Summary
Protokol, farklı türlerden potansiyel β 2 mikroglobulin (β 2m)ikameyoluyla stabil majör histocompatibility complex (MHC) sınıfı I elde etmek için deneysel yöntemleri açıklar. MHC I'in homolog ve heterolog β2m ile stabilize edilen yapısal karşılaştırması araştırılmıştır.
Abstract
Başlıca histocompatibility complex (MHC), bulaşıcı hastalık ve tümör gelişimine karşı antijen peptit sunumunda ve T hücre immün yanıtlarında önemli bir rol oynar. Farklı türlerden heterolog β2mikroglobulin (β 2 m)ikameile karmaşık olan hibrit MHC in vitro stabilize edilebilir. Bu, 2 m'lik homolog β mevcut olmadığında, memelilerin MHCI'iniincelemek için mümkün bir araçtır. Bu arada,2m ikamesi β memelinin peptit sunumunun önemli ölçüde etkilenmediği belirtilmiştir. Bununla birlikte, heterolog β2mikroglobulin (β2m) ile karmaşık hale gelen hibrit MHC'nin metodolojisi ve teknolojisi ile ilgili sınırlı özetleme vardır. Burada MHC I çalışmasında heterolog β2m ikame fizibilitesini değerlendirme yöntemleri sunulmuştur. Bu yöntemler, ifade yapılarının hazırlanmasıni içerir; dahil etme organlarının saflaştırılması ve MHC kompleksinin yeniden katlandırılması; protein termosabilme kabiliyetinin belirlenmesi; kristal tarama ve yapı tespiti. Bu çalışma MHC I'in işlevini ve yapısını anlamak için bir öneri sağlar ve ayrıca enfeksiyöz hastalık ve tümör immünoterapisi sırasında T hücre yanıtı değerlendirmesi için de önemlidir.
Introduction
Başlıca histocompatibility complex (MHC) tüm omurgalılarda bulunur ve enfeksiyöz patojenlere karşı hücre aracılı bağışıklığı belirleyen bir gen kümesidir. MHC sınıfı I, hücresel bağışıklığa aracılık etmek ve bağışıklık düzenlemesine katılmak için CD8+ T hücrelerinin yüzeyindeki T hücre reseptörlerine (TCR) virüs enfeksiyonu üzerine üretilen viral bileşenler gibi endojen peptitler sunar1. Peptitlere bağlı MHC I'in yapısal bir çalışması, CD8+ T hücre immün yanıtlarının değerlendirilmesinde ve aşı geliştirilmesinde hayati roller oynayan MHC I moleküllerinin peptit bağlama motifleri ve sunum özellikleri hakkında bilgi sağlar.
MHC I molekülerinin Bjorkman ve ark.2tarafından ilk kristalizasyonu ve yapısal belirlenmesinden bu yana, MHC I moleküllerinin kristal yapı analizi, peptitlerin MHC I moleküllerine nasıl bağlandığı anlayışını büyük ölçüde teşvik etti ve ışık zincirlerinin ağır zincirler ve peptitlerle etkileşimini anlamaya yardımcı oldu. Bir dizi takip çalışması, ışık zincirini kodlayan genlerin MHC ile ilişkili olmamasına rağmen, ışık zincirinin MHC I moleküllerinin montajı için önemli bir protein olduğunu belirtti3,4. Birden fazla yüzeyde MHC sınıf I moleküllerinin üç alanıyla etkileşime girer. Işık zinciri olmadığında, MHC sınıfı I molekülleri antijen sunan hücrelerin yüzeyinde doğru bir şekilde ifade edilemez ve immünolojik işlevlerini uygulamak için TCR ile etkileşime giremez.
MHC I, ağır bir zincir (H zinciri) ve ışık zincirinden (yani,β 2mikroglobulinden (β2m)) oluşur ve uygun bir peptit5'ebağlanarak monte edilir. H zincirinin hücre dışı segmenti α1, α2 ve α3 etki alanlarından oluşur6. α1 ve α2 etki alanları peptit bağlama oluğunu (PBG) oluşturur. β2m zincir, MHC I'deki montaj kompleksinin yapısal bir alt birliği olarak hareket eder ve kompleksin konformasyonunu stabilize eder ve MHC I H zinciri için7, 8,9katlanan moleküler bir refakatçidir. Bir dizi çalışma, MHC I H zincirlerinin yarasa (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10, rhesus makak (Primatlar) gibi çeşitli memelilerden olduğunu göstermiştir. (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, fare (Rodentia) (H-2Kd)14,15, köpek (Etobur) (DLA-88 * 50801)16, sığır (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 ve at (Peris)sodactyla) (Eqca-N*00602 ve Eqca-N*00601)18 heterologöz β2m (Tablo 1) ile birleştirebilir. Bu melez moleküller genellikle yapısal ve fonksiyonel çalışmalarda kullanılır. Bununla birlikte, hibrid MHC I'in heterolog β2m ile fonksiyonel ve yapısal çalışması için metodoloji henüz özetlenmiş değildir. Bu arada, farklı taksonlar arasındaki2m β değişim için yapısal temel belirsizliğini koruyor.
Burada MHC I ekspresyonu, yeniden katlama, kristalizasyon, kristal veri toplama ve yapı belirleme prosedürü özetlenmiştir. Ek olarak, farklı türlerden β2 m'likpotansiyel ikameleri, homolog ve heterolog β2m ile stabilize edilen MHC'nin yapısal uyumu karşılaştırılarak analiz edilir. Bu yöntemler kanser ve bulaşıcı hastalıkta daha fazla MHC I yapısal çalışması ve CD8+ T hücre immün yanıt değerlendirmesi için yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İfade yapılarının hazırlanması
- MHC sınıfı I genlerinin dizilerini (tahmin edilen genler dahil) NCBI veritabanından yarasalardan alın.
- İmmüno Polimorfizm Veritabanı (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) ve UniProt veritabanından (www.uniprot.org) daha yüksek memeli MHC I ağır zincir dizileri alın.
- Çözünür MHC kompleksleri elde etmek için, sitozolizik ve transmembran bölgelerini çıkarmak için dizileri mutasyona uğratın.
- Ptal-N*01:01 yarasasının ectodomainlerini kodlayan genleri klonla (GenBank no. KT98792919) (kalıntılar 1–277) ve yarasa β2m (GenBank no. XP_006920478.1) (kalıntılar 1–98) pET-28a vektörlerine (Novagen, Pekin, Çin), sırasıyla.
- Modifiye edilmiş bir pET-28a vektörün NcoI ve EcoR1 siteleri arasına optimize edilmiş (Escherichia coliiçin) diziler eklendi.
- Daha önce açıklandığı gibi insan β2m ifade plazmidleri inşa edin20.
2. Peptit sentezi
- Peptit tahmini
- Daha önce açıklandığı gibi10, Ptal-N* 01:01'e bağlanabilecek peptitleri taramak için, yarasa ile ilişkili virüsler hendra virüsünün (HeV) protein gövdelerini kullanarak aday peptitleri tahmin edin. Çevrimiçi sunucudan yapısal modele dayalı yüksek benzeşimli peptitler elde etmek için, NetMHCpan 4.0 sunucusu (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 ve Rosetta FlexPepDock22 seçilen peptit fraksiyonunda potansiyel bağlamayı öngördü. Buna ek olarak, BIMAS dahil olmak üzere diğer yazılım ve veritabanları, Immune Epitope Veritabanı (IEDB), NetCTL 1.2 ve SYFPEITHI de kullanılabilir, bunların hepsi peptit-MHC sınıfı I bağlayıcı benzeşimin tahminini, antijen işleme (TAP) taşıma verimliliği ile ilişkili taşıyıcıyı, proteazomal C-terminal bölünmesini ve peptit-HLA sınıfı I moleküllerinin okumalarında yarım kez ayrışma süresini bütünleştirir.
- Yüksek bağlayıcı peptitleri tahmin etmek için hem NetMHCpan hem de Rosetta FlexPepDock sunucusunu kullanın.
NOT: Ne yazık ki, üretilen tahminler deneysel verilerle eşleşmedi. Bu, mevcut MHC bağlayıcı peptit tahminlerinin, farklı bir peptit bağlama şekline sahip olabilecek yarasalar gibi insan olmayan ve fare olmayan memeliler için uygun olmadığını gösterebilir. Bu nedenle, yüksek benzeşimli peptitler elde etmek için kapsamlı analiz için çeşitli tahmin yazılımlarını ve deneysel sonuçları birleştirmemiz gerekir.
- Peptitlerin hazırlanması ve korunması
- Özel peptitler oluşturmak yerine, özel hizmet sağlayıcılar kullanın. Daha yüksek bağlayıcı puana sahip peptit tahmin araçlarını izleyerek ticari olarak tüm peptitleri satın alın. Peptit saflığı HPLC ve kütle spektrometresi ile %95 olarak belirlendi.
- Satın alınan tüm peptitleri −80 °C'de dondurularak kurutulmuş toz olarak saklayın ve kullanmadan önce dimetil süloksit (DMSO) içinde çözün.
3. İçerme organlarının saflaştırılması
- E. coli dönüşümü
- Yarasa MHC I Ptal-N * 01:01 H zinciri içeren 10 ng plazmid veya2m'β insan β veya yarasayı100μL BL21 (DE3) E. coli'yedönüştürün. 30 dakika buzda yıkan.
- 90 s için 42 °C'de ısı şoku, ardından 2 dakika buzda yıkanma.
- 3.1.2 adımına 800 μL lysojeny suyu ekleyin (LB: maya özü, tripon ve NaCl; Malzeme Tablosunabakın) ve 20 dakika boyunca 37 °C'de sallanan bir platformda dakikada 200 dönüşte (rpm) sallayın.
- Önceki yapılarla aynı olan ilgili antibiyotik direncini (ampisilin: 100 ng/mL) içeren plakaya 100 μL bakteri süspansiyonu uygulayın.
- Aşı kültürleri
- Yakın zamanda dönüştürülmüş tek bir bakteri klonunu antibiyotik ortamı (ampisilin: 100 ng/mL) ile 3 mL LB'ye ve 37 °C'de kültüre çevirirken, bakterileri aktive etmek için sallanan bir platformda 200 rpm'de titreyin. Kültürler, ertesi sabah indüksiyona hazır olmak için gece geç saatlerde aşılanabilir.
- Bir gece önceden, aktif bakteri stoğunun 500 μL'lik kısmını antibiyotik ortamı (ampisilin: 100 ng/mL) ile 50 mL LB'ye aktarın ve 200 rpm'de titreyerek 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Bir sonraki aşıyı hazırlarken kolaylık sağlamak için, kalan aktif bakteri stoğunu bir sonraki hazırlık gerekinceye kadar −80 °C'de 1 mL aliquots (500 μL%40 gliserol ile 500 μL kültür) içinde dondurun.
- Büyük miktarlarda rekombinant protein üretmek için bakteriyel preparatı antibiyotik ortamı (ampisilin: 100 ng/mL) ile 2 L LB'ye 1:100 oranında aktarın, 200 rpm'de titrerken 37 °C'de kuluçkaya yatırın. 600 nm'de 0.6 absorbansına kadar kültür elde edilir. Protein ekspresyonunun indüksiyonu için şişeye 1 mM izopropil-1-tiyo-β-D-galaktopyranoside (IPTG) (farklı MHC'ler için IPTG konsantrasyonunu, çoğunlukla 0,1 mM-1 mM arasında değişir) ekleyin.
- Hasat bakterileri
- Bakterileri 4 °C'de 20 dakika boyunca 5000 x g'da santrifüj şişelerine ve santrifüje aktarın. Bundan sonra tüm adımlar 4 °C'de yapılmalıdır.
- Bakterileri 60 mL fosfat tampon salininde (PBS) yeniden canlandırın ve ifade edilen rekombinant proteini ultrasonik hücre bozucu ile serbest kalındırın.
NOT: Genel olarak, bu makinede belirlediğimiz program ultrasonik 6S, aralık 12S, 300 W, 99 kez).
- İçerme organlarının saflaştırılması
- Sonicated bakteri süspansiyonu 30 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peleti uygun bir yıkama tamponu hacminde yeniden biriktirin (%0,5 Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.
- 10-20 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj. Süpernatantı atın ve inklüzyon gövdelerini resüspensyon tamponunda (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT) yeniden biriktirin. dahil etme gövdelerinin saflığını test etmek için SDS-PAGE için 20 μL'lik bir numuneyi (resüspenzyon tamponundaki inklüzyon gövdeleri) çıkarın.
- Kalan hazırlığı 10-20 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin. Üstnatant atın. İçerme gövdelerini içeren peleni tartın ve 30 mg/mL'lik son konsantrasyona çözünme tamponu (6 M Gua-HCl, %10 gliserin, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) ekleyin. İçerme gövdeleri çözünme tamponunda çözünene kadar 4 °C'de manyetik bir karıştırıcı kullanarak yavaşça karıştırın.
- Santrifüj 10-20 dk için 12.000 x g. Çökeltmeyi atın. İçerme gövdelerini −20 °C veya −80 °C'de saklayın.
NOT: İnklüzyon cisimlerinin saflaştırılmasına devam etmeden önce, rekombinant proteinin indüksiyonunun ve ekspresyonunun başarılı olduğunu onaylayın. Her kültürden (IPTG indüksiyonundan önce ve sonra alınan) örnekleri bir protein jeli üzerinde çalıştırın; %15 SDS-PAGE (SDS-PAGE konsantre sakız: H2O, %30 akrilamid, 1 M Tris-HCl pH 6.8, %10 SDS, %10 APS ve TEMED; SDS-PAGE ayırma jeli: H2O, %30 akrilamid, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, %10 SDS, %10 APS ve TEMED; Bkz. Malzeme Tablosu ) β için2m, H zinciri için% 10 SDS-PAGE.
4. MHC kompleksinin yeniden katası
NOT: Yeniden katlanan inklüzyon cisimlerinin verimliliği, elde edilen proteinin verimini etkileyecektir. Katlama polimerizasyon ile rekabet eder, bu nedenle genellikle düşük protein konsantrasyonlarında yeniden katlamanın en başarılı yöntem olduğu kabul edilir. Bu makalede, inklüzyon organları konsantrasyonu 30 mg / mL'dir.
- Yeniden katlama arabelleği hazırlayın.
- Proteine bağlı olarak yeniden katlama tamponunun bileşimini değiştirin. Örneğin, pH, iyonik mukavemet, redoks koşulları ve ligandların varlığı yeniden katlama sonuçlarını etkileyecektir. En yaygın olanı, 50-500 mM'lik NaCl konsantrasyonuna sahip nötr bir pH'da Tris veya HEPES tabanlı tamponlar kullanmaktır, ancak bu aynı zamanda hedef proteine de bağlıdır. Bu makalede kullanılan yeniden katlama arabelleği formülü aşağıdadır.
- Katlanır tamponu 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-2Na ile hazırlayın.
- Tamponu 250-300 mL'lik bir şişede 4 °C'ye soğutun ve ardından 5 mM azaltılmış glutatyon (GSH) ve 0,5 mM oksitlenmiş glutatyon (GSSG) ekleyin. İçerme gövdelerini ve peptitleri eklemeden önce 4 °C'de manyetik bir karıştırıcı kullanarak 10-20 dakika daha yavaşça karıştırın.
- MHC H zincirinin enjeksiyonu ve seyreltilmesi veβ 2m
NOT: Yeniden katlamanın yapıldığı sıcaklık değişebilir, ancak genellikle toplamayı en aza indirmek için 4 °C en iyisidir. Proteinleri yeniden katlamak için seyreltme kullanıyoruz.- 1 mL şırıngadan bir iğne kullanarak, sırasıyla iki yeniden katlama tamponuna (her biri 1 litre)1mL hβ 2 m inklüzyon cisimleri veya bβ2m inklüzyon cisimleri enjekte edin. Hızlı ve verimli seyreltme elde etmek için kuvvetlice dönen karıştırma çubuğunun yanına enjekte edin. β2m nispeten kolay yeniden katlar ve H zincirinin yokluğunda bile sabit kalır.
- β2m yeniden katlama çözeltisinde çözüldükten sonra, DMSO'daki peptitleri (5 mg / mL) çözün ve yeniden katlama çözeltisine hızlı bir şekilde 200 μL enjekte edin. H zincirini eklemeden önce 10-20 dakika yavaşça karıştırın.
- H zincirini β2m boyunca yukarıda açıklanan prosedürle enjekte edin. H zinciri çok dengesizdir; bu nedenle, enjeksiyon sırası oldukça önemlidir. Sırasıyla hβ 2 m veya bβ 2 m ile iki farklı yeniden katlama tamponuna (her biri 1 litre)3mL H zincir inklüzyoncisimlerienjekte edin. Tüm protein miktarının tek uygulaması yerine küçük aliquotların ardışık enjeksiyonu, yeniden katlanmış MHC'nin verimini arttırır. Yeniden katlamanın 8-10 saat boyunca 4 °C'de devam etmesine izin verin.
- Yeniden katlanmış protein konsantrasyonu
- Yeniden katlama proteinlerinin konsantrasyonu için 10 kDa MMCO membranlı basınçlı bir odada ultrafiltrasyon kullanın. Bu yöntem uygundur ve arabellek değişimi ile birleştirilebilir. Odaya değişim tamponu (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) ekleyin ve 30-50 mL'lik son hacme konsantre edin.
- Yeniden katlama çözeltisini bir santrifüj tüpüne aktarın, çökeltmeleri gidermek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün.
- Süpernatant'ı dikkatlice aktarın ve ~1 mL'lik son hacme daha fazla konsantre olun.
- 10-20 dakika boyunca 12.000 xg'da santrifüj. Süpernatantı steril bir tüpe aktarın ve proteinleri 10/300 GL boyut dışlama sütunu kullanarak arındırın.
- Örnekleri zirvede toplayın ve SDS-PAGE (%15 poliakrilamid jel) kullanarak analiz edin.
- MHC karmaşık tepe noktasını toplayın ve 15 mg/ mL'lik son konsantrasyona konsantre olun.
- Kristalizasyon için kompleksi 7,5 mg/mL ve 15 mg/mL'ye seyreltin.
5. Kristalizasyon, veri toplama ve işleme
- Oturma damlası buharı difüzyon tekniğini kullanarak karmaşık MHC ve peptidin kristalizasyonunu gerçekleştirin.
- Ptal-N*01:01/peptit komplekslerini ticari kristal kitlerle (örneğin, Kristal Ekran kiti I/II, Dizin Ekran kiti, PEGIon kiti I/II ve PEGRx kiti) tarayın.
- Elde edilen çözeltiyi kapatın ve 4 veya 18 °C'de 100 μL rezervuar çözeltisine karşı dengeleyin.
- Kültürdeki kristal büyümesini 3 gün, 1 hafta, 2 hafta, 1 ay, 3 ay ve 6 ay boyunca gözlemleyin. Kristal plakadaki her damlanın kristalleri olup olmadığını görmek için bir mikroskop kullanın.
NOT: Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) kristaller 0.2 M NaCl, 0.1 M Bis-Tris (pH 5.5) ve %25 (w/v) polietilen glikol 3.350 mg/mL konsantrasyonda gözlendi. Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) kristaller 0.1 M HEPES, pH 7.0, %2 w/v polietilen glikol 3.350'de 7.5 mg/mL konsantrasyonda gözlendi. - Kriyojenik koruma için kristalleri% 20 gliserol içeren bir depolama çözeltisine aktarın ve ardından 100 K gazlı azot akışında hızla soğutun.
- Şanghay senkrotron radyasyon tesisinin (Şanghay, Çin) bl19U ışın hattından X-ışını kırınım verilerini toplayın.
6. Yapı belirleme ve analizleri
- Yüksek çözünürlüklü yapısal verilerle, Denzo programını ve HKL2000 yazılım paketini (https://hkl-xray.com/) kullanarak koleksiyonun gücünü işleyin ve ölçeklendirin 23.
- Protein Veri Bankası'nda (PDB) daha iyi bir başlangıç modeli seçtikten sonra, CCP424'te Phaser MR programı ile moleküler değiştirme kullanarak yapıları belirleyin (http://www.ccp4.ac.uk/). Kullanılan model Protein Data Bank (PDB) kod 5F1I ile yapı koordinatlarıydı.
- İlk eklem iyileştirmesi için rafine X-ray modelini kullanın. Phenix rafine tek başına ve ortak modları tek başına X-ışını ve eklem nötron ve X-ışını arıtma için kullanın.
- Her arıtma turundan sonra, modeli Coot 25'teki (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/) Fo − Fc ve2Fo − Fc pozitif nükleer yoğunluk haritaları ile manuel olarak kontrol edin. Bu, suların ve belirli D atomlarının uygun şekilde yerleştirilmesini kolaylaştırır. Yapıların tüm figürleri PyMOL (http://www.pymol.org/) tarafından oluşturulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki çalışma, HeV türevi HeV1 (DFANTFLP) peptidinin Ptal-N * 01:0110 , 19tarafından sunulduğunubildirmiştir. Burada bu peptidin 2m (bβ2 m) homolog yarasa β Ptal-N*01:01'e veheterolog insan β2m (hβ2m) (Şekil1C,1D)ile bağlanma kapasitesi değerlendirildi. Sırasıyla daha yüksek çözünürlüğe sahip kristaller oluşturulmuştur (Şekil 1E,1F). Bβ2m ile yeniden doyma yoluyla oluşturulan Ptal-N*01:01/HeV1 kompleksinden bir kristal oluşur ve çözünürlük 2.31 Å'dır. Hβ2m ile yeniden doyma yoluyla oluşturulan Ptal-N*01:01/HeV1 kompleksinden bir kristal oluşur ve çözünürlük 1,6 Å'dır. Ptal-N*01:01/HeV1 kompleksi hem bβ 2 m hem de hβ2m (Şekil 1C,1D)ile yeniden doyma yoluyla başarıyla oluşturulmuştur. Bu bağlamda Ptal-N*01:01/HeV1 kompleksinin β2m ( Şekil 1A ) ve hβ 2 m(Şekil 1B)boyunca doğru katlananH-2Kd olmadan oluşmadığını gösterdik.
Daha sonra Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m ve Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m yapıları analiz edildi. Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m yapısında, Bβ2m'nin R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 kalıntıları PBG'nin dibinden H zinciri kalıntılarına bağlanır ve Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 kalıntıları H zincirinin α3 etki alanına bağlanır. Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m kompleksine benzer şekilde, Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m yapısında, bβ2m'ye karşılık gelen H31, D53, W60, Y63 hβ2m'nin korunmuş kalıntıları, PBG'nin tabanıyla temas etti ve α3 etki alanına bağlı bβ 2 m'ye karşılık gelen Q8, Y10,R12,N24 kalıntılarını muhafaza etti (Şekil 2A,2B).
Genel yapılarda Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m ve Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, H zincirlerinin 1–184'lü kalıntılarının ortalama kök-ortalama kare sapması (RMSD) (α1α2 PBG'yi oluşturan) tüm Cα atomları süperpozisyasyonu altında 0.248 idi (Şekil 3A). Bu bulgu, bu iki kompleks arasında bir fark olmadığını gösteriyordu. Daha sonra farklı β2m ile komplekslerdeki benzer peptitlerin konformasyonları karşılaştırıldı. Peptit hizalamasının yapısı, bu iki kompleksteki HeV1 peptitlerinin konformasyonlarının oldukça benzer olduğunu göstermiştir (Şekil 3B). Ayrıca H-2Db tarafından sunulan ve 2 m (mβ 2 m) veya hβ2m β fare ilekarmaşık olan gp33 (KAVYNFATM) yapıları hizalanmıştır. H-2Db'nin α1α2 PBG'si RMSD 0.283 idi ve bu iki yapıdaki peptitlerin genel konformasyonları da benzerdi (Şekil 3C,3D). Bu veriler, bβ2m ve hβ2m ile mβ 2 m ve mβ 2 m arasındaki 2 mikameβ, sunulan peptitlerin konformasyonlarını etkilemediğini göstermektedir.
Sıra hizalaması, farklı türlerden2m β amino asitlerinin yüksek oranda korunduğu göstermiştir (Şekil 4). Farklı türlerden2m β analizinin ardından, MHC I'nin H zinciri ile hidrojen bağlarını oluşturanβ 2m'lik amino asitlerin çoğunun korunduğu gösterildi (Şekil 4, Tablo 2). Bu arada, çeşitli kalıntılar da memelilerde benzer kimyasal özelliklere sahip amino asitlerdi. Bununla birlikte, MHC'nin H zincirineβ 2m bağlamada yer alan anahtar kalıntılar tavuklarda, balıklarda ve amfibilerde polimorfizmlergöstermiştir (Şekil 4).
Tablo 1: Çeşitli memeliler heterolog β2m ile birleşir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Çeşitli türlerin MHC I'de heterolog β2m ile ağır zincir arasındaki hidrojen bağı etkileşimleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 1: Çözünür ve yeniden katlanmış Ptal-N*01:01/HeV1 kompleks proteinlerinin saflaştırılması ve kırınım analizi için kullanılan kristalin fotoğrafları. M, kDa'daki moleküler ağırlık belirteçleridir. P1 agregalardır. P2, MHC kompleksidir. P3 β2 m'dir.(A) Ptal-N*01:01/HeV1 kompleksi β bulunmadan oluşmadı2m. (B) H-2Kd kompleks hβ2m. (C) Ptal-N* 01:01/HeV1 kompleksi bβ2m ile yeniden doyma yoluyla oluşturulmuştur. Profil, 75.0, 44.0 ve 13.7 kDa moleküler kütle standartlarının yaklaşık konumlarıyla işaretlenmiştir. (D) Ptal-N*01:01/ HeV1 kompleksi hβ2m. ile yeniden doyma yoluyla oluşmuştur. (E) Kristal, bβ 2 m ile yeniden doyma yoluyla oluşan Ptal-N*01:01/HeV1 kompleksinden oluşur. Siyah ok, X-ışını kırınımı sırasında veri toplamak için kullanılan kristali temsil eder. (F) Kristal, hβ 2 m ile yeniden doyma yoluyla oluşturulan Ptal-N * 01:01 / HeV1 kompleksinden oluşur. Siyah ok, X-ışını kırınımı sırasında veri toplamak için kullanılan kristali temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hibrit MHC I komplekslerinde β2m ile ağır zincir arasında hidrojen bağlanması. (A)Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 ve (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC komplekslerinde β2m ile H zinciri arasında hidrojen bağlanması. Hidrojen bağı etkileşimleri siyah noktalı bir çizgi ile temsil edilir. Kare, yakınlaştırılmış ve ilgili renkli kutularda sağda gösterilen alanı temsil eder. Kırmızı, homolog β2m ve heterolog β2m'nin H zinciri ile hidrojen bağları oluşturmak için aynı amino asitleri kullandığını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hibrid MHC I komplekslerinde MHC kompleksinin ve antijenik peptitlerin benzer uyumu. (A) Ptal-N*01:01/bβ 2 m (yeşil) ve Ptal-N*01:01/hβ2m (gri) α1α2 etki alanlarının üst üste bindirmesi. (B) HeV1 peptidinin her Ptal-N* 01:01 molekülünün α1α2 etki alanının süperimpozisyasyonu ile süperpozisyasyonu. HeV1 Peptit Ptal-N*01:01/bβ 2 m'de pembe ve Ptal-N*01:01/hβ2m'de sarı olarak temsil edilir. (C) H-2Db /mouse α1α2 etki alanlarının üst düzeye çıkarılması 2 m (mβ2m) (yeşil) veH-2Db /hβ2m (gri) β. (D) Gp33 peptidin her H-2Db molekülünün α1α2 etki alanının süperimpozisyasyonu ile süperpozisyasyonu. Peptid gp33, H-2Db /mβ2m'de mavi ve H-2Db /hβ2m'de pembe olarak temsil edilir.
Şekil 4: Hβ2m'nin yapı tabanlı sıra hizalaması, diğer türlerin β2m'si ile. Siyah oklar β iplikçiklerini gösterir. Kırmızı ile vurgulanan kalıntılar tamamen korunur ve mavi kutulardaki kalıntılar yüksektir (>%80) Korunmuş. Sarı üçgenler,β 2m ve H zincirleri arasındaki etkileşim için anahtar amino asitleri temsil eder. Sıra hizalaması Clustal X32 ve ESPript33kullanılarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Farklı taksondan heterolog ikame yoluyla hibrit bir protein kompleksinin inşası, MHC I ve ligandlarında olduğu gibi homolog kompleks mevcut olmadığında fonksiyonel ve yapısal araştırmalar için ortak bir stratejidir. Bununla birlikte, metodoloji ve teknoloji ile ilgili sınırlı bir özet vardır. Burada bβ 2 m veya hβ 2 m ile stabilize edilen yarasa MHC I, Ptal-N*01:01'in yapısı analiz edildi. Ptal-N*01:01'e 2m'lik β bağlayıcı anahtar amino asitlerin yarasa ve insan arasında korunduğu bulunmuştur. Daha fazla analiz üzerine, MHC I'in H zincirine2m'lik β bağlamada yer alan anahtar kalıntının memelilerde korunduğu, ancak tavuklarda, balıklarda ve amfibilerde çok biçimli olduğu bulunmuştur. Bu veriler, heterolog β 2 m ikameninmemelilerinMHC I'ini incelemek için uygulanabilir bir araç olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, memeliler ve kuşlar, balıklar veya amfibiler arasında ikame mümkün olmayabilir.
Yapısal çalışmalar, MHC I moleküllerinin peptit sunumunun moleküler mekanizmalarını anlamada önemli roller oynar. Heterolog β2m ikame genellikle MHC I yapısal etütlerindekullanılır 14,16,17,18,26,27,28. Önceki çalışmalar sığır MHC I, N * 01801, murine β2m ve sığır β2m N * 01801 H zincirinin α1α2 alanlarına bağlama sırasında benzer şekilde davrandığını göstermiştir17. Burada, aynı H MHC I zinciri tarafından sunulan ancak2m'β farklı olan tek bir peptitin yapısı analiz edildi. Bu veriler, peptit konformasyonlarının2m'β çapraz takson ile stabilize edildiğinde benzer olduğunu göstermektedir, bu nedenle heterolog β2m ikamesi peptit sunumını etkilemez.
MHC I tarafından sunulan antijen peptitleri, T hücre aktivasyonuna aracılık etmek için TCR tarafından tanınır29. Viral enfeksiyon sırasında, antijene özgü T hücre immün yanıtlarının değerlendirilmesi viral enfeksiyonların anlaşılmasını büyük ölçüde artıracak ve immün yanıtlara ev sahipliği yapacaktır. Peptit-MHC tetramer, T hücre yanıtlarını değerlendirmek için önemli bir tekniktir; MHC monomer molekülünü tetramerize etmek, benzeşimini artırmak ve T hücrelerinde birden fazla TCRS ile birleştirmek için bir tekniktir. Tetramerler araştırma ve klinik tanıda yaygın olarak kullanılmaktadır14,29,30. Son zamanlarda, TCR tarafından tasarlanmış T hücreleri (TCR-T), kötü huylu tümörlerin tedavisinde potansiyel etkinliği için tümör immünoterapisinde sıcak bir konu haline gelmiştir31. MHC I tetramer boyama, MHC I molekülleri tarafından sunulan kansere bağlı antijen peptitlerine spesifik TCR bağlamasını taramak için çok önemli bir yöntemdir29. Bu nedenle, MHC I tetramer hazırlığı TCR taramasında hayati bir rol oynar. MHC I H zincirinin bağlanmasına ek olarak,β 2m de T hücre yüzeyindeKI CD8'e bağlanır ve bu da MHC I tetramer boyama ile TCR taraması sırasında spesifik olmayan lekelenmeye neden olabilir. Heterolog β2m ikamesi, MHC I tetramerinin bu spesifik olmayan bağlayıcısını azaltabilir.
Ancak, protokolde bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, E. coli rekombinant proteinler için baskın ifade konağı olmaya devam etse de, çeviri sonrası birçok değişiklik yapılamaz ve eksprese edilen protein ürünleri çözünmez inklüzyon cisimleri oluşturur. Daha sonra, 2 m'β bazı memeli olmayanlarınmemeliβ 2 m ile benzer ikamesi nedeniyle,2m'βmemeliolmayanların MHC yapılarına yardımcı olmak ve stabilize etmek için heterolog β2m ile değiştirilip değiştirilemeyeceği bilinmemektedir. Protokolde, hem NetMHCpan hem de Rosetta FlexPepDock sunucusunu kullanarak denenen analizlerimize bir açıklama eklenmiştir. Ne yazık ki, iki tahmin de deneysel verilerle eşleşmedi. Bu, mevcut MHC bağlayıcı peptit tahminlerinin, farklı bir peptit bağlama şekline sahip olabilecek yarasalar gibi insan olmayan ve fare olmayan memeliler için uygun olmadığını gösterebilir. Bu nedenle, yüksek benzeşimli peptitler elde etmek için kapsamlı analiz için çeşitli tahmin yazılımlarını ve deneysel sonuçları birleştirmemiz gerekir.
Burada açıklanan protokolde, temel adım MHC'nin doğru bir şekilde yeniden çevrilebilmesidir. Yüksek yeniden katlama verimliliğine sahip bir MHC kompleksi elde etmek çok önemlidir. Bu nedenle, uygun peptitleri seçmeye ve içerme organlarının saflığını artırmaya dikkat etmek çok önemlidir.
Sonuç olarak, burada MHC I ekspresyonu, yeniden katlama, kristalizasyon, kristal veri toplama ve yapı belirleme için bir protokol özetlenmiştir. Ayrıca, I. MHC'de heterolog β2m ikamenin fizibilitesi analiz edildi. Bu çalışma, yapısal ve fonksiyonel çalışmalarda MHC I'yi anlamak için sağlam bir referans sunmaktadır. Ayrıca bu veriler bulaşıcı hastalık ve tümör immünoterapisi sırasında T hücre yanıtlarının değerlendirilmesi açısından da önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Nan-jing Üniversitesi farmasötik biyoteknoloji devlet anahtar laboratuvarının açık fonu tarafından desteklendi (Grant no. KF-GN-201905), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81971501 hibeleri). William J. Liu, NSFC'nin Mükemmel Genç Bilim Adamı Programı (81822040) ve Pekin Yeni Yıldız Bilim ve Teknoloji Planı (Z181100006218080) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
