Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Stabiliteit en structuur van Vleermuis Major Histocompatibiliteit Complexe Klasse I met Heterologe β2-Microglobuline

Published: March 10, 2021 doi: 10.3791/61462
Automatic Translation
*1,2, *3,4, *2,5, 1,2, 1,2, 2, 2, 4, 1, 4, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Het protocol beschrijft experimentele methoden om stabiele grote histocompatibiliteitscomplexen (MHC) klasse I te verkrijgen door middel van mogelijke β2-microglobuline (β2m) vervangingen van verschillende soorten. De structurele vergelijking van MHC I gestabiliseerd door homologe en heterologe β2m werd onderzocht.

Abstract

Het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC) speelt een cruciale rol in de presentatie van antigeenpeptiden en de immuunresponsen van T-cellen tegen infectieziekten en tumorontwikkeling. De hybride MHC I gecomplexeerd met heterologe β2-microglobuline (β2m) substitutie van verschillende soorten kan in vitro worden gestabiliseerd. Dit is een haalbaar middel om MHC I van zoogdieren te bestuderen, wanneer de homologe β2m niet beschikbaar is. Ondertussen is aangegeven dat zoogdier β2m substitutie geen significante invloed heeft op de presentatie van peptiden. Er is echter beperkte samenvatting met betrekking tot de methodologie en de technologie voor de hybride MHC I gecomplexeerd met heterologe β2-microglobuline (β2m). Hierin worden methoden gepresenteerd om de haalbaarheid van heterologe β2m substitutie in MHC I-studie te evalueren. Deze methoden omvatten de voorbereiding van expressieconstructies; zuivering van inclusieorganen en herindeling van het MHC-complex; bepaling van de thermostabiliteit van eiwitten; kristalscreening en structuurbepaling. Deze studie biedt een aanbeveling voor het begrijpen van de functie en structuur van MHC I, en is ook belangrijk voor de evaluatie van de T-celrespons tijdens infectieziekte en tumorimmunotherapie.

Introduction

Het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex (MHC) bestaat in alle gewervelde dieren en is een reeks genen die de celgemedieerde immuniteit tegen infectieuze pathogenen bepaalt. MHC klasse I presenteert endogene peptiden, zoals virale componenten geproduceerd bij virusinfectie, aan T-celreceptoren (TCR) op het oppervlak van CD8+ T-cellen om cellulaire immuniteit te bemiddelen en deel te nemen aan immuunregulatie1. Een structurele studie van MHC I binding aan peptiden geeft informatie over peptidebindende motieven en presentatiekenmerken van MHC I-moleculen, die een essentiële rol spelen bij de evaluatie van CD8+ T-cel immuunresponsen en vaccinontwikkeling.

Sinds de eerste kristallisatie en structurele bepaling van MHC I moleculair door Bjorkman et al.2, heeft de kristalstructuuranalyse van MHC I-moleculen het begrip van hoe peptiden zich binden aan MHC I-moleculen sterk bevorderd en helpt het de interactie van lichte ketens met zware ketens en peptiden te begrijpen. Een reeks vervolgstudies wees uit dat hoewel de genen die coderen voor de lichtketen niet geassocieerd zijn met de MHC, de lichtketen een belangrijk eiwit is voor de assemblage van MHCI-moleculen 3,4. Het interageert met de drie domeinen van MHC klasse I moleculen op meerdere oppervlakken. Wanneer de lichtketen afwezig is, kunnen MHC-moleculen van klasse I niet correct worden uitgedrukt op het oppervlak van antigeen presenterende cellen en kunnen ze niet interageren met TCR om hun immunologische functies uit te oefenen.

MHC I bestaat uit een zware ketting (H-ketting) en lichte ketting (d.w.z. β2-microglobuline (β2m)), en wordt geassembleerd door binding aan een geschikt peptide5. Het extracellulaire segment van de H-keten bestaat uit α1-, α2- en α3-domeinen6. De domeinen α1 en α2 vormen de peptidebindende groef (PBG). De β ketting van2m fungeert als een structurele subeenheid van het assemblagecomplex in MHC I, stabiliseert de exterieur van het complex en is een moleculaire chaperonne voor MHC I H-kettingvouwen7,8,9. Een reeks studies heeft aangetoond dat MHC I H kettingen van verschillende zoogdieren zoals vleermuis (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primaten) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, muis (Rodentia) (H-2Kd)14,15, hond (Carnivora) (DLA-88 *50801)16, runderen (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 en paard (Peris sodactyla) (Eqca-N*00602 en Eqca-N*00601)18 kan worden gecombineerd met heterologe β2m (tabel 1). Deze hybride moleculen worden vaak gebruikt in structurele en functionele studies. De methodologie voor de functionele en structurele studie van de hybride MHC I met heterologe β2m is echter nog niet samengevat. Ondertussen blijft de structurele basis voor de verwisselde β2m tussen verschillende taxa onduidelijk.

Hierin wordt de procedure voor MHC I-expressie, refolding, kristallisatie, kristalgegevensverzameling en structuurbepaling samengevat. Bovendien worden potentiële vervangingen van β2m van verschillende soorten geanalyseerd door vergelijking van de structurele conformiteit van MHC I gestabiliseerd door homologe en heterologe β2m. Deze methoden zullen nuttig zijn voor verdere MHC I structurele studie en CD8+ T cel immuunrespons evaluatie bij kanker en infectieziekten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van expressieconstructies

  1. Haal de sequenties van MHC klasse I genen (inclusief voorspelde genen) uit vleermuizen uit de NCBI database.
  2. Haal hogere zoogdier MHC I zware kettingsequenties op uit de Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) en de UniProt database (www.uniprot.org).
  3. Om oplosbare MHC-complexen te verkrijgen, mutagenize de sequenties om de cytosolische en transmembrane gebieden te verwijderen.
  4. Kloon de genen die coderen voor de ectodomains van de vleermuis Ptal-N*01:01 (GenBank nr. KT98792919) (residuen 1–277) en vleermuis β2m (GenBank nr. XP_006920478.1) (residuen 1–98) in respectievelijk pET-28a vectoren (Novagen, Beijing, China).
  5. Plaats de geoptimaliseerde (voor Escherichia coli)sequenties werden ingevoegd tussen de NcoI en EcoR1 sites van een gemodificeerde pET-28a vector.
  6. Construeer menselijke β2m expressieplasmiden zoals eerder beschreven20.

2. Peptidesynthese

  1. Peptiden voorspelling
    1. Zoals eerder beschreven10, om te screenen op peptiden die zich kunnen binden aan Ptal-N *01:01, voorspel kandidaat-peptiden met behulp van de eiwitlichamen van vleermuisgerelateerde virussen hendravirus (HeV). Om peptiden met hoge affiniteit te verkrijgen op basis van het structurele model van de online server, voorspelden NetMHCpan 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 en Rosetta FlexPepDock22 potentiële binding in de geselecteerde peptidefractie. Daarnaast kunnen ook andere software en databases worden gebruikt, waaronder BIMAS, de Immune Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2 en SYFPEITHI, die allemaal voorspellingen van peptide-MHC klasse I binding affiniteit integreren, transporter geassocieerd met antigeenverwerking (TAP) transportefficiëntie, proteasomaal C-terminal decolleté en halftijdse dissociatie van peptide-HLA klasse I moleculen in hun uitlezingen.
    2. Gebruik zowel de NetMHCpan- als de Rosetta FlexPepDock-server om hoogbindende peptiden te voorspellen.
      OPMERKING: Helaas komen geen van de geproduceerde voorspellingen overeen met de experimentele gegevens. Dit kan erop wijzen dat de huidige MHC bindende peptidevoorspellingen niet geschikt waren voor niet-menselijke en niet-muiszoogdieren zoals vleermuizen, die een andere manier van peptidebinding kunnen hebben. Daarom moeten we verschillende voorspellingssoftware en experimentele resultaten combineren voor uitgebreide analyse om peptiden met hoge affiniteit te verkrijgen.
  2. Peptiden bereiding en conservering
    1. In plaats van het genereren van aangepaste peptiden, gebruik gespecialiseerde dienstverleners. Koop alle peptiden commercieel volgens peptide voorspellingstools, die een hogere bindingsscore hebben. De zuiverheid van het peptide werd bepaald om >95% door HPLC en massaspectrometrie te zijn.
    2. Bewaar alle gekochte peptiden als gevriesdroogd poeder bij −80 °C en los voor gebruik op in dimethylsulfoxide (DMSO).

3. Zuivering van inclusieorganen

  1. Transformatie van E. coli
    1. Transformeer 10 ng plasmide bevattende vleermuis MHC I Ptal-N*01:01 H ketting, of menselijke β2m of vleermuis β2m in 100 μL BL21(DE3) E. coli. Baad 30 minuten in ijs.
    2. Hitteschok bij 42 °C gedurende 90 s, gevolgd door baden in ijs gedurende 2 minuten.
    3. Voeg 800 μL lysogeny bouillon (LB: gistextract, tryptone en NaCl; zie de Materialentabel) toe aan stap 3.1.2 en schud bij 200 rotaties per minuut (tpm) gedurende 20 minuten op een schommelplatform bij 37 °C.
    4. Breng 100 μL bacteriële suspensie aan op de plaat met de bijbehorende antibioticaresistentie (ampicilline: 100 ng/ml), die gelijk zijn aan eerdere constructies.
  2. Culturen inenten
    1. Kies een enkele onlangs getransformeerde bacteriële kloon in 3 ml LB met antibioticummedium (ampicilline: 100 ng/ml) en cultuur bij 37 °C, terwijl je schudt bij 200 tpm op een schommelplatform om de bacteriën te activeren. Culturen kunnen 's avonds laat worden ingeënt, om de volgende ochtend klaar te zijn voor inductie.
    2. Breng een nacht van tevoren 500 μL van de geactiveerde bacterievoorraad over in 50 ml LB met antibioticummedium (ampicilline: 100 ng/ml) en incubeer 's nachts bij 37 °C, schuddend bij 200 tpm. Voor het gemak bij het bereiden van de volgende inenting, bevries de resterende geactiveerde bacteriële voorraad in 1 ml aliquots (500 μL cultuur met 500 μL van 40% glycerol) bij −80 °C totdat de volgende bereiding nodig is.
    3. Om grote hoeveelheden recombinant eiwit te genereren, brengt u het bacteriële preparaat over in 2 L LB met antibioticummedium (ampicilline: 100 ng/ml) bij een verhouding van 1:100, incubert u bij 37 °C terwijl u schudt bij 200 tpm. Kweek tot een absorptie van 0,6 bij 600 nm wordt bereikt. Voeg 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (varieer de concentratie IPTG voor verschillende MHCs, meestal tussen 0,1 mM-1 mM) toe aan de kolf voor inductie van eiwitexpressie.
  3. De bacteriën van de oogst
    1. Breng de bacteriën over op centrifugeflessen en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 4 °C op 5000 x g. Alle stappen moeten vanaf nu bij 4 °C worden uitgevoerd.
    2. Resuspend de bacteriën in 60 ml fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en bevrijd het uitgedrukte recombinante eiwit door ultrasone celverstoorder.
      OPMERKING: Over het algemeen is het programma dat we op deze machine hebben ingesteld ultrasone 6S, interval 12S, 300 W, 99 keer).
  4. Zuivering van inclusie-instanties
    1. Centrifugeer de gesoniceerde bacteriële suspensie gedurende 30 minuten op 12.000 x g. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in een geschikt volume wasbuffer (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Herhaal dit proces nogmaals.
    2. Centrifugeren bij 12.000 x g gedurende 10-20 min. Gooi de supernatant weg en resuspendeer de inclusielichamen in resuspensiebuffer (50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Verwijder een monster van 20 μL (insluitlichamen in resuspensiebuffer) voor SDS-PAGE om de zuiverheid van inclusielichamen te testen.
    3. Centrifugeer de resterende bereiding op 12.000 x g gedurende 10-20 min. Gooi de supernatant weg. Weeg de pellet met de insluitlichamen af en voeg ontbindingsbuffer (6 M Gua-HCl, 10% glycerine, 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) toe aan een uiteindelijke concentratie van 30 mg/ml. Roer langzaam met een magneetroerder bij 4 °C totdat de insluitlichamen in de ontbindingsbuffer zijn opgelost.
    4. Centrifugeer 12.000 x g gedurende 10-20 min. Gooi de neerslagen weg. Bewaar de insluitlichamen bij −20 °C of −80 °C.
      OPMERKING: Voordat u doorgaat met de zuivering van inclusielichamen, bevestigt u dat de inductie en expressie van recombinant eiwit succesvol waren. Voer monsters van elke kweek (genomen voor en na IPTG-inductie) uit op een eiwitgel; 15% SDS-PAGE (SDS-PAGE geconcentreerd tandvlees: H2O, 30% acrylamide, 1 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 10% APS en TEMED; SDS-PAGE scheidingsgel: H2O, 30% acrylamide, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS en TEMED; zie de Materialentabel ) voor de β2m, 10% SDS-PAGE voor de H-keten.

4. Herverdeel van MHC-complex

OPMERKING: De efficiëntie van de opnieuw gevouwen inclusielichamen heeft invloed op de opbrengst van het verkregen eiwit. Vouwen concurreert met polymerisatie, dus het wordt algemeen aanvaard dat hervervouwen bij lage eiwitconcentraties de meest succesvolle methode is. In dit artikel is de concentratie van de inclusielichamen 30 mg/ml.

  1. Bereid het opnieuw vouwen van de buffer voor.
    1. Varieer de samenstelling van de refolding buffer afhankelijk van het eiwit. De pH, ionische sterkte, redoxcondities en de aanwezigheid van liganden hebben bijvoorbeeld invloed op de refoldingresultaten. De meest voorkomende is het gebruik van tris- of HEPES-gebaseerde buffers bij een neutrale pH met de NaCl-concentratie van 50-500 mM, maar dit hangt ook af van het doeleiwit. Hieronder volgt de bufferformule voor het opnieuw vouwen die in dit artikel wordt gebruikt.
    2. Bereid de vouwbuffer voor met 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM L-arginine, 2 mM EDTA-2Na.
    3. Koel de buffer tot 4 °C in een kolf van 250-300 ml en voeg vervolgens 5 mM gereduceerd glutathion (GSH) en 0,5 mM geoxideerd glutathion (GSSG) toe. Roer langzaam met een magneetroerder bij 4 °C gedurende nog eens 10-20 minuten voordat u de insluitlichamen en peptiden toevoegt.
  2. Injectie en verdunning van MHC H ketting en β2m
    OPMERKING: De temperatuur waarbij het opnieuw wordt gevouwen kan variëren, hoewel over het algemeen, om aggregatie te minimaliseren, 4 °C het beste is. We gebruiken verdunning om de eiwitten te refolden.
    1. Injecteer met behulp van een naald uit een spuit van 1 ml 1 ml hβ2m inclusielichamen of bβ2m inclusielichamen in respectievelijk twee hervouwbare buffers (elk 1 liter). Injecteer in de buurt van de krachtig roterende roerstaaf om een snelle en efficiënte verdunning te verkrijgen. β2m refoldt relatief eenvoudig en blijft stabiel, zelfs bij afwezigheid van de H-keten.
    2. Nadat de β2m is opgelost in refoldingoplossing, lost u peptiden (5 mg/ml) op in DMSO en injecteert u snel 200 μL in de refoldingoplossing. Roer langzaam gedurende 10-20 minuten voordat u de H-ketting toevoegt.
    3. Injecteer de H-ketting met dezelfde procedure die hierboven is beschreven voor β2m. De H-keten is zeer onstabiel; daarom is de volgorde van injectie heel belangrijk. Injecteer 3 ml H-keteninsluitingslichamen in twee verschillende refoldingbuffers (elk 1 liter) met respectievelijk hβ2m of bβ2m. De opeenvolgende injectie van kleine aliquots in plaats van de enkele toepassing van de hele hoeveelheid eiwit verhoogt de opbrengst van opnieuw gevouwen MHC. Laat het opnieuw vouwen gedurende 8-10 uur bij 4 °C doorgaan.
  3. Concentratie van gevouwen eiwit
    1. Gebruik ultrafiltratie in een kamer onder druk met 10 kDa MMCO-membraan voor de concentratie van de refolding-eiwitten. Deze methode is handig en kan worden gecombineerd met bufferuitwisseling. Voeg uitwisselingsbuffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) toe aan de kamer en concentreer tot een eindvolume van 30-50 ml.
    2. Breng de refolding-oplossing over in een centrifugebuis, draai gedurende 15 minuten bij 4 °C op 12.000 x g om neerslag te verwijderen.
    3. Breng het supernatant voorzichtig over en concentreer je verder naar een laatste volume van ~1 ml.
    4. Centrifugeren bij 12.000 xg gedurende 10-20 min. Breng het supernatant over in een steriele buis en zuiver de eiwitten met behulp van een 10/300 GL-kolom voor grootte-uitsluiting.
    5. Verzamel de monsters op het hoogtepunt en analyseer ze met behulp van SDS-PAGE (15% polyacrylamide gel).
    6. Verzamel de MHC-complexpiek en concentreer tot een uiteindelijke concentratie van 15 mg/ml.
    7. Verdun het complex tot 7,5 mg/ml en 15 mg/ml voor kristallisatie.

5. Kristallisatie, gegevensverzameling en verwerking

  1. Voer kristallisatie uit van complexe MHC en peptide met behulp van de zitdruppeldampdiffusietechniek.
  2. Screen de Ptal-N*01:01/peptide complexen met commerciële kristalkits (bijv. Crystal Screen kit I/II, Index Screen kit, PEGIon kit I/II en de PEGRx kit).
  3. Sluit de resulterende oplossing af en evenwicht tegen 100 μL reservoiroplossing bij 4 of 18 °C.
  4. Observeer de kristalgroei in cultuur gedurende 3 dagen, 1 week, 2 weken, 1 maand, 3 maanden en 6 maanden. Gebruik een microscoop om te zien of elke druppel in de kristalplaat kristallen heeft.
    OPMERKING: Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) kristallen werden waargenomen in 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) en 25% (w/v) polyethyleenglycol 3.350 bij een concentratie van 7,5 mg/ml. Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) kristallen werden waargenomen in 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v polyethyleenglycol 3.350 bij een concentratie van 7,5 mg/ml.
  5. Voor cryogene bescherming, breng de kristallen over naar een opslagoplossing die 20% glycerol bevat en koel vervolgens snel af in een 100 K gasvormige stikstofstroom.
  6. Verzamel röntgendiffractiegegevens van de straallijn BL19U van de shanghai synchrotron stralingsfaciliteit (Shanghai, China).

6. Structuurbepaling en analyses

  1. Met structurele gegevens met hoge resolutie, verwerk en schaal de sterkte van de verzameling met behulp van het Denzo-programma en het HKL2000-softwarepakket (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Na het kiezen van een beter eerste model in de Protein Data Bank (PDB), bepaal de structuren met behulp van moleculaire vervanging met het programma Phaser MR in CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Het gebruikte model was de structuurcoördinaten met Protein Data Bank (PDB) code 5F1I.
  3. Gebruik het verfijnde röntgenmodel voor de eerste voegverfijning. Gebruik Phenix refine alleen en joint modes voor de röntgen alleen en de gezamenlijke neutronen en röntgen verfijning, respectievelijk.
  4. Controleer na elke verfijningsronde handmatig het model tegen Fo − Fc en 2Fo − Fc positieve nucleaire dichtheidskaarten in Meerkoet25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Dit vergemakkelijkt de juiste plaatsing van wateren en bepaalde D-atomen. Alle figuren van structuren zijn gemaakt door PyMOL (http://www.pymol.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eerder werk meldde dat de HeV-afgeleide HeV1 (DFANTFLP) peptide werd gepresenteerd door Ptal-N *01:0110,19. Hierin werd de bindingscapaciteit van dit peptide aan Ptal-N*01:01 met homologe vleermuis β2m (bβ2m) en heterologe menselijke β2m (hβ2m) (figuur1C,1D)geëvalueerd. Er werden respectievelijk kristallen met een hogere resolutie gevormd (figuur 1E,1F). Een kristal wordt gevormd uit het Ptal-N*01:01/HeV1 complex, dat werd gevormd door renaturatie met bβ2m, en de resolutie is 2,31 Å. Een kristal wordt gevormd uit het Ptal-N*01:01/HeV1 complex, dat werd gevormd door renaturatie met hβ2m, en de resolutie is 1,6 Å. Het Ptal-N*01:01/HeV1 complex is met succes gevormd door renaturatie met zowel bβ2m als hβ2m (figuur 1C,1D). In dit verband hebben we aangetoond dat het Ptal-N*01:01/HeV1-complex niet is gevormd zonder de aanwezigheid van β2m (figuur 1A) en de H-2Kd die correct door de hβ2m (figuur 1B )vouwen.

De structuren van Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m en Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m werden vervolgens geanalyseerd. In de structuur Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, residuen R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 van bβ2m gebonden aan de H-ketenresiduen via de bodem van de PBG en residuen Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 gebonden aan het α3-domein van de H-keten. gelijk aan de Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m complex, in de Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m structuur, geconserveerde residuen H31, D53, W60, Y63 van hβ2m die overeenkomen met bβ2m, contact gemaakt met de bodem van de PBG en geconserveerde residuen Q8, Y10, R12, N24 die overeenkomen met bβ2m gebonden aan α3-domein (figuur 2A,2B).

In de algemene structuren Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m en Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, de gemiddelde wortelgemiddelde-kwadratafwijking (RMSD) van residuen 1–184 van de H-ketens (die de α1α2 PBG vormen) was 0,248 onder alleC-α atomen superpositie (figuur 3A). Deze bevinding wees erop dat er geen verschil was tussen deze twee complexen. De conformaties van de vergelijkbare peptiden in de complexen met verschillende β2m werden vervolgens vergeleken. De structuur van de peptide-uitlijning toonde aan dat de conformaties van HeV1-peptiden in deze twee complexen vrij vergelijkbaar waren (figuur 3B). Bovendien werden de structuren van gp33 (KAVYNFATM) gepresenteerd door H-2Db en complex met muis β2m (mβ2m) of hβ2m uitgelijnd. De RMSD van de α1α2 PBG van H-2Db was 0,283 en de totale conformaties van peptiden in deze twee structuren waren ook vergelijkbaar (figuur 3C,3D). Deze gegevens geven aan dat de β substitutie van2m tussen bβ2m en hβ2m, en mβ2m en hβ2m geen invloed hebben op de conformaties van gepresenteerde peptiden.

De uitlijning van desequentietoonde aan dat de aminozuren van β 2 m van verschillende soorten sterk bewaard zijn gebleven (figuur 4). Na analyse van de β2m van verschillende soorten bleek dat de meeste aminozuren van β2m die de waterstofbindingen met de H-keten van MHC I vormden, werden bewaard (figuur 4, tabel 2). Ondertussen waren de verschillende residuen ook aminozuren met vergelijkbare chemische eigenschappen bij zoogdieren. De belangrijkste residuen die betrokken waren bij β2m binding aan de H-keten van MHC I toonden echter polymorfismen bij kippen, vissen en amfibieën (figuur 4).

Tabel 1: De verschillende zoogdieren combineren met heterologe β2m. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Waterstofbindingsinteracties tussen heterologe β2m en zware keten in MHC I van verschillende soorten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 1
Figuur 1: Zuivering van de oplosbare en opnieuw gevouwen Ptal-N*01:01/HeV1 complexe eiwitten en foto's van het kristal dat wordt gebruikt voor diffractieanalyse. De M is moleculaire gewichtsmarkers in kDa. De P1 zijn de aggregaten. De P2 is het MHC complex. De P3 is het β2m. (A) Ptal-N*01:01/HeV1 complex werd niet gevormd zonder de aanwezigheid van β2m. (B) H-2Kd complex werd gevormd door renaturatie met hβ2m. (C) Ptal-N*01:01/HeV1 complex werd gevormd door renaturatie met bβ2m. Het profiel is gemarkeerd met de geschatte posities van de moleculaire massanormen van 75,0, 44,0 en 13,7 kDa. (D) Ptal-N*01:01/ HeV1 complex werd gevormd door renaturatie met hβ2m. (E) Het kristal wordt gevormd uit Ptal-N*01:01/HeV1 complex, dat werd gevormd door renaturatie met bβ2m. De zwarte pijl vertegenwoordigt het kristal dat wordt gebruikt om gegevens te verzamelen tijdens röntgendiffractie. (F) Het kristal wordt gevormd uit Ptal-N*01:01/HeV1 complex dat werd gevormd door renaturatie met hβ2m. De zwarte pijl vertegenwoordigt het kristal dat wordt gebruikt om gegevens te verzamelen tijdens röntgendiffractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Waterstofbinding tussen β2m en zware keten in hybride MHC I-complexen. Waterstofbinding tussen βketen van 2m en H in (A) Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 en (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC complexen. Waterstofbindingsinteracties worden vertegenwoordigd door een zwarte stippellijn. Het vierkant vertegenwoordigt het gebied dat is ingezoomd en rechts wordt weergegeven in de bijbehorende gekleurde vakken. Het rood vertegenwoordigt dat de homologe β2m en de heterologe β2m dezelfde aminozuren gebruiken om waterstofbindingen met de H-keten te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Vergelijkbare exterieur van het MHC-complex en de antigene peptiden in hybride MHC I-complexen. (A) De superpositie van α1α2 domeinen van Ptal-N*01:01/bβ2m (groen) en Ptal-N*01:01/hβ2m (grijs). (B) De superpositie van HeV1 peptide met de superpositie van α1α2 domein van elk Ptal-N*01:01 molecuul. HeV1 Peptide wordt weergegeven als roze in Ptal-N*01:01/bβ2m en als geel in Ptal-N*01:01/hβ2m. (C) De superpositie van α1α2 domeinen van H-2Db /muis β2m (mβ2m) (groen) en H-2Db /hβ2m (grijs). (D) De superpositie van gp33 peptide met de superpositie van α1α2 domein van elk H-2Db molecuul. Peptide gp33 wordt weergegeven als blauw in H-2Db /mβ2m en als roze in H-2Db /hβ2m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Structuurgebaseerde sequentie-uitlijning van hβ2m met β2m van andere soorten. De zwarte pijlen duiden β-strengen aan. De in rood gemarkeerde residuen zijn volledig geconserveerd en de residuen in blauwe dozen zijn zeer (>80%) Bewaard. De gele driehoeken vertegenwoordigen de belangrijkste aminozuren voor de interactie tussen de β2m en H-ketens. De reeksuitlijning is gegenereerd met Clustal X32 en ESPript33. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De bouw van een hybride eiwitcomplex door heterologe vervanging van verschillende taxa is een gemeenschappelijke strategie voor functionele en structurele onderzoeken wanneer het homologe complex niet beschikbaar is, zoals in de MHC I en zijn liganden. Er is echter een beperkte samenvatting met betrekking tot de methodologie en de technologie. Hierin werd de structuur van vleermuis MHC I, Ptal-N*01:01, gestabiliseerd door bβ2m of hβ2m geanalyseerd. De belangrijkste aminozuren van β2m binding aan Ptal-N *01:01 bleken te zijn bewaard tussen vleermuis en mens. Bij verdere analyse bleek het belangrijkste residu dat betrokken was bij β2m binding aan de H-keten van MHC I te worden bewaard bij zoogdieren, maar polymorf bij kippen, vissen en amfibieën. Deze gegevens geven aan dat heterologe β substitutie van2m een haalbaar middel is om de MHC I van zoogdieren te bestuderen. Vervanging tussen zoogdieren en vogels, vissen of amfibieën is echter mogelijk niet haalbaar.

Structurele studies spelen een cruciale rol bij het begrijpen van de moleculaire mechanismen van peptidepresentatie door MHC I-moleculen. Heterologe β substitutie van2m wordt vaak gebruikt in MHC I structurele studies14,16,17,18,26,27,28. Uit eerder werk is gebleken dat in runderen MHC I, N*01801, murine β2m en runderen β2m zich op dezelfde wijze gedroegen tijdens binding aan de α1α2-domeinen van de N*01801 H-keten17. Hierin werd de structuur van een enkel peptide gepresenteerd door dezelfde H-keten van MHC I, maar verschillende β2m geanalyseerd. Deze gegevens tonen aan dat de conformaties van peptiden vergelijkbaar zijn wanneer gestabiliseerd door cross-taxa β2m, wat erop wijst dat heterologe β substitutie van2m geen invloed heeft op de presentatie van peptiden.

Antigeenpeptiden gepresenteerd door MHC I worden herkend door TCR om T-celactivering te bemiddelen29. Tijdens virale infectie zal de evaluatie van antigeenspecifieke T-cel immuunresponsen het begrip van virale infecties en host immuunreacties aanzienlijk verbeteren. Het peptide-MHC tetrameer is een belangrijke techniek om T-celreacties te evalueren; het is een techniek om het MHC monomeer molecuul te tetrameriseren, zijn affiniteit te verbeteren en te combineren met meerdere TCRS op T-cellen. Tetramers worden veel gebruikt in onderzoek en klinische diagnose14,29,30. Onlangs zijn TCR-gemanipuleerde T-cellen (TCR-T) een hot topic geworden in tumorimmunotherapie vanwege hun potentiële werkzaamheid bij de behandeling van kwaadaardigetumoren 31. MHC I tetramerkleuring is een cruciale methode voor het screenen van specifieke TCR-binding aan kankergerelateerde antigeenpeptiden gepresenteerd door MHC I-moleculen29. Daarom speelt MHC I tetramerpreparaat een cruciale rol bij TCR-screening. Naast het binden van de MHC I H-keten bindt β2m ook aan CD8 op het T-celoppervlak, wat kan leiden tot niet-specifieke kleuring tijdens TCR-screening door MHC I tetramerkleuring. Heterologe β substitutie van2m kan deze niet-specifieke binding van de MHC I-tetramer verminderen.

Er zijn echter enkele beperkingen aan het protocol. Ten eerste, hoewel E. coli de dominante expressiehost blijft voor recombinante eiwitten, kunnen veel post-translationele wijzigingen niet worden uitgevoerd en vormen de uitgedrukte eiwitproducten onoplosbare inclusielichamen. Dan, als gevolg van de vergelijkbare vervanging van sommige niet-zoogdier β2m met zoogdier β2m, is het niet bekend of niet-zoogdier β2m kan worden vervangen door heterologe β2m om hun MHC-structuur te helpen en te stabiliseren. In het protocol hebben we een beschrijving opgenomen van onze beproefde analyses met behulp van zowel de NetMHCpan- als Rosetta FlexPepDock-server. Helaas kwamen geen van beide geproduceerde voorspellingen overeen met de experimentele gegevens. Dit kan erop wijzen dat de huidige MHC bindende peptidevoorspellingen niet geschikt waren voor niet-menselijke en niet-muiszoogdieren zoals vleermuizen, die een andere manier van peptidebinding kunnen hebben. Daarom moeten we verschillende voorspellingssoftware en experimentele resultaten combineren voor uitgebreide analyse om peptiden met hoge affiniteit te verkrijgen.

In het hier beschreven protocol is de belangrijkste stap dat de MHC correct kan worden gerenatureerd. Het is erg belangrijk om een MHC-complex te verkrijgen met een hoge refolding-efficiëntie. Daarom is het cruciaal om aandacht te besteden aan het selecteren van geschikte peptiden en het verhogen van de zuiverheid van inclusielichamen.

Tot slot wordt hierin een protocol samengevat voor MHC I expressie, refolding, kristallisatie, kristaldataverzameling en structuurbepaling. Bovendien werd de haalbaarheid van heterologe β2m substitutie in MHC I-studie geanalyseerd. Deze studie biedt een goede referentie voor het begrijpen van MHC I in structurele en functionele studies. Daarnaast zijn deze gegevens ook significant voor de evaluatie van T-celreacties tijdens infectieziekten en tumorimmunotherapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te verklaren.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door het open fonds van het belangrijkste staatslaboratorium voor farmaceutische biotechnologie, Nan-jing University, China (Grant no. KF-GN-201905), de National Natural Science Foundation of China (subsidies 81971501). William J. Liu wordt ondersteund door het Excellent Young Scientist Program van de NSFC (81822040) en Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
  28. McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Tags

Immunologie en infectie Major histocompatibility antigen complex (MHC) klasse I moleculen β2-microglobuline (β2m) complexe structuur peptide TCR tetramer
Stabiliteit en structuur van Vleermuis Major Histocompatibiliteit Complexe Klasse I met Heterologe β<sub>2</sub>-Microglobuline
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang,… More

Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter