Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מינוף טורבידיות וטרומבולסטוגרפיה לאפיון קרישי דם משלימים

Published: June 4, 2020 doi: 10.3791/61519
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Emergency Medicine Department, Indiana University School of Medicine, 2Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University

Summary

פיברין אחראי על היווצרות קריש במהלך המוסטאזיס ופקקת. אסמים סוערים וhromboelastograhy (TEG) יכול להיות מנוצל ככלים סינרגטיים המספקים הערכה משלימה של קריש דם. שתי טכניקות אלה יחד יכולות לתת תובנה נוספת כיצד תנאי קרישה משפיעים על היווצרות קריש פיברין.

Abstract

פקקת היא סיבת מוות מובילה ברחבי העולם. פיברין (אוגן) הוא החלבון האחראי בעיקר על היווצרות קריש דם או פקקת. לכן, אפיון היווצרות קריש פיברין הוא מועיל לחקר פקקת. טורבידיות וטרומבולסטוגרפיה (TEG) הן שניהם מנוצלים באופן נרחב במבחנה אסרות לניטור היווצרות קריש. Turbidity מודד באופן דינמי את העברת האור באמצעות מבנה קריש פיברין באמצעות ספקטרומטר והוא משמש לעתים קרובות במעבדות מחקר. TEG היא טכניקה ויסקולסטית מיוחדת המודדת ישירות את עוצמת קריש הדם והוא מנוצל בעיקר בהגדרות קליניות כדי להעריך את המוסטאזיס של המטופלים. בעזרת שני כלים אלה, מחקר זה מתאר שיטה לאפיון קריש דם במבחנה פיברין באמצעות מודל קרישי פיברינוגן/טרומבין פשוט. מגמות נתונים על פני שתי הטכניקות הושוו בתנאי קרישה שונים. קרישי פיברין אנושיים ובצק נוצרו זה לצד זה במחקר זה כמו גורמי קרישת בקרישת בקר משמשים לעתים קרובות כתחליף גורמי קרישה אנושיים בהגדרות קליניות ומחקר. התוצאות מוכיחות כי TEG ו- turbidity לעקוב אחר היווצרות קריש דם באמצעות שתי שיטות נפרדות וכאשר מנוצל יחד לספק כוח קריש משלים ומידע מבני סיבים על פני תנאי קרישה מגוונים.

Introduction

פקקת היא היווצרות פתולוגית של קריש דם בגוף שחוסם את זרימת הדם המובילה לתמולות ותמותה גבוהות ברחבי העולם. ישנם 1-2 מקרים של פקקת ורידים ו 2-3 מקרים של פקקת המושרה מחלות כלי דם לכל 1000אנשים מדי שנה 1,,2. מוצג כאן היא שיטה מינוף טרומבולסטוגרפיה (TEG) וטורביות כדי לפקח על היווצרות קריש תחת תנאי קרישה שונים. פיברין (אוגן) הוא החלבון העיקרי האחראי על היווצרות קריש דם בגוף. בשלבים האחרונים של מפל קרישה, פיברינופטידים הם קצוצים פיברינוגן על ידי טרומבין ייזום הפולימר של מונומרים פיברין מסיסים כמו קרישמפתחת 3,,4. כדי להבין היווצרות קריש ים בפקקת פתולוגית, יש צורך לאפיין היווצרות פיברין בנסיבות קרישה מגוונות. מספר ניטור קרישים נעשה שימוש כדי ללמוד היווצרות קריש פיברין במבחנה. זמן פרותרומבין (PT/INR) וזמן טרומבופלסטיקן חלקי פעיל (aPTT) הם שני נושאים קליניים נפוצים המודדים את השלמות של מסלול קרישה ספציפי. עם זאת, הם משתמשים בזמן כמשתנה היחיד שלא נותן שום אינדיקציה של תכונות קריש פיזי5. מיקרוסקופאלקטרונים מאפשר הדמיה של המיקרו-מבנה של קריש פיברין שנוצר לחלוטין, אך אינו מספק מידע על תהליך יצירת הקריש עצמו6. בין כל ההתבטאויות, ההתבטאות הסוערת וה-TEG מציעות את היכולת לעקוב אחר מאפייני קריש דם באופן דינמי לאורך זמן. טכניקות אלה מאפשרות מידה של פרופילי קרישה מקיפים ולכן, לספק תועלת מסוימת על פני כלים אחרים אפיון קריש פיברין.

באופן ספציפי, תקרת טורבידיות (או turbidimetry קריש) משמש נרחב עבור מחקר ויישומים קליניים בשל הטמעתו פשטנית ואת הנגישות הרחבה של ספקטרומטרים במעבדות מחקר. אסייד זה מאפשר מדידה דינמית של שידור אור באמצעות קריש דם יוצר על ידי לקיחת קריאות חוזרות בודדות באורך גל מוגדר (הנפוץ ביותר באורך גל בטווח של 350 – 700 נק')7. ניתן גם להתאים את הטמפרטורה בתא הקריאה. כמו צורות ג'ל פיברין, כמות האור שעובר דרך רשת החלבון מופחתת גורם לעלייה בספיגה לאורך זמן. באופן דומה, הספיגה פוחתת כאשר רשת הקרישים מתדרדרת. ניתן בקלות לבצע את ההכפלה של Turbidity באמצעות תבנית צלחת מרובת בארות כדי לאפשר הקרנה של מדגם תפוקה גבוהה הן ב-96 ו-384 בארות. מספר מאפייני קריש ניתן לגזור עקומת מעקב turbidity (ספיגה לאורך מדידת זמן) הכוללים: מערבולת מקסימלית, זמן למערבולת מקסימלית, זמן לתחילת קריש, וקצב היווצרות קריש (Vmax). יחס מסה/אורך סיב פיברין יכול גם להיות נגזר מנתוני מערבולת גולמית כדי להעריךעובי סיבים פיברין 8,9,10.

TEG מנוצל בעיקר בסביבה הקלינית כדי להעריך את ההמוסטזיס של המטופלים ואת הליזה קריש. הוא משמש גם ביישומים כירורגיים כדי לקבוע מתי תרופות אנטי-פיברינוליטיות או מוצרי דם המוסאטיים צריך להינתן11,,12. היווצרות קריש מתרחשת בתוך TEG עם כל רכיבי קרישת ההתווספו לספל לפני החניכה של ההסתה. הספל, עם קריש דם מתפתח, מסתובב פיזית כנגד סיכה המוכנסת למרכזה וחיישן פיתול אלקטרומכני מודד את הכוח ההולך וגדל של הקריש. אסייפ זה מתבצע בדרך כלל בטמפרטורה הפיזיולוגית של 37 °C; עם זאת, ניתן לכוונן את הטמפרטורה באופן ידני על המכשיר. משרעת מקסימלית (MA), קצב תגובה (R), זמן קינטיקה (K), α-זווית (זווית) וזמן למשרעת מקסימלית (TMA) מופקים על-ידי תוכנת TEG ממעקב TEG דינמי. ערכים אלה מושווים בדרך כלל עם טווחים נורמליים קליניים כדי להעריך את מצב קרישה של המטופל. בעוד TEG הוא לא בדיוק viscometer, כפי שהוא מודד כוח קריש ביחידות מילימטר, זה מספק נתוני קריש ויסות ופונקציות חשובות ככלי קבלת החלטות קליניות יקרות ערך עבור רופאים להחליט לנהל מוצרי דם ספציפיים ולהתאים מינוןטיפולי 13. כאשר הן TEG והן מערבולת assays מנוצלים יחד, הם מספקים מידע אפיון קריש משלים כמו כוח קריש קינטיקה מופקים בקלות מ TEG ועובי סיבים פיברין ניתן לגשת על ידי מדידות turbidity אופטי.

כמו fibrin הוא מרכיב קריטי של קריש דם, אפיון קריש פיברין בתנאים מגוונים היווצרות קריש יכול לספק תובנה חשובה כיצד משתנה מסוים תורם לתהליך היווצרות קריש ומאפייני קריש דם האולטימטיבי. הבנת זה יכול לספק הדרכה לאבחון פקקת ופיתוח של טיפולית. כדי להשיג אפיון קריש פיברין מייצג יותר, פלזמה ניתן להחליף כדי לפקח על היווצרות קריש כפי שהוא דומה בתנאי קרישת vivo יותר מקרוב מאשר מערכת מודל פיברינוגן/ טרומבין פשוטה. עם זאת, בשל האופי המורכב של מפל קרישה, היווצרות קריש באמצעות פלזמה מוסיף למורכבות, מה שהופך את זה קשה יותר לבודד את ההשפעה של גורמים בודדים. שימוש במודל פיברינוגן/טרומבין פשוט מונע את הצורך ליזום את כל מפל הקרישה המאפשר בידוד של שלב היווצרות פיברין הסופי. על ידי הכללת שני רכיבים עיקריים ליצירת פיברין (פיברינוגן ותרומבין), התקנה זו יוצרת מצב היווצרות קריש מבוקר מאוד. חשוב גם לציין כי בעוד מודל קרישי דם פשוטה משמש כאן, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לאפיין קרישי דם מורכבים יותר על ידי הכללת גורמי קרישה נוספים. במחקר זה, אפיון קריש פיברין באמצעות turbidity ו TEG מתבצעים על ידי ריכוזי פיברינוגן ותרומבין שונים, כוח יוני, pH, וריכוז חלבון כולל בתמיסת קרישה לחקות שונה בנסיבות קרישת vivo14. פרטים אודות וריאציות אלה בפרוטוקול נכללו בסעיף 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS)

הערה: PBS שימש לאורך כל מחקר זה כמו ההתארות לא דורשים תוספת של סידן. חשוב לציין כי בעת הוספת סידן, מנוצל לעתים קרובות כדי re-calcify מוצרי דם citrated, PBS יש להימנע כמו סידן ידוע לזרז במאגרי פוספט.

  1. להפוך 0.01 M, pH 7.4 PBS מאגר על ידי ערבוב 137 mM נתרן כלוריד, 1.8 mM אשלגן פוספט מונובאסי, 10 mM נתרן פוספט dibasic ו 2.7 mM אשלגן כלורי במים DI.
  2. ודא את החומציות במאגר באמצעות בדיקה של חומציות ותכוונן את ה-pH באמצעות נתרן הידרוקסיד או חומצה הידרוכלורית לפי הצורך.
  3. השתמש ב- PBS זה להכנת פיברינוגן וקרישת דם (אלא אם צוין אחרת).
    הערה: המאגר מוצע לשחזר אבקת פיברינוגן מאז התייבשות במים DI יכול לגרום משקעים פיברינוגן אפילו ב 37 °C.

2. הכנה ואחסון של חלבונים

הערה: לאורך הפרוטוקול ריכוזי מלאי החלבון מוכנים בריכוזים שונים עבור מערבולת ו TEG כדי לאפשר יחס עקבי של מלח, מי DI, PBS וגורמים שיורית אחרים בפתרונות קרישה הסופיים.

  1. הכנה ואחסון של פיברינוגן
    הערה: מזהמים בפיברינוגן זמין מסחרית כוללים כמות משמעותית של גורם XIII, כמויות שיורית של גורמי קרישה אחרים, מאגר אחסון ומלחים. בנוכחות סידן, פקטור 13 ידוע כדי לחצות את רשת קרישי הפיברין. אפקט זה תורם למבנה קריש מהודק וכוח קריש משופר המשפיע על אפיון פיברין. ניתן להשתמש ערכות פעילות זמינות מסחרית כדי לקבוע את רמות הגורם הפעיל XIIIa. כדי למזער את השונות הנגרמת על-ידי פקטור XIIIa, יש לתוועד ניסויים עם הדרת סידן או שלבים נוספים להסרת פקטור XIIIa יש לשלב בפרוטוקול זה. בנוסף, יש להעריך את מלח אחסון החלבון ואת סוג המאגר, ובמידת הצורך ניתן לבצע דיאליזה כדי לעבור למאגר עבודה מועדף.
    1. לשקול וallyquot lyophilized אבקת פיברינוגן (בקר או אדם) בצינורות 2 מ"ל ב 20 מ"ג של חלבון לכל צינור ולאחסן aliquots ב -20 ° C עד 6 חודשים.
    2. אפשר aliquot fibrinogen להסתגל RT (טמפרטורת החדר) במשך 10 דקות ביום הניסוי. Reconstitute fibrinogen על ידי הוספת 600 μL של PBS aliquot 20 דקות לפני השימוש.
    3. קח 10 μL של פיברינוגן ולדלל אותו עם 190 μL של PBS בצלחת UV שקוף 96-גם או cuvette. לקבוע ריכוז פיברינוגן על ידי לקיחת ספיגה ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרומטר מסחרי והתוכנה שלה.
    4. לחשב ריכוז פיברינוגן (מ"ג / מ"ל) באמצעות החוק של בירה. הכן 12 מ"ג/מ"ל (לתאגידות סוערות) ו-3.2 מ"ג/מ"ל (עבור TEG) פתרונות מניות פיברינוגן על ידי דילול נוסף עם PBS (אלא אם צוין אחרת).
      הערה: קביעת ריכוז פיברינוגן (מ"ג/מ"ל) על פי חוק הבירה:
      Equation 1
      מקדם הכחדה טוחנת: ɛ = 513,400 L mol-1 ס"מ-1 ב 280 נה"מ; אורך נתיב (L); גורם דילול (D); משקל מולקולרי (MW) = 340,000 Da. ɛ נגזר על ידיהכפלת E 0.1% = 1.51 (280 נה"מ) (מקדם הכחדה, שניתן על ידי הספק) עם MW.
  2. הכנה ואחסון של טרומבין
    1. Reconstitute lyophilized thrombin (בקר או אדם, 1000 U מניות) ב 200 μL של מים deionized (DI) כדי להפוך 200 μL של 5000 U /mL תרומבין פתרון מניות.
    2. הפוך 5 μL (20 U / שפופרת) aliquots של הפתרון ולשמור aliquots קפוא ב -20 °C.
    3. להפשיר את תרומבין aliquots ב RT במשך 15 דקות ביום הניסוי והפוך את פתרון העבודה thrombin על ידי דילול אותו 20 U / מ"ל עבור תקרה turbidity ו 18 U /mL עבור TEG עם מים DI (אלא אם צוין אחרת).
      הערה: יש לנקוט באמצעי זהירות כדי לשמור על פעילות אנזימים אשר ניתן לבצע על ידי שמירה על אנזימים על קרח במהלך הפשרה ושימוש; עם זאת, לא נצפתה ירידה בפעילות תרומבין כאשר נוצלה ישירות לאחר הפשרה ב- RT.

3. טורבידיות

  1. השתמש בכל ספקטרומטר זמין מסחרית בעלת טווח ספיגה של 350 - 700 ננומטר ותוכנה מתאימה כדי לפקח על מערבולת קריש לאורך זמן (ראה טבלת חומרים).
  2. הפעל את הספקטרומטר ופתח את תוכנת הניתוח המתאימה.
  3. בחר לוח 1 ופתח את כרטיסיית הגדרות לוח. לחץ על מצב ABS ועל קינטי כדי לפקח על קריאת ספיגה דינמית לאורך זמן.
  4. בחר 550 דפים לשעה (או כל ערך בטווח של 350 - 700 נה"מ) בכרטיסיה אורך הגל והתאם את זמן הריצה הכולל ל- 60 דקות עם מרווח של 30 שניות בכרטיסיה תזמון. בחר בארות מעניינות לקריאה על-ידי הדגשת בארות. התאם הגדרות אחרות במידת הצורך.
    הערה: בחירת אורך גל בקצה התחתון של הטווח (כ- 350 ננומטר) מביאה לרגישות טובה יותר, אך הספיגה עשויה גם לחרוג ממגבלת הזיהוי של הספקטרומטר. אורך הגל הנפוץ ביותר למדידת מערבולת הוא 405 נה"מ בספרות; עם זאת, פרוטוקול זה משתמש ב- 550 nm כדי להבטיח שערכי הערר הדינאמיים יהיה במסגרת מגבלת הזיהוי עבור כל הניסויים. מרווח הקריאה שנבחר צריך להיות קצר ככל האפשר כדי להשיג את הרמה הגבוהה ביותר של רגישות ל- assay. זה יהיה תלוי ספקטרומטר ומספר בארות לקרוא במהלך הודעה נתונה.
  5. קח צלחת UV שקופה 96-באר. פיפט 140 μL PBS בבאר שנבחרה לקריאה. להוסיף ולערבב 10 μL של טרומבין (20 U /mL) בבאר.
    הערה: אין להשתמש לוחות כריכה גבוהה כדי למזער כריכת חלבון לא ספציפית אל פני הבאר. זה יכול להשפיע על פיזור חלבון בפתרון וכתוצאה מכך השתנות גבוהה.
  6. ליזום קרישה באופן מיידי על ידי הוספת 50 μL של פיברינוגן (12 מ"ג / מ"ל) בבאר כדי להשיג 200 μL קרישה פתרון עם ריכוז סופי של 3 מ"ג / מ"ל פיברינוגן ו 1 U /mL תרומבין. לערבב את התוכן בבאר על ידי pipetting למעלה ומטה חמש פעמים טיפול כדי למנוע את יצירת בועות בפתרון כפי שהם ישפיעו על ספיגה על ידי פיזור אור.
    הערה: השתמש בפיפטה רב-ערוצית בעת הפעלת דגימות קרישי דם מרובות באותה צלחת בו-זמנית. הקלט הבדלי זמן בין בארות ואת פרק הזמן לפני הקריאה הראשונה על-ידי המכשיר כדי לקזז את זמני הקרישה.
  7. מקם את צלחת 96 באר במחזיק ולחץ על התחל בתוכנה כדי להתחיל קריאה סוערת ב RT.
    הערה: אם ביצוע ההסכם בטמפרטורה גבוהה אז ספקטרומטר, צלחת, ריגנטים יש לשמור על כל בטמפרטורה הרצויה לפני חניכת קריש.
  8. לאחר השלמת, לאחזר את נתוני turbidity ולקבל עקומת מעקב turbidity על ידי התוויית שינוי ספיגה לאורך זמן בתוכנה מתווה.
  9. להפיק TurbMax (מערבולת מקסימלית המעידה על עובי סיב פיברין וצפיפות רשת fibrin) על ידי לקיחת ערך הספיגה המרבי של העקומה לאורך זמן.
    הערה: ניתן לחשב יחס מסה/אורך של סיב פיברין מתוך ערכי טורביות באמצעות המשוואה המסופקת בכתב היד הבא8.
  10. חשב 90% מערבולת מקסימלית על ידי הכפלת טורב מקס ב-90%.Max להפיק זמן Turbעל ידי זמן מחשוב מחניכת קריש ל 90% מערבולת מקסימלית.
    הערה: הזמן ל-90% מערבולת מקסימלית הוא מדד אמין יותר מהזמן למערבולת מקסימלית מוחלטת כפי שהוא מייצג טוב יותר את זמן קריש הדם על ידי ביטול תקופת היווצרות קריש הדם הסופי משתנה מאוד. פרמטרי קרישה נוספים כגון זמן תחילת קריש דם (זמן מתחילת הבדיקה עד כאשר הספיגה מתחילה לגדול), וקצב היווצרות קריש (Vmax, המדרון הגדול ביותר של האזור הליניארי בעקומת המעקב turbidity) ניתן לחלץ גם מן המעקבים turbidity.

4. טרמבולסטוגרפיה (TEG)

  1. הפעל את מנתח הטרמבולסטוגרף והמתן שהטמפרטורה תתייצב ב-37°C.
  2. פתח TEG - תוכנה. לאחר שאתה מחובר, צור שם ניסוי תחת המקטע מזהה.
  3. ערוך בדיקה אלקטרונית עבור כל הערוצים על-ידי ביצוע ההנחיות של התוכנה שעל המסך. הזמן את הידית בחזרה למיקום העומס לאחר השלמת כל הבדיקות.
    הערה: נדרשת בדיקת TEG אלקטרונית ויש לבצעה בכל פעם בעת השימוש במכשיר. בדיקות בקרת קרישה TEG (באמצעות TEG רמה 1 ופקדים ברמה 2) נדרשים ביצרן הרגיל הציע מרווחי זמן כאשר מנוצל עבור דגימות קליניות.
  4. לחץ על הכרטיסיה TEG, קלט מידע לדוגמה עבור ערוצים בהם יייעשה שימוש. מקם TEG לא מרשימה ברורה בערוץ המתאים שלה. החלק את המוביל למעלה ולחץ על הספל התחתון 5 פעמים כדי להצמיד את הסיכה למוט הפיתול. מנמיך את המוביל ולחץ את הספל כלפי מטה לתוך בסיס המוביל עד שהוא "לוחץ".
  5. פיפטה 20 μL של תמיסת טרומבין (18 U/mL) לתוך TEG. ליזום קרישה באופן מיידי על ידי הוספת 340 μL של פיברינוגן (3.2 מג / מל) לתוך TEG כדי להשיג תמיסת קרישה μL 360 עם ריכוז סופי של 3 מג /מל פיברינוגן ו 1 U /mL thrombin ב. מערבבים את התוכן על-ידי התפתלות למעלה ומטה חמש פעמים.
    הערה: גורמי קרישה פוטנציאליים או רכיבים אחרים של עניין יש להוסיף במהלך שלב זה להיות זהיר תמיד לשמור על נפח סופי של 360 μL ב גביע TEG.
  6. החלק את המוביל הטעון של הספל למעלה, הזז את הידית למיקום הקריאה ולחץ על התחל בתוכנה כדי ליזום את קריאת ה- TEG.
  7. לאחר השלמת TEG (לאחר כשעה), לאחזר פרמטרים TEG ולקבל עקומת מעקב TEG על-ידי התוויית משרעת לאורך זמן בתוכנה מתווה.
  8. לאסוף MA כמו TEGמקס (משרעת מקסימלית מעידה על כוח קריש דם) וTMA כמו זמן TEG (זמן למשרעת מקסימלית) מהתוכנה.
    הערה: MA מחושב על-ידי התוכנה כמשרעת המרבית בזמן שבו למשרעת יש פחות מ-5% סטייה על פני פרק זמן של 3 דקות. TMA נקבע כזמן מקצב יצירת תרומבוס המרבי (ליד נקודת הפיצול) ל-MA. פרמטרים אחרים עשויים גם להיות שימושיים כדי להעריך בעת ביצוע ניתוח קרישי דם. כמה דוגמאות לפרמטרים אלה כוללות: R-time (הזמן מתחילת הבדיקה ועד למשרעת מגיעה ל-2 מ"מ), K (הזמן מסוף R ועד למשרעת מגיעה ל-20 מ"מ), אלפא (מדרון הקו בין R ל-K) ו-CLT (זמן קריש דם).

5. אפיון פיברין בתנאי קרישה שונים

הערה: לבצע ניסויי אפיון פיברין על ידי לווסת משתנה מסוים בפתרונות קרישה כגון: ריכוזי פיברינוגן וטרומבין, כוח יוני, pH, וריכוזי חלבון הכולל. הכנות ניסיוניות עם משתני דוגמה אלה מתוארות בסעיף זה; עם זאת, גורמי קרישה אחרים ותנאי עניין יכולים להיות מוחלף גם כן. בחר בקפידה מערכת חיץ מתאימה תוך התחשבות בכל דרישות מאפיין ייחודיות. עבור הסתערות ו- TEG, כלול בקרה במאגר רק כדי להבטיח חיסור רקע מדויק בעת ניתוח ההשפעה של משתנים אלה.

  1. ריכוז פיברינוגן משתנה (1, 2, 3, 4, 5 מ"ג/מ"ל)
    1. כוונון שלב 2.1.4 כדי להכין את מלאי פיברינוגן בריכוזים שונים (4, 8, 12, 16, 20 מ"ג/מ"ל לתאגידות סוערות ו-1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 מ"ג/מ"ל עבור TEG).
    2. להתאים את שלב 3.6 כדי "להוסיף 50 μL fibrinogen (4, 8, 12, 16, 20 מ"ג / מ"ל) לתוך בארות מרובות של 96 צלחת היטב" עבור בדיקות turbidity.
    3. כוונון שלב 4.5 כדי "להוסיף 340 μL fibrinogen (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 מ"ג / מ"ל) לתוך כוסות TEG ברור" עבור TEG.
  2. ריכוז טרומבין משתנה (0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1, 2.5, 5, 10 U/mL)
    1. התאמת שלב 2.2.3 כדי להכין את מלאי טרומבין בריכוזים שונים (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL עבור תסדירות סוערות ו- 1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL עבור TEG).
    2. להתאים את שלב 3.5 כדי "להוסיף 10 μL thrombin (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U /mL) לתוך בארות מרובות של 96 צלחת היטב" עבור בדיקות turbidity.
    3. כוונון שלב 4.5 ל"פיפטה 20 μL thrombin (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL) לתוך כוסות TEG ברורות" עבור TEG.
  3. עוצמה יונית משתנה (0.05, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17 ו- 0.3 M)
    1. להמיס נתרן כלורי (21, 101, 111, 121, 131, 141 ו- 271 מ') יחד עם אשלגן כלורי 1.8 מ"מ פוספט מונובאסי, 10 mM נתרן פוספט דיבאסיק ו 2.7 mM אשלגן כלורי במים DI כדי להפוך 0.01 M PBS פתרונות עם חוזקות ionic שונות.
    2. כוונן את שלב 1.3 לשימוש PBS עשה ביתרונות יוניים שונים כדי להכין פיברינוגן ופתרונות קרישה הן עבור מערבולת ו- TEG.
  4. pH משתנה (5.8, 6.6, 7.3, 7.4, 7.5 ו- 8.0)
    1. להמיס נתרן פוספט דיבאסיק (0.7, 3.2, 7.7, 8.1, 8.4, 9.5 מ') ואשלגן פוספט מונובאסי (8.2, 6.0, 2.0, 1.7, 1.4, 0.5 מ') יחד עם אשלגן כלורי ונתרן כלורי (153, 147, 138, 137, 136, 134 מ') כדי ליצור פתרונות PBS 0.01 M עם pH משתנה וכוח יוני סופי ב 0.165 M.
    2. אמת ערך pH של מאגר באמצעות בדיקה pH והתאם את ה-pH במידת הצורך.
    3. כוונן את שלב 1.3 לשימוש PBS שנעשו ב pH שונה כדי להכין פיברינוגן ופתרון קרישה עבור גם turbidity ו- TEG assays.
  5. ריכוז אלבומין משתנה (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 מ"ג/מ"ל)
    1. להמיס 2 גרם של אלבומין lyophilized ב 500 μL של PBS ב RT במשך 20 דקות ביום הניסוי.
    2. לקבוע ריכוז אלבומין באמצעות אותו הליך המוזכר בשלב 2.1.3 ו 2.1.4 עם מקדם הכחדה טוחנת של 43,800 L mol(1 ס"מ-1 (ב 280 נה"מ) עבור אלבומין.
    3. הכן מלאי אלבומין בריכוזים שונים.
    4. להתאים את שלב 3.5 "פיפטה 40 μL PBS בבאר שנבחרה לקריאה ולהוסיף 10 μL thrombin (20 U / מ"ל)". להתאים את שלב 3.6 "ליזום קרישה באופן מיידי על ידי הוספת 50 μL fibrinogen (12 מ"ג / מ"ל) עם 100 μL אלבומין (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 מ"ג/מ"ל) לתוך בארות מרובות לריכוז סופי של 3 מ"ג/מ"ל פיברינוגן, 1 U/mL תרומבין ו 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 מ"ג / מ"ל אלבומין בארות."
    5. כוונון שלב 4.5 ל"ליזום קרישה באופן מיידי על ידי הוספת תערובת של 200 μL אלבומין (36, 72, 90, 108, 144, 180 מ"ג/מ"ל) ו 140 μL 7.7 מ"ג/מ"ל פיברינוגן לתוך כוסות TEG כדי להשיג פתרון קרישה 360 μL עם ריכוז סופי של 3 מ"ג/מ"ל פיברינוגן, 1 U/mL thrombin ו 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 מ"ג/מ"ל אלבומין ב כוסות TEG."

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הניסויים המוצגים באיור 1 הם עקומות מעקב טורבינות מייצגות של קרישי פיברין אנושיים ושורים ברמות פיברינוגן שונות. נציג TEG עקומות מעקב עבור היווצרות קריש פיברין ברמות פיברינוגן שונות מוצגים איור 2. שתי עקומות המעקב מוכיחות כי לאחר תקופת השהיה לאחר חניכת קריש דם, התכווצות קריש דם או משרעת קריש עולה לאורך זמן ורמות את בסוף היווצרות קריש. ערך נקודת קצה של היווצרות קריש מרבי והזמן להיווצרות קריש מרבי מכל דרך משמשים להערכת התכונות של קריש דם שנוצר לחלוטין ואת תהליך הקרישה הכולל. תבורה מקסימלית (TurbMax)והזמן לטורליות מקסימלית (זמןטורב)הם שני הפרמטרים הנגזרים מטורליות בעוד משרעת מקסימלית (TEGMax)והזמן למשרעת מקסימלית (זמןTEG)נגזרים מ-TEG.

בנוסף, TurbMax הוא מדד אופטי של מבנה קריש אשר מעיד על עובי סיבים פיברין וצפיפות רשת פיברין. TEGMax הוא אמצעי מכני המשקף כוח קריש דם מוחלט. הם מייצגים היבטים שונים של קריש דם שיכול להשתנות ללא תלות זה בזה בהתבסס על הממצאים הקודמים שלנו14. יחד, שני הערכים מספקים תובנה משלימה על מיקרו-מבנים קריש, כגון כמה צפוף הסיבים ארוזים ברשת פיברין. כדי לראות במפורש כיצד אפנון משתנה קרישה משפיע על התוצאות, הנתונים אורגנו עוד יותר והוצגו באמצעות מתווה מגמה. דוגמאות מייצגות הן למגמות של נתוני ה-TEG והן של מגמות TEG מוצגות באיון 3. ברמה גבוהה יותר של פיברינוגן בתמיסת הקרישה, כל ארבעת הערכים (TurbMax, TEGMax, TurbTime ו-TEGTime)גדלים. מתוצאות אלה, ניתן לפרש כי רמת פתת פיברינוגן גבוהה יותר גורמת לרשת סיבית צפופה יותר המגבילה שידור אור דרך קריש הדם (טורב מקסגדול יותר). רשת מהודרת זו גם משפרת את עוצמת הקריש (TEGMax גדול יותר). ההאריך של זמןטורב וזמןTEG מצביע על כך פולימר פיברין הוא מעוכב ברמות פיברינוגן מוגברת. המגמות של TurbMax ו- TEGMax עבור משתנים שנבדקו על ידי הקבוצה שלנו ופרשנויותיהם מוצגות בטבלה 1.

Figure 1
איור 1: דוגמאות מייצגות לעקומת המעקב של קריש דם (0 עד 30 דקות). מעקבים טורבידיים של שור (A) ואדם (ב) היווצרות פיברין לאורך זמן בריכוזי פיברינוגן שונים (1, 2, 3, 4, 5 מ"ג/מ"ל) עם 1 מינים U/mL תואמים תרומבין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: דוגמאות מייצגות של עקומת מעקב TEG (0 עד 30 דקות). משרעת TEG מעקבים של שורים (A) ואדם (B) היווצרות פיברין לאורך זמן בריכוזי פיברינוגן שונים (1, 2, 3, 4, 5 מ"ג / מ"ל) עם 1 מינים U /mL תואמים תרומבין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: דוגמאות מייצגות למגמות נתונים סוערות ו-TEG. מגמות נתונים של TurbMax ו Turbזמן (A) ומגמות של TEGמקס ו TEGזמן (B) עבור ריכוזי פיברינוגן שונים של פר או אנושי (1, 2, 3, 4, 5 מ"ג/ מ"ל) עם 1U / מ"ל מינים תואמים טרומבין. כל נקודות הנתונים ומ קווי השגיאה הם ממוצעים וסטיות תקן של עותקים (Turbidity) וכפילויות (TEG). נתון זה נעשה בוהן נעשה בוהן נעשה בוהן נעשה בוהן נעשה בוהן נעשה בוהןדרך 14. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

משתנים ומשתנים תוצאות מגמה פרשנויות ופרשנויות
רמת פיברינוגן מוגברת טורב מקסמוגבר ו-TEG Max היווצרות סיבים סיביים הדוקים יותר וברשת סיבית צפופה יותר
רמת טרום-rombin מוגברת, pH וכוח יוני ירידה טורבמקס, גדל TEGמקס היווצרות סיבים פיברין דקים והדוקים יותר
רמת אלבומין מוגברת גדל טורבמקס, ירידה TEGמקסימום היווצרות סיבים סיבים סיבים סיבים עבים ומשוחררים יותר

טבלה 1: תוצאות ופרשנויות של TurbMax ו- TEGMax.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מדגים את הניצול של שני כלים ייחודיים לאפיון קרישי דם בדיקת מודל קרישי פיברינוגן/טרומבין פשוט באמצעות רכיבים זמינים מסחרית. גם TEG וגם אסות טורביות קלות להתנהלות. הם לא רק מספקים בדיקות קריש קצה כגון היווצרות קריש מרבי (TurbTime Max ו TEGMax)וזמן היווצרות קריש דם (זמן טורב וזמןTEG)אלא גם להעריך את תהליך יצירת קריש הדינמי. זה הופך את TEG וturbidity כלים בעלי ערך לאפיון קריש להוסיף לשיטות חלופיות כגון: SEM, PT, aPTT, או rheology קריש, אשר יכול להיות הליכים ניסיוניים מסובכים או להתמקד רק בבדיקה של היבט קריש יחיד. תוצאות Turbidity ו-TEG יחד מציעות גם פרופיל שלם יותר של האופן שבו משתנה קרישה משפיע על מאפייני הקריש.

בנוסף למשתני הקרישה המפורטים בפרוטוקול זה, ישנם משתנים רבים אחרים שניתן ללמוד מינוף טכניקות אלה. פרוטוקול זה ניתן לשנות על ידי התאמת: טמפרטורה, רמות סידן, רמות גורם קרישה, תוספת של מפעילי קריש דם או מעכבים, או תוספת של סוכני תרופות, אם לשמוח כמה. משתנים אלה יכולים להיחקר באופן פוטנציאלי באמצעות מערכת מודל פיברינוגן/תרומבין פשוטה או באמצעות פלזמה. לימוד גורמי קרישה דורש התחשבות קפדנית והתקנה להיות בטוח לספק הפעלה נכונה במעלה הזרם קרישה ייזום מסלול קרישה. Turbidity ו TEG הם גם כלים יעילים המשמשים לניטור עיכול קריש. הפרוטוקול ניתן לשנות כדי לאפיין היווצרות קריש פיברין lysis בנוכחות נוגדי קרישה או חומרים טרומוליטיים. חשוב לציין כי יש להוסיף את הסוכן הטיפולי לפני חניכת הקריש בעת שימוש ב-TEG כאשר מערכת הקרישה סגורה באופן פונקציונלי כאשר המכשיר פועל עם הסיכה היושבת בספל ה-TEG. עם זאת אמר, TEG אינו יכול לשמש כדי לבדוק את הפרופיל הטיפולי של סוכן טרוממבוליטי בקריש דם קיים.

בפרוטוקול זה, שני ההתניות נערכו בתנאים הניסיוניים הנפוצים שלהם. TEG מבוצע בדרך כלל ב 37 ° C וsaysays turbidity מתבצעים בטמפרטורת החדר (RT). הדגש של שיטת אפיון זו הוא לקבוע ולפרש את תוצאות המגמה שיש למשתנה מסוים על קרישת. חשוב לציין, שליטה בטמפרטורה ניצול TEG הוא פשוט כמו reagents הם pipetted ישירות לתוך TEG מבוקר טמפרטורה. בקרת טמפרטורה בהסתה סוערת היא פחות פשוטה כמו קרישת מחדשגנטים מעורבבים ויזם בצלחת היטב לפני ממוקם בתוך ספקטרומטר מחומם. הקצב שבו צלחת ותמיסת קרישה חם בתוך התא הוא איטי יחסית לקצב היווצרות קריש ושמירה על כל reagents ואת הצלחת בטמפרטורה גבוהה לפני כניסת לתוך התא מחומם יכול להיות קשה ולעתים קרובות התוצאה של שכפול assay עני. שמירה על טמפרטורה קבועה מלבד טמפרטורת החדר עבור אסמים סוערים היא מסובכת עוד יותר כאשר multiplexing על פני בארות רבות. צעד קריטי נוסף כדי להבטיח תוצאה אמינה ושחזור של מערבולת הוא ערבוב הבאר כדי ליזום קרישה. כמו מחשוף תרומבין-פיברינוגן ישיר הוא מהיר, ערבוב הבאר לפני חניכה קריש יכול לעקוף היווצרות פיברין לא אחיד.

פרוטוקול זה יכול גם להיות שונה בקלות כדי לאפיין קריש שנוצר על ידי דגימות קליניות כגון פלזמה עשירה טסיות דם או פלזמה טסיות דם עניים. בדיקות דם ציטוט מומלצות כפי שהם אומתו בעבר על ידי פרוטוקולי TEG סטנדרטיים. ניתן להפריד פלזמה עשירה בטסיות דם ופלסמה דלה בטסיות דם מדם שלם באמצעות צנטריפוגציה ב-200 ויותר מ-2,000 x g למשך 15 דקות ב-RT, בהתאמה. במערבולת או TEG, קרישי דם ניתן ליזום עם תוספת של עודף סידן כלורי (11 mM). עם זאת, מאז פוספט יכול להיקשר לסידן וכתוצאה מכך משקעים, PBS יש להימנע כאשר סידן משמש כיוזם קריש. בעת לימוד היווצרות קריש פלזמה עשיר טסיות דם, חשוב לשקול את ההתיישבות טסיות דם כמו חידה משמעותית בעת הפעלת היווצרות קריש ים בתנאים שבהם היווצרות קריש הוא איטי. בעיות לגבי יישוב טסיות דם הן פחות השפעה כאשר היווצרות קריש הוא מהיר. הדבר חשוב במיוחד לתסיסה, כאשר הדיוק והרבייה מסתמכים במידה רבה על ההומוגניות של הריאגנטים בבאר. אם תכנון ניסיוני מאפשר, קאולין (לעתים קרובות מנוצל כיוזם קריש עבור TEG) או מפעילי חלקיקים טעונים שלילית אחרים יכול לשמש כדי להאיץ את חניכת קריש פלזמה על ידי מתן שטח פנים נוסף להפעלת מסלול מגע מהיר יותר של מפל קרישה. חשוב לציין, השעיות מפעיל צריך להיות מעורבב ביסודיות עם פתרונות קרישה כדי למנוע יישוב. בעת שימוש משטח או מפעיל קריש מבוסס חלקיקים טעון להבטיח כי פקדי הרקע הדרושים נלקחים בחשבון כמו reagents עצמם עשויים לתרום לספיגה בsaysays turbidity. בנוסף, יישוב עשוי להיות בעיה עם תוספים מבוססי חלקיקים גדולים יותר כגון קאולין.

דגימות דם שלמות יש לעבד בזהירות כאשר שוקלים את השימוש בsaysays turbidity מאז תאי דם אדומים לתרום באופן משמעותי לספיגה באורכי גל סוערים סטנדרטיים. מסיבה זו, המדידה של דם שלם באמצעות turbidity לעתים קרובות עולה על מגבלת הזיהוי של רוב ספקטרומטרים והוא בדרך כלל לא אפשרי. שיטות חלופיות לאפיון דם שלם עשוי להיות נחוץ או דילול לפני הפעלת אסמים סוערים על דגימות דם המכילות תאי דם אדומים אפשרי גם. TEG וturbidity, כאשר נעשה שימוש יחד, לספק היווצרות קרישי דם מקיפה אפיון עיכול על ידי שילוב מדידות נפרדות עבור כוח קריש דם מורפולוגיה סיבים פיברין / רשת עבור שניהם מבוקרים מאוד מינימאלית קרישת חלבון דגימות פלזמה קלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אף לא אחד .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate Corning 3635 Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Albumin from human serum Millipore Sigma A1653 ≥96%, lyophilized powder
Arium Mini Plus Ultrapure Water System Sartorius NA DI water source
Bovine serum albumin Millipore Sigma A2153 ≥96%, lyophilized powder
Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) Haemonetics REF 6211
Fibrinogen, Bovine Plasma Millipore Sigma 341573 contains more than 95% clottable protein
Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma Millipore Sigma 341578 Contains ≥ 95% clottable proteins.
Phosphate buffered saline Millipore Sigma P3813 Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Potassium chloride Millipore Sigma 60130 ≥99.5% purity
Potassium phosphate monobasic Millipore Sigma P9791 ≥98% purity
SevenEasy pH Meter Mettler Toledo S20
Sodium chloride Millipore Sigma 71378 ≥99.5% purity
Sodium phosphate dibasic Millipore Sigma 71636 ≥99.5% purity
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system Molecular Devices M5
TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system Haemonetics 07-022
Thrombin, Bovine Millipore Sigma 605157
Thrombin, Human Plasma, High Activity Millipore Sigma 605195

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
  2. Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
  3. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
  4. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
  5. Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
  6. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural origins of fibrin clot rheology. Biophysical Journal. 77 (5), 2813-2826 (1999).
  7. Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
  8. Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
  9. Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
  10. Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
  11. da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
  12. Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
  13. Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
  14. Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).

Tags

רפואה גיליון 160 טרוממבולסטוגרפיה טורבידיות פקקת פיברין קלוט כוח קריש מערבולת קריש
מינוף טורבידיות וטרומבולסטוגרפיה לאפיון קרישי דם משלימים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., … More

Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Leveraging Turbidity and Thromboelastography for Complementary Clot Characterization. J. Vis. Exp. (160), e61519, doi:10.3791/61519 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter