Summary
Her presenterer vi en protokoll for å måle in vitro Ca2 + fluxes i midbrain nevroner og deres nedstrøms effekter på caspase-3 ved hjelp av primær mus midbrain kulturer. Denne modellen kan brukes til å studere patofysiologiske endringer knyttet til unormal Ca2 + aktivitet i midbrain nevroner, og for å screene nye terapeutiske midler for anti-apoptotiske egenskaper.
Abstract
Parkinsons sykdom (PD) er en ødeleggende nevrodegenerativ lidelse forårsaket av degenerasjon av dopaminerge (DA) nevroner. Overdreven Ca2 + tilstrømning på grunn av unormal aktivering av glutamatreseptorer resulterer i DA excitotoxicity og har blitt identifisert som en viktig mekanisme for DA neuron tap. I denne studien isolerer vi, dissosierer og kultur midbrain nevroner fra musen ventral mesencephalon (VM) av ED14 mus embryoer. Vi smitter deretter de langsiktige primære musemidbrainkulturene med et adeno-assosiert virus (AAV) som uttrykker en genetisk kodet kalsiumindikator, GCaMP6f under kontroll av den menneskelige nevronspesifikke synapsinarrangøren, hSyn. Ved hjelp av live confocal imaging viser vi at kultiverte musemidbrainnevroner viser spontane Ca2 + flukser oppdaget av AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath anvendelse av glutamat til midbrain kulturer forårsaker unormale økninger i intracellulær Ca2 + i nevroner og dette er ledsaget av caspase-3 aktivering i DA nevroner, som demonstrert ved immunostaining. Teknikkene for å identifisere glutamat-mediert apoptose i primær mus DA nevroner har viktige anvendelser for høyt innhold screening av legemidler som bevarer DA neuron helse.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er den nest vanligste nevrodegenerative lidelsen over hele verden, uten kjent kur. Estimater tyder på at PD-utbredelsen vil fortsette å øke og forventes å overgå 1 million diagnoser innen år 2030 i USA alene1. Med få effektive behandlinger som for tiden er tilgjengelige for å bekjempe PD, er det et presserende behov for å utvikle mer effektive terapier. PD er preget av et raskt og progressivt tap av midbrain dopamin (DA) nevroner2. Mekanismene som ligger til grunn for nevrodegenerasjon i PD er dårlig forstått. Bevis tyder på en sannsynlig konvergens av flere mekanismer, som oksidativt stress og mitokondriedysfunksjon, etc. som bidrar til initiering av apoptotiske signalkaskader og eventueltcelledød 3.
En slik konvergent mekanisme, glutamat-mediert excitotoxicity har vært innblandet i flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert PD4. Mens glutamat-mediert excitotoxicity antas å fungere hovedsakelig gjennom stimulering av NMDA reseptorer via en overdreven økning i intracellulær Ca2 + konsentrasjon og eventuell initiering av apoptose, Ca2 +-permeable AMPA reseptorer har også vært innblandet i eksoksikoksiøs respons5,6,7. Derfor er det av interesse å bestemme bidraget fra AMPA-reseptorer til glutamat-mediert apoptose i en PD-modell. Dette kan oppnås ved hjelp av NBQX, en AMPA og kainate blokkering, som ved mikromolarkonsentrasjoner er selektiv for AMPAreseptorer 8. Glutamat-mediert excitotoxicity og apoptotiske signalkaskader er et ideelt nedstrøms mål for å måle omfanget av celledød, og et potensielt mål for terapeutisk intervensjon. Derfor, utvikle en høyinnhold metode for å vurdere glutamat-mediert modulering av kalsiumaktivitet og tilhørende nedstrøms signalering i primære ventral mesencephalic (VM) nevroner ville være verdifull for screening nye behandlingsmetoder på deres evne til å bevare nevronal helse.
Her har vi utviklet en protokoll der vi uttrykker den genetisk kodede kalsiumindikatoren (GECI), GCaMP6f, ved hjelp av AAV2/5 med den menneskelige synapsin (hSyn) promotor for å måle Ca2 + aktiviteten til mus VM primære nevroner som svar på glutamat applikasjon som kan måles på fysiologisk og molekylært nivå. Denne høyinnholdsscreeningen kan tilpasses for å oppdage legemidler eller behandlinger som modulerer Ca2 + aktivitet for å bevare helsen til VM-nevroner. Vi foreslår at denne primære kulturmodellen er en effektiv måte å screene for nye PD-intervensjoner, basert på deres evne til å bevare helsen til VM-nevroner og redusere utviklingen av PD.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer bruk av dyreforsøk har blitt godkjent av Texas A&M University Institutional Animal Care and Use Committee (25.november 2019; AUP # 2019-0346).
MERK: Tilberedning av cellekulturløsninger bør gjøres ved hjelp av steril prosedyre i et biologisk sikkerhetsskap og filtreres ved 0,2 μm for å forhindre kontaminering.
1. Utarbeidelse av løsninger og kulturmedium
- Forbered lamininbeleggopplegget ved å fortynne 20 μL à 1 mg/ml lamininlager i 2 ml steril destillert H2O. Forbered på disseksjonsdagen.
- Forbered 10% equine (hest) serum (ES) stoppløsning ved å legge til 5 ml ES til 45 ml 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS). Sterilt filter med et filtertuppe på 0,2 μm eller sprøytefilter. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered 4 % storfe serumalbumin (BSA) lagerløsning ved å tilsette 2 g BSA-pulver til 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og bringe til et endelig volum på 45 ml. Sterilt filter med et filtertuppe på 0,2 μm eller sprøytefilter. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered papain lagerløsning ved å fortynne papain til 3 mg /ml i 1x HBSS. Sterilt filter med et filtertuppe på 0,2 μm eller sprøytefilter. Oppbevares ved -20 °C.
- Forbered deoksyribonukle (DNase) oppløsning ved å tilsette 20 mg DNase pulver for å sterilisere H2O og bringe til et endelig volum på 20 ml. Sterilt filter med et filtertuppe på 0,2 μm eller sprøytefilter. Oppbevares ved -20 °C.
- Forbered askorbinsyre lager løsning ved å tilsette 352 mg askorbinsyre til sterilt destillert H2O og bringe til et endelig volum på 20 ml. Varm inn 37 °C bad for å oppløse om nødvendig. Sterilt filter med et filtertuppe på 0,2 μm eller sprøytefilter. Oppbevares ved -20 °C.
- Forbered cellekulturmedium ved å legge til følgende til 50 ml neurobasal medium: 500 μL glutamax (100x), 500 μL equine serum, 1 ml B-27, 100 μL askorbinsyre, 500 μL penicillin-streptomycin, 50 μL kanamycin og 50 μL med ampicillin. Sterilt filter ved hjelp av et 0,2 μm filtersystem. Oppbevares ved 4 °C.
- Forbered 0,01 % Triton X-100-løsning ved å legge til 1 ml Triton X-100 i 9 ml 1x PBS for å lage en 10 % løsning. Siden Triton X-100 er viskøs, skal pipetten sakte la spissen fylles helt. Varm inn 37 °C bad for å oppløse om nødvendig. Oppbevares ved 4 °C.
- For å fortynne 10% Triton X-100 lager til 0,01%, utfør 3 seriell 1:10 fortynninger. Fortynn 1 ml 10% lager i 9 ml 1x PBS for å lage 1% løsning. Fortynn 1 ml 1% oppløsning i 9 ml 1x PBS for å lage 0,1% løsning. Fortynn 1 ml 0,1% oppløsning i 9 ml 1x PBS for å lage en 0,01% løsning.
- Forbered 10% og 1% normal geit serum (NGS) løsning ved å legge til 1 ml NGS til 9 ml 1x PBS for en 10% løsning. Tilsett 100 μL NGS til 9,9 ml 1x PBS for å lage 1% løsning.
- Forbered glutamat lagerløsning (100 mM) ved å tilsette 735 mg L(+)-Glutaminsyre for å sterilisere destillert H2O og bringe til et endelig volum på 50 ml. Løselighet ved denne konsentrasjonen vil være et problem. Tilsetning av små volumer (100 μL) av 1 M saltsyre er tilstrekkelig til å øke løseligheten.
- Klargjør NBQX lagerløsning (10 mM) ved å tilsette 50 mg NBQX for å steril destillere H2O og bringe til et endelig volum på 13 ml.
2. Utarbeidelse av kulturretter og dekkslips (Ferdig dagen før disseksjon)
MERK: Vi har funnet ut at å kombinere tre beleggmidler, poly-L-lysin, poly-L-ornitin og laminin gir mulighet for ideell celleadhesjon og levedyktighet.
- Legg 10 35 mm Petri retter i et biologisk sikkerhetsskap. Legg to sirkulære 12 mm dekkslips i hver tallerken og fyll med 70% EtOH i 10 min. Bruk en vakuumlinje til å aspirere den gjenværende EtOH fra hver tallerken, slik at EtOH kan fordampe helt.
- Pipette ~90-100 μL 0,1 % poly-l-lysinoppløsning på hver dekkslips, og pass på at hele dekkslippen er dekket av poly-L-lysinoppløsningen. Dekk oppvasken med lokk og legg i en 37 °C inkubator i 1 time.
- Aspirer gjenværende poly-L-lysinoppløsning fra hver dekkslipp og skyll med steril H2O.
- Gjenta trinn 2,2 – 2,3 med 0,1 % poly-l-ornitinoppløsning.
- Gjenta trinn 2,2 – 2,3 igjen med 0,01 % lamininløsning. Plasser i en 37 °C/5 % CO2-inkubator til den er klar for celleplating neste dag.
3. Mus embryonale disseksjoner
MERK: Vi bruker mellom 4 og 6 tids brukte drektige mus per kultur. Mens mye av disseksjonsprosessen skjer utenfor et biologisk sikkerhetsskap, er det fortsatt viktig å opprettholde steril prosedyre. Rikelig bruk av 70% EtOH på overflater i nærheten av disseksjonsmikroskopet og på kirurgiske verktøy er ideelt. En maske kan også brukes under disseksjonen for å forhindre kontaminering ytterligere. I tillegg bruker vi 4 separate antibiotika i kulturmediet, så forurensning er usannsynlig. Men hvis bruk av antibiotika er problematisk, kan dette disseksjonsoppsettet flyttes inne i en steril hette. For å bevare cellelevabiliteten bør alle disseksjonsløsninger forkjøles ved 4 °C, og disseksjonene bør fullføres så raskt som mulig. Vi utfører ikke disseksjonene på is. Metoden for disseksjon av mus embryonale midbrain nevroner er identisk med tidligere beskrevne metoder9,10.
- Forbered et rom på en benk i nærheten av et disseksjonsmikroskop med en absorberende pute og spray liberalt med 70% EtOH.
- Spray to 100 x 15 mm glass Petri retter og en 50 x 10 mm glass Petriskål med 70% EtOH og la EtOH fordampe. Når den er fordampet, plasserer du 50 ml steril 1x HBSS i hver petriskål på 100 x 15 mm.
- Senk kirurgisk saks, tang og mikrotomblad i 70% EtOH i 10 min minimum for å sterilisere. Plasser instrumentene på absorberende pute for å tørke.
- Ved hjelp av CO2 etterfulgt av cervical forvridning, euthanize 2-3 måneder gamle tidsbestemt graviditet mus på embryonisk dag 14.
- Spray magen til de eutaniserte musene med 70% EtOH. Ved hjelp av tang ta tak i underlivet og åpne bukhulen ved hjelp av kirurgisk saks. Begynn å kutte i nærheten av der tangen holder magen, og gjør sidekutt på hver side til bukveggen kan brettes tilbake og livmoren er tydelig synlig.
- Ved hjelp av kirurgisk saks, kutt begge endene av livmorhornet. Fjern deretter livmoren og legg den i petriskålen med 1x HBSS.
- Ved hjelp av rett-tips tang forsiktig fjerne embryoer fra livmoren. La embryoer i HBSS gjennom hele denne prosessen. Bruk enten tang eller et mikrotomblad, raskt halshugge embryoer ved å kutte nær nakken. Å gjøre så nivå et kutt som mulig.
- Under et dissekerende mikroskop flytter du et embryohode til en tørr 50 mm petriskål og plasser på ventralsiden. Stabiliser hodet med tang ved å plassere og trenge inn i nærheten av øynene / snuten. Tang bør vinkles nedover på ~ 45 ° for å unngå å trenge inn i mesencephalon.
- Ved hjelp av tang i den annen side, fjern forsiktig det gjennomsiktige laget av hud og hodeskalle like før den fremtredende ryggen av mesencephalon. Start nær midtlinjen og fjern hud og skallen caudally til mesencephalon er fullt eksponert.
- Hold tangen vinkelrett på den eksponerte mesencephalon med ett tips mellom cortex og mesencephalon og den andre i nærheten av lillehjernen. Trykk ned og klyp tangen sammen for å fjerne hele midtinbremmen. Midbrainsegmentet skal være ca. 0,5 mm tykt. Legg midbrainsegmentet i den andre petriskålen fylt med frisk 1x HBSS. Gjenta denne prosessen for hvert embryo.
- Ved hjelp av disseksjonsmikroskopet plasserer du hjernesegmentet med ventralsiden vendt opp. Hvis meningene fortsatt er festet, fjern den forsiktig ved å gripe tak i tangene og løfte opp og bort fra hjernesegmentet.
- Hjernesegmentet skal ha 4 synlige kvadranter. Plasser segmentet på en slik måte at de to mindre kvadrantene er plassert bedre enn de to større kvadrantene. Det er en fremtredende rygg som skiller de overlegne to (små) kvadrantene fra de dårligere to (store) kvadrantene.
- Bruk tangklemmen og skill de overlegne kvadrantene fra de dårligere kvadrantene, og kast deretter de overlegne kvadrantene. De resterende dårligere kvadranter vil ha overflødig vev lateralt på dorsalsiden, dette vevet vil se mindre ugjennomsiktig ut enn det gjenværende ventrale vevet. Fjern det mindre tette dorsaltvevet og kast. Det gjenværende segmentet skal inneholde både Substantia nigra pars compacta (SNc) og ventraltegmentalområdet (VTA).
- Ved hjelp av tang kutte gjenværende ventral vev segmentet i 4 mindre stykker og ved hjelp av en 1ml bred bore pipette overføre disse segmentene i en 15 ml konisk rør med 1x HBSS. Hold det koniske røret med hjernesegmenter på is gjennom hele prosedyren.
- Gjenta denne prosessen for alle gjenværende hjernesegmenter.
4. Dissosiasjon av celler
- Enzymatisk fordøyelse av celler
- Aspirer HBSS forsiktig fra det koniske røret på 15 ml som inneholder mellomhjernesegmenter, slik at segmentene ligger nederst på røret.
- Tilsett ~ 800 μL papainoppløsning til røret og legg i en 37 ° C inkubator i 7 min. Resuspend celler ved å knipse røret og erstatte til 37 ° C inkubator i ytterligere 7 min.
- Med en bred-bore 1 ml pipette tips fjerne bare midbrain segmenter i en 1 ml aliquot av DNase. La segmentene nå bunnen av aliquot eller ca 1 min eksponering.
- Med en bredbar 1 ml pipettespiss fjerner du bare mellomhjernsegmentene i et konisk rør på 15 ml som inneholder 2 ml stoppløsning. La segmentene bosette seg på bunnen av røret og gjenta skyllingen i et ekstra konisk rør fylt med stoppløsning.
- Mekanisk triturasjon av cellefjæring
- I det andre stoppløsningsskyllerøret, ved hjelp av en bredbar 1 ml pipettespiss, pipette cellene opp og ned 10 ganger til det ikke er noen store vevssegmenter synlige. Det er viktig å unngå over triturasjon for minimal cellelys.
- Pipette 300 μL langsomt på 4 % BSA-oppløsning til bunnen av det koniske røret på 15 ml som inneholder hjernesegmenter. Fjern pipettespissen forsiktig for å opprettholde et fjæringslag. Sentrifuge ved 0,4 x g i 3 min. Deretter aspirerer du forsiktig de overnaturante og resuspendcellene i 400 μL cellekulturmedium.
5. Plating cellene
MERK: Basert på erfaring samles ca. 100 000 levedyktige celler per embryo. 2-3 måneder gamle tidsbestede gravide mus har vanligvis kullstørrelser på 8-10 embryoer; Derfor er et grovt estimat for total utbytte av celler per tidsuttalt gravid mus ca 1 million celler.
- Bruk et hemocytometer forhåndsform et celletall og deretter fortynne suspensjonen til 2000 celler / μL ved hjelp av cellekulturmedium. Triturate kort å blande.
- Fjern dekkglass med lamininoppløsning fra trinn 2 fra inkubatoren og aspirer den gjenværende lamininløsningen fra de bebelagte dekkslipsene ved hjelp av et vakuum. Plate raskt for å unngå at dekkglassene tørker helt. Pipette 100 μL (2,0 x 105 celler/dekkslips) på hver dekkslips og legg Petri-retter i en 37 °C inkubator i 1 time.
- Tilsett forsiktig 3 ml cellekulturmedium til hver tallerken og plasser tilbake i 37 °C inkubatoren. Preform halvmedium endres 2 ganger per uke i 2 uker.
6. Infeksjon av cellekultur ved 14 DIV med adeno-assosierte virale (AAV) vektorer
- For hver tallerken forberede 1 ml serumfri DMEM medium med 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 titer)
- Aspirer cellekulturmediet fra hver tallerken og erstatt med 1 ml serumfri DMEM som inneholder hSyn-GCaMP6f. Plasser rettene tilbake i 37 °C inkubatoren i 1 time.
- Aspirer serumfrie mediet som inneholder AAVer og erstatt med 3 ml cellekulturmedium. Plasser rettene tilbake i inkubatoren på 37 °C. Vi har funnet ut at 5-7 dager med AAV infeksjon gir mulighet for ideelle nivåer av GCaMP uttrykk. Fortsett å endre medium hver 2-3 dager gjennom hele denne perioden med virusinfeksjon.
7. Live confocal Ca2 + bildebehandling mellom 19-21 DIV
MERK: Som nevnt i trinn 6.3, kan bildebehandling gjøres mellom 5-7 dager etter virusinfeksjon. Dette er det ideelle vinduet for å oppnå synlig uttrykk for fluorofor på nivåer som tillater påvisning av spontan Ca2 + aktivitet.
- Utarbeidelse av opptaksbuffere
- Hvis du vil lage 1 L HEPES-opptaksbuffer, legger du til: 9.009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-glukose, 2,381 g HEPES, 2 ml sterilt destillert H2O. Bring pH til 7,4 med NaOH.2 2 Ta med til et endelig volum på 1 L.
- For å lage 200 ml 20 μM glutamatopptaksbuffer, fortynne 40 μL på 100 mM glutamat lagerløsning i 200 ml HEPES-opptaksbuffer beskrevet ovenfor.
- For å lage 200 ml 10 μM NBQX-opptaksbuffer, fortynne 200 μL på 10 mM NBQX-lagerløsning i 200 ml HEPES-opptaksbuffer.
- Konfokal bildebehandling
- Fyll en steril 35 mm petriskål med 3 ml opptaksbuffer.
- Fjern en 35 mm petriskål med infiserte kulturer fra 37 °C inkubatoren. Bruk fine spisstrang, ta forsiktig tak i kanten av en dekkslipp og overfør den raskt til petriskålen fylt med opptaksbuffer. Plasser de resterende dekkglassene i medium tilbake i 37 °C inkubatoren. Transporter fatet med opptaksbuffer til det konokale mikroskopet.
- Start bildeprogramvaren. Fortsett til neste trinn mens det initialiseres.
- Start den peristaltiske pumpen og plasser linjen i opptaksbufferen. Kalibrer hastigheten på strømmen til å være 2 ml/ min.
- Overfør den infiserte dekkslippen fra 35 mm petriskålen til opptaksbadet.
- Ved hjelp av 10x vann nedsenking mål og BF lys, finne planet av fokus og se etter en region med en høy tetthet av nevron celle legemer. Bytt til 40x vann nedsenking mål og ved hjelp av BF lys refokusere prøven.
- I vinduet "Fargestoffer liste" i FluoView velger du AlexaFluor 488 og bruker den.
- AAV-uttrykk kan være variabelt. Derfor, for å forhindre overeksponering og fotobleaching av fluoroforene, start med lave HV- og laserstrøminnstillinger. For AlexaFluor 488-kanalen setter du høyspenningen (HV) til 500, forsterkning til 1x og oppveid til 0. For 488 laserlinjen satt kraften til 5%. For å øke det effektive volumet avbildet i z-flyet, øk pinholestørrelsen til 300 μm. Bruk skannealternativet "fokus x2" til å justere utslippssignaler optimalt til undermetningsnivåer. Herfra kan innstillingene justeres til ideell synlighet for hver kanal er oppnådd.
MERK: For å nøyaktig fange opp hele spekteret av Ca2+ flukser med GCaMP, juster innstillingene for baseline HV og laserstrøm for å tillate en økning i fluorescerende intensitet uten å oversaturere detektoren. - Når mikroskopinnstillingene er optimalisert, flytter du scenen for å finne et område med flere celler som viser spontane endringer i GCaMP6f fluorescens og fokuserer på ønsket plan for avbildning.
- Bruk "Clip rect" -verktøyet til å feste bilderammen til en størrelse som kan oppnå et rammeintervall på i underkant av 1 sekund. Dette er nødvendig for å angi bildeintervallet på 1 ramme per sekund.
- Sett "Intervall"-vinduet til en verdi på 1,0 og "Num" -vinduet til 600.
MERK: For å kunne levere forskjellige opptaksbuffere på ønsket tidspunkt (300 s), er det viktig å kalibrere pumpens ventetid for å levere den nye løsningen til badekaret. Dette vil være avhengig av oppløsningsperfusjonshastigheten (2 ml/min) og lengden på linjen som brukes til å pumpe oppløsningen. - For å fange en t-serie film velg "Tid" alternativet og deretter bruke "XYt" skanning alternativet for å begynne bildebehandling.
- Se fremdriftslinjen for bildebehandling og flytt linjen fra HEPES-opptaksbufferen til 20 μM glutamatopptaksbufferen på riktig tidspunkt (f.eks. hvis pumpens ventetid kalibreres for å levere løsning på 60 s, flytt linjen inn i glutamatbufferen ved 240 bilder for å levere glutamat på 300 s).
- Når bildet er fullført, velger du Serie ferdig-knappen og lagrer den ferdige t-seriefilmen. Fortsett å perfuse 20 μM Glutamat i ytterligere 5 min, slik at de kultiverte nevronene har blitt utsatt for glutamat i totalt 10 min. Gjenta denne prosessen for hver dekkslip som skal avbildes.
- Etter ytterligere 5 min eksponering for 20 μM glutamat, fjern dekkslippen fra badekaret og plasser tilbake i 35mm Petri skål som inneholder opptaksbuffer til bildedagen er fullført. Når du er ferdig, går du videre til trinn 8.
- Ca2+ sporanalyse
- Utfør bildeanalyse i ImageJ. Installer BIO-FORMATS plugin for ImageJ, som vil tillate . OIB-bildefiler for å åpne.
- Klikk analyser | Angi Målinger, og merk av i boksen for Gjennomsnittsgrå verdi (MGV).
- I ImageJ åpner du en t-seriefilm som en hyperstakk.
- Dra glidebryteren for filmen og identifisere rammen med maksimal glutamat respons for å visualisere alle nevroner som reagerer på glutamat. Bruk polygonverktøyet til å spore alle synlige nevroncellelegemer, og legg til ROIene i "ROI manager"-listen.
- Når du er ferdig med å spore og legge til ROIer, velger du alle ROIer i ROI Manager-vinduet og bruker multimålsvalget i listen over flere alternativer. Kopier og lim inn disse dataene i et regneark. Fullfør denne prosessen for alle filmer som skal analyseres.
- For hver avkastning konverterer du de rå MGV-dataene fra hver ramme til ΔF/F0-verdier ved hjelp av ligningen: ΔF/F0 = [F(t) – F0] / F0. Hvor F(t) = MGV av en gitt ramme, og F0 = gjennomsnittlig baseline MGV på ~ 10 rammer der ingen Ca2 + flukser er til stede.
- Ved hjelp av en statistisk programvare som OriginPro 2020 kan konverterte ΔF/F0-spor gjøres om til linjegrafer. "Peak analyzer" -funksjonen kan brukes (eller lignende funksjon hvis du bruker en annen programvare) for å måle toppa amplituden av glutamat respons, ventetid for å svare på glutamat og område under kurven.
8. Immunstaining av kulturer
MERK: Etter fiksering med formalin kan dekkslepper oppbevares i 1x PBS ved 4 °C til de er klare til å behandles for immunoppnåelse. Primær og sekundær antistoff inkubasjon ble gjort på en seriell måte, som sådan inkubasjon med anti-Caspase-3 primære antistoff og dens komplementære sekundære antistoff forut for inkubasjon med anti-TH primære antistoff og dets komplementære sekundære antistoff.
- Umiddelbart etter glutamateksponering, legg dekkglasset tilbake i sin 35 mm petriskål, aspirer opptaksbufferen og tilsett 3 ml 10% formalin. La sitte i 40 min ved romtemperatur (RT).
- Skyll fatet 3 ganger med 1x PBS.
- Aspirer PBS og gjennomsyre celler i 1 ml på 0,01% Triton X-100 i PBS i 2 min.
- Skyll fatet 3 ganger med 1x PBS.
- Aspirer PBS og blokkceller i 1 ml på 10% NGS i PBS i 40 min.
- Skyll fatet 3 ganger med 1x PBS.
- Tilsett 1 μL kaninanti-caspase-3 primært antistoff til 1 ml 1 % NGS i PBS (1:1000 fortynning). Aspirer PBS fra fatet og erstatt med den primære antistoffløsningen. Plasser på en shaker og inkuber i 1,5 t ved RT.
- Skyll fatet 3 ganger med 1x PBS.
- Tilsett 1 μL geit anti-kanin AlexaFluor 488 sekundært antistoff til 1 ml 1% NGS i PBS (1:1000 fortynning). Aspirer PBS fra fatet og erstatt med den sekundære antistoffløsningen. Plasser på en shaker og inkuber i 1 time ved RT. For å beskytte prøvene mot lys.
- Skyll fatet 3 ganger med 1x PBS.
- Gjenta trinn 8.7 – 8.10, men bruk kyllinganti-TH primærantistoff (1:1000) i trinn 8.7 og geiteanti-kylling AlexaFluor 594 sekundært antistoff (1:1000) i trinn 8.9.
- Etter den endelige PBS-skyllingen plasserer du 30 μL monteringsmedium på et mikroskopsklie. Bruk tang ta en dekkslips fra 35 mm Petri skål og plassere dekkslips med cellene vendt ned i monteringsmediet. Begge dekkslips vil passe på et enkelt mikroskop lysbilde hvis plassert riktig. Plasser i et tørt, mørkt område og la monteringsmediet tørke over natten.
9. Konfokal avbildning av immunostede kulturer
- Konfokal bildebehandling
- Start bildeprogramvaren. Plasser prøven på mikroskopstadiet.
- Med mikroskop okularene, ved hjelp av en 20x forstørrelse mål og epifluorescent lys med en TRITC filter, fokusere prøven og søke etter en TH + celle kropp.
- Når du har funnet en TH + cellekropp, sentrerer du den i synsfeltet og flytter deretter til 60x forstørrelsesmål.
- Velg AlexaFluor 488 og AlexaFluor 594 fargestoffer i "fargeliste" -vinduet.
- Som med live bildebehandling, start med lav HV, gevinst, offset og laser strøminnstillinger for å hindre fotografering. Bruk skannealternativet "fokus x2" til å vurdere fluorescerende intensitet for hver kanal og justere tilsvarende. Siden disse bildene senere vil bli kvantifisert for fluorescerende intensitet, er det nødvendig å holde bildeinnstillingene konsekvente på tvers av alle synsfelt. Derfor er det best å se på noen eksempler på hver tilstand for å få en ide om rekkevidden av fluorescerende intensitet på tvers av prøver.
- Når ideelle bildeinnstillinger er bestemt, velger du alternativet "fokus x2" og flytter cellen av interesse inn i midten av synsfeltet. Øk den digitale zoomen til 3x ved hjelp av glidebryteren "zoom".
- Bruk fokusknappen til å finne fokusplanet med den lyseste fluorescensen og ta et enkelt planet XY-bilde. Lagre bildet for å fullføre.
- Bytt tilbake til 20x forstørrelsesmål for å søke etter en annen TH + celle. Gjenta denne prosessen til ønsket antall celler er samplet fra hver betingelse.
- Bildeanalyse
- Klikk analyser | Angi Målinger, og velg boksene for Område, Integrert tetthet og Gjennomsnitt grå verdi.
- Åpne et bilde som en hyperstakk med hver kanal atskilt ved å dra og slippe inn på ImageJ-verktøylinjen eller velge bildet via filmenyen.
- Bruk TH-kanalen (594 nm) til å tegne ROIer rundt cellekroppen. Bruk polygonsporingsverktøyet i ImageJ til å spore den ytre kanten av cellelegemet nøye. Der avstanden mellom cellemembranen og cellekjernen er den minste, spor en rett linje gjennom cytosolen til kanten av kjernen og følg deretter omrisset av kjernen for å utelukke den. Spor deretter en rett linje tilbake til den eksterne membranen, som grenser til den opprinnelige linjen så nært som mulig, og fortsett å følge omrisset av cellekroppen til avkastningen er fullført.
- Bruke hurtigtasten "T" eller bruke verktøylinjen menybanen Analyser | Verktøy | ROI Manager, åpne ROI manager og legge til avkastningen som nettopp ble trukket til listen.
- Velg vinduet på caspase-3-kanalen (488 nm), og velg deretter den ekstra avkastningen i "ROI Manager" -listen.
- Velg Mål-knappen i VINDUET ROI Manager. Resultatvinduet vises med målingene som er angitt tidligere. Kopier disse til et regneark, og gjenta denne prosessen for hver celle.
Representative Results
Etter første dyrking av celler, behandlet vi VM kultur retter på 14 DIV med 1 μL AAV hSyn-GCaMP6f og tillatt for 5 dager med viraluttrykk. På dagen for avbildning hepes opptak buffer ble utarbeidet frisk. Vi brukte to forhold; i en tilstand 20 μM glutamat ble påført i 10 min, mens i den andre tilstanden 5 min av 10 μM NBQX søknad forut for en 10 min co-applikasjon av 10 μM NBQX + 20 μM glutamat. Under begge forhold observerte vi heterogene og spontane endringer i GCaMP6f fluorescens, noe som indikerer spontan Ca2 + flukser, som vist i de representative sporene (Figur 1A, B, Supplerende Film 1-2). Anvendelse av 20 μM glutamat genererte en robust og vedvarende Ca2 + respons i både spontant aktive og quiescent nevroner (Figur 1A, Supplerende Movie 1). Påføring av 10 μM NBQX redusert spontan aktivitet, og delvis blokkert glutamat respons (Figur 1B, Supplerende Movie 2). I hvilken grad glutamatsøknad stimulerte en Ca2 + respons i hver tilstand ble kvantifisert ved hjelp av området under kurven, topp amplitude og ventetid for å svare. Begge områder under kurven og maksimal amplitude var like for både glutamat og NBQX + glutamat behandlede forhold (figur 1C), mens ventetiden til respons ble betydelig økt i NBQX + glutamat tilstand (figur 2A, B). I tillegg til å kvantifisere Ca2+ respons på glutamatbehandling, fikset og farget vi prøver med et anti-caspase-3 antistoff som et mål på glutamatmediert apoptose. Vi observerte en rekke caspase-3 aktivering på tvers av forholdene (Figur 3A, B). Caspase-3 aktivering ble kvantifisert ved måleområde og gjennomsnittlig caspase-3 intensitet. Sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, det gjennomsnittlige området av celler med caspase-3 aktivering under glutamat og NBQX + glutamat forhold trended mot betydning (Figur 3B). Gjennomsnittlig caspase-3 intensitet var signifikant høyere i glutamat og NBQX + glutamat forhold sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 3B). Sammen viser disse resultatene et rammeverk med høyt innhold der apoptose av nevroner kan måles ved å kvantifisere Ca2 + svar på eksoksikotiske midler og følges opp med en analyse av nedstrøms apoptotiske hendelser som caspase-3 aktivering i samme sett med kulturer.
Figur 1: Kultiverte ventrale mesencephalic nevroner viser spontan Ca2 + aktivitet og stimuleres robust av glutamat applikasjon. (A)Representative spor av spontan Ca2 + aktivitet i VM nevroner og deres respons på 20 μM Glutamat søknad. (B)Representative spor av spontan Ca2 + aktivitet i VM nevroner og deres respons på 10 μM NBQX + 20 μM Glutamat søknad. (C) Befolkningsdata som viser område under kurven og maksimal amplitude på Ca2 + spor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: AMPAR-blokade med NBQX forsinker respons på glutamatapplikasjon i kultiverte ventrale mesencephalic nevroner. (A)Representant Ca2 + spor av glutamat (grå) og NBQX + glutamat (blå) fremkalte svar. Gjennomsnittlig Ca2 + spor av glutamat (svart) og NBQX + glutamat (rød) er vist overlaid. (B)Befolkningsdata som viser ventetid til respons for glutamat og NBQX + glutamat fremkalte responser. Prosentvis endring mellom glutamat og NBQX + glutamatforhold vises i høyre panel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Glutamatapplikasjon øker caspase-3-uttrykket i tyrosinhydroksylase (TH) positive ventrale mesencephalic nevroner. (A) Representative konfokale bilder av VM kulturer immunostained for caspase-3 (grønn) og TH (rød), skala bar = 10 μm. (B) Befolkningsdata som viser DA neuron område og gjennomsnittlig grå verdi av caspase-3 uttrykk i hver tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende film 1: Spontan Ca2 + aktivitet og respons på glutamat søknad.
Spontan Ca2 + flukser i nærvær av HEPES-opptaksbuffer (0-300 s) etterfulgt av påføring av 20 μM glutamat (301-600 s). Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende film 2: Spontan Ca2+ aktivitet og respons på NBQX + glutamatapplikasjon.
Spontan Ca2 + flukser i nærvær av HEPES-opptaksbuffer (0-300 s) etterfulgt av påføring av 10 μM NBQX (301-600 s) og 10 μM NBQX + 20 μM glutamat (601-900 s). Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Vi beskriver et langsiktig primært ventral mesencephalic (VM) cellekultursystem for analyse av høyt innhold av glutamat-mediert apoptose i nevroner. Studier har brukt primære midbrain dopaminerge kulturer for å belyse eksoksiske mekanismer i sammenheng medPD-modeller 11,12. I denne studien bruker vi en kombinatorisk tilnærming ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) for å måle Ca2 + aktivitet og videre knytte denne aktiviteten til nedstrøms molekylære endringer, for eksempel initiering av apoptotiske signalkaskader4. Metoden har flere fordeler med andre lignende cellekultursystemer. Som vi har spesiell interesse for excitotoxicity i sammenheng med Parkinsons sykdom, ved hjelp av primære VM cellekulturer er ideelt. Ved å bruke ulike feltflyttingsteknikker, for eksempel gridded coverslips eller et motorisert XY-mikroskopstadium kombinert med TH-immunstaining, kan vi direkte studere celletypenspesifikke effekter av glutamatmediert apoptose i ventrale midbrainnevroner. I tillegg gjør den 3-ukers cellekulturmodellen det mulig for nevroner å utvikle sin fulle, modne molekylære profil, noe som gjenspeiler voksne DA-nevroner9. Tidligere metoder har hovedsakelig fokusert på molekylære endringer etter glutamat-mediert excitotoxicity13,14. Modellen er unik i sin evne til å korrelere akutte endringer i nevronal fysiologi med nedstrøms molekylære hendelser i identifiserte celletyper. En begrensning av den primære kulturmodellen er at disseksjonsteknikken fanger hele ventrale midbrain, inkludert DA og GABAergic nevroner samt nevroner fra SNc og VTA. Bevis tyder nå på at DA nevroner av SNc har selektiv sårbarhet for kalsium og eventuell celledød sammenlignet med DA nevroner av nabo VTA15. Dessverre har differensiering av SNc fra VTA-nevroner i embryonale kulturer vist seg vanskelig med få anatomiske landemerker for å definere disse strukturene i den embryonale hjernen.
Vi viser at den primære kulturteknikken tillater kvantifisering av heterogen spontan Ca2 + aktivitet (figur 1). Derfor er dette en ideell cellekultursystemmodell for å studere tonisk aktive celler, for eksempel pacemaking dopaminerge nevroner i midbrain, neokortikale nevroner og GABAergiske nevroner i suprachiasmatic kjernen (SCN)16,17. I de fleste applikasjoner oppnår ca2 + bildebehandling ikke samme temporal oppløsning som elektrofysiologi. Derfor er det sannsynlig at en enkelt Ca2 + hendelse er analog med et utbrudd av nevronale virkningspotensialer. Dette kan tolkes slik at Ca2 + bildebehandling gir mulighet for relativt nøyaktige målinger av unormal sprengningsaktivitet i pacemaking celler og er derfor egnet for en høyinnholdsskjerm av Ca2 +-mediert eksoksisk celledød.
For å oppnå og opprettholde spontan Ca2 + aktivitet, er det viktig å ta opp to viktige punkter i protokollen. Først er plating tettheten av cellene etter disseksjon. For primære VM nevroner, tidligere studier har brukt rundt 100.000 celler/cm29,,10. Vi har tilpasset protokollen til plate en tetthet på 200.000 celler / cm2, noe som skaper et heterogent spekter av spontan aktivitet og øker antall dopaminerge VM nevroner tilstede på hver coverlip. Siden ulike pacemaking nevroner har forskjellige avfyring egenskaper16, plating tetthet må tilpasses celletypen blir studert og optimalisert for å oppnå ideelle nivåer av spontan aktivitet. For det andre er inkubasjonstiden etter virusinfeksjon av AAVs. Som plating tetthet, dette vil være avhengig av den spesifikke konteksten av forskningsspørsmålet og type AAV som brukes. For den spesifikke AAV brukes her, 5 dager med inkubasjon etter virusinfeksjon er ideell for å oppnå ønsket protein uttrykk nivåer, som gjør det mulig for dynamiske endringer i GCaMP fluorescens for å registrere Ca2 + aktivitet. Mange faktorer bestemmer hvor raskt og effektivt en AAV vil uttrykke sin last, hvorav mye er utenfor omfanget av denne metoden, men kort er det viktig å vurdere arrangøraktivitet og hastigheten som lastproteinet modnes og bretter seg.
En annen fordel med metoden er at den gir betydelig fleksibilitet i format, uttrykksvektorer, bruk av bildeutstyr og utvalget av vitenskapelige spørsmål som kan tas opp. I tillegg gjør metoden det mulig å granske et bredt spekter av spesifikke spørsmål som omgir glutamat-mediert spenning i PD, og andre modeller av nervesystemet dysfunksjon. Glutamat-mediert eksitoksisitet innebærer for eksempel flere reseptorer og signaliserer kaskader5. Ved å bruke metoden, og som demonstrert med AMPAR-blokkeringen, NBQX i figur 1,er det mulig å dissekere ut spesifikke komponenter i den eksoksiske glutamatresponsen på fysiologisk og molekylært nivå. Tenkelig, en lignende tilnærming ved hjelp av hemmere av andre messenger systemer kan brukes til å bestemme deres bidrag til excitotoxicity. I tillegg kan AAVs som brukes her tilpasses for å uttrykke GECIer med cellespesifikke arrangører eller AAV-uttrykte optogenetiske sensorer som kan brukes til å måle andre parametere som nevrotransmitterutgivelse.
Bortsett fra primære embryonale disseksjoner og konokkal avbildning, bruker mye av protokollen grunnleggende laboratorieferdigheter som ikke krever spesialisert opplæring. Derfor inkluderer begrensningene til modellen vanskeligheten med den embryonale disseksjonsteknikken, hvor lenge cellene må dyrkes for å nå modenhet, og tilgang til et konokkalt mikroskop eller lignende bildeapparat. De mange fordelene og fleksibiliteten ved metoden oppveier disse begrensningene, noe som gjør dette til en ideell modell for å studere rollen glutamat-mediert excitotoxicity i nervesystemet lidelser. Til slutt kan denne modellen være et effektivt verktøy for å screene nye forbindelser for anti-apoptotiske effekter og deres evne til å bevare DA neuron helse.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Støttet av tilskudd fra American Parkinson Disease Association (APDA) og NIH R01NS115809-01 til RS. Vi takker Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) for å gi tidsbevisste gravide mus for å generere primære dopaminerge kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
| 10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
| 20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
| 35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
| 40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
| Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
| B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
| Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
| Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
| Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
| Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
| Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
| Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
| Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
| HEPES | VWR | 101170-478 | |
| HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
| ImageJ v1.52e | NIH | ||
| IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
| Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
| L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
| NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
| Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
| Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
| Origin 2020 | OriginLab | ||
| pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
| Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
| Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
| Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
| Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |
References
- Marras, C., et al. Prevalence of Parkinson's disease across North America. NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).
- Poewe, W., et al.
- Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders. European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).
- Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).
- Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
- Vieira, M., et al. Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation. Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).
- Sebe, J. Y., et al. Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse. Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).
- Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism. Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henley, B. M., et al. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).
- Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors. Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).
- Lavaur, J., et al. The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).
- Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).
- Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons. Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).
- Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).
- Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).
