Summary
Her præsenterer vi en protokol til måling in vitro Ca2 + fluxes i midbrain neuroner og deres downstream virkninger på caspase-3 ved hjælp af primær mus midbrain kulturer. Denne model kan anvendes til at studere patofysiologic ændringer relateret til unormal Ca2 + aktivitet i midbrain neuroner, og at screene nye terapeutiske for anti-apoptotiske egenskaber.
Abstract
Parkinsons sygdom (PD) er en ødelæggende neurodegenerative lidelse forårsaget af degeneration af dopaminerge (DA) neuroner. Overdreven Ca2 + tilstrømning på grund af den unormale aktivering af glutamat receptorer resulterer i DA excitotoxicity og er blevet identificeret som en vigtig mekanisme for DA neuron tab. I denne undersøgelse isolerer, tager vi afstand fra og kulturer midbrain neuroner fra musens ventrale mesencephalon (VM) af ED14 museembryoner. Vi inficerer derefter de langsigtede primære musemidthinkulturer med en adeno-associeret virus (AAV), der udtrykker en genetisk kodet calciumindikator, GCaMP6f under kontrol af den humane neuron-specifikke synapsin promotor, hSyn. Ved hjælp af levende konfokal billeddannelse, viser vi, at dyrkede mus midbrain neuroner vise spontane Ca2 + fluxes opdaget af AAV-hSyn-GCaMP6f. Bad anvendelse af glutamat til midbrain kulturer forårsager unormale stigninger i intracellulære Ca2 + i neuroner, og dette er ledsaget af caspase-3 aktivering i DA neuroner, som det fremgår af immunstaining. De teknikker til at identificere glutamat-medieret apoptose i primær mus DA neuroner har vigtige applikationer til det høje indhold screening af lægemidler, der bevarer DA neuron sundhed.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er den anden mest almindelige neurodegenerative lidelse på verdensplan, uden kendt kur. Skøn tyder på , at PD prævalens vil fortsætte med at stige og forventes at overgå 1 million diagnoser i år 2030 i USA alene1. Med få effektive behandlinger i øjeblikket til rådighed til bekæmpelse af PD, der er et presserende behov for at udvikle mere effektive behandlinger. PD er karakteriseret ved en hurtig og progressiv tab af midbrain dopamin (DA) neuroner2. De mekanismer, der ligger til grund for neurodegeneration i PD er dårligt forstået. Beviser tyder på en sandsynlig konvergens af flere mekanismer, såsom oxidativstress og mitokondriel dysfunktion, osv., der bidrager til indledningen af apoptotiske signalering kaskader og eventuel celledød3.
En sådan konvergerende mekanisme, glutamat-medieret excitotoxicity har været involveret i flere neurodegenerative sygdomme, herunder PD4. Mens glutamat-medieret excitotoxicity menes at arbejde primært gennem stimulering af NMDA receptorer via en overdreven stigning i intracellulære Ca2 + koncentration og eventuel indledning af apoptose, Ca2 +-permeable AMPA receptorer har også været involveret i excitotoksiske respons5,6,7. Derfor er det af interesse at bestemme bidraget fra AMPA-receptorer til glutamat-medieret apoptose inden for en PD-model. Dette kan opnås ved hjælp af NBQX, en AMPA og kainate blocker, som ved mikromolar koncentrationer er selektiv for AMPA receptorer8. Glutamat-medieret excitotoxicity og apoptotiske signalering kaskader er et ideelt downstream mål at måle omfanget af celledød, og et potentielt mål for terapeutisk intervention. Derfor, udvikle et højt indhold metode til vurdering glutamat-medieret graduering af calcium aktivitet og tilhørende downstream signalering i primær ventral mesencephalic (VM) neuroner ville være værdifuldt for screening nye behandlingsmetoder på deres evne til at bevare neuronal sundhed.
Her har vi udviklet en protokol, hvor vi udtrykker den genetisk kodede calciumindikator (GECI), GCaMP6f, ved hjælp af AAV2/5 med den menneskelige synapsin (hSyn) promotor til at måle Ca2 + aktiviteten af mus VM primære neuroner som reaktion på glutamat ansøgning, som kan måles på det fysiologiske og molekylære niveau. Denne screening med højt indhold kan tilpasses til at opdage lægemidler eller behandlinger, der modulerer Ca2+ aktivitet for at bevare sundheden for VM-neuroner. Vi foreslår, at denne primære kultur model er en effektiv måde at screene for nye PD interventioner, baseret på deres evne til at bevare sundheden for VM neuroner og afbøde udviklingen af PD.
Protocol
Alle procedurer, der involverer brug af forsøgspersoner, er blevet godkendt af Texas A&M University Institutional Animal Care and Use Committee (25.november 2019; AUP# 2019-0346).
BEMÆRK: Forberedelse af cellekulturopløsninger bør ske ved hjælp af steril procedure i et biologisk sikkerhedsskab og filtreres ved 0,2 μm for at forhindre kontaminering.
1. Udarbejdelse af løsninger og kulturmedium
- Laminin belægningsopløsning klargøres ved fortynding af 20 μL 1 mg/ml lamininbestand i 2 ml steril destilleret H2O. Forbered på dissektionsdagen.
- Der tilberes 10% hesteseal (heste)serum (ES) stopopløsning ved at tilsætte 5 ml ES til 45 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Sterilt filter ved hjælp af et 0,2 μm filtersystem eller sprøjtefilterspids. Opbevares ved 4 °C.
- Der tilberedes en 4% kvægserumalbuminopløsning (BSA) ved at tilsætte 2 g BSA-pulver til 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) og bringe det endelige volumen på 45 ml til. Sterilt filter ved hjælp af et 0,2 μm filtersystem eller sprøjtefilterspids. Opbevares ved 4 °C.
- Papain stock opløsning ved at fortynde papain til 3 mg/ml i 1x HBSS. Sterilt filter ved hjælp af et 0,2 μm filtersystem eller sprøjtefilterspids. Opbevares ved -20 °C.
- Deoxyribonuclease (DNase) opløsning klargøres ved tilsætning af 20 mg DNasepulver til steril H2O og til et endeligt volumen på 20 ml. Sterilt filter ved hjælp af et 0,2 μm filtersystem eller sprøjtefilterspids. Opbevares ved -20 °C.
- Der tilberes en ascorbinsyrebestandopløsning ved tilsætning af 352 mg ascorbinsyre til sterildestillet H2O og bringes til et endeligt volumen på 20 ml. Varm i 37 °C bad for at opløse, hvis det er nødvendigt. Sterilt filter ved hjælp af et 0,2 μm filtersystem eller sprøjtefilterspids. Opbevares ved -20 °C.
- Forbered cellekulturmedium ved at tilsætte følgende til 50 ml neurobasalt medium: 500 μL glutamax (100x), 500 μL hesteserum 1 ml B-27, 100 μL ascorbinsyre, 500 μL penicillin-streptomycin, 50 μL kanamycin og 50 μL ampicillin. Sterilt filter ved hjælp af et 0,2 μm filtersystem. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered 0,01% Triton X-100 Løsning ved at tilføje 1 ml Triton X-100 i 9 ml 1x PBS for at lave en 10% opløsning. Da Triton X-100 er tyktflydende, pipette langsomt at tillade spidsen til at fylde helt. Varm i 37 °C bad for at opløse, hvis det er nødvendigt. Opbevares ved 4 °C.
- For at fortynde 10% Triton X-100 lager til 0,01%, udføre 3 seriel 1:10 fortyndinger. Fortynd 1 ml 10% lager i 9 ml 1x PBS for at lave 1% opløsning. 1 ml 1% opløsning fortyndes til 9 ml 1x PBS for at lave 0,1% opløsning. 1 ml 0,1% opløsning fortyndes til 9 ml 1x PBS for at lave en opløsning på 0,01 %.
- Der klargør 10% og 1% normal gedeserum (NGS) ved at tilsætte 1 ml NGS til 9 ml 1x PBS for en 10% opløsning. Der tilsættes 100 μL NGS til 9,9 ml 1x PBS for at lave 1% opløsning.
- Glutamatbestandopløsning (100 mM) klargøres ved tilsætning af 735 mg L(+)-glutaminsyre til steril destilleret H2O og bringes til et endeligt volumen på 50 ml. Opløselighed ved denne koncentration vil være et problem. Tilsætning af små mængder (100 μL) 1 M saltsyre er tilstrækkelig til at øge opløseligheden.
- Der klargør NBQX-lageropløsning (10 mM) ved at tilsætte 50 mg NBQX til sterildestillet H2O og bringes til et endeligt volumen på 13 ml.
2. Forberedelse af kulturretter og coverslips (Udført dagen før dissektion)
BEMÆRK: Vi har konstateret, at kombinere tre belægningsmidler, poly-L-lysin, poly-L-ornithin, og laminin giver mulighed for ideelle celle vedhæftning og levedygtighed.
- Placer 10 35 mm petriskåle i et biologisk sikkerhedsskab. Placer to cirkulære 12 mm dækslæber i hver skål og fyld med 70% EtOH i 10 min. Brug en vakuumlinje til at aspirere de resterende EtOH fra hver skål, så EtOH kan fordampe helt.
- Pipette ~90-100 μL 0,1% poly-L-lysinopløsning på hver dækslip, og sørg for, at hele dækslæbet er dækket af poly-L-lysinopløsningen. Opbetræk med låg og læg dem i en 37 °C-inkubator i 1 time.
- Aspirere resterende poly-L-lysinopløsning fra hver dækslædlip og skyl med steril H2O.
- Gentag trin 2.2 – 2.3 med 0,1% poly-L-ornithinopløsning.
- Igen, gentag trin 2,2 - 2,3 med 0,01% laminin løsning. Der indbringes i en 37 °C/5% CO2-inkubator, indtil den er klar til cellebelægning den følgende dag.
3. Mus embryonale dissektioner
BEMÆRK: Vi bruger mellem 4 og 6 timede drægtige mus pr. kultur. Mens en stor del af dissektionsprocessen sker uden for en biologisk sikkerhed kabinet er det stadig vigtigt at opretholde steril procedure. Rigelig brug af 70% EtOH på overflader nær dissektion mikroskop og på kirurgiske værktøjer er ideel. Der kan også bæres en maske under dissektionen for yderligere at forhindre kontaminering. Derudover bruger vi 4 separate antibiotika i kulturmediet, så forurening er usandsynlig. Men hvis brugen af antibiotika er problematisk, denne dissektion setup kunne flyttes inde i en steril hætte. For at bevare cellernes levedygtighed bør alle dissektionsopløsninger forkøles ved 4 °C, og dissektionerne bør færdiggøres så hurtigt som muligt. Vi udfører ikke dissektionerne på is. Metoden til dissektion af musepromiske midbrain neuroner er identisk med tidligere beskrevne metoder9,10.
- Forbered en plads på en bænk i nærheden af en dissektion mikroskop med en absorberende pad og spray liberalt med 70% EtOH.
- Spray to 100 x 15 mm glas petriskåle og en 50 x 10 mm glas petriskål med 70% EtOH og lad EtOH fordampe. Når fordampet, placere 50 ml steril 1x HBSS i hver 100 x 15 mm petriskål.
- Nedsænk kirurgisk saks, scer og mikrotomklinge i 70% EtOH i 10 min minimum for at sterilisere. Anstæn skal instrumenterne på den absorberende pude tørre.
- Ved hjælp af CO2 efterfulgt af cervikal dislokation, aflive 2-3 måneder gamle timet graviditet mus på embryonale dag 14.
- Spray maven af de aflivede mus med 70% EtOH. Brug afcefet fat i underlivet og åbne bughulen ved hjælp af kirurgisk saks. Begynd at skære i nærheden af, hvor de spån holder maven, hvilket gør laterale nedskæringer på hver side, indtil bugvæggen kan foldes tilbage og livmoderen er klart synlig.
- Ved hjælp af kirurgisk saks, skære begge ender af livmoderen horn. Fjern derefter livmoderen og sted i Petriskål med 1x HBSS.
- Brug lige spids snævler forsigtigt fjerne embryoner fra livmoderen. Lad embryonerne blive i HBSS under hele denne proces. Brug enten syr- eller mikrotombladet til hurtigt at halshugge embryoner ved at skære i nærheden af halsen. Gør så niveau et snit som muligt.
- Under et dissekerende mikroskop skal du flytte et embryonhoved til en tør 50 mm petriskål og placere det på ventrale side. Stabilisere hovedet med pincet ved at placere og trænge ind i nærheden af øjne / snude. Pincet skal vinkles nedad ved ~ 45° for at undgå at trænge ind i mesencephalon.
- Brug af spån i den anden hånd, forsigtigt fjerne gennemskinnelige lag af hud og kraniet lige før den fremtrædende højderyg af mesencephalon. Start i nærheden af midterlinjen og fjern hud og kraniet caudally indtil mesencephalon er fuldt eksponeret.
- Hold de vicesper vinkelret på den eksponerede mesencephalon med en spids mellem cortex og mesencephalon og den anden nær lillehjernen. Tryk og knib agrenen sammen for at fjerne hele midterhjernen. Midbrainsegmentet skal være ca. 0,5 mm tykt. Placer midbrainsegmentet i den anden petriskål fyldt med frisk 1x HBSS. Gentag denne proces for hvert embryon.
- Brug dissektionmikroskopet til at placere hjernesegmentet med ventrale side opad. Hvis meninges stadig er fastgjort, forsigtigt fjerne det ved at snuppe med slænde og løfte op og væk fra hjernen segment.
- Hjernen segmentet skal have 4 synlige kvadranter. Placer segmentet på en sådan måde, at de to mindre kvadranter er placeret overlegen i forhold til de to større kvadranter. Der er en fremtrædende højderyg adskille de overlegne to (små) kvadranter fra ringere to (store) kvadranter.
- Brug af knyt knivspids og adskille de overlegne kvadranter fra ringere kvadranter, og derefter kassere den overlegne kvadranter. De resterende ringere kvadranter vil have overskydende væv lateralt på dorsale side, vil dette væv ser mindre uigennemsigtig end de resterende ventrale væv. Fjern det mindre tætte dorsale væv og kassér. Det resterende segment skal indeholde både Substantia nigra pars compacta (SNc) og ventrale tegmental område (VTA).
- Ved hjælp af scet skære de resterende ventrale væv segment i 4 mindre stykker og ved hjælp af en 1mL bred boring pipette overføre disse segmenter i en 15 ml konisk rør med 1x HBSS. Hold det koniske rør med hjernesegmenter på is under hele proceduren.
- Gentag denne proces for alle resterende hjernesegmenter.
4. Dissociation af celler
- Enzymatisk fordøjelse af celler
- Modsugning omhyggeligt HBSS fra det 15 ml koniske rør, der indeholder midbrainsegmenter, så segmenterne efterlades i bunden af røret.
- Der tilsættes ~800 μL papainopløsning til røret og anbringes i en 37 °C-inkubator i 7 min. Opslænkning af celler ved at svippe røret og udskift inkubatoren på 37 °C i yderligere 7 minutter.
- Med en bredbålet 1 ml pipettespids fjernes kun mellemhjernens segmenter i en 1 ml aliquot DNase. Lad segmenterne nå bunden af aliquot eller ca. 1 min eksponering.
- Med en bredbålet 1 ml pipettespids fjernes kun mellemhjernens segmenter i et 15 ml konisk rør med 2 ml stopopløsning. Lad segmenterne sætte sig i bunden af røret og gentage skylningen i et ekstra konisk rør fyldt med stopopløsning.
- Mekanisk triturisering af celleaffjedring
- I den anden stopopløsning skylles rør, ved hjælp af en bred-boring 1 ml pipette spids, pipette cellerne op og ned 10 gange, indtil der ikke er nogen store væv segmenter synlige. Det er vigtigt at undgå over trituration for minimal celle lysis.
- Langsomt pipette 300 μL 4% BSA opløsning til bunden af 15 ml konisk rør, der indeholder hjernesegmenter. Fjern forsigtigt pipettens tip for at opretholde et affjedringslag. Centrifuge ved 0,4 x g i 3 min. Derefter forsigtigt aspirere supernatant og resuspend celler i 400 μL af cellekultur medium.
5. Plating cellerne
BEMÆRK: På baggrund af erfaringer indsamles ca. 100.000 levedygtige celler pr. embryo. 2-3 måneder gamle timede drægtige mus har typisk kuldstørrelser på 8-10 embryoner; Derfor er et groft skøn for det samlede udbytte af celler pr. timet gravid mus ca. 1 million celler.
- Ved hjælp af et hæmocytometer præforme et celletal og derefter fortynde suspensionen til 2.000 celler / μL ved hjælp af cellekultur medium. Triturate kort at blande.
- Fjern dækslæber med lamininopløsning fra trin 2 fra inkubatoren, og inspirer den resterende lamininopløsning fra de overtræbte dæksæber ved hjælp af et vakuum. Plade hurtigt for at undgå coverslips fra tørring helt. Pipette 100 μL (2,0 x 105 celler/dækslæb) på hver dækslædlip og placere petriskåle i en 37 °C inkubator i 1 time.
- Tilsæt forsigtigt 3 ml cellekulturmedium til hver skål og læg det tilbage i 37 °C-inkubatoren. Præforme halv medium ændringer 2 gange om ugen i 2 uger.
6. Infektion af cellekultur ved 14 DIV med adeno-associerede virale (AAV) vektorer
- For hver skål klargøres 1 ml serumfrit DMEM-medium med 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 titer)
- Aspirere cellekulturmediet fra hver skål og udskift det med 1 ml serumfri DMEM, der indeholder hSyn-GCaMP6f. Anbring retterne tilbage i 37 °C-inkubatoren i 1 time.
- Aspirere det serumfrie medium, der indeholder AAV'er, og erstattes med 3 ml cellekulturmedium. Anbring retterne tilbage i 37 °C-inkubatoren. Vi har konstateret, at 5-7 dage af AAV infektion giver mulighed for ideelle niveauer af GCaMP udtryk. Fortsæt med at skifte medium hver 2-3 dage i hele denne periode med virusinfektion.
7. Live konfokale Ca2 + billeddannelse mellem 19-21 DIV
BEMÆRK: Som nævnt i trin 6.3 kan billeddannelse foretages mellem 5-7 dage efter virusinfektion. Dette er det ideelle vindue til at opnå synligt udtryk for fluorophore på niveauer, der giver mulighed for påvisning af spontan Ca2 + aktivitet.
- Forberedelse af optagelsesbuffere
- Hvis du vil lave 1 L HEPES-optagelsesbuffer, skal du tilføje: 9,009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-glucose, 2,381 g HEPES, 2 ml 1 M CaCl2 lageropløsning og 500 μL 1 M MgCl2 lageropløsning til 800 ml steril destilleret H2O. Bring pH til 7,4 med NaOH. Bring til et endeligt volumen på 1 L.
- For at gøre 200 ml 20 μM glutamat optagelse buffer, fortyndes 40 μL af 100 mM glutamat bestand opløsning i 200 ml HEPES optagelse buffer beskrevet ovenfor.
- For at lave 200 ml 10 μM NBQX-optagelsesbuffer fortyndes 200 μL 10 mM NBQX-stamopløsning til 200 ml HEPES-optagelsesbuffer.
- Konfokal billeddannelse
- Fyld en steril 35 mm petriskål med 3 ml optagelsesbuffer.
- En 35 mm petriskål med inficerede kulturer fjernes fra inkubatoren på 37 °C. Brug fine tip kraftpind, omhyggeligt fat i kanten af en coverslip og overføre det hurtigt ind i Petriskålen fyldt med optagelse buffer. Den resterende dækslæbet hældes i medium tilbage i inkubatoren på 37 °C. Transporter skålen med optagelsesbuffer til det konfokale mikroskop.
- Start billedbehandlingssoftwaren. Fortsæt til næste trin, mens det initialiserer.
- Start peristaltiske pumpe og placere linjen i optagelsen buffer. Kalibrer hastigheden af flow til at være 2 ml / min.
- Den inficerede dæksling fra 35 mm petriskålen overføres til optagebadet.
- Brug 10x vand nedsænkning mål og BF lys, finde planet af fokus og kigge efter en region med en høj tæthed af neuron celle organer. Skift til målet om 40x vandnedsænkning, og brug af BF-lys, der skal fokusere prøven igen.
- I vinduet "Farvestoffer" i FluoView skal du vælge AlexaFluor 488 og anvende den.
- AAV-udtryk kan være variabelt. Derfor, for at forhindre overeksponering og fotobleaching af fluorophores, start med lav HV og laser magt indstillinger. For AlexaFluor 488-kanalen skal du indstille højspændingen (HV) til 500, gevinsten til 1x og forskyde til 0. For 488 laser linje indstille magt til 5%. For at øge den effektive volumen afbildet i z-flyet, øge pinhole størrelse til 300 μm. Brug scanningsindstillingen "focus x2" til at justere emissionssignalerne optimalt til submætningsniveauer. Herfra kan indstillingerne justeres, indtil der opnås en ideel synlighed af hver kanal.
BEMÆRK: For præcist at registrere hele spektret af Ca2+ fluxes med GCaMP skal du justere indstillingerne for baseline HV og lasereffekt for at muliggøre en stigning i lysstofrør uden at overmætte detektoren. - Når mikroskopindstillingerne er optimeret, skal du flytte scenen for at finde et område med flere celler, der viser spontane ændringer i GCaMP6f-fluorescens og fokuser til det ønskede plan til billedbehandling.
- Brug værktøjet "Klip rektal" til at klippe billedrammen til en størrelse, der kan opnå et rammeinterval på knap 1 sekund. Dette er nødvendigt for at indstille billeddiagnostisk interval på 1 ramme per sekund.
- Angiv vinduet "Interval" til en værdi på 1,0 og vinduet "Num" til 600.
BEMÆRK: For at kunne levere forskellige optagelsesbuffere på det ønskede tidspunkt (300 s) er det vigtigt at kalibrere pumpens latenstid for at levere den nye løsning til badet. Dette afhænger af opløsningsperfusionshastigheden (2 ml/min.) og længden af den linje, der bruges til at pumpe opløsningen. - Hvis du vil hente en film i t-serien, skal du vælge indstillingen "Tid" og derefter bruge scanningsindstillingen "XYt" til at begynde billeddannelse.
- Se statuslinjen for billeddiagnostiske billeder, og flyt linjen fra HEPES-optagelsesbufferen ind i den 20 μM-glutamatoptagelsesbuffer på det relevante tidspunkt (f.eks. hvis pumpens ventetid er kalibreret til at levere opløsning ved 60 s, skal du flytte linjen ind i glutamatbufferen ved 240 billeder for at levere glutamat ved 300 s).
- Når billedbehandling er fuldført, skal du vælge knappen Serie færdig og gemme den færdige film i t-serien. Fortsæt med at gennemgå 20 μM glutamat i yderligere 5 min, således at de dyrkede neuroner har været udsat for glutamat i alt 10 min. Gentag denne proces for hver dækslæb, der skal afbildes.
- Efter den yderligere 5 minutters eksponering for 20 μM glutamat fjernes dækslæbet fra badet og sættes tilbage i 35mm Petriskålen, der indeholder optagelsesbuffer, indtil billeddannelsesdagen er afsluttet. Når du er færdig, skal du fortsætte til trin 8.
- Ca2+ sporingsanalyse
- Udfør billedanalyse i ImageJ. Installer BIO-FORMATERS plugin til ImageJ, som vil tillade . OIB-billedfiler, der skal åbnes.
- Klik på Analysér | Angiv målinger, og markér feltet for Middelgråværdi (MGV).
- Åbn en film i Billedj som en hyperstack.
- Træk skyderen for filmen og identificere rammen med maksimal glutamat svar til at visualisere alle neuroner, der reagerer på glutamat. Brug polygonværktøjet til at spore alle synlige neuroncellekroppe og føje deres ROI'er til listen "ROI manager".
- Når du er færdig med at spore og tilføje ROI'er, skal du markere alle roi-aktiver i vinduet Roi Manager og bruge valget af flere målpunkter på den mere liste over indstillinger. Kopiere og indsætte disse data i et regneark. Gennemfør denne proces, for at alle film kan analyseres.
- For hver investeringsafkast skal de rå MGV-data fra hver ramme konverteres til ΔF/F0-værdier ved hjælp af ligningen: ΔF/F0 = [F(t) – F0] / F0. Hvor F(t) = MGV af en given ramme, og F0 = gennemsnitlig baseline MGV på ~ 10 rammer, hvor der ikke ca2 + fluxes er til stede.
- Ved hjælp af en statistisk software som OriginPro 2020 kan konverterede ΔF/F0-spor gøres til kurvediagrammer. Funktionen "Peak analysator" kan bruges (eller lignende funktion, hvis du bruger en anden software) til at måle toppen amplitude af glutamat respons, latenstid til at reagere på glutamat, og område under kurven.
8. Immunstaining af kulturer
BEMÆRK: Efter fiksering med formalin kan dækslips opbevares i 1x PBS ved 4 °C, indtil de er klar til at blive behandlet til immunstaining. Primær og sekundær antistof inkubation blev udført på en seriel måde, som sådan inkubation med anti-Caspase-3 primære antistof og dens komplementære sekundære antistof forud inkubation med anti-TH primære antistof og dens komplementære sekundære antistof.
- Umiddelbart efter glutamat eksponering, placere coverslip tilbage i sin 35 mm Petri fad, aspirere optagelsen buffer, og tilsæt 3 ml af 10% formalin. Lad sidde i 40 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Skyl skålen 3 gange med 1x PBS.
- Inspirer PBS og permeabilize celler i 1 ml af 0,01% Triton X-100 i PBS i 2 min.
- Skyl skålen 3 gange med 1x PBS.
- Inspirer PBS og blokceller i 1 ml 10% NGS i PBS i 40 min.
- Skyl skålen 3 gange med 1x PBS.
- Der tilsættes 1 μL kaninanti-Caspase-3 primært antistof til 1 ml 1 % NGS i PBS (1:1000 fortynding). Aspirer PBS fra skålen og udskift den primære antistofopløsning. Placer på en shaker og inkubere i 1,5 timer på RT.
- Skyl skålen 3 gange med 1x PBS.
- Der tilsættes 1 μL gedanti-kanin AlexaFluor 488 sekundært antistof til 1 ml 1% NGS i PBS (1:1000 fortynding). Aspirere PBS ud af skålen og udskift den sekundære antistofopløsning. Placer på en shaker og inkubere i 1 time på RT. Bevæger sig fremad beskytte prøverne mod lys.
- Skyl skålen 3 gange med 1x PBS.
- Gentag trin 8.7 til 8.10, men ved hjælp af kylling anti-TH primære antistof (1:1000) i trin 8.7 og ged anti-kylling AlexaFluor 594 sekundære antistof (1:1000) i trin 8.9.
- Efter den endelige PBS-skylning skal der sættes 30 μL monteringsmedium på et mikroskopslide. Brug af snævler fat i en dækslæd fra 35 mm petriskålen, og placer dækslingen med cellerne nedad i monteringsmediet. Begge coverslips vil passe på et enkelt mikroskop dias, hvis de placeres korrekt. Placer i et tørt, mørkt område og lad monteringsmediet tørre natten over.
9. Konfokal billeddannelse af immunstained kulturer
- Konfokal billeddannelse
- Start billedbehandlingssoftwaren. Anberet prøven på mikroskopstadiet.
- Med mikroskopet okularer, ved hjælp af en 20x forstørrelse mål og epifluorescerende lys med en TRITC filter, fokusere prøven og søge efter en TH + celle krop.
- Når du har fundet en TH + celle krop, centrere det i synsfeltet og derefter flytte til 60x forstørrelse mål.
- Vælg AlexaFluor 488 og AlexaFluor 594 farvestoffer i "farvestof liste" vinduet.
- Som med levende billedbehandling skal du starte med lave indstillinger for HV, gain, offset og laser for at forhindre fotobleaching. Brug scanningsindstillingen "focus x2" til at vurdere den fluorescerende intensitet af hver kanal og justere i overensstemmelse hermed. Da disse billeder senere vil blive kvantificeret for lysstofrør, er det nødvendigt at holde billedindstillingerne ensartede på tværs af alle synsfelter. Derfor er det bedst at se på et par eksempler på hver betingelse for at få en idé om rækken af fluorescerende intensitet på tværs af prøver.
- Når ideelle billedindstillinger er fastlagt, skal du vælge scanningsindstillingen "fokus x2" og flytte den celle, der er interesseret i, til midten af synsfeltet. Forøg den digitale zoom til 3x ved hjælp af skyderen "zoom".
- Ved hjælp af fokusknappen skal du finde fokusplanet med den lyseste fluorescens og tage et enkelt xy-billede. Gem billedet til.
- Skift tilbage til 20x forstørrelsesmålsætningen for at søge efter en anden TH+ celle. Gentag denne proces, indtil det ønskede antal celler er blevet udtaget prøver fra hver betingelse.
- Billedanalyse
- Klik på Analysér | Angiv målinger, og marker felterne for Område, Integreret tæthed og Middelgråværdi.
- Åbn et billede som en hyperstack, hvor hver kanal er adskilt ved at trække og slippe ind på værktøjslinjen ImageJ eller vælge billedet via filmenuen.
- Brug TH-kanalen (594 nm) til at tegne ROI'er rundt om cellekroppen. Brug polygonsporingsværktøjet i ImageJ til at spore cellekroppens yderkant tæt. Hvis afstanden mellem cellemembranen og cellekernen er den mindste, spores en lige linje gennem cytosolen til kernens kant og derefter nøje følge kernens omrids for at udelukke den. Derefter spore en lige linje tilbage til den eksterne membran, der grænser op til den oprindelige linje så tæt som muligt, og fortsætte med at følge omridset af cellekroppen, indtil investeringsafkastet er færdigt.
- Brug af tastaturgenvejen "T" eller ved hjælp af værktøjslinjemenustien Analyze | Redskaber | Roi Manager, åbn roi manager og tilføje investeringsafkastet, der netop er trukket til listen.
- Vælg vinduet på caspase-3-kanalen (488 nm), og vælg derefter det tilføjede investeringsafkast på listen "ROI Manager".
- Vælg knappen Målpunkt i vinduet Roi Manager. Resultatvinduet vises med målingerne angivet tidligere. Kopier disse til et regneark, og gentag denne proces for hver celle.
Representative Results
Efter indledende dyrkning af celler behandlede vi VM-kulturretter ved 14 DIV med 1 μL AAV hSyn-GCaMP6f og tilladt i 5 dages viralt udtryk. På dagen for billeddannelse hepes optagelse buffer blev udarbejdet frisk. Vi brugte to betingelser; i den ene betingelse blev der anvendt 20 μM glutamat i 10 minutter, mens der i den anden tilstand gik 5 min af 10 μM NBQX-applikationen forud for en 10 min co-applikation på 10 μM NBQX + 20 μM glutamat. Under begge forhold observerede vi heterogene og spontane ændringer i GCaMP6f fluorescens, som indikerer spontane Ca2+ fluxes, som vist i de repræsentative spor (Figur 1A, B, Supplerende Movie 1-2). Anvendelse af 20 μM glutamat genereret en robust og vedvarende Ca2 + respons i både spontant aktive og quiescent neuroner (Figur 1A, Supplerende Movie 1). Anvendelse af 10 μM NBQX reduceret spontan aktivitet, og delvist blokeret glutamat respons (Figur 1B, Supplerende Movie 2). I hvilket omfang glutamatapplikationen stimulerede et Ca2+-respons i hver tilstand, blev kvantificeret ved hjælp af område under kurven, peak amplitude og ventetid til at reagere. Begge områder under kurven og top amplitude var ens for både glutamat og NBQX + glutamat behandlede betingelser (Figur 1C), mens ventetiden på respons blev væsentligt forøget i NBQX + glutamat tilstand (Figur 2A, B). Ud over at kvantificere Ca2 + respons på glutamat behandling, vi faste og farvede prøver med en anti-caspase-3 antistof som et mål for glutamat-medieret apoptose. Vi observerede en række caspase-3 aktivering på tværs af betingelserne(Figur 3A, B). Caspase-3 aktivering blev kvantificeret ved måleområde og gennemsnitlig caspase-3 intensitet. Sammenlignet med ubehandlede kontrolceller, det gennemsnitlige område af celler med caspase-3 aktivering under glutamat og NBQX + glutamat betingelser tendens til betydning (Figur 3B). Gennemsnitlig caspase-3 intensitet var signifikant højere i glutamat og NBQX + glutamat betingelser i forhold til ubehandlede kontroller (Figur 3B). Tilsammen viser disse resultater en ramme med højt indhold, hvor apoptose af neuroner kan måles ved at kvantificere Ca2+ respons på excitotoksiske midler og fulgt op med en analyse af downstream-apoptotiske hændelser såsom caspase-3 aktivering i samme sæt kulturer.
Figur 1: Kultiverede ventrale mesencephalic neuroner vise spontane Ca2 + aktivitet og er robust stimuleret af glutamat ansøgning. a) Repræsentative spor af spontan Ca2+ aktivitet i VM-neuroner og deres respons på 20 μM glutamatpåføring. b)Repræsentative spor af spontan Ca2+ aktivitet i VM-neuroner og deres respons på 10 μM NBQX + 20 μM glutamat. c)Befolkningsdata, der viser område under kurven og toppede amplitude afca. 2+ spor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: AMPAR blokade med NBQX forsinkelser svar på glutamat ansøgning i dyrkede ventrale mesencephalic neuroner. (A)Repræsentant Ca2 + spor af glutamat (grå) og NBQX + glutamat (blå) fremkaldte reaktioner. GennemsnitligeCa 2 + spor af glutamat (sort) og NBQX + glutamat (rød) er vist overlejret. (B)Befolkningsdata, der viser ventetid for respons for glutamat og NBQX + glutamat fremkaldte reaktioner. Procentvis ændring mellem glutamat og NBQX + glutamat betingelser vises i højre panel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Glutamat ansøgning øger caspase-3 udtryk i tyrosin hydroxylase (TH) positive ventrale mesencephalic neuroner. aA) Repræsentative konfokale billeder af VM-kulturer, der er immunostained for caspase-3 (grøn) og TH (rød), skalalinje = 10 μm.(B)Populationsdata, der viser DA neuron-området og gennemsnitlig gråværdi af caspase-3-udtryk i hver tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: Spontan Ca2 + aktivitet og reaktion på glutamat ansøgning.
Spontane Ca2+ fluxes i nærværelse af HEPES-optagelsesbuffer (0-300 s) efterfulgt af anvendelse af 20 μM glutamat (301-600 s). Skala bar = 50 μm. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende Movie 2: Spontan Ca2 + aktivitet og reaktion på NBQX + glutamat ansøgning.
Spontane Ca2+ fluxes i nærvær af HEPES-optagelsesbuffer (0-300 s) efterfulgt af anvendelse af 10 μM NBQX (301-600 s) og 10 μM NBQX + 20 μM glutamat (601-900 s). Skala bar = 50 μm. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Vi beskriver en langsigtet primær ventral mesencephalic (VM) cellekultur system til højt indhold analyse af glutamat-medieret apoptose i neuroner. Undersøgelser har anvendt primære midbrain dopaminerge kulturer til at belyse excitotoksiske mekanismer i forbindelse med PD model11,,12. I denne undersøgelse anvender vi en kombinatorisk tilgang ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer (GECIs) til at måle Ca2+ aktivitet og yderligere forbinde denne aktivitet med downstream-molekylære ændringer, såsom indledning af apoptotiske signalkaskader4. Metoden har flere fordele til andre lignende cellekultursystemer. Da vi har særlig interesse i excitotoxicity i forbindelse med Parkinsons sygdom, ved hjælp af primære VM-celle kulturer er ideel. Ved hjælp af forskellige felt flytning teknikker, såsom gridded coverslips eller en motoriseret XY mikroskop fase kombineret med TH immunostaining, kan vi direkte studere celletype specifikke virkninger af glutamat-medieret apoptose i ventral midbrain neuroner. Derudover, den 3-ugers cellekultur model giver mulighed for neuroner til at udvikle deres fulde, modne molekylære profil, der afspejler voksne DA neuroner9. Tidligere metoder har hovedsagelig fokuseret på molekylære ændringer efter glutamat-medieret excitotoxicity13,14. Modellen er unik i sin evne til at korrelere akutte ændringer i neuronal fysiologi med downstream molekylære hændelser i identificerede celletyper. En begrænsning af den primære kultur model er, at dissektion teknik indfanger hele ventrale midbrain, herunder DA og GABAergic neuroner samt neuroner fra SNc og VTA. Beviser tyder nu på, at DA neuroner af SNc har selektiv sårbarhed over for calcium og eventuel celledød i forhold til DA neuroner af de omkringliggende VTA15. Desværre har det vist sig vanskeligt at skelne SNC fra VTA-neuroner i embryonale kulturer med få anatomiske vartegn for at definere disse strukturer i embryonale hjerner.
Vi viser, at den primære kulturteknik giver mulighed for kvantificering af heterogen spontan Ca2+ aktivitet (figur 1). Derfor er dette en ideel cellekultur system model til at studere tonisk aktive celler, såsom pacemaking dopaminerge neuroner i midbrain, neocortical neuroner, og GABAergic neuroner af suprachiasmatic kernen (SCN)16,17. I de fleste applikationer opnår Ca2+ billeddannelse ikke den samme tidsmæssige opløsning som elektrofysiologi. Derfor er det sandsynligt, at en enkelt Ca2 + begivenhed svarer til en byge af neuronal handling potentialer. Dette kan fortolkes således, at Ca2+ billeddannelse giver mulighed for relativt nøjagtige målinger af unormal sprængningsaktivitet i tempogivende celler og derfor er velegnet til en skærm med højt indhold af Ca2+-medieret excitoxisk celledød.
For at opnå og opretholde spontan Ca2+ aktivitet er det vigtigt at tage fat på to centrale punkter i protokollen. For det første er plating tæthed af cellerne efter dissektion. For primære VM neuroner, tidligere undersøgelser har brugt omkring 100,000 celler/cm29,,10. Vi har tilpasset protokollen til plade en tæthed på 200.000 celler/cm2,hvilket skaber en heterogen vifte af spontan aktivitet og øger antallet af dopaminerge VM neuroner til stede på hver coverslip. Da forskellige pacemaking neuroner har forskellige fyring egenskaber16,den plating tæthed skal tilpasses til den celletype, der studeres og optimeres for at opnå ideelle niveauer af spontan aktivitet. For det andet er inkubationstiden efter virusinfektion af AAVs. Ligesom plating tæthed, vil dette være afhængig af den specifikke sammenhæng med forskning spørgsmål og type AAV bliver brugt. For den specifikke AAV, der anvendes her, 5 dages inkubation efter virusinfektion er ideel til at opnå de ønskede proteinudsetryksniveauer, hvilket giver mulighed for dynamiske ændringer i GCaMP fluorescens for at registrere Ca2+ aktivitet. Mange faktorer bestemmer, hvor hurtigt og effektivt en AAV vil udtrykke sin last, hvoraf en stor del er uden for rammerne af denne metode, men kort, er det vigtigt at overveje initiativtageraktivitet og den hastighed, hvormed fragtproteinet modnes og foldes.
En anden fordel ved metoden er, at den giver mulighed for betydelig fleksibilitet i format, udtryksvektorer, brug af billedbehandlingsudstyr og den række af videnskabelige spørgsmål, der kan løses. Desuden gør metoden det muligt at undersøge en lang række specifikke spørgsmål, der omgiver glutamat-medieret excitotoksicitet i PD, og andre modeller af nervesystemet dysfunktion. For eksempel, glutamat-medieret excitotoxicity indebærer flere receptorer og signalering kaskader5. Ved at bruge metoden, og som påvist med AMPAR-blokkeren, NBQX i figur 1, er det muligt at dissekere specifikke komponenter i excitotoksisk glutamatrespons på et fysiologisk og molekylært niveau. Man kan forestille sig, at en lignende fremgangsmåde ved hjælp af hæmmere af anden messenger-systemer kan bruges til at bestemme deres bidrag til excitotoxicity. Desuden kunne de ARO'er, der anvendes her, tilpasses til at udtrykke GECI'er med cellespecifikke promotorer eller AAV-udtrykte optogenetiske sensorer, der kan anvendes til at måle andre parametre såsom neurotransmitterudgivelse.
Bortset fra primære embryonale dissektioner og konfokal billeddannelse, meget af protokollen bruger grundlæggende laboratoriefærdigheder, der ikke kræver specialiseret uddannelse. Derfor omfatter begrænsningerne for modellen vanskeligheden ved den embryonale dissektionsteknik, hvor lang tid cellerne skal dyrkes for at modnes, og adgang til et konfokalt mikroskop eller lignende billeddannelsesapparat. De mange fordele og fleksibilitet af metoden opvejer disse begrænsninger, hvilket gør dette til en ideel model til at studere den rolle glutamat-medieret excitotoxicity i nervesystemet lidelser. Endelig, denne model kunne være et effektivt redskab til at screene nye forbindelser for anti-apoptotiske effekter og deres evne til at bevare DA neuron sundhed.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Støttet af tilskud fra American Parkinson Disease Association (APDA) og NIH R01NS115809-01 til RS. Vi takker Texas A & M Institute for Genomic Medicine (TIGM) for at give timede gravide mus til at generere primære dopaminerge kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
| 10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
| 20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
| 35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
| 40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
| Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
| B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
| Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
| Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
| Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
| Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
| Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
| Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
| Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
| HEPES | VWR | 101170-478 | |
| HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
| ImageJ v1.52e | NIH | ||
| IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
| Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
| L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
| NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
| Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
| Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
| Origin 2020 | OriginLab | ||
| pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
| Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
| Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
| Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
| Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |
References
- Marras, C., et al. Prevalence of Parkinson's disease across North America. NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).
- Poewe, W., et al.
- Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders. European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).
- Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).
- Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
- Vieira, M., et al. Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation. Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).
- Sebe, J. Y., et al. Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse. Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).
- Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism. Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henley, B. M., et al. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).
- Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors. Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).
- Lavaur, J., et al. The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).
- Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).
- Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons. Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).
- Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).
- Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).
