC I على أسطح متعددة. عندما تكون سلسلة الضوء غائبة، لا يمكن التعبير عن جزيئات MHC من الفئة I بشكل صحيح على سطح الخلايا التي تقدم المستضد ولا يمكن أن تتفاعل مع TCR لممارسة وظائفها المناعية.
MHC الأول يتكون من سلسلة ثقيلة (سلسلة H) وسلسلة خفيفة (أي β2-ميكروغلوبولين (β2م))، ويتم تجميعها من خلال ربط لببتيد مناسب5. يتكون الجزء خارج الخلية من سلسلة H من مجالات α1 وα2 وα36. تشكل مجالات α1 وα2 الأخدود ملزم الببتيد (PBG). سلسلة β2متر بمثابة وحدة فرعية هيكلية من مجمع التجميع في MHC I، استقرار التشكل من المجمع، وهو مرافق الجزيئية ل MHC I H سلسلة قابلة للطي7،8،9. وقد أظهرت سلسلة من الدراسات أن سلاسل MHC I H من الثدييات المختلفة مثل الخفافيش (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10، ريسوس المكاك (الرئيسيات) (مامو - ب * 17)11 (مامو - A * 01)12 (مامو - A * 02)13، فأر (القوارض) (H - 2Kد)14،1 15, (Carnivora) (DLA-88*50801)16, ماشية (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 وequine (بيريس 25- يمكن الجمع بين18 و 18 مع β2م(الجدول 1)(Eqca-N*00602) (Eqca-N*00601). وغالبا ما تستخدم هذه الجزيئات الهجينة في الدراسات الهيكلية والوظيفية. ومع ذلك، لم يتم تلخيص منهجية الدراسة الوظيفية والهيكلية للمهجن الهجين MHC I مع β2م. وفي الوقت نفسه، لا يزال الأساس الهيكلي للتبادل β2متر بين مختلف أنواع الـ 2 من نوع "تاكسا" غير واضح.
هنا ، ويرد ملخصا للإجراءات للتعبير MHC الأول ، والمجلدات ، والتبلور ، وجمع البيانات الكريستال وتحديد الهيكل. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحليل بدائل محتملة β2متر من الأنواع المختلفة من خلال مقارنة التشكل الهيكلي لل MHC I استقرت من قبل β2م المتجانية المتجانسة. هذه الأساليب سوف تكون مفيدة لمزيد من MHC I الدراسة الهيكلية وC8+ T تقييم الاستجابة المناعية خلية في السرطان والأمراض المعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد التعبير يبني
- استرداد تسلسل الجينات MHC الفئة الأولى (بما في ذلك الجينات المتوقعة) من الخفافيش من قاعدة بيانات NCBI.
- استرجاع أعلى الثدييات MHC الأول تسلسل سلسلة الثقيلة من قاعدة بيانات متعددة الأشكال المناعية (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) وقاعدة بيانات UniProt (www.uniprot.org).
- للحصول على مجمعات MHC القابلة للذوبان، قم بتكديس التسلسلات لإزالة المناطق السيتوسولية والعابرة.
- استنساخ الجينات ترميز ectodomains من الخفافيش Ptal - N * 01:01 (GenBank لا. KT98792919) (بقايا 1-277) والخفافيش β2م (جينبانك لا. XP_006920478.1) (المخلفات من 1 إلى 98) إلى ناقلات pET-28a (نوفاغن، بيجين، الصين)، على التوالي.
- إدراج الأمثل (لEscherichia القولونية)تم إدراج تسلسل بين مواقع NcoI و EcoR1 من ناقلات pET-28a المعدلة.
- بناء الإنسان β2متر التعبير plasmids كما سبق وصفها20.
2. تركيب الببتيد
- التنبؤ الببتيدات
- كما هو موضح سابقا10، لفحص الببتيدات التي قد تربط Ptal-N * 01:01، التنبؤ الببتيدات المرشح باستخدام أجسام البروتين من الفيروسات المتصلة بالخفافيش hendra فيروس (HeV). للحصول على الببتيدات تقارب عالية على أساس نموذج الهيكلية من الخادم على الانترنت، NetMHCpan 4.0 خادم (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 وSys flexPepDock22 تنبأ الربط المحتملة في جزء الببتيد المحدد. وبالإضافة إلى ذلك، البرامج الأخرى وقواعد البيانات بما في ذلك BIMAS، قاعدة بيانات Epitope المناعي (IEDB)، NetCTL 1.2، وSYFPEITHI يمكن أيضا أن تستخدم، وكلها تكامل التنبؤ من فئة الببتيد-MHC أنا ربط التقارب، الناقل المرتبطة معالجة المستضد (TAP) كفاءة النقل، proteasomal C-المحطة الطرفية الانقسام ونصف الوقت من تفكك الببتيد-HLA فئة الجزيئات I في قراءاتهم.
- للتنبؤ بالببتيدات عالية الربط، استخدم كل من خادم NetMHCpan و Rosetta FlexPepDock.
ملاحظة: لسوء الحظ، لم تتطابق أي تنبؤات مُنتجة مع البيانات التجريبية. وقد يشير هذا إلى أن التنبؤات الحالية لبيبتيد MHC الملزم لم تكن مناسبة للثدييات غير البشرية وغير الماوس مثل الخفافيش، والتي قد يكون لها طريقة مختلفة لربط الببتيد. لذلك، نحن بحاجة إلى الجمع بين مختلف برامج التنبؤ والنتائج التجريبية لتحليل شامل للحصول على الببتيدات تقارب عالية.
- الببتيدات إعداد وحفظ
- بدلا من توليد الببتيدات المخصصة، واستخدام مقدمي الخدمات المتخصصة. شراء جميع الببتيدات تجاريا بعد أدوات التنبؤ الببتيد، والتي لديها درجة أعلى ملزمة. تم تحديد نقاء الببتيد ليكون > 95٪ من قبل HPLC وقياس الطيف الشامل.
- تخزين جميع الببتيدات المشتراة كمسحوق مجفف بالتجميد عند −80 درجة مئوية واذاب في ثنائيثيل السلفوكسيد (DMSO) قبل الاستخدام.
3- تنقية هيئات الإدماج
- تحويل الإشريكية القولونية
- تحويل 10 نانوغرام من plasmid تحتوي على الخفافيش MHC I Ptal-N * 01:01 H سلسلة، أو الإنسان β2متر أو الخفافيش β2متر في 100 ميكرولتر من BL21 (DE3) الإشريكية القولونية. يستحم في الجليد لمدة 30 دقيقة.
- صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 90 s، تليها الاستحمام في الجليد لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 800 ميكرولتر من مرق lysogeny (LB: استخراج الخميرة، tryptone و NaCl؛ انظر جدول المواد)إلى الخطوة 3.1.2 ويهز في 200 دوران في الدقيقة (دورة في الدقيقة) على منصة هزاز في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تطبيق 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري على لوحة تحتوي على مقاومة المضادات الحيوية المقابلة (أمبيسيلين: 100 نانوغرام / مل) ، والتي هي نفس الانشاءات السابقة.
- الثقافات تلقيح
- اختيار استنساخ واحد البكتيرية التي تحولت مؤخرا إلى 3 مل من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة (أمبيسلين: 100 نانوغرام / مل) والثقافة في 37 درجة مئوية، في حين تهتز في 200 دورة في الدقيقة على منصة هزاز لتنشيط البكتيريا. يمكن تلقيح الثقافات في وقت متأخر من الليل ، لتكون جاهزة للحث في صباح اليوم التالي.
- ليلة واحدة مقدما، ونقل 500 ميكرولتر من المخزون البكتيري المنشط إلى 50 مل من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة (أمبيسلين: 100 نانوغرام / مل) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، تهتز عند 200 دورة في الدقيقة. للراحة عند إعداد تلقيح المقبل، تجميد المخزون البكتيري المنشط المتبقي في 1 مل aliquots (500 μL من الثقافة مع 500 μL من 40٪ الجلسرين) في -80 درجة مئوية حتى مطلوب التحضير المقبل.
- لتوليد كميات كبيرة من البروتين المؤتلف، نقل إعداد البكتيريا إلى 2 لتر من LB مع المضادات الحيوية المتوسطة (أمبيسيلين: 100 نانوغرام / مل) بنسبة 1:100، احتضان في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 200 دورة في الدقيقة. ثقافة حتّى امتصاص من 0.6 في 600 [نم]. أضف 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (تختلف تركيز IPTG ل MHCs مختلفة، ومعظمها بين 0.1 mM-1 mM) إلى قارورة لاستقرار التعبير البروتين.
- حصاد البكتيريا
- نقل البكتيريا إلى قوارير الطرد المركزي والطرد المركزي في 5000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات من الآن فصاعداً عند 4 درجة مئوية.
- Resuspend البكتيريا في 60 مل من الفوسفات المالحة العازلة (PBS) وتحرير البروتين المؤتلف أعرب عن طريق تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية.
ملاحظة: بشكل عام، فإن البرنامج الذي وضعناه على هذا الجهاز هو الموجات فوق الصوتية 6S، الفاصل 12S، 300 W، 99 مرات).
- تنقية هيئات الإدماج
- الطرد المركزي تعليق البكتيرية سونيكاتيد في 12،000 س ز لمدة 30 دقيقة. تجاهل السوبر و resuspend بيليه في حجم مناسب من العازلة الغسيل (0.5٪ تريتون-100، 50 mM تريس pH 8.0، 300 M NaCl، 10 mM EDTA، 10 M DTT). كرر هذه العملية مرة أخرى.
- جهاز طرد مركزي عند 12,000 x ز لمدة 10-20 دقيقة. تجاهل تراكب و resuspend الهيئات إدراج في العازلة resuspension (50 mM تريس pH 8.0، 100 mM NaCl، 10 mM EDTA، 10 mM DTT). إزالة عينة 20 ميكرولتر (إدراج الهيئات في العازلة resuspension) لSDS-PAGE لاختبار نقاء الهيئات إدراج.
- جهاز طرد مركزي التحضير المتبقي في 12،000 س ز لمدة 10-20 دقيقة. تجاهل المُندفع. وزن بيليه التي تحتوي على الهيئات إدراج وإضافة العازلة حل (6 M غواتيمالا-HCl، 10٪ الجلسرين، 50 mM تريس درجة ح h 8.0، 100 mM NaCl، 10 mM EDTA) إلى تركيز نهائي من 30 ملغم / مل. اثارة ببطء باستخدام مُحرك مغناطيسي عند 4 درجة مئوية حتى يتم حل الأجساد المُدرجة في عازلة الحل.
- الطرد المركزي 12000 س ز لمدة 10-20 دقيقة. تخلص من الرواسب. تخزين الهيئات إدراج في -20 درجة مئوية أو −80 درجة مئوية.
ملاحظة: قبل الشروع في تنقية أجسام التضمين، تأكد من نجاح تحريض تعبير البروتين المؤتلف. تشغيل عينات من كل ثقافة (التي اتخذت قبل وبعد التعريفي IPTG) على هلام البروتين؛ 15٪ SDS-PAGE (SDS-PAGE اللثة المركزة: H2O، 30٪ أكريلاميد، 1 M تريس-HCL pH 6.8، 10٪ SDS، 10٪ APS وTEMED؛ SDS-PAGE هلام الفصل: H2O, 30٪ أكريلاميد, 1.5 M تريس-HCl pH 8.8, 10٪ SDS, 10٪ APS وTEMED; انظر جدول المواد) β2م، 10٪ SDS-PAGE لسلسلة H.
4. إعادة اِلَتْع مجمع MHC
ملاحظة: إن كفاءة هيئات الإدراج التي أعيد اُعاد اُعادها سوف تؤثر على عائد البروتين الذي تم الحصول عليه. الطي ينافس البلمرة، لذلك فمن المقبول عموما أن إعادة التطوّر بتركيزات البروتين المنخفضة هي الطريقة الأكثر نجاحا. في هذه الورقة، تركيز أجسام التضمين هو 30 ملغ/مل.
- تحضير المخزن المؤقت لإعادة التكتكت.
- تختلف تكوين المخزن المؤقت إعادة التراكب اعتمادا على البروتين. على سبيل المثال، فإن درجة الـ (PH)، والقوة الأيونية،ظروف الأكسدة الحمراء ووجود اليغاندات تؤثر على نتائج إعادة الأحرف. الأكثر شيوعا هو استخدام تريس أو هيبس المستندة إلى مخازن حاجز في درجة هيدروكلوري مع تركيز NaCl من 50-500 mM، ولكن هذا يعتمد أيضا على البروتين المستهدف. فيما يلي صيغة المخزن المؤقت refolding المستخدمة في هذه المقالة.
- إعداد العازلة للطي مع 100 mM تريس HCl pH 8.0, 400 M L-أرجينين, 2 mM EDTA-2Na.
- تبريد العازلة إلى 4 درجة مئوية في قارورة 250-300 مل، ثم إضافة 5 mM خفض الجلوتاثيون (GSH) و 0.5 mM الجلوتاثيون المؤكد (GSSG). اثارة ببطء باستخدام مُحرك مغناطيسي عند 4 درجات مئوية لمدة 10-20 دقيقة أخرى قبل إضافة الأجسام المضمّنة والببتيدات.
- حقن وتمييع سلسلة MHC H وβ 2م
ملاحظة: قد تختلف درجة الحرارة التي يتم فيها إعادة التكفّل، على الرغم من أنّه من أجل تقليل التجميع إلى أدنى حدّ، تكون 4 درجة مئوية أفضل. نحن نستخدم التخفيف لإعادة مضاعفة البروتينات.- باستخدام إبرة من حقنة 1 مل، حقن 1 مل من hβ2م إدراج الهيئات أو bβ2م إدراج الهيئات في اثنين من مخازن refolding (1 لتر لكل منهما)، على التوالي. حقن بالقرب من قضيب التحريك الدورية بقوة للحصول على تخفيف سريع وفعال. β2م refolds سهلة نسبيا وتبقى مستقرة حتى في غياب سلسلة H.
- بعد β2م قد تم حلها في حل إعادة التكديس، حل الببتيدات (5 ملغ / مل) في DMSO وحقن بسرعة 200 ميكرولتر في حل إعادة التكديس. يُحرّك المزيج ببطء لمدة 10-20 دقيقة قبل إضافة سلسلة H.
- حقن سلسلة H مع نفس الإجراء الموصوف أعلاه ل2m β. سلسلة H غير مستقرة جداً; ولذلك، فإن ترتيب الحقن مهم جدا. حقن 3 مل من H سلسلة الهيئات إدراج في اثنين من المخازن المؤقتة إعادة تفول مختلفة (1 لتر لكل منهما) مع hβ2م أو bβ2م، على التوالي. الحقن المتتالية من aliquots الصغيرة بدلا من تطبيق واحد من كامل كمية البروتين يزيد من العائد من MHC مُعاد مُكَدَّد. السماح لإعادة التكفّل بالمضي قدماً عند 4 درجات مئوية لـ 8-10 ساعات.
- تركيز البروتين المُعاد تجمُّه
- استخدم الترشيح الفائق في غرفة مضغوطة مع غشاء MMCO 10 كيلو Da لتركيز البروتينات التي تُطَوّر. هذا الأسلوب هو مريحة ويمكن الجمع بين تبادل المخزن المؤقت. إضافة مخزن الصرف (20 mM تريس-HCl، 50 mM NaCl 8.0 pH) إلى الغرفة والتركيز على حجم النهائي من 30-50 مل.
- نقل حل إعادة التكديس إلى أنبوب الطرد المركزي، تدور في 12،000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الترسبات.
- نقل بعناية فائقة والتركيز إلى مزيد من حجم النهائي من ~ 1 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 12,000 xز لمدة 10-20 دقيقة. نقل المابير إلى أنبوب معقمة وتنقية البروتينات باستخدام 10/300 GL حجم استبعاد العمود.
- جمع العينات في الذروة وتحليلها باستخدام SDS -PAGE (15٪ هلام بولياكريلاميد).
- جمع قمة مجمع MHC والتركيز على تركيز نهائي من 15 ملغ / مل.
- تخفيف المجمع إلى 7.5 ملغم / مل و 15 ملغ / مل للتبلور.
5. التبلور، وجمع البيانات، والمعالجة
- أداء تبلور MHC المعقدة والببتيد باستخدام تقنية نشر بخار قطرة الجلوس.
- شاشة مجمعات Ptal-N*01:01/ببتيد مع مجموعات الكريستال التجارية (على سبيل المثال، مجموعة الشاشة الكريستال I/II، مجموعة شاشة مؤشر، مجموعة PEGION I/II، ومجموعة PEGRx).
- ختم الحل الناتج وتككيل ضد 100 ميكرولتر من محلول الخزان عند 4 أو 18 درجة مئوية.
- مراقبة النمو البلورية في الثقافة لمدة 3 أيام، 1 أسبوع، 2 أسابيع، 1 شهر، 3 أشهر و 6 أشهر. استخدام المجهر لمعرفة ما إذا كان كل قطرة في لوحة الكريستال لديه بلورات.
ملاحظة: ملاحظة: لوحظت بلورات Ptal-N*01:01/HeV1 (bβ2m) في 0.2 M NaCl، و0.1 M Bis-Tris (pH 5.5)، و25٪ (ث/الخامس) بولي إيثيلين جلايكول 3350 بتركيز 7.5 ملغ/مل. Ptal-N*01:01/HeV1 (hβ2م) لوحظت بلورات في 0.1 M HEPES، درجة حَسَر 7.0، 2٪ ث/ v بولي إيثيلين جلايكول 3350 بتركيز 7.5 ملغ/مل. - لحماية المبردات، نقل البلورات إلى محلول تخزين يحتوي على 20٪ الجلسرين ثم يبرد بسرعة في تيار النيتروجين الغازي 100 ك.
- جمع بيانات الحيود بالأشعة السينية من خط شعاع BL19U لمرفق إشعاع سينكروترون شنغهاي (شنغهاي، الصين).
6 - تحديد الهيكل وتحليله
- مع البيانات الهيكلية عالية الدقة، معالجة وحجم قوة جمع باستخدام برنامج دنزو وحزمة البرامج HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
- بعد اختيار نموذج أولي أفضل في بنك بيانات البروتين (PDB) ، حدد الهياكل باستخدام الاستبدال الجزيئي مع برنامج Phaser MR في CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). النموذج المستخدم هو الإحداثيات الهيكلية مع رمز بنك بيانات البروتين (PDB) 5F1I.
- استخدم نموذج الأشعة السينية المكررة لصقل المفصل الأولي. استخدم فينيكس الصقل وحده ووضع المفاصل للأشعة السينية وحدها والصقل المشترك النيوترونية والأشعة السينية، على التوالي.
- بعد كل جولة من الصقل، تحقق يدويًا من النموذج ضد Fo - Fc و 2Fo − خرائط الكثافة النووية الإيجابية في Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). وهذا يسهل الموضع السليم للمياه وبعض الذرات D. تم إنشاء جميع الأرقام من الهياكل من قبل PyMOL (http://www.pymol.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وذكرت الأعمال السابقة أن HeV-المستمدة من HeV1 (DFANTFLP) الببتيد قدمتها Ptal-N * 01:0110,19. هنا، القدرة ملزمة من هذا الببتيد إلى Ptal-N *01:01 مع الخفافيش المتجانسة β2متر (bβ2م) وغير β الإنسانheterologous 2م (hβ2م) (الشكل1C، 1D)تمتقييم. شكلت بلورات مع دقة أعلى، على التوالي (الشكل 1E، 1F). تتكون الكريستالة من مجمع Ptal-N*01:01/HeV1، الذي تم تشكيله من خلال الرناتون مع bβ2m، والقرار هو 2.31 Å. يتم تشكيل الكريستال من مجمع Ptal-N *01:01/HeV1، الذي تم تشكيله من خلال الرناتون مع hβ2m، والقرار هو 1.6 Å. تم تشكيل مجمع Ptal-N *01:01/HeV1 بنجاح من خلال الرناتون مع كل من bβ2m و hβ2m(الشكل 1C, 1D). في هذا السياق، أظهرنا أن مجمع Ptal-N*01:01/HeV1 لم يتم تشكيله دون وجود β2م(الشكل 1A)وH-2Kd التي تُطوى بشكل صحيح من خلال hβ2m(الشكل 1B).
ثم تم تحليل هياكل Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m و Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m. في هيكل Ptal-N *01:01/HeV1/bβ2m، المخلفات R3، H31، Q34، D53، W60، Y63 bβ2m منضمة إلى بقايا سلسلة H من خلال الجزء السفلي من PBG وبقايا Q8، Y10، R12، N24، Y28، N98، N99 منضم إلى نطاق α3 من سلسلة H. على غرار Ptal-N *01:01/HeV1/bβ2متر، في هيكل Ptal-N * 01:01/HeV1/hβ2متر، المخلفات المحفوظة H31، D53، W60، Y63 من hβ2م التي تتوافق مع bβ2m، أجرى اتصال مع الجزء السفلي من PBG والمخلفات المحفوظة Q8، Y10، R12، N24 التي تتوافق مع bβ2m منضم إلى نطاق α3(الشكل 2A, 2B).
في الهياكل العامة Ptal-N *01:01/HeV1/bβ2متر و Ptal-N * 01:01/HeV1/hβ2m, متوسط الانحراف التربيعي للجذور المتوسطة (RMSD) للمخلفات 1-184 من سلاسل H (تشكيل PBG α1α2) كان 0.248 تحت كل الذراتα C(الشكل 3A). وتشير هذه النتيجة إلى أنه لا يوجد فرق بين هذين المجمعين. ثم تمت مقارنة التشكلات من الببتيدات مماثلة في المجمعات مع βمختلفة 2م ثم. وأظهرت بنية محاذاة الببتيد أن التشكلات من HeV1 الببتيدات في هذين المجمعين كانت متشابهة تماما (الشكل 3B). وبالإضافة إلى ذلك، فإن هياكل gp33(KAVYNFATM) التي قدمها H-2Dب والمُعقدة مع الماوس β2م (mβ2m) أو hβ2m. وكان RMSD من PBG α1α2 من H-2Dب 0.283 والتشكلات الشاملة من الببتيدات في هذين الهيكلين كانت متشابهة أيضا(الشكل 3C، 3D). وتشير هذه البيانات إلى أن استبدال β2م بين bβ2m وhβ2m، و mβ2m و hβ2m لا تؤثر على التشكلات من الببتيدات المقدمة.
وأظهرت محاذاة التسلسل أن الأحماض الأمينية β2متر من الأنواع المختلفة يتم الحفاظ عليها بشكل كبير (الشكل 4). بعد تحليل β2م من الأنواع المختلفة أظهرت أن معظم الأحماض الأمينية من β2م التي كانت تشكل السندات الهيدروجين مع سلسلة H من MHC الأول تم حفظها (الشكل 4، الجدول 2). وفي الوقت نفسه، كانت المخلفات المتنوعة أيضا الأحماض الأمينية مع خصائص كيميائية مماثلة في الثدييات. ومع ذلك ، فإن المخلفات الرئيسية المشاركة في β2متر ملزمة لسلسلة H من MHC أظهرت أنني متعدد الأشكال في الدجاج والأسماك والبرمائيات (الشكل 4).
الجدول 1: تتحد الثدييات المختلفة مع β غيرم. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول 2: تفاعلات السندات الهيدروجين بين β2م سلسلة ثقيلة في MHC I من الأنواع المختلفة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
الشكل 1: تنقية Ptal-N*01:01/HeV1 القابل للذوبان والمُعاد تجمُّع البروتينات والصور الفوتوغرافية للبلورة المستخدمة في تحليل الحيود. M هو علامات الوزن الجزيئي في kDa. ف 1 هو الإجماليات. وP2 هو مجمع MHC. وP3 هو β2م (أ) Ptal-N * 01:01/HeV1 لم يتم تشكيلها دون وجود β2م (B) H-2Kمجمع د تم تشكيله من خلال الرناتونية مع hβ2م (C) Ptal-N * 01:01/HeV1 تم تشكيله من خلال رناتريف مع b2m. تم وضع علامة على الملف الشخصي مع المواقف التقريبية لمعايير الكتلة الجزيئية من 75.0، 44.0، و 13.7 كيلو. (D)Ptal-N*01:01/ تم تشكيل مجمع HeV1 من خلال الرناتون مع hβ2م (E)يتم تشكيل الكريستال من Ptal-N *01:01/HeV1 المعقدة، والتي تشكلت من خلال الرناتويل مع bβ2م. السهم الأسود يمثل البلورة المستخدمة لجمع البيانات أثناء حيود الأشعة السينية. (F) يتم تشكيل الكريستال من Ptal-N * 01:01/HeV1 المعقدة التي تشكلت من خلال الرناتون مع hβ2م. السهم الأسود يمثل البلورة المستخدمة لجمع البيانات أثناء حيود الأشعة السينية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الترابط الهيدروجيني بين β2متر وسلسلة ثقيلة في مجمعات MHC I الهجينة. هيدروجين الترابط بين β2م و H سلسلة في (A) Ptal-N * 01:01/bβ2m/HeV1 و (B) Ptal-N *01:01/hβ2m/HeV1 MHC complexes. يتم تمثيل تفاعلات السندات الهيدروجينية بخط منقط أسود. يمثل المربع المساحة التي تم تكبيرها وإظهارها إلى اليمين في المربعات الملونة المقابلة. يمثل الأحمر أن β المتجانسة2متر β2م استخدام نفس الأحماض الأمينية لتشكيل السندات الهيدروجينية مع سلسلة H. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التشكل المماثل لمجمع MHC والببتيدات المضادة للحساسية في مجمعات MHC I الهجينة. (أ)تراكب نطاقات α1α2 من Ptal-N *01:01/bβ2م (الأخضر) و Ptal-N * 01:01/hβ2m (رمادي). (B) تراكب ببتيد HeV1 مع تراكب نطاق α1α2 لكل جزيء Ptal-N *01:01. HeV1 الببتيد هو ممثل كما الوردي في Ptal-N * 01:01/bβ2متر والأصفر في Ptal-N * 01:01/hβ2متر. (C) تراكب نطاقات α1α2 من H-2Db /mouse β2م (mβ2م) (الأخضر) و H-2Db /hβ2m (رمادي). (D) تراكب من الببتيد gp33 مع تراكب المجال α1α2 من كل جزيء H-2Dب. يتم تمثيل ببتيد gp33 كما الأزرق في H-2Dب / mβ2م والوردي في H-2Dب / hβ2 م. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: محاذاة تسلسلية مبنية على الهيكل منhβ 2m مع β2م من الأنواع الأخرى. الأسهم السوداء تدل على β- خيوط. يتم حفظ المخلفات التي تم تمييزها باللون الأحمر بالكامل، والمخلفات في الصناديق الزرقاء مرتفعة للغاية (> 80٪) الحفظ. تمثل المثلثات الصفراء الأحماض الأمينية الرئيسية للتفاعل بين سلاسل β2m و H. تم إنشاء محاذاة التسلسل باستخدام Clustal X32 و ESPript33. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بناء مجمع البروتين الهجين من خلال استبدال heterologous من مختلف التاشيا هي استراتيجية مشتركة للتحقيقات الوظيفية والهيكلية عندما لا تتوفر مجمع متماثل، كما هو الحال في MHC الأول ويغاندس. غير أن الملخصات المتعلقة بالمنهجية والتكنولوجيا محدودة. هنا، تم تحليل هيكل الخفافيش MHC الأول، Ptal-N * 01:01، استقرت من قبل bβ2م أو hβ2متر. تم العثور على الأحماض الأمينية الرئيسية β2متر ملزمة لبتال N * 01:01 أن تكون محفوظة بين الخفافيش والإنسان. وعند إجراء مزيد من التحليل، تبين أن البقايا الرئيسية التي ينطوي عليها β2متر من الربط لسلسلة H من MHC I قد تم حفظها في الثدييات ولكنها متعددة الأشكال في الدجاج والأسماك والبرمائيات. وتشير هذه البيانات إلى أن استبدال β2م هو وسيلة مجدية لدراسة MHC I للثدييات. ومع ذلك، قد لا يكون من الممكن استبدال الثدييات والطيور والأسماك أو البرمائيات.
تلعب الدراسات الهيكلية أدوارًا محورية في فهم الآليات الجزيئية لعرض الببتيد من قبل جزيئات MHC I. يستخدم عادة β استبدال2متر في MHC الأول الدراسات الهيكلية14،16،17،18،26،27،28. وقد أظهرت الأعمال السابقة أنه في الأبقار MHC الأول، N * 01801، β2متر والbovineβ 2م تصرف بالمثل أثناء الربط إلى المجالات α1α2 من سلسلة N * 01801 H17. هنا، تم تحليل هيكل الببتيد واحد التي قدمها نفس سلسلة H من MHC الأول ولكن مختلفة β2متر. وتبين هذه البيانات أن التشكلات من الببتيد متشابهة عندما تستقر بواسطة التاشير β2م، مما يدل على أن استبدال β2م لا يؤثر على عرض الببتيد.
الببتيدات المستضدية التي قدمها MHC أنا معترف بها من قبل TCR للتوسط T خلية التنشيط29. خلال العدوى الفيروسية، فإن تقييم استجابات المناعة الخلايا التاتية المحددة للمستضد تحسن بشكل كبير من فهم العدوى الفيروسية والاستجابات المناعية المضيفة. رباعيات الببتيد MHC هو تقنية هامة لتقييم استجابات الخلايا T; بل هو تقنية ل tetramerize جزيء مونومر MHC، وتحسين تقاربه، والجمع بين ذلك مع TCRS متعددة على الخلايا T. وتستخدم على نطاق واسع tetramers في البحوث والتشخيص السريري14,29,30. في الآونة الأخيرة، TCR هندسة الخلايا التائية (TCR-T) أصبحت موضوعا ساخنا في العلاج المناعي الورم لفعاليتها المحتملة في علاج الأورام الخبيثة31. MHC I تترامير تلطيخ هو وسيلة حاسمة لفحص TCR محددة ملزمة لببتيدات مستضد المرتبطة بالسرطان التي تقدمها جزيئات MHC I29. ولذلك، فإن إعداد رباعيات MHC I يلعب دورًا حيويًا في فحص TCR. بالإضافة إلى ربط سلسلة MHC I H، β2متر يربط أيضا إلى CD8 على سطح الخلية T، والتي قد تؤدي إلى تلطيخ غير محددة أثناء فحص TCR بواسطة تلطيخ THC I tetramer. قد يقلل استبدال β2م هذا الربط غير المحدد لـ MHC I tetramer.
ومع ذلك، هناك بعض القيود على البروتوكول. أولاً، على الرغم من أن الإشريكية القولونية تظل هي المضيفة المهيمنة للبروتينات المؤتلفة، إلا أنه لا يمكن إجراء العديد من التعديلات اللاحقة للترجمة، وتشكل منتجات البروتينات المعبّر عنها هيئات إدراج غير قابلة للذوبان. ثم، وبسبب استبدال بعض β غير الثدييات β2متر مع الثدييات β2متر، لا يُعرف ما إذا كان يمكن استبدال الثدييات β2م β2م للمساعدة في استقرار هيكلها MHC. في البروتوكول ، قمنا بتضمين وصفًا لتحليلاتنا المجربة باستخدام خادم NetMHCpan و Rosetta FlexPepDock. ولسوء الحظ، لم تتطابق أي تنبؤات من التوقعات المنتجة مع البيانات التجريبية. وقد يشير هذا إلى أن التنبؤات الحالية لبيبتيد MHC الملزم لم تكن مناسبة للثدييات غير البشرية وغير الماوس مثل الخفافيش، والتي قد يكون لها طريقة مختلفة لربط الببتيد. لذلك، نحن بحاجة إلى الجمع بين مختلف برامج التنبؤ والنتائج التجريبية لتحليل شامل للحصول على الببتيدات تقارب عالية.
في البروتوكول الموصوف هنا ، فإن الخطوة الرئيسية هي أنه يمكن رنة MHC بشكل صحيح. من المهم جدا الحصول على مجمع MHC مع كفاءة إعادة تتكف عالية. ولذلك، فمن الأهمية بمكان أن تولي اهتماما لاختيار الببتيدات المناسبة وزيادة نقاء الهيئات إدراج.
في الختام، يتلخص هنا بروتوكول للتعبير MHC الأول، وتكميم، والتبلور، وجمع البيانات الكريستال وتحديد الهيكل. وعلاوة على ذلك، تم تحليل جدوى استبدال β2م في دراسة MHC الأول. تقدم هذه الدراسة مرجعاً سليماً لفهم MHC الأول في الدراسات الهيكلية والوظيفية. بالإضافة إلى ذلك، هذه البيانات مهمة أيضاً لتقييم استجابات الخلايا التائية أثناء الأمراض المعدية والعلاج المناعي للورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يعلنونه.
Acknowledgments
وقد دعم هذه الدراسة من قبل الصندوق المفتوح من مختبر الدولة الرئيسية للتكنولوجيا الحيوية الصيدلانية، جامعة نان جينغ، الصين (منحة لا. KF-GN-201905)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنح 81971501). وليام J. ليو هو مدعوم من قبل برنامج العلماء الشباب ممتازة من NSFC (81822040) وبكين خطة نجمة جديدة للعلوم والتكنولوجيا (Z181100006218080).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
