Summary
El protocolo describe métodos experimentales para obtener sustitutos estables del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase I a través de posibles β sustituciones de2-microglobulina (β2m) de diferentes especies. Se investigó la comparación estructural del MHC I estabilizado por β2m homólogas y heterologosas.
Abstract
El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) desempeña un papel fundamental en la presentación de péptidos de antígeno y las respuestas inmunes a las células T contra las enfermedades infecciosas y el desarrollo tumoral. El MHC híbrido I complejo con β heterologosa2-microglobulina (β2m) sustitución de diferentes especies se puede estabilizar in vitro. Este es un medio factible para estudiar MHC I de mamíferos, cuando el βhomónode 2 m no está disponible. Mientras tanto, se indica que la sustitución de mamíferos β2m no afecta significativamente la presentación de péptidos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología para el MHC I híbrido complejo con heterologous β2-microglobulina (β2m). En este documento, se presentan métodos para evaluar la viabilidad de la sustitución heterologosa βde 2m en el estudio MHC I. Estos métodos incluyen la preparación de construcciones de expresión; purificación de los organismos de inclusión y refolding del complejo MHC; determinación de la termosabilidad proteica; cribado de cristal y determinación de la estructura. Este estudio proporciona una recomendación para entender la función y estructura del MHC I, y también es significativo para la evaluación de la respuesta de las células T durante las enfermedades infecciosas y la inmunoterapia tumoral.
Introduction
El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) existe en todos los vertebrados y es un conjunto de genes que determina la inmunidad mediada por células a patógenos infecciosos. MHC clase I presenta péptidos endógenos, tales como componentes virales producidos sobre la infección por virus, a los receptores de células T (TCR) en la superficie de las células CD8+ T para mediar la inmunidad celular y participar en la regulación inmune1. Un estudio estructural de la unión MHC I a péptidos proporciona información sobre motivos de unión de péptidos y características de presentación de moléculas MHC I, que desempeña un papel vital en la evaluación de las respuestas inmunes a células CD8+ T y el desarrollo de vacunas.
Desde la primera cristalización y determinación estructural del MHC I molecular por Bjorkman et al.2,el análisis de estructura cristalina de moléculas MHC I ha promovido en gran medida la comprensión de cómo los péptidos se unen a las moléculas MHC I, y ayuda a entender la interacción de cadenas ligeras con cadenas pesadas y péptidos. Una serie de estudios de seguimiento indicaron que aunque los genes que codifican la cadena de luz no están asociados con el MHC, la cadena de luz es una proteína clave para el montaje de moléculas MHC I3,4. Interactúa con los tres dominios de las moléculas de clase I de MHC en múltiples superficies. Cuando la cadena de luz está ausente, las moléculas MHC clase I no se pueden expresar correctamente en la superficie de las células que presentan antígenos y no pueden interactuar con TCR para ejercer sus funciones inmunológicas.
MHC I se compone de una cadena pesada (cadena H) y cadena de luz (es decir, β2-microglobulina (β2m)), y se ensambla a través de la unión a un péptido adecuado5. El segmento extracelular de la cadena H consta de α1, α2 y α3 dominios6. Los dominios α1 y α2 forman la ranura de unión de péptidos (PBG). La cadena βde 2m actúa como subunidad estructural del complejo de montaje en MHC I, estabilizando la conformación del complejo, y es una chaperona molecular para la cadena MHC I H plegable7,8,9. Una serie de estudios han demostrado que las cadenas MHC I H de varios mamíferos como murciélago (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, ratón (Rodentia) (H-2Kd)14,15, perro (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, ganado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 y equino (Periss (Eqca-N*00602 y Eqca-N*00601)18 puede combinarse con β heterologous2m (Tabla 1). Estas moléculas híbridas se utilizan a menudo en estudios estructurales y funcionales. Sin embargo, la metodología para el estudio funcional y estructural del MHC I híbrido con β heterologousde 2m aún no se resume. Mientras tanto, la base estructural para el intercambiado β2m entre diferentes taxones sigue sin estar clara.
En este documento, se resume el procedimiento para la expresión MHC I, la refolding, la cristalización, la recopilación de datos de cristal y la determinación de la estructura. Además, se analizan posibles sustituciones de β2m de diferentes especies comparando la conformación estructural del MHC I estabilizada por β2m. Estos métodos serán útiles para un mayor estudio estructural del MHC I y la evaluación de la respuesta inmune de células T CD8+ en cáncer y enfermedades infecciosas.
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Protocol
1. Preparación de construcciones de expresión
- Recuperar las secuencias de genes de clase I MHC (incluyendo genes predichos) de murciélagos de la base de datos NCBI.
- Recupere secuencias de cadena pesada MHC I de mamíferos superiores de la base de datos de inmuno polimorfismo (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) y la base de datos UniProt (www.uniprot.org).
- Para obtener complejos de MHC solubles, mutar las secuencias para eliminar las regiones citosólicas y transmembranas.
- Clonar los genes que codifican los ectodominios del murciélago Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (residuos 1–277) y bate β2m (GenBank no. XP_006920478.1) (residuos 1–98) en vectores pET-28a (Novagen, Beijing, China), respectivamente.
- Se insertaron las secuencias optimizadas (para Escherichia coli)entre los sitios NcoI y EcoR1 de un vector pET-28a modificado.
- Construir plásmidos de expresión humanos β2m como se describió anteriormente20.
2. Síntesis de péptidos
- Predicción de péptidos
- Como se describió anteriormente10, para detectar péptidos que pueden unirse a Ptal-N*01:01, predecir péptidos candidatos utilizando los cuerpos proteicos de virus relacionados con murciélagos virus hendra (HeV). Para obtener péptidos de alta afinidad basados en el modelo estructural del servidor en línea, NetMHCpan 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 y Rosetta FlexPepDock22 predijeron el enlace potencial en la fracción peptídica seleccionada. Además, también se pueden utilizar otros programas informáticos y bases de datos como BIMAS, la Base de Datos de Epitopos Inmunes (IEDB), NetCTL 1.2 y SYFPEITHI, todos ellos integrando la predicción de afinidad de unión peptido-MHC clase I, transportador asociado con la eficiencia de transporte de procesamiento de antígenos (TAP), escote proteasomal C-terminal y medio tiempo de disociación de moléculas de péptido-HLA clase I en sus lecturas.
- Para predecir péptidos de enlace alto, utilice el servidor NetMHCpan y Rosetta FlexPepDock.
NOTA: Desafortunadamente, ninguna de las predicciones producidas coincidía con los datos experimentales. Esto puede indicar que las predicciones actuales de péptidos de unión mhc no eran adecuadas para mamíferos no humanos y no ratones como murciélagos, que pueden tener una forma diferente de unión de péptidos. Por lo tanto, necesitamos combinar varios software de predicción y resultados experimentales para un análisis exhaustivo para obtener péptidos de alta afinidad.
- Preparación y conservación de péptidos
- En lugar de generar péptidos personalizados, utilice proveedores de servicios especializados. Compre todos los péptidos siguiendo comercialmente las herramientas de predicción de péptidos, que tienen una puntuación de enlace más alta. La pureza del péptido se determinó que era >95% por HPLC y espectrometría de masas.
- Almacene todos los péptidos comprados como polvo liofilizado a −80 °C y disuelva en sulfóxido de dimetil (DMSO) antes de su uso.
3. Purificación de órganos de inclusión
- Transformación de E. coli
- Transformar 10 ng de plásmido que contiene el murciélago MHC I Ptal-N*01:01 H cadena, o humano β2m o murciélago β2m en 100 μL de BL21(DE3) E. coli. Bañarse en hielo durante 30 minutos.
- Choque de calor a 42 °C durante 90 s, seguido de bañarse en hielo durante 2 minutos.
- Añadir 800 μL de caldo lysogeny (LB: extracto de levadura, triptona y NaCl; ver la Tabla de Materiales)a paso 3.1.2 y agitar a 200 rotaciones por minuto (rpm) en una plataforma de balanceo a 37 °C durante 20 minutos.
- Aplicar 100 μL de suspensión bacteriana en la placa que contenga la resistencia a los antibióticos correspondiente (ampicilina: 100 ng/ml), que son las mismas que las construcciones anteriores.
- Inocular culturas
- Elija un solo clon bacteriano recientemente transformado en 3 ml de LB con medio antibiótico (ampicilina: 100 ng/ml) y cultivo a 37 °C, mientras tiembla a 200 rpm en una plataforma de balanceo para activar la bacteria. Las culturas se pueden inocular a altas horas de la noche, para estar listas para la inducción a la mañana siguiente.
- Con una noche de antelación, transfiera 500 μL del caldo bacteriano activado a 50 ml de LB con el medio antibiótico (ampicilina: 100 ng/ml) e incuba durante la noche a 37 °C, temblando a 200 rpm. Para mayor comodidad al preparar la siguiente inoculación, congele el caldo bacteriano activado restante en 1 mL de alícuotas (500 μL de cultivo con 500 μL de 40% de glicerol) a −80 °C hasta que se necesite la siguiente preparación.
- Para generar grandes cantidades de proteína recombinante, transfiera la preparación bacteriana a 2 L de LB con el medio antibiótico (ampicilina: 100 ng/ml) a una proporción de 1:100, incubar a 37 °C mientras tiembla a 200 rpm. Cultivo hasta que se logra una absorbancia de 0,6 a 600 nm. Añadir 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (variar la concentración de IPTG para diferentes MHCs, principalmente entre 0,1 mM-1 mM) al matraz para la inducción de la expresión proteica.
- Bacterias de la cosecha
- Transfiera la bacteria a botellas de centrífuga y centrífuga a 5000 x g durante 20 min a 4 °C. Todos los pasos a partir de ahora deben realizarse a 4 °C.
- Resuspend las bacterias en 60 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) y liberar la proteína recombinante expresada por disruptor celular ultrasónico.
NOTA: En general, el programa que establecemos en esta máquina es ultrasónico 6S, intervalo 12S, 300 W, 99 veces).
- Purificación de órganos de inclusión
- Centrífuga la suspensión bacteriana sonicada a 12.000 x g durante 30 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en un volumen adecuado de búfer de lavado (0.5% Tritón-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM TDT). Repita este proceso una vez más.
- Centrífuga a 12.000 x g durante 10-20 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a abrir los cuerpos de inclusión en el búfer de resuspensión (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM TDT). Retire una muestra de 20 μL (cuerpos de inclusión en búfer de resuspensión) para que SDS-PAGE pruebe la pureza de los sólidos de inclusión.
- Centrífuga la preparación restante a 12.000 x g durante 10-20 min. Deseche el sobrenadante. Pesar el pellet que contiene los cuerpos de inclusión y añadir buffer de disolución (6 M Gua-HCl, 10% glicerina, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) a una concentración final de 30 mg/mL. Revuelva lentamente usando un agitador magnético a 4 °C hasta que los cuerpos de inclusión se disuelvan en el búfer de disolución.
- Centrífuga 12.000 x g durante 10-20 min. Deseche los precipitados. Almacene los cuerpos de inclusión a −20 °C o −80 °C.
NOTA: Antes de proceder con la purificación de los cuerpos de inclusión, confirme que la inducción y la expresión de proteína recombinante tuvieron éxito. Ejecutar muestras de cada cultivo (tomada antes y después de la inducción de IPTG) en un gel proteico; 15% SDS-PAGE (goma concentrada SDS-PAGE: H2O, 30% acrilamida, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS y TEMED; Gel de separación SDS-PAGE: H2O, 30% acrilamida, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS y TEMED; ver la Tabla de Materiales ) para el β2m, 10% SDS-PAGE para la cadena H.
4. Reabanamiento del complejo MHC
NOTA: La eficiencia de los cuerpos de inclusión redilados afectará el rendimiento de la proteína obtenida. El plegado compite con la polimerización, por lo que generalmente se acepta que el reenfoque a bajas concentraciones de proteínas es el método más exitoso. En este documento, la concentración de los cuerpos de inclusión es de 30 mg/ml.
- Prepare el búfer de refolding.
- Variar la composición del búfer de refolding dependiendo de la proteína. Por ejemplo, el pH, la fuerza iónica, las condiciones de redox y la presencia de ligandos afectarán a los resultados de refolding. El más común es utilizar tampones basados en Tris o HEPES en un pH neutro con la concentración nacl de 50-500 mM, pero esto también depende de la proteína objetivo. A continuación se siguiente se encuentra la fórmula de búfer de refolding utilizada en este artículo.
- Prepare el búfer plegable con 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA-2Na.
- Enfríe el búfer a 4 °C en un matraz de 250-300 ml, y luego agregue 5 mM de glutatión reducido (GSH) y 0,5 mM de glutatión oxidado (GSSG). Revuelva lentamente usando un agitador magnético a 4 °C durante otros 10-20 minutos antes de agregar los cuerpos de inclusión y péptidos.
- Inyección y dilución de la cadena MHC H y β2m
NOTA: La temperatura a la que se realiza el refolding puede variar, aunque generalmente, para minimizar la agregación, 4 °C es mejor. Utilizamos la dilución para redilar las proteínas.- Utilizando una aguja de una jeringa de 1 ml, inyecte 1 ml de cuerpos de inclusión hβ2m o cuerpos de inclusión bβ2m en dos tampones de refolding (1 litro cada uno), respectivamente. Inyecte cerca de la varilla de agitación que gira vigorosamente para obtener una dilución rápida y eficiente. β2m se vuelve a multiplicar relativamente fácil y se mantiene estable incluso en ausencia de la cadena H.
- Después de la β2m se ha disuelto en solución de reenganquitación, disolver péptidos (5 mg/ml) en DMSO e inyectar rápidamente 200 μL en la solución de reenganquitación. Revuelva lentamente durante 10-20 minutos antes de agregar la cadena H.
- Inyecte la cadena H con el mismo procedimiento descrito anteriormente para β2m. La cadena H es muy inestable; por lo tanto, el orden de inyección es bastante importante. Inyecte 3 ml de sólidos de inclusión de cadena H en dos búferes de refolding diferentes (1 litro cada uno) con hβ2m o bβ2m, respectivamente. La inyección consecutiva de pequeños alícuotas en lugar de la aplicación única de toda la cantidad de proteína aumenta el rendimiento del MHC reabierto. Permitir que la reasignación continúe a 4 °C durante 8-10 h.
- Concentración de proteínas refolded
- Utilice ultrafiltración en una cámara presurizada con membrana MMCO de 10 kDa para la concentración de las proteínas de reenlaza. Este método es conveniente y se puede combinar con el intercambio de búferes. Agregue el búfer de intercambio (Tris-HCl de 20 mM, 50 mM NaCl pH 8.0) a la cámara y concéntrate en un volumen final de 30-50 mL.
- Transfiera la solución de refolding a un tubo centrífuga, gire a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar precipitados.
- Transfiera cuidadosamente el sobrenadante y concéntrate aún más a un volumen final de ~1 mL.
- Centrífuga a 12.000 xg durante 10-20 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo estéril y purifique las proteínas utilizando una columna de exclusión de tamaño de 10/300 GL.
- Recoger las muestras en el pico y analizarlas utilizando SDS–PAGE (15% gel de poliacrilamida).
- Recoger el pico complejo MHC y concentrarse a una concentración final de 15 mg/ml.
- Diluir el complejo a 7,5 mg/ml y 15 mg/ml para cristalización.
5. Cristalización, recopilación de datos y procesamiento
- Realice la cristalización del MHC complejo y péptido utilizando la técnica de difusión de vapor de caída sentado.
- Examine los complejos Ptal-N*01:01/peptide con kits de cristal comerciales (por ejemplo, kit de pantalla de cristal I/II, kit de pantalla de índice, kit PEGIon I/II y el kit PEGRx).
- Selle la solución resultante y el equilibrio contra 100 μL de solución de reservorio a 4 o 18 °C.
- Observe el crecimiento del cristal en la cultura durante 3 días, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 3 meses y 6 meses. Utilice un microscopio para ver si cada gota en la placa de cristal tiene cristales.
NOTA: Se observaron cristales Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) en 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) y 25% (w/v) polietilenglicol 3.350 a una concentración de 7,5 mg/ml. Se observaron cristales Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) en HEPES de 0,1 M, pH 7,0, 2% w/v polietileno glicol 3.350 a una concentración de 7,5 mg/ml. - Para la protección criogénica, transfiera los cristales a una solución de almacenamiento que contenga un 20% de glicerol y luego enfríe rápidamente en una corriente de nitrógeno gaseoso de 100 K.
- Recopile datos de difracción de rayos X de la línea de haz BL19U de la instalación de radiación sincrotrón de Shanghái (Shanghái, China).
6. Determinación y análisis de la estructura
- Con datos estructurales de alta resolución, procese y escale la intensidad de la colección utilizando el programa Denzo y el paquete de software HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
- Después de elegir un mejor modelo inicial en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), determine las estructuras utilizando el reemplazo molecular con el programa Phaser MR en CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). El modelo utilizado fue la estructura coordinada con el código 5F1I del Banco de Datos de Proteínas (PDB).
- Utilice el refinado modelo de rayos X para el refinamiento de juntas inicial. Utilice los modos de refinamiento Phenix solo y articular para la radiografía y el refinamiento de neutrones y rayos X de la articulación, respectivamente.
- Después de cada ronda de refinamiento, compruebe manualmente el modelo contra Fo − Fc y 2Fo - Fc mapas de densidad nuclear positiva en Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Esto facilita la correcta colocación de las aguas y ciertos átomos D. Todas las figuras de estructuras fueron creadas por PyMOL (http://www.pymol.org/).
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Representative Results
Trabajos anteriores informaron que el péptido HeV1 (DFANTFLP) derivado del HeV fue presentado por Ptal-N*01:0110,19. En este documento seevaluó la capacidad de unión de este péptido a Ptal-N*01:01 con murciélago homólogo β2m (bβ2m) y β humanoheterologoso de 2m (hβ2m) (Figura1C,1D). Se formaron cristales con mayor resolución, respectivamente (Figura 1E,1F). Se forma un cristal a partir del complejo Ptal-N*01:01/HeV1, que se formó a través de la renaturalización con bβ2m, y la resolución es de 2,31 Å. Se forma un cristal a partir del complejo Ptal-N*01:01/HeV1, que se formó a través de la reaturación con hβ2m, y la resolución es de 1,6 Å. El complejo Ptal-N*01:01/HeV1 se formó con éxito mediante la reaturación con bβ2m y hβ2m (Figura 1C,1D). En este contexto, demostramos que el complejo Ptal-N*01:01/HeV1 no se formó sin la presencia de β2m (Figura 1A) y el H-2Kd que se pliegan correctamente a través del hβ2m (Figura 1B).
A continuación, se analizaron las estructuras de Ptal-N*01/HeV1/bβ2m y Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m. En la estructura Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, residuos R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 de bβ2m enlazados a los residuos de la cadena H a través de la parte inferior del PBG y residuos Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 vinculados al dominio α3 de la cadena H. Similar al complejo Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, en la estructura Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, residuos conservados H31, D53, W60, Y63 de hβ2m que corresponden a bβ2m, hicieron contacto con la parte inferior del PBG y residuos conservados Q8, Y10, R12, N24 que corresponden a bβ2m enlazados a dominio α3 (Figura 2A,2B).
En las estructuras generales Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m y Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, la desviación media-cuadrada de raíz promedio (RMSD) de los residuos 1–184 de las cadenas H (formando el α1α2 PBG) fue de 0,248 bajo toda la superposición de átomosC α (Figura 3A). Esta constatación indicaba que no había diferencia entre estos dos complejos. A continuación, se compararon las conformaciones de los péptidos similares en los complejos con diferentes β2m. La estructura de la alineación del péptido mostró que las conformaciones de péptidos HeV1 en estos dos complejos eran bastante similares(Figura 3B). Además, se alinearon las estructuras de gp33(KAVYNFATM) presentadas por H-2Db y complejas con ratón β2m (mβ2m) o hβ2m. El RMSD del α1α2 PBG de H-2Db fue de 0,283 y las conformaciones generales de péptidos en estas dos estructuras también fueron similares (Figura 3C,3D). Estos datos indican que el β sustitución de2m entre bβ2m y hβ2m, y mβ2m y hβ2m no afectan a las conformaciones de péptidos presentados.
La alineación de secuencias mostró que los aminoácidos de β2m de diferentes especies están altamente conservados(Figura 4). Tras el análisis de la β2m de diferentes especies se demostró que la mayoría de los aminoácidos de β2m que estaban formando los enlaces de hidrógeno con la cadena H de MHC I fueron conservados(Figura 4, Tabla 2). Mientras tanto, los diversos residuos también eran aminoácidos con propiedades químicas similares en mamíferos. Sin embargo, los residuos clave involucrados en β unión de2m a la cadena H de MHC I mostraron polimorfismos en pollos, peces y anfibios(Figura 4).
Tabla 1: Los diversos mamíferos se combinan con β heterologosasde 2m. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Interacciones de unión al hidrógeno entre β heterologosasde 2m y cadena pesada en MHC I de varias especies. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Figura 1: Purificación del Ptal-N*01:01/HeV1 soluble y reenfocado proteínas complejas y fotografías del cristal utilizado para el análisis de difracción. La M son marcadores de peso molecular en kDa. El P1 son los agregados. El P2 es el complejo MHC. El P3 es el complejo β2m. (A) Ptal-N*01:01/HeV1 no se formó sin la presencia de β complejo de2m. (B) H-2Kd se formó a través de la reaturación con hβ2m. (C) Ptal-N *01:01/HeV1 complejo se formó a través de la reaturación con bβ2m. El perfil está marcado con las posiciones aproximadas de los estándares de masa molecular de 75.0, 44.0 y 13.7 kDa. (D) Ptal-N*01:01/ HeV1 complejo se formó a través de la reaturación con hβ2m. (E) El cristal se forma a partir del complejo Ptal-N*01:01/HeV1, que se formó a través de la reaturación con bβ2m. La flecha negra representa el cristal utilizado para recopilar datos durante la difracción de rayos X. (F) El cristal se forma a partir del complejo Ptal-N*01:01/HeV1 que se formó a través de la reaturación con hβ2m. La flecha negra representa el cristal utilizado para recopilar datos durante la difracción de rayos X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Unión de hidrógeno entre β2m y cadena pesada en complejos híbridos MHC I. Unión de hidrógeno entre β cadenade 2m y H enloscomplejos Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 y (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC. Las interacciones de los enlaces de hidrógeno están representadas por una línea de puntos negro. El cuadrado representa el área ampliada y mostrada a la derecha en los cuadros de color correspondientes. El rojo representa que los βhomóneos de 2m y los heterologosos β2m utilizan los mismos aminoácidos para formar enlaces de hidrógeno con la cadena H. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Conformación similar del complejo MHC y los péptidos antigénicos en complejos híbridos MHC I. (A) La superposición de dominios α1α2 de Ptal-N*01:01/bβ2m (verde) y Ptal-N*01:01/hβ2m (gris). (B) La superposición del péptido HeV1 con la superposición de dominio α1α2 de cada molécula Ptal-N*01:01. El péptido HeV1 está representado como rosa en Ptal-N*01:01/bβ2m y como amarillo en Ptal-N*01:01/hβ2m. (C) La superposición de dominios α1α2 de H-2Db /mouse β2m (mβ2m) (verde) y H-2Db /hβ2m (gris). (D) La superposición de péptido gp33 con la superposición de dominio α1α2 de cada molécula H-2Db. Péptido gp33 se representa como azul en H-2Db /mβ2m y como rosa en H-2Db /hβ2m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Alineación de secuencia basada en estructura de hβ2m con β2m de otras especies. Las flechas negras denotan β hebras. Los residuos resaltados en rojo se conservan por completo, y los residuos en cajas azules son altamente (>80%) Conservado. Los triángulos amarillos representan los aminoácidos clave para la interacción entre las cadenas β2m y H. La alineación de secuencia se generó utilizando Clustal X32 y ESPript33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La construcción de un complejo proteico híbrido a través de la sustitución heterologosa de diferentes taxones es una estrategia común para las investigaciones funcionales y estructurales cuando el complejo homólogo no está disponible, como en el MHC I y sus ligandos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología. En este documento, se analizó la estructura del murciélago MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizado por bβ2m o hβ2m. Los aminoácidos clave de β unión de2m a Ptal-N*01:01 se encontraron conservados entre murciélagos y humanos. Tras un análisis posterior, se encontró que los residuos clave involucrados en β unión de2m a la cadena H de MHC I se conservaban en mamíferos pero polimorfos en pollos, peces y anfibios. Estos datos indican que la sustitución heterologosa βde 2m es un medio factible para estudiar el MHC I de mamíferos. Sin embargo, la sustitución entre mamíferos y aves, peces o anfibios puede no ser factible.
Los estudios estructurales desempeñan un papel fundamental en la comprensión de los mecanismos moleculares de la presentación de péptidos por moléculas MHC I. La sustitución heterologosa βde 2m se utiliza comúnmente en los estudios estructurales MHC I14,16,17,18,26,27,28. Trabajos anteriores han demostrado que en MHC I bovino, N*01801, murine β2m y bovino β2m se comportaron de manera similar durante la unión a los dominios α1α2 de la cadena N*01801 H17. En este documento, se analizó la estructura de un solo péptido presentado por la misma cadena H de MHC I pero diferente β2m. Estos datos muestran que las conformaciones de péptido son similares cuando se estabilizan por β2m, lo que indica que la sustitución heterologosa βde 2m no afecta a la presentación de péptidos.
Péptidos de antígeno presentados por MHC I son reconocidos por TCR para mediar activación de células T29. Durante la infección viral, la evaluación de las respuestas inmunes específicas de las células T específicas del antígeno mejorará en gran medida la comprensión de las infecciones virales y las respuestas inmunes del huésped. El tetramer peptítido-MHC es una técnica importante para evaluar las respuestas de las células T; es una técnica para tetramerizar la molécula monómer MHC, mejorar su afinidad y combinarla con múltiples TCRS en células T. Los tetramémeros son ampliamente utilizados en la investigación y el diagnóstico clínico14,29,30. Recientemente, las células T diseñadas por TCR (TCR-T) se han convertido en un tema candente en la inmunoterapia tumoral por su eficacia potencial en el tratamiento de tumores malignos31. La tinción de tetramer MHC I es un método crucial para la detección de la unión específica al TCR a péptidos de antígeno relacionados con el cáncer presentados por moléculas MHC I29. Por lo tanto, la preparación del tetramer MHC I desempeña un papel vital en la detección de TCR. Además de la unión de la cadena MHC I H, β2m también se une a CD8 en la superficie de la célula T, lo que puede conducir a manchas no específicas durante la detección de TCR por tinción de tetramer MHC I. La sustitución heterologosa βde 2m puede disminuir esta unión no específica del tetramer MHC I.
Sin embargo, hay algunas limitaciones al protocolo. En primer lugar, aunque E. coli sigue siendo el huésped de la expresión dominante para las proteínas recombinantes, muchas modificaciones post-traslacionales no se pueden realizar y los productos proteicos expresados forman cuerpos de inclusión insolubles. Luego, debido a la sustitución similar de algunos β no mamíferosde 2m con mamíferos β2m, no se sabe si los no mamíferos β2m pueden ser reemplazados por heterologous β2m para ayudar y estabilizar su estructura MHC. En el protocolo, hemos incluido una descripción de nuestros análisis probados utilizando el servidor NetMHCpan y Rosetta FlexPepDock. Desafortunadamente, ninguna de las predicciones producidas coincidía con los datos experimentales. Esto puede indicar que las predicciones actuales de péptidos de unión mhc no eran adecuadas para mamíferos no humanos y no ratones como murciélagos, que pueden tener una forma diferente de unión de péptidos. Por lo tanto, necesitamos combinar varios software de predicción y resultados experimentales para un análisis exhaustivo para obtener péptidos de alta afinidad.
En el protocolo descrito aquí, el paso clave es que el MHC se puede renaturalizar correctamente. Es muy importante obtener un complejo MHC con alta eficiencia de refolding. Por lo tanto, es crucial prestar atención a seleccionar péptidos adecuados y aumentar la pureza de los organismos de inclusión.
En conclusión, en este documento se resume un protocolo para la expresión MHC I, refolding, cristalización, recolección de datos de cristal y determinación de estructura. Además, se analizó la viabilidad de la sustitución heterologosa βde 2m en el estudio MHC I. Este estudio proporciona una referencia sólida para entender el MHC I en estudios estructurales y funcionales. Además, estos datos también son significativos para la evaluación de las respuestas de las células T durante enfermedades infecciosas e inmunoterapia tumoral.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que declarar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el fondo abierto del laboratorio clave estatal de Biotecnología Farmacéutica, Universidad Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 81971501). William J. Liu cuenta con el apoyo del Programa de Jóvenes Científicos Excelentes de la NSFC (81822040) y beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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