Summary
Fibrin is verantwoordelijk voor stolselvorming tijdens hemostase en trombose. Troebelheidstesten en tromboelastograhy (TEG) kunnen worden gebruikt als synergetische instrumenten die complementaire beoordeling van een stolsel bieden. Deze twee technieken samen kunnen meer inzicht geven in hoe stollingscondities de vorming van fibrinstolsel beïnvloeden.
Abstract
Trombose is wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak. Fibrin(ogen) is het eiwit dat primair verantwoordelijk is voor stolselvorming of trombose. Daarom is het karakteriseren van fibrinestolselvorming gunstig voor de studie van trombose. Troebelheid en trombo-lastografie (TEG) worden beide op grote schaal gebruikt in vitro tests voor het monitoren van stolselvorming. Troebelheid meet dynamisch de lichtdoorlatendheid via een fibrinstolselstructuur via een spectrometer en wordt vaak gebruikt in onderzoekslaboratoria. TEG is een gespecialiseerde visco-elastische techniek die direct de sterkte van de bloedstolsel meet en voornamelijk wordt gebruikt in klinische omgevingen om de hemostase van patiënten te beoordelen. Met behulp van deze twee instrumenten beschrijft deze studie een methode voor het karakteriseren van een in vitro fibrin stolsel met behulp van een vereenvoudigd fibrinogen/trombinstoletmodel. Gegevenstrends in beide technieken werden onder verschillende stollingsomstandigheden vergeleken. Menselijke en runderfibrinstols werden in deze studie naast elkaar gevormd, omdat boviene stollingsfactoren vaak worden gebruikt als vervanging van menselijke stollingsfactoren in klinische en onderzoeksomgevingen. De resultaten tonen aan dat TEG en troebelheid stolselvorming volgen via twee verschillende methoden en wanneer ze samen worden gebruikt complementaire stollingssterkte en vezel structurele informatie bieden over diverse stollingsomstandigheden.
Introduction
Trombose is de pathologische vorming van een bloedstolsel in het lichaam dat de bloedcirculatie blokkeert, wat wereldwijd leidt tot hoge morbiditeit en mortaliteit. Er zijn 1 tot 2 gevallen van veneuze trombo-embolie en 2 tot 3 gevallen van trombose-geïnduceerde vasculaire ziekten per 1000 mensen per jaar1,2. Hier gepresenteerd is een methode gebruik te maken van trombo-lastografie (TEG) en troebelheid om stolselvorming te controleren onder verschillende stollingsomstandigheden. Fibrin(ogen) is het primaire eiwit dat verantwoordelijk is voor stolselvorming in het lichaam. In de laatste stappen van de stollingscasclaat worden fibrinopeptiden uit fibrinogen gespleten door trombine die de polymerisatie van onoplosbare fibrinemonmeren initieert terwijl het stolselzich ontwikkelt 3,4. Om stolselvorming in pathologische trombose te begrijpen, is het noodzakelijk om fibrinevorming te karakteriseren onder diverse stollingsomstandigheden. Meerdere stolsel monitoring testen zijn gebruikt om fibrin stolsel vorming in vitro studie. Prothrombin tijd (PT / INR) en geactiveerde gedeeltelijke tromboplastine tijd (aPTT) zijn twee veel voorkomende klinische tests die de integriteit van een specifieke stollingsroute te meten. Ze gebruiken echter tijd als de enige variabele die geen indicatie geeft van fysieke stolseleigenschappen5. Elektronenmicroscopie maakt visualisatie van de microstructuur van een volledig gevormd fibrinstolsel mogelijk, maar geeft geen informatie over het stolselvormingsproces zelf6. Onder alle testen, troebelheid testen en TEG bieden de mogelijkheid om stolsel kenmerken dynamisch te volgen in de tijd. Deze technieken maken het mogelijk om uitgebreide stollingsprofielen te meten en bieden daarom enig voordeel ten opzichte van andere fibrine stolselkarakteriseringstools.
Specifiek, troebelheid testen (of stolsel troebeleimetrie) wordt op grote schaal gebruikt voor onderzoek en klinische toepassingen als gevolg van de simplistische implementatie en de brede toegankelijkheid van spectrometers in onderzoekslaboratoria. Deze test maakt een dynamische meting van lichtdoorlatendheid door middel van een vormend stolsel mogelijk door individuele repetitieve metingen te doen op een gedefinieerde golflengte (meestal bij een golflengte in het bereik van 350 – 700 nm)7. Ook de temperatuur in de leeskamer kan worden aangepast. Naarmate fibringel zich vormt, wordt de hoeveelheid licht die door het eiwitnetwerk reist verminderd waardoor de absorptie na verloop van tijd toeneemt. Op dezelfde manier neemt de absorptie af wanneer het stolselnetwerk degradeert. Troebelheidstesten kunnen gemakkelijk worden gevoefd met behulp van een multi-well plaatformaat om een hoge doorvoermonsterscreening in zowel 96- als 384-putplaten mogelijk te maken. Verschillende stolsel kenmerken kunnen worden afgeleid van een troebelheid tracing curve (absorptie na tijd meting) die omvatten: maximale troebelheid, tijd tot maximale troebelheid, tijd om te stollen begin, en stolsel vorming tarief (Vmax). Een fibrin vezel massa / lengte verhouding kan ook worden afgeleid van ruwe troebelheid gegevens te schatten fibrin vezel dikte8,9,10.
TEG wordt voornamelijk gebruikt in de klinische setting om de hemostase en stolsellyse van patiënten te beoordelen. Het wordt ook vaak gebruikt in chirurgische toepassingen om te bepalen wanneer anti-fibrinolytische geneesmiddelen of hemostatische bloedproducten moeten worden toegediend11,12. Stolselvorming vindt plaats in een TEG-beker waarbij alle stollingscomponenten aan de beker worden toegevoegd voordat de test wordt ingeleid. De beker, met evoluerende stolsel, draait fysiek tegen een pin die in het midden wordt ingebracht en een elektromechanische torsiesensor meet de toenemende visco-elastische sterkte van het stolsel. Deze test wordt meestal uitgevoerd bij de fysiologische temperatuur van 37 °C; de temperatuur kan echter handmatig op het instrument worden aangepast. Maximale amplitude (MA), reactiesnelheid (R), kinetiektijd (K), α-hoek (Hoek) en time-to-maximum amplitude (TMA) worden door de TEG-software uit de dynamische TEG-tracering gehaald. Deze waarden worden meestal vergeleken met klinische normale bereiken om de stolling van een patiënt te beoordelen. Hoewel TEG niet precies een viscometer is, omdat het de stollingssterkte meet in millimetereenheden, biedt het wel belangrijke visco-elastische stolselgegevens en functioneert het als een waardevol klinisch beslissingsinstrument voor artsen om te beslissen om specifieke bloedproducten toe te dienen en therapeutische dosering aan te passen13. Wanneer zowel TEG- als troebelheidstesten samen worden gebruikt, bieden ze aanvullende informatie over de karakterisering van het stolsel, omdat stolselsterkte en kinetiek gemakkelijk kunnen worden geëxtraheerd uit TEG en fibrinvezeldikte toegankelijk is via optische troebelheidsmetingen.
Omdat fibrin een essentieel onderdeel is van een bloedstolsel, kan fibrinstololkkarakterisering onder diverse stolselvormingsomstandigheden waardevol inzicht geven in hoe een specifieke variabele bijdraagt aan het stolselvormingsproces en de uiteindelijke stolseleigenschappen. Inzicht in dit kan begeleiding bieden voor trombose diagnose en de ontwikkeling van therapieën. Om een representatievere fibrin stollende karakterisering te verkrijgen, kan plasma worden vervangen om de stolselvorming te controleren omdat het lijkt op in vivo stollingsomstandigheden dichter dan een vereenvoudigd fibrinogen/trombin modelsysteem. Echter, als gevolg van de ingewikkelde aard van de stolling cascade, stolsel vorming met behulp van plasma draagt bij aan de complexiteit, waardoor het moeilijker is om de impact van individuele factoren te isoleren. Het gebruik van een vereenvoudigd fibrinogen/trombin model voorkomt dat de hele stollingscascade moet worden gestart, waardoor de uiteindelijke fibrinevormingsstap kan worden geïsoleerd. Door het opnemen van twee grote fibrinevormende componenten (fibrinogen en trorombine), creëert deze setup een zeer gecontroleerde stolselvormingsconditie. Het is ook belangrijk op te merken dat, terwijl de vereenvoudigde stolsel model hier wordt gebruikt, dit protocol kan ook worden gebruikt om meer complexe stolsels te karakteriseren door het opnemen van extra stollingsfactoren. In deze studie worden fibrinstolololtaktisatie met troebelheid en TEG uitgevoerd door verschillende fibrinogen- en trombineconcentraties, ionische sterkte, pH en totale eiwitconcentratie in de stollingsoplossing om verschillende in vivo stollingsomstandigheden na te bootsen14. Details met betrekking tot deze wijzigingen in het protocol zijn opgenomen in sectie 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS)
OPMERKING: PBS werd gebruikt tijdens deze studie als de beschreven tests niet vereist de toevoeging van calcium. Het is belangrijk op te merken dat bij het toevoegen van calcium, vaak gebruikt om citrated bloedproducten opnieuw te verkalken, PBS moet worden vermeden als calcium is bekend dat neerslaan in fosfaatbuffers.
- Maak een 0,01 M, pH 7.4 PBS buffer door het mengen van 137 mM natriumchloride, 1,8 mM kalium fosfaat monobasic, 10 mM natriumfosfaat dibasic en 2,7 mM kaliumchloride in DI water.
- Controleer de pH-buffer met behulp van een pH-sonde en pas de pH aan met natriumhydroxide of zoutzuur indien nodig.
- Gebruik deze PBS voor de bereiding van fibrinogeen en stollingstesten (tenzij anders vermeld).
OPMERKING: Buffer wordt voorgesteld om fibrinogen poeder te reconstrueren, omdat rehydratatie in DI water kan resulteren in fibrinogen neerslag, zelfs bij 37 °C.
2. Bereiding en opslag van eiwitten
OPMERKING: In het protocol worden de eiwitvoorraadconcentraties in verschillende concentraties voor troebelheid en TEG bereid om de consistente verhouding van zout, DI-water, PBS en andere restfactoren in de uiteindelijke stollingsoplossingen mogelijk te maken.
- Bereiding en opslag van fibrinogen
OPMERKING: Verontreinigingen in commercieel verkrijgbaar fibrinogen omvatten een aanzienlijke hoeveelheid factor XIII, resthoeveelheden van andere stollingsfactoren, opslagbuffer en zouten. In aanwezigheid van calcium, factor XIII is bekend dat crosslink de fibrin stolsel netwerk. Dit effect draagt bij aan een aangescherpte stolselstructuur en verbeterde stolselsterkte die fibrinkarakterisering beïnvloedt. Commercieel beschikbare activiteitskits kunnen worden gebruikt om de xiiia-niveaus van actieve factor te bepalen. Om de variabiliteit veroorzaakt door factor XIIIa tot een minimum te beperken, moeten experimenten worden ontworpen met uitsluiting van calcium of aanvullende stappen om factor XIIIa te verwijderen, moeten in dit protocol worden opgenomen. Daarnaast moeten eiwitopslagzout en buffertype worden beoordeeld en zo nodig dialyse worden uitgevoerd om over te dragen aan een voorkeurstestwerkbuffer.- Weeg en aliquot lyophilized fibrinogenpoeder (runderen of mens) in 2 mL-buizen bij 20 mg eiwit per buis en bewaar aliquots tot -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
- Laat fibrinogen aliquot 10 minuten op de dag van het experiment acclimatiseren aan RT (kamertemperatuur). Reconstitute fibrinogen door 600 μL PBS toe te voegen aan de aliquot 20 min voorafgaand aan gebruik.
- Neem 10 μL fibrinogeen en verdun het met 190 μL PBS in een UV-transparante 96-putplaat of een cuvette. Bepaal de concentratie van fibrinogen door absorptie op 280 nm te nemen via een commerciële spectrometer en de bijbehorende software.
- Bereken fibrinogenconcentratie (mg/mL) met behulp van de wet van Bier. Bereid 12 mg/mL (voor troebelheidstesten) en 3,2 mg/mL (voor TEG) fibrinogen-voorraadoplossingen door verdere verdunning met PBS (tenzij anders vermeld).
OPMERKING: Fibrinogen concentratie bepaling (mg/mL) volgens de wet van Bier:
Molaire extinctiecoëfficiënt: ṭ = 513.400 L mol-1 cm-1 bij 280 nm; Pathlength (L); Verdunningsfactor (D); Moleculair gewicht (MW) = 340.000 Da. ṭ wordt afgeleid door E0,1% = 1,51 (280 nm) (uitstervingscoëfficiënt, gegeven door de leverancier) te vermenigvuldigen met MW.
- Voorbereiding en opslag van trombine
- Gereconstitueerde lyophilized trorombine (runderen of menselijke, 1000 U-voorraad) in 200 μL gedeïmpliceerd (DI) water om 200 μL van 5000 U/mL trombinevoorraadoplossing te maken.
- Maak 5 μL (20 U/tube) aliquots van de oplossing en houd aliquots bevroren op −20 °C.
- Dooi trombin aliquots bij RT gedurende 15 minuten op de dag van het experiment en maken trorombine werkoplossing door het te verdunnen tot 20 U / mL voor troebelheid testen en 18 U / mL voor TEG met DI water (tenzij anders vermeld).
OPMERKING: Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om de enzymactiviteit te behouden die kan worden bereikt door enzymen op ijs te houden tijdens het ontdooien en gebruik; er werd echter geen vermindering van de trorombinactiviteit waargenomen wanneer deze direct na het ontdooien bij RT werd gebruikt.
3. Troebelheid
- Gebruik elke commercieel verkrijgbare spectrometer met een absorptiebereik van 350 - 700 nm en een bijbehorende software om stolsel troebelheid na verloop van tijd te controleren (zie Tabel van materialen).
- Schakel de spectrometer in en open de bijbehorende analysesoftware.
- Selecteer het tabblad Plaat 1 en open plaatinstellingen. Klik op abs-modus en Kinetic om een dynamische absorptiemeting in de loop van de tijd te controleren.
- Selecteer 550 nm (of een waarde in het bereik van 350 – 700 nm) in het tabblad golflengte en pas de totale looptijd aan op 60 min met een interval van 30 s op het tabblad tijd. Selecteer putten van belang voor het lezen door het benadrukken van de putten. Pas indien nodig andere instellingen aan.
OPMERKING: Het selecteren van een golflengte aan de onderkant van het bereik (ongeveer 350 nm) brengt een betere gevoeligheid, maar absorptie kan ook de detectielimiet van de spectrometer overschrijden. De meest gebruikte golflengte voor troebelheid meting is 405 nm in de literatuur; Dit protocol maakt echter gebruik van 550 nm om ervoor te zorgen dat de dynamische troebelheidswaarden binnen de detectielimiet voor alle experimenten vallen. Het geselecteerde leesinterval moet zo kort mogelijk zijn om het hoogste niveau van testgevoeligheid te bereiken. Dit zal afhangen van de spectrometer en het aantal putten wordt gelezen tijdens een bepaalde test. - Neem een UV transparante 96-put plaat. Pipette 140 μL PBS in een put die is geselecteerd om te lezen. Voeg 10 μL trombine (20 U/mL) toe en meng ze in de put.
OPMERKING: Gebruik geen hoge bindtestplaten om niet-specifieke eiwitbinding aan het putoppervlak te minimaliseren. Dit kan de eiwitverspreiding in de oplossing beïnvloeden en resulteren in een hoge testvariabiliteit. - Begin de stolling onmiddellijk door 50 μL fibrinogen (12 mg/mL) in de put toe te voegen om een 200 μL stollingsoplossing te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van 3 mg/mL fibrinogen en 1 U/mL trombine. Meng de inhoud in de put door pipetting op en neer vijf keer zorgen om te voorkomen dat de oprichting van bubbels in de oplossing als ze absorptie beïnvloeden door het verstrooien van licht.
OPMERKING: Gebruik een meerkanaals pipet wanneer u meerdere stolselmonsters tegelijkertijd op dezelfde plaat uitvoert. Nota tijdsverschillen tussen putten en de periode voorafgaand aan de eerste lezing door het instrument om stollingstijden te compenseren. - Plaats de 96-put plaat in de houder en klik op Start in de software om troebelheid te beginnen met lezen bij RT.
OPMERKING: Als de test bij een verhoogde temperatuur wordt uitgevoerd, moeten de spectrometer, plaat en reagentia allemaal op de gewenste temperatuur worden gehouden voordat de stolsel wordt inwijdd. - Zodra voltooid, haal de troebelheid gegevens en het verkrijgen van een troebelheid tracing curve door plotten absorptie verandering in de tijd in een plotten software.
- Derive TurbMax (maximale troebelheid indicatief voor fibrin vezel dikte en fibrin netwerkdichtheid) door het nemen van de maximale absorptiewaarde van de curve na verloop van tijd.
OPMERKING: Fibrin vezel massa /lengte verhouding kan worden berekend op basis van troebelheid waarden met behulp van de vergelijking in het volgende manuscript8. - Bereken 90% maximale troebelheid door TurbMax met 90% te vermenigvuldigen. Ontlenen TurbTime door het berekenen van de tijd van stolsel initiatie tot 90% maximale troebelheid.
OPMERKING: De tijd tot 90% maximale troebelheid is een betrouwbaardere metrische dan tijd tot absolute maximale troebelheid als het beter vertegenwoordigt stolsel tijd door het elimineren van de zeer variabele uiteindelijke stolsel vorming periode. Aanvullende stollingsparameters zoals de begintijd van het stolsel (de tijd van het begin van de test tot wanneer de absorptie begint toe te nemen) en de stollingsvorming (Vmax, de grootste helling van het lineaire gebied in de troebelheidstraceringscurve) kunnen ook worden geëxtraheerd uit de troebelheidstracerings traceringen.
4. Trombo-lastografie (TEG)
- Zet de tromboelastograaf analyzer aan en wacht tot de temperatuur stabiliseert bij 37 °C.
- Open TEG - software. Zodra u bent ingelogd, maakt u een experimentnaam onder de sectie ID.
- Voer een e-test uit voor alle kanalen door de softwareprompts op het scherm te volgen. Plaats de hendel terug naar de laadpositie zodra alle controles zijn voltooid.
OPMERKING: Een TEG e-test is vereist en moet elke keer worden uitgevoerd wanneer u het instrument gebruikt. TEG stollingscontroletesten (met behulp van TEG-niveau 1- en niveau 2-controles) zijn vereist op de door de reguliere fabrikant voorgestelde intervallen wanneer deze worden gebruikt voor klinische monsters. - Klik op het tabblad TEG en voer voorbeeldgegevens in voor kanalen die worden gebruikt. Plaats een duidelijke ongecoate TEG-beker in het bijbehorende kanaal. Schuif de drager naar boven en druk 5 keer op de bekerbodem om de pin op de torsiestang aan te brengen. Laat de drager zakken en druk de beker naar beneden in de dragerbasis totdat deze "klikt".
- Pipette 20 μL trombineoplossing (18 U/mL) in de TEG-beker. Begin de stolling onmiddellijk door 340 μL fibrinogen (3,2 mg/mL) in de TEG-beker toe te voegen om een 360 μL stollingsoplossing met een uiteindelijke concentratie van 3 mg/mL fibrinogen en 1 U/mL trombine in de beker te verkrijgen. Meng de inhoud door het op en neer pikken vijf keer.
OPMERKING: Potentiële stollingsfactoren of andere onderdelen van belang moeten tijdens deze stap worden toegevoegd, omdat het voorzichtig is om altijd een eindvolume van 360 μL in de TEG-beker te behouden. - Schuif de door de kop geladen drager omhoog, verplaats de hendel naar de leespositie en klik op Start in de software om de TEG-lezing te starten.
- Zodra TEG is voltooid (na ongeveer een uur), haalt u TEG-parameters op en verkrijgt u een TEG-traceringscurve door amplitude in de loop van de tijd in een plottingsoftware uit te plotten.
- Verzamel MA als TEGMax (maximale amplitude is indicatief voor stolselsterkte) en TMA als TEGTime (tijd tot maximale amplitude) van de software.
OPMERKING: MA wordt door de software berekend als de maximale amplitude op het moment dat de amplitude minder dan 5% afwijking heeft over een periode van 3 minuten. TMA wordt bepaald als de tijd van de maximale thrombus generatie snelheid (in de buurt van het split point) naar de MA. Andere parameters kunnen ook nuttig zijn om te beoordelen bij het uitvoeren van de stolselanalyse. Enkele voorbeelden van deze parameters zijn: R-time (de tijd van het begin van de test tot wanneer amplitude 2 mm bereikt), K (de tijd vanaf het einde van R tot wanneer amplitude 20 mm bereikt), alfa (helling van de lijn tussen R en K) en CLT (stolsel lysetijd).
5. Fibrin karakterisering onder verschillende stollingsomstandigheden
OPMERKING: Voer fibrine karakteriseringsexperimenten uit door een specifieke variabele te moduleren in de stollingsoplossingen zoals: fibrinogen- en trombineconcentraties, ionische sterkte, pH en totale eiwitconcentraties. Experimentele preparaten met deze voorbeeldvariabelen worden in deze sectie beschreven; echter, andere stollingsfactoren en voorwaarden van belang kan ook worden vervangen. Selecteer zorgvuldig een geschikt buffersysteem, rekening houdend met elke unieke testvereisten. Voor troebelheid en TEG-tests, omvatten een buffer alleen controle om een nauwkeurige achtergrond aftrekken te garanderen, terwijl het analyseren van het effect van deze variabelen.
- Variërende fibrinogenconcentratie (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
- Pas stap 2.1.4 aan om de fibrinogenvoorraad in verschillende concentraties voor te bereiden (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL voor troebelheidstesten en 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL voor TEG).
- Pas stap 3.6 aan om "50 μL fibrinogen (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL) toe te voegen aan meerdere putten van de 96 well-plate" voor troebelheidstesten.
- Pas stap 4.5 aan om "340 μL fibrinogen (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL) toe te voegen aan heldere TEG-cups" voor TEG.
- Variërende trombineconcentratie (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/mL)
- Pas stap 2.2.3 aan om trombinevoorraad in verschillende concentraties voor te bereiden (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL voor troebelheidstesten en 1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/mL voor TEG).
- Pas stap 3.5 aan om "10 μL trombine (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) toe te voegen aan meerdere putten van de 96 well-plate" voor troebelheidstesten.
- Pas stap 4.5 aan op "pipet 20 μL trombine (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL) in clear TEG cups" voor TEG.
- Wisselende ionische sterkte (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 en 0,3 M)
- Los natriumchloride op (21, 101, 111, 121, 131, 141 en 271 mM) samen met 1,8 mM kaliumfosfaatmonabasic, 10 mM natriumfosfaat dibasic en 2,7 m kaliumchloride in DI water om 0,01 M PBS-oplossingen te maken met verschillende ionische sterktes.
- Pas stap 1.3 aan om PBS te gebruiken die op verschillende ionische sterktes zijn gemaakt om fibrinogen- en stollingsoplossingen voor te bereiden op zowel troebelheids- als TEG-testen.
- Variërende pH (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 en 8,0)
- Oplossen van natriumfosfaatdibasic (0,7, 3,2, 7,7, 8,1, 8,4, 9,5 mM) en kaliumfosfaatmonabasisch (8,2, 6,0, 2,0, 1.7, 1,4, 0,5 mM) samen met 2,7 mM kaliumchloride en natriumchloride (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) om 0,01 M PBS-oplossingen te maken met wisselende pH en een uiteindelijke ionische sterkte op 0,165 M.
- Controleer de pH-waarde van de buffer via de pH-sonde en pas indien nodig de pH aan.
- Pas stap 1.3 aan om PBS te gebruiken die bij verschillende pH is gemaakt om fibrinogeen en stollingsoplossing voor te bereiden op zowel troebelheid als TEG-testen.
- Variërende albuminconcentratie (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
- Los 2 g lyofphilized albumine op in 500 μL PBS bij RT gedurende 20 minuten op de dag van het experiment.
- Bepaal de albuminconcentratie met dezelfde procedure vermeld in stap 2.1.3 en 2.1.4 met een molaire extinctiecoëfficiënt van 43.800 L mol−1 cm−1 (bij 280 nm) voor albumine.
- Bereid albumin voorraad op verschillende concentraties.
- Pas stap 3.5 aan op "Pipette 40 μL PBS in een put die is geselecteerd voor het lezen en voeg 10 μL trombine (20 U/mL)". Pas stap 3.6 aan "Start de stolling onmiddellijk door 50 μL fibrinogen (12 mg/mL) toe te voegen met 100 μL albumine (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/mL) in meerdere putten tot een laatste concentratie van 3 mg/mL fibrinogen, 1 U/mL trombine en 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL album in putten."
- Pas stap 4.5 aan "Start de stolling onmiddellijk door een mengsel van 200 μL albumine toe te voegen (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/mL) en 140 μL 7,7 mg/mL fibrinogen in TEG-cups om een 360 μL-stollingsoplossing te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van 3 mg/mL fibribrinoen, 1 U/mL trombine en 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albumin in TEG cups."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De in figuur 1 getoonde experimenten zijn representatieve troebelheidstraceringskrommen van menselijke en runderfibrinstols op verschillende fibrinogenniveaus. Representatieve TEG-traceringscurven voor fibrinstolselvorming op verschillende fibrinogenniveaus worden weergegeven in figuur 2. Beide traceringscurven tonen aan dat na een vertragingsperiode na het initiëren van stolsel, stolsel troebelheid of stolselamplitude in de loop van de tijd toeneemt en niveaus af nemen aan het einde van de stolselvorming. Een eindpuntwaarde van maximale stolselvorming en de tijd tot maximale stolselvorming van elke test worden gebruikt om de kenmerken van een volledig gevormd stolsel en het totale stollingsproces te beoordelen. Maximale troebelheid (TurbMax)en tijd tot maximale troebelheid (TurbTime)zijn de twee parameters die zijn afgeleid van troebelheid, terwijl maximale amplitude (TEGMax)en tijd tot maximale amplitude (TEGTime)zijn afgeleid van TEG.
Bovendien is TurbMax een optische maatstaf voor de stolselstructuur die indicatief is voor fibrinvezeldikte en fibrin netwerkdichtheid. TEGMax is een mechanische maat die de absolute stolselsterkte weerspiegelt. Ze vertegenwoordigen verschillende aspecten van een stolsel dat onafhankelijk van elkaar kan veranderen op basis van onze eerdere bevindingen14. Samen bieden de twee waarden complementair inzicht in de stolselmicrostructuren, zoals hoe dicht de vezels in het fibrinnetwerk zitten. Om expliciet te zien hoe het moduleren van een stollingsvariabele de resultaten beïnvloedt, werden gegevens verder georganiseerd en gepresenteerd met behulp van trendplots. Representatieve voorbeelden van zowel troebelheid als TEG-gegevenstrends worden weergegeven in figuur 3. Op een hoger niveau van fibrinogen in de stollingsoplossing nemen alle vier de waarden (TurbMax, TEGMax,TurbTime en TEGTime)toe. Uit deze resultaten kan worden uitgelegd dat een hoger fibrinogen substraatniveau resulteert in een dichter vezelig netwerk dat de lichttransmissie via het stolsel beperkt (grotere TurbMax). Dit aangescherpte netwerk verbetert ook de stolselsterkte (grotere TEGMax). De verlenging van zowel TurbTime als TEGTime geeft aan dat fibrine polymerisatie wordt belemmerd bij verhoogde fibrinogenniveaus. De trends van TurbMax en TEGMax voor variabelen getest door onze groep en hun interpretaties zijn te zien in tabel 1.
Figuur 1: Representatieve voorbeelden van de curve van de troebelheidstracering (0 tot 30 min). Troebelheidstracering van runder (A) en menselijke (B) fibrinevorming in de loop van de tijd bij verschillende fibrinogenconcentraties (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) met 1 U/mL-soorten die overeenkomen met trombine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve voorbeelden van TEG-traceringscurve (0 tot 30 min). TEG amplitude traceringen van runder (A) en menselijke (B) fibrine vorming in de tijd bij verschillende fibrinogen concentraties (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) met 1 U / mL soorten afgestemd trombine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve voorbeelden van troebelheid en TEG-gegevenstrends. Gegevenstrends van TurbMax en TurbTime (A) en trends van TEGMax en TEGTime (B) voor verschillende boviene of menselijke fibrinogenconcentraties (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) met 1U/mL-soorten die overeenkomen met trombine. Alle gegevenspunten en foutbalken zijn gemiddelden en standaarddeviaties van drievouden (troebelheid) en duplicaten (TEG). Dit cijfer is hergebruikt van [Zeng, 2020]14. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Variabelen | Trendresultaten | Interpretaties |
| Verhoogd fibrinogen niveau | Verhoogde TurbMax en TEGMax | Vorming van strakkere fibrinevezels en dichter vezelig netwerk |
| Verhoogde trombineniveau, pH en ionische sterkte | Verminderde TurbMax, verhoogde TEGMax | Vorming van dunnere en strakkere fibrinevezels |
| Verhoogd albumin niveau | Verhoogde TurbMax, Verminderde TEGMax | Vorming van dikkere en lossere fibrinevezels |
Tabel 1: Resultaten en interpretaties van TurbMax en TEGMax.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol toont het gebruik van twee verschillende stolsel karakterisering tools testen van een vereenvoudigde fibrinogen / trombin stolsel model met behulp van commercieel beschikbare componenten. Zowel TEG- als troebelheidstesten zijn eenvoudig uit te voeren. Ze bieden niet alleen eindpunt stolsel onderzoeken zoals max stolsel vorming (TurbMax en TEGMax) en stolsel vorming tijden (TurbTime en TEGTime),maar ook beoordelen de dynamische stolsel vorming proces. Dit maakt TEG en troebelheid waardevolle instrumenten voor stolsel karakterisering toe te voegen aan alternatieve methoden zoals: SEM, PT, aPTT, of stolsel reologie, die ingewikkelde experimentele procedures kan hebben of zich alleen richten op het testen van een enkel stolsel aspect. Troebelheid en TEG-resultaten samen bieden ook een completer profiel van hoe een stollingsvariabele stollingskenmerken beïnvloedt.
Naast de stollingsvariabelen die in dit protocol worden beschreven, zijn er nog vele andere variabelen die kunnen worden bestudeerd door gebruik te maken van deze technieken. Dit protocol kan worden gewijzigd door het aanpassen van: temperatuur, calciumniveaus, stollingsfactorniveaus, de toevoeging van stolselactivatoren of remmers, of de toevoeging van farmaceutische middelen, om er maar een paar te noemen. Deze variabelen kunnen mogelijk worden bestudeerd met behulp van zowel de vereenvoudigde fibrinogen / trombin model systeem of met behulp van plasma. Het bestuderen van stollingsfactoren vereist zorgvuldige overweging en setup is zeker te voorzien in een goede upstream stolsel activering initiëren van de stolling traject. Troebelheid en TEG zijn ook effectieve instrumenten die worden gebruikt om de vertering van het stolsel te controleren. Het protocol kan worden aangepast om fibrinstololselvorming en lyse te karakteriseren in aanwezigheid van antistollingsmiddelen of trombolytische middelen. Het is belangrijk op te merken dat het therapeutische middel moet worden toegevoegd voordat stollingsmiddel wordt inwijdding wanneer het TEG wordt gebruikt, omdat het stollingssysteem functioneel gesloten is wanneer het instrument in werking is met de pin die in de TEG-testbeker zit. Met dat gezegd, TEG is niet in staat om te worden gebruikt om het therapeutische profiel van een trombolytische agent te testen in een bestaand stolsel.
In dit protocol werden beide tests uitgevoerd onder hun vaak gebruikte experimentele omstandigheden. TEG wordt vaak uitgevoerd bij 37 °C en troebelheidstesten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). De nadruk van deze karakteriseringsmethode is het bepalen en interpreteren van de trendresultaten die een specifieke variabele heeft op stolling. Belangrijk is dat het regelen van de temperatuur met behulp van TEG eenvoudig is, omdat reagentia rechtstreeks in een temperatuurgecontroleerde TEG-beker worden gepipeteerd. Temperatuurregeling in een troebelheidstest is minder eenvoudig omdat stollingsreagentia worden gemengd en in een goed-plaat worden gestart voordat ze in een verwarmde spectrometer worden geplaatst. De snelheid waarmee de plaat en stollingsoplossing warm in de kamer is traag ten opzichte van de stolselvorming tarief en het handhaven van alle reagentia en de plaat op verhoogde temperatuur voorafgaand aan het plaatsen in de verwarmde kamer kan moeilijk zijn en resulteert vaak in een slechte reproduceerbaarheid. Het handhaven van een constante temperatuur anders dan kamertemperatuur voor troebelheid testen is verder ingewikkeld wanneer multiplexing over vele putten. Een andere kritieke stap om een betrouwbaar en reproduceerbaar troebelheidsresultaat te garanderen is het mengen van de put om stolling te starten. Aangezien het directe trombine-fibrinogen decolleté snel is, kan het mengen van de goed voor stolselinitiatie niet-uniforme fibrinevorming omzeilen.
Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast om een stolsel gevormd door klinische monsters zoals bloedplaatjes-rijk plasma of bloedplaatjes-arm plasma te karakteriseren. Citrated bloedtrekkingen worden aanbevolen omdat ze eerder zijn gevalideerd volgens standaard TEG-protocollen. Bloedplaatjesrijk en bloedplaatjesarm plasma kan worden gescheiden van citrated whole blood via centrifugatie bij respectievelijk 200 en meer dan 2.000 x g gedurende 15 minuten bij RT. In troebelheid of TEG-testen kunnen stolsels worden gestart met de toevoeging van overtollig calciumchloride (11 mM). Aangezien fosfaat zich echter kan binden aan calcium, wat resulteert in neerslag, moet PBS worden vermeden wanneer calcium wordt gebruikt als initiator van het stolsel. Bij het bestuderen van bloedplaatjesrijke plasmastolselvorming is het belangrijk om bloedplaatjes als een belangrijke medeoprichter te beschouwen bij het uitvoeren van stolselvormingstesten onder omstandigheden waarin stolselvorming traag is. Problemen met betrekking tot bloedplaatjes bezinken zijn minder impactvol wanneer stolsel vorming snel is. Dit is vooral belangrijk voor troebelheidstesten waarbij de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de test grotendeels afhankelijk zijn van de homogeniteit van de reagentia in de put. Als experimenteel ontwerp het toelaat, kaolien (vaak gebruikt als een stolsel initiator voor TEG) of andere negatief geladen deeltjesactivatoren kunnen worden gebruikt om plasma stolsel initiatie te versnellen door het verstrekken van extra oppervlakte voor snellere contactroute activering van de stolling cascade. Belangrijk is dat activatorsuspensies grondig moeten worden gemengd met stollingsoplossingen om bezinking te voorkomen. Bij het gebruik van een oppervlakte of geladen op deeltjes gebaseerde stolt activator ervoor te zorgen dat de nodige achtergrond controles in aanmerking worden genomen als de reagentia zelf kan bijdragen tot onthouding in troebelheid testen. Bovendien, de afwikkeling kan een probleem zijn met grotere deeltjes gebaseerde additieven zoals kaolien.
Bloedmonsters moeten zorgvuldig worden verwerkt bij het overwegen van het gebruik van troebelheidstesten, aangezien rode bloedcellen aanzienlijk bijdragen aan absorptie bij standaard troebelheidsgolflengten. Om deze reden overschrijdt de meting van volbloed via troebelheid vaak de detectielimiet van de meeste spectrometers en is het meestal niet haalbaar. Alternatieve methoden om geheel bloed te karakteriseren kan nodig zijn of verdunning voorafgaand aan het uitvoeren van troebelheid testen op bloedmonsters die rode bloedcellen bevatten is ook mogelijk. TEG en troebelheid, wanneer ze samen worden gebruikt, zorgen voor uitgebreide stollings- en spijsverteringskarakterytisering door verschillende metingen voor stollingssterkte en fibrinvezel/netwerkmorfologie te combineren voor zowel sterk gecontroleerde minimale eiwitstollingstesten als klinische plasmamonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
