Summary
Fibrin er ansvarlig for blodproppdannelse under hemostase og trombose. Turbiditetsanalyser og tromboelastograhy (TEG) kan benyttes som synergistiske verktøy som gir komplementær vurdering av en blodpropp. Disse to teknikkene sammen kan gi mer innsikt i hvordan koagulasjonsforhold påvirker fibrin koagulasjonsdannelse.
Abstract
Trombose er en ledende dødsårsak over hele verden. Fibrin(ogen) er proteinet som primært er ansvarlig for koagulasjon eller trombose. Derfor er karakterisering av fibrin koagulasjonsdannelse gunstig for studiet av trombose. Turbiditet og tromboelastografi (TEG) er begge mye brukt in vitro analyser for overvåking av blodproppdannelse. Turbiditet måler dynamisk lysoverføringen gjennom en fibrinklotstruktur via et spektrometer og brukes ofte i forskningslaboratorier. TEG er en spesialisert viskoelastisk teknikk som direkte måler blodproppstyrke og brukes hovedsakelig i kliniske omgivelser for å vurdere pasientenes hemostase. Ved hjelp av disse to verktøyene beskriver denne studien en metode for å karakterisere en in vitro fibrin blodpropp ved hjelp av en forenklet fibrinogen / trombin koagulasjonsmodell. Datatrender på tvers av begge teknikkene ble sammenlignet under ulike koagulasjonsforhold. Menneskelige og storfe fibrin blodpropper ble dannet side om side i denne studien som storfe koagulasjon faktorer brukes ofte som erstatninger til menneskelige koagulasjonsfaktorer i kliniske og forskningsinnstillinger. Resultatene viser at TEG og turbiditet spor blodpropp dannelse via to forskjellige metoder og når det brukes sammen gir komplementære blodpropp styrke og fiber strukturell informasjon på tvers av ulike koagulasjonsforhold.
Introduction
Trombose er den patologiske dannelsen av en blodpropp i kroppen som blokkerer blodsirkulasjonen som fører til høy sykelighet og dødelighet over hele verden. Det er 1 til 2 tilfeller av venøs tromboembolisme og 2 til 3 tilfeller av tromboseinduserte vaskulære sykdommer per 1000 mennesker årlig1,,2. Presentert her er en metode som utnytter tromboelastografi (TEG) og turbiditet for å overvåke koagulasjonsdannelse under ulike koagulasjonsforhold. Fibrin(ogen) er det primære proteinet som er ansvarlig for blodproppdannelse i kroppen. I de siste trinnene i koagulasjonskaskaden blir fibrinopeptider spaltet fra fibrinogen ved trombin som initierer polymeriseringen av uoppløselige fibrinmonabimerer etter hvert som blodproppen utvikler3,4. For å forstå blodproppdannelse i patologisk trombose, er det nødvendig å karakterisere fibrindannelse under ulike koagulasjonsforhold. Det er brukt flere koagulasjonsanalyser for å studere fibrin clot formasjon in vitro. Protrombintid (PT/INR) og aktivert delvis tromboplastintid (aPTT) er to vanlige kliniske analyser som måler integriteten til en bestemt koagulasjonsvei. De bruker imidlertid tid som den eneste variabelen som ikke gir noen indikasjon på fysiske blodproppegenskaper5. Elektronmikroskopi tillater visualisering av mikrostrukturen til en fullstendig dannet fibrinklot, men gir ingen informasjon om selve koagulasjonsprosessen6. Blant alle analyser tilbyr turbiditetsanalyser og TEG muligheten til å spore koagulasjonsegenskaper dynamisk over tid. Disse teknikkene gjør det mulig å måle omfattende koagulasjonsprofiler, og gir derfor en viss fordel over andre fibrin clot karakteriseringsverktøy.
Spesielt er turbiditetsanalyser (eller klonet turbidimetry) mye brukt til forskning og kliniske anvendelser på grunn av sin forenklede implementering og den brede tilgjengeligheten av spektrometre i forskningslaboratorier. Denne analysen tillater en dynamisk måling av lystransndering gjennom en forming blodpropp ved å ta individuelle repeterende avlesninger ved en definert bølgelengde (oftest ved en bølgelengde i området 350 - 700 nm)7. Temperaturen i lesekammeret kan også justeres. Som fibrin gel dannes, reduseres mengden lys som reiser gjennom proteinnettverket, noe som forårsaker en økning i absorbans over tid. På samme måte reduseres absorbansen når koagulasjonsnettverket brytes ned. Turbiditetsanalyser kan enkelt multiplekseres ved hjelp av et multi-well plateformat for å tillate høy gjennomstrømningsprøvescreening i både 96- og 384-brønnplater. Flere koagulasjonsegenskaper kan avledet fra en turbiditetssporingskurve (absorbans over tidsmåling) som inkluderer: maksimal turbiditet, tid til maksimal turbiditet, tid til å koagulere utbruddet og blodproppformasjonshastighet (Vmax). En fibrin fiber masse / lengde forholdet kan også utledes fra rå turbiditet data for å estimere fibrin fibertykkelse 8,,9,,10.
TEG benyttes hovedsakelig i klinisk setting for å vurdere pasientenes hemostase og blodpropplys. Det er også vanlig i kirurgiske applikasjoner for å avgjøre når anti-fibrinolytiske legemidler eller hemostatiske blodprodukter skal administreres11,12. Koagulasjonsdannelse skjer inne i en TEG-kopp, og alle koagulasjonskomponentene legges til koppen før analysen starter. Koppen, med utviklende blodpropp, roterer fysisk mot en pinne som settes inn i midten og en elektromekanisk torsjonssensor måler den økende viskoelastiske styrken til blodproppen. Denne analysen utføres vanligvis ved den fysiologiske temperaturen på 37 °C; Temperaturen kan imidlertid justeres manuelt på instrumentet. Maksimal amplitude (MA), reaksjonshastighet (R), kinetikktid (K), α-vinkel (vinkel) og tid til maksimal amplitude (TMA) ekstraheres av TEG-programvaren fra den dynamiske TEG-sporingen. Disse verdiene sammenlignes vanligvis med kliniske normale områder for å vurdere pasientens koagulasjonstilstand. Mens TEG ikke er nettopp et viskometer, da det måler blodproppstyrke i millimeterenheter, gir det viktige viskoelastiske koagulasjonsdata og fungerer som et verdifullt klinisk beslutningsverktøy for leger å bestemme seg for å administrere spesifikke blodprodukter og justere terapeutisk dosering13. Når både TEG og turbiditetsanalyser brukes sammen, gir de komplementær koagulasjonskarakteriseringsinformasjon som blodproppstyrke og kinetikk lett ekstraheres fra TEG og fibrin fibertykkelse kan nås ved optiske turbiditetsmålinger.
Siden fibrin er en kritisk komponent i en blodpropp, kan fibrin clot karakterisering under ulike blodproppformasjonsforhold gi verdifull innsikt i hvordan en bestemt variabel bidrar til koagulasjonsprosessen og ultimate koagulasjonsegenskaper. Forstå dette kan gi veiledning for trombose diagnose og utvikling av terapeutiske midler. For å oppnå en mer representativ fibrin clot karakterisering, plasma kan erstattes for å overvåke blodpropp dannelse som det ligner på vivo koagulasjonsforhold tettere enn en forenklet fibrinogen / trombin modellsystem. Men på grunn av koagulasjonskaskadens intrikate natur, legger koagulasjonsdannelse ved hjelp av plasma til kompleksiteten, noe som gjør det vanskeligere å isolere virkningen av individuelle faktorer. Ved hjelp av en forenklet fibrinogen/trombinmodell forhindrer behovet for å initiere hele koagulasjonskaskaden som åpner for isolering av det endelige fibrinformasjonstrinnet. Ved å inkludere to store fibrin forming komponenter (fibrinogen og trombin), dette oppsettet skaper en svært kontrollert blodpropp formasjon tilstand. Det er også viktig å merke seg at mens den forenklede koagulasjonsmodellen brukes her, kan denne protokollen også brukes til å karakterisere mer komplekse blodpropper ved å inkludere flere koagulasjonsfaktorer. I denne studien utføres fibrin clot karakterisering ved hjelp av turbiditet og TEG av varierende fibrinogen og trombinkonsentrasjoner, ionisk styrke, pH og total proteinkonsentrasjon i koagulasjonsløsningen for å etterligne forskjellige in vivo koagulasjonsforhold14. Detaljer om disse variasjonene i protokollen er inkludert i avsnitt 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av fosfatbuffer saltvann (PBS)
MERK: PBS ble brukt gjennom hele denne studien, da de beskrevne analysene ikke krevde tilsetning av kalsium. Det er viktig å merke seg at når du legger til kalsium, ofte brukt til å forkalke citrated blodprodukter, PBS bør unngås som kalsium er kjent for å utløse i fosfat buffere.
- Lag en 0,01 M, pH 7,4 PBS buffer ved å blande 137 mM natriumklorid, 1,8 mM kaliumfosfat monobasisk, 10 mM natriumfosfatdibasisk og 2,7 mM kaliumklorid i DI vann.
- Kontroller buffer pH ved hjelp av en pH-probe og juster pH ved hjelp av natriumhydroksid eller saltsyre etter behov.
- Bruk denne PBS for fremstilling av fibrinogen og koagulasjonsanalyser (med mindre annet er spesifisert).
MERK: Buffer foreslås å rekonstituere fibrinogenpulver, da rehydrering i DI-vann kan føre til fibrinogennedbørsel selv ved 37 °C.
2. Tilberedning og lagring av proteiner
MERK: Gjennom hele protokollen tilberedes proteinlagerkonsentrasjonene ved ulike konsentrasjoner for turbiditet og TEG for å tillate konsistent forhold mellom salt, DI-vann, PBS og andre gjenværende faktorer i de endelige koagulasjonsløsningene.
- Forberedelse og lagring av fibrinogen
MERK: Kontaminanter i kommersielt tilgjengelig fibrinogen inkluderer en betydelig mengde faktor XIII, gjenværende mengder andre koagulasjonsfaktorer, lagringsbuffer og salter. I nærvær av kalsium er faktor XIII kjent for å kryssbinde fibrinklotnettverket. Denne effekten bidrar til en strammet blodpropp struktur og forbedret blodpropp styrke påvirker fibrin karakterisering. Kommersielt tilgjengelige aktivitetssett kan brukes til å bestemme aktiv faktor XIIIa nivåer. For å minimere variasjon forårsaket av faktor XIIIa, bør eksperimenter utformes med utelukkelse av kalsium eller ytterligere tiltak for å fjerne faktor XIIIa bør innlemmes i denne protokollen. I tillegg bør proteinlagringssalt og buffertype vurderes, og om nødvendig kan dialyse utføres for å overføre til en foretrukket analysearbeidsbuffer.- Veie og aliquot lyofilisert fibrinogenpulver (storfe eller menneske) i 2 ml rør ved 20 mg protein per rør og lagre aliquots ved -20 °C i opptil 6 måneder.
- La fibrinogen aliquot akklimatisere seg til RT (romtemperatur) i 10 minutter på dagen for eksperimentet. Rekonstituer fibrinogen ved å tilsette 600 μL PBS til aliquot 20 min før bruk.
- Ta 10 μL fibrinogen og fortynne den med 190 μL PBS i en UV gjennomsiktig 96-brønnsplate eller en cuvette. Bestem fibrinogenkonsentrasjon ved å ta absorbans ved 280 nm via et kommersielt spektrometer og dens programvare.
- Beregn fibrinogenkonsentrasjon (mg/ml) ved hjelp av Øls lov. Forbered 12 mg/ml (for turbiditetsanalyser) og 3,2 mg/ml (for TEG) fibrinogen lagerløsninger ved ytterligere fortynning med PBS (med mindre annet er spesifisert).
MERK: Fibrinogenkonsentrasjonsbestemmelse (mg/ml) etter ølloven:
Molar utryddelseskoeffisient: ŵ = 513 400 L mol-1 cm-1 ved 280 nm; Banelengde (L); Fortynningsfaktor (D); Molecular Weight (MW) = 340 000 Da. ŵ er avledet ved å multiplisere E0,1% = 1,51 (280 nm) (utryddelseskoeffisient, gitt av leverandøren) med MW.
- Klargjøring og lagring av trombin
- Rekonstituert lyofilisert trombin (storfe eller menneske, 1000 E-lager) i 200 μL av deionisert (DI) vann for å lage 200 μL av 5000 E /ml trombin lagerløsning.
- Lag 5 μL (20 U/tube) aliquots av oppløsningen og hold aliquots frosset ved -20 °C.
- Tin trombin aliquots ved RT i 15 min på dagen for eksperimentet og gjøre trombin arbeidsløsning ved å fortynne den til 20 U / ml for turbiditetsanalyser og 18 U / ml for TEG med DI vann (med mindre annet er spesifisert).
MERK: Forholdsregler bør tas for å opprettholde enzymaktivitet som kan oppnås ved å opprettholde enzymer på is under tining og bruk; Det ble imidlertid ikke observert noen reduksjon i trombinaktivitet ved bruk direkte etter tining ved RT.
3. Turbiditet
- Bruk et kommersielt tilgjengelig spektrometer som har et absorbansområde på 350 - 700 nm og en tilsvarende programvare for å overvåke koagulasjonsturbiditet over tid (se Materials tabell).
- Slå på spektrometeret og åpne den tilsvarende analyseprogramvaren.
- Velg plate 1 og åpne plateinnstillingsfanen. Klikk ABS-modus og Kinetic for å overvåke en dynamisk absorbansavlesning over tid.
- Velg 550 nm (eller en hvilken som helst verdi i området 350 – 700 nm) i bølgelengdefanen og juster den totale kjøretiden til 60 min med et intervall på 30 s i tidsberegningsfanen. Velg brønner av interesse for lesing ved å fremheve brønnene. Juster andre innstillinger om nødvendig.
MERK: Hvis du velger en bølgelengde i den nedre enden av området (rundt 350 nm), kan det også overskride deteksjonsgrensen for spektrometeret. Den mest brukte bølgelengden for turbiditetsmåling er 405 nm i litteratur; Denne protokollen bruker imidlertid 550 nm for å sikre at de dynamiske turbiditetsverdiene er innenfor deteksjonsgrensen for alle eksperimenter. Det valgte leseintervallet bør være så kort som mulig for å oppnå det høyeste nivået av analysefølsomhet. Dette vil avhenge av spektrometeret og antall brønner som leses under en gitt analyse. - Ta en UV gjennomsiktig 96-brønns plate. Pipette 140 μL PBS i en brønn som er valgt for lesing. Tilsett og bland 10 μL trombin (20 E/ml) i brønnen.
MERK: Ikke bruk høybindede analyseplater for å minimere ikke-spesifikk proteinbinding til brønnoverflaten. Dette kan påvirke proteindispersjon i oppløsningen og føre til høy analysevariasjon. - Initier koagulering umiddelbart ved å tilsette 50 μL fibrinogen (12 mg/ml) i brønnen for å oppnå en 200 μL koagulasjonsløsning med en endelig konsentrasjon på 3 mg/ml fibrinogen og 1 E/ml trombin. Bland innholdet i brønnen ved å pipetter opp og ned fem ganger, og ta vare på å unngå å skape bobler i løsningen, da de vil påvirke absorbansen ved å spre lys.
MERK: Bruk en flerkanals pipette når du kjører flere koagulasjonsprøver på samme plate samtidig. Registrer tidsforskjeller på tvers av brønner og tidsperioden før det første som ble lest av instrumentet for å kompensere for koagulasjonstider. - Plasser 96-brønnsplaten i holderen, og klikk Start i programvaren for å starte turbiditetslesing ved RT.
MERK: Hvis analysen utføres ved forhøyede temperaturer, må spektrometeret, platen og reagensene alle opprettholdes ved ønsket temperatur før koagulasjon. - Når du er ferdig, hente turbiditet data og få en turbiditet sporing kurve ved plotting absorbans endring over tid i en plotting programvare.
- Utlede TurbMax (maksimal turbiditet indikerer fibrin fibertykkelse og fibrin nettverkstetthet) ved å ta den maksimale absorbansverdien av kurven over tid.
MERK: Fibrin fibermasse/lengdeforhold kan beregnes ut fra turbiditetsverdier ved hjelp av ligningen i følgende manuskript8. - Beregn 90% maksimal turbiditet ved å multiplisere TurbMax med 90%. Utlede TurbTid ved å beregne tid fra blodpropp initiering til 90% maksimal turbiditet.
MERK: Tiden til 90 % maksimal turbiditet er en mer pålitelig beregning enn tid til absolutt maksimal turbiditet, da den bedre representerer blodpropptid ved å eliminere den svært variable endelige koagulasjonsperioden. Ytterligere koagulasjonsparametere som blodproppstart (tid fra teststart til når absorbansen begynner å øke), og koagulasjonsformasjonshastighet (Vmax, den største skråningen av den lineære regionen i turbiditetssporingskurven) kan også ekstraheres fra turbiditetssporingene.
4. Tromboelastografi (TEG)
- Slå på tromboelastografanalysatoren og vent til temperaturen stabiliseres ved 37 °C.
- Åpne TEG - programvare. Når du er logget inn, oppretter du et eksperimentnavn under ID-delen.
- Utuk en e-test for alle kanaler ved å følge instruksjonene på skjermen. Sett spaken tilbake til lasteposisjonen når alle kontrollene er fullført.
MERK: En TEG e-test er nødvendig og bør utføres hver gang du bruker apparatet. TEG koagulasjonskontrollanalyser (ved hjelp av TEG nivå 1 og nivå 2-kontroller) kreves med de vanlige produsentens foreslåtte intervaller når de brukes til kliniske prøver. - Klikk kategorien TEG, skriv inn eksempelinformasjon for kanaler som skal brukes. Plasser en klar ubestrøket TEG-kopp i den tilsvarende kanalen. Skyv stativet opp til toppen og trykk koppen nederst 5 ganger for å feste pinnen til torsjonsstangen. Senk transportøren og trykk koppen nedover i bærebasen til den "klikker".
- Pipette 20 μL trombinoppløsning (18 E/ml) inn i TEG-koppen. Start koagulering umiddelbart ved å tilsette 340 μL fibrinogen (3,2 mg/ml) i TEG-koppen for å få en 360 μL koagulasjonsløsning med en endelig konsentrasjon på 3 mg/ml fibrinogen og 1 E/ml trombin i koppen. Bland innholdet ved å pipetter opp og ned fem ganger.
MERK: Potensielle koagulasjonsfaktorer eller andre komponenter av interesse bør tilsettes i løpet av dette trinnet, og må alltid opprettholde et endelig volum på 360 μL i TEG-koppen. - Skyv den kopplastede stativet opp, flytt spaken til leseposisjonen og klikk Start i programvaren for å starte TEG-lesingen.
- Når TEG er fullført (etter omtrent en time), hente TEG parametere og få en TEG sporing kurve ved å plotte amplitude over tid i en plotting programvare.
- Samle MA som TEGMax (maksimal amplitude er et tegn på blodpropp styrke) og TMA som TEGTid (tid til maksimal amplitude) fra programvaren.
MERK: MA beregnes av programvaren som maksimal amplitude på det tidspunktet amplituden har mindre enn 5% avvik over en 3-minutters periode. TMA bestemmes som tiden fra maksimal trombegenereringshastighet (nær delingspunktet) til MA. Andre parametere kan også være nyttige for å vurdere når du utfører koagulasjonsanalysen. Noen eksempler på disse parameterne inkluderer: R-tid (tiden fra teststart til når amplitude når 2 mm), K (tiden fra slutten av R til når amplituden når 20 mm), alfa (helling av linje mellom R og K) og CLT (klonlystid).
5. Fibrin karakterisering under forskjellige koagulasjonsforhold
MERK: Utfør fibrin karakteriseringseksperimenter ved å modulere en bestemt variabel i koagulasjonsløsningene som: fibrinogen- og trombinkonsentrasjoner, ionisk styrke, pH og totale proteinkonsentrasjoner. Eksperimentelle preparater med disse eksempelvariablene er beskrevet i denne delen; Andre koagulasjonsfaktorer og betingelser av interesse kan imidlertid også erstattes. Velg nøye et passende buffersystem med tanke på hvert unike analysekrav. For turbiditet og TEG-analyser, inkluder en buffer bare kontroll for å sikre en nøyaktig bakgrunn subtraksjon mens analysere effekten av disse variablene.
- Varierende fibrinogenkonsentrasjon (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml)
- Juster trinn 2.1.4 for å forberede fibrinogenlageret ved forskjellige konsentrasjoner (4, 8, 12, 16, 20 mg/ml for turbiditetsanalyser og 1,1, 2,1, 3,2, 4,2, 5,3 mg/ml for TEG).
- Juster trinn 3.6 for å "tilsette 50 μL fibrinogen (4, 8, 12, 16, 20 mg / ml) i flere brønner av 96 brønnplaten" for turbiditetsanalyser.
- Juster trinn 4,5 for å "tilsett 340 μL fibrinogen (1,1, 2,1, 3,2, 4,2, 5,3 mg / ml) i klare TEG-kopper" for TEG.
- Varierende trombinkonsentrasjon (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/ml)
- Juster trinn 2.2.3 for å klargjøre trombinlager ved forskjellige konsentrasjoner (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/ml for turbiditetsanalyser og 1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/ml for TEG).
- Juster trinn 3,5 for å "tilsett 10 μL trombin (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 E /ml) i flere brønner av 96 brønnplaten" for turbiditetsanalyser.
- Juster trinn 4,5 til "pipette 20 μL trombin (1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 E /ml) i klare TEG-kopper" for TEG.
- Varierende ionisk styrke (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 og 0,3 M)
- Oppløs natriumklorid (21, 101, 111, 121, 131, 141 og 271 mM) sammen med 1,8 mM kaliumfosfat monobasisk, 10 mM natriumfosfatdibasisk og 2,7 mM kaliumklorid i DI vann for å lage 0,01 M PBS-løsninger med varierende ionic styrker.
- Juster trinn 1.3 for å bruke PBS laget ved forskjellige ioniske styrker for å forberede fibrinogen- og koagulasjonsløsninger for både turbiditet og TEG-analyser.
- Varierende pH (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 og 8,0)
- Oppløs natriumfosfatdibasisk (0,7, 3,2, 7,7, 8,1, 8,4, 9,5 mM) og kaliumfosfat monobasisk (8,2, 6,0, 2,0, 1,7, 1,4, 0,5 mM) sammen med 2,7 mM kaliumklorid og natriumklorid (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) for å lage 0,01 M PBS-løsninger med varierende pH og en endelig ionisk styrke på 0,165 M.
- Kontroller buffer pH-verdien via pH-proben og juster pH om nødvendig.
- Juster trinn 1.3 for å bruke PBS laget ved forskjellig pH for å forberede fibrinogen og koagulasjonsløsning for både turbiditet og TEG-analyser.
- Varierende albuminkonsentrasjon (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml)
- Oppløs 2 g lyofilisert albumin i 500 μL PBS ved RT i 20 min på eksperimentdagen.
- Bestem albuminkonsentrasjonen ved hjelp av samme prosedyre som er nevnt i trinn 2.1.3 og 2.1.4 med en molarutryddelseskoeffisient på 43 800 L mol−1 cm−1 (ved 280 nm) for albumin.
- Forbered album på lager ved ulike konsentrasjoner.
- Juster trinn 3,5 til "Pipette 40 μL PBS i en brønn som er valgt for lesing og tilsett 10 μL trombin (20 U /ml)". Juster trinn 3,6 til "Start koagulering umiddelbart ved å tilsette 50 μL fibrinogen (12 mg/ml) med 100 μL albumin (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/ml) i flere brønner til en endelig konsentrasjon på 3 mg/ml fibrinogen, 1 U/ml trombin og 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml albumin i brønner."
- Juster trinn 4,5 til "Start koagulering umiddelbart ved å tilsette en blanding av 200 μL albumin (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/ml) og 140 μL 7,7 mg/ml fibrinogen i TEG-kopper for å oppnå en 360 μL koagulasjonsløsning med en endelig konsentrasjon på 3 mg/ml fibrinogen, 1 U/ml trombin og 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg / ml albumin i TEG kopper."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentene som vises i figur 1 er representative turbiditetssporingskurver av menneskelige og storfe fibrinkløver på forskjellige fibrinogennivåer. Representative TEG sporingskurver for fibrin koagulasjon ved ulike fibrinogennivåer er vist i figur 2. Begge sporingskurvene viser at etter en forsinkelsesperiode etter blodproppinitiering øker koagulasjonsturbiditeten eller koagulasjonsalituden over tid og nivåer av ved slutten av koagulasjonsdannelsen. En endepunktverdi av maksimal blodproppdannelse og tid til maksimal koagulasjonsdannelse fra hver analyse brukes til å vurdere egenskapene til en fullstendig formet blodpropp og den generelle koagulasjonsprosessen. Maksimal turbiditet (TurbMax) og tid til maksimal turbiditet (TurbTid) er de to parametrene avledet fra turbiditet mens maksimal amplitude (TEGMax) og tid til maksimal amplitude (TEGTid) er avledet fra TEG.
I tillegg er TurbMax et optisk mål på koagulasjonsstruktur som indikerer fibrin fibertykkelse og fibrin nettverkstetthet. TEGMax er et mekanisk tiltak som gjenspeiler absolutt blodpropp styrke. De representerer ulike aspekter ved en blodpropp som kan endres uavhengig av hverandre basert på våre tidligere funn14. Samlet sett gir de to verdiene komplementær innsikt om blodproppmikrostrukturene, for eksempel hvordan tette fibrene er pakket i det fibrinske nettverket. For å eksplisitt se hvordan modulering av en koagulasjonsvariabel påvirker resultatene, ble data ytterligere organisert og presentert ved hjelp av trendplott. Representative eksempler på både turbiditet og TEG-datatrender er vist i figur 3. På et høyere nivå av fibrinogen i koagulasjonsløsningen øker alle fire verdiene (TurbMax,TEGMax,TurbTime og TEGTime). Fra disse resultatene kan det tolkes at et høyere fibrinogen substratnivå resulterer i et tyngre fibrøs nettverk som begrenser lysoverføringen gjennom blodproppen (større TurbMax). Dette strammet nettverket forbedrer også blodpropp styrke (større TEGMax). Forlengelsen av både TurbTime og TEGTime indikerer at fibrin polymerisering er hemmet ved økt fibrinogennivå. Trendene til TurbMax og TEGMax for variabler testet av vår gruppe og deres tolkninger er vist i tabell 1.
Figur 1: Representative eksempler på clot turbiditet sporing kurve (0 til 30 min). Turbiditetssporinger av storfe (A) og human (B) fibrindannelse over tid ved ulike fibrinogenkonsentrasjoner (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) med 1 E/ml arter matchet trombin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative eksempler på TEG sporingskurve (0 til 30 min). TEG amplitude tracings av storfe (A) og menneskelig (B) fibrin dannelse over tid ved ulike fibrinogenkonsentrasjoner (1, 2, 3, 4, 5 mg / ml) med 1 U / ml arter matchet trombin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative eksempler på turbiditet og TEG datatrender. Datatrender av TurbMax og TurbTime (A) og trender av TEGMax og TEGTime (B) for ulike storfe eller humane fibrinogenkonsentrasjoner (1, 2, 3, 4, 5 mg / ml) med 1U / ml arter matchet trombin. Alle datapunkter og feilfelt er gjennomsnitt og standardavvik for triplikater (Turbiditet) og duplikater (TEG). Dette tallet har blitt gjenbrukt fra [Zeng, 2020]14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Variabler | Trend resultater | Tolkninger |
| Økt fibrinogennivå | Økt TurbMax og TEGMax | Dannelse av strammere fibrinfibre og tettere fibrøs nettverk |
| Økt trombinnivå, pH og ionisk styrke | Redusert TurbMax, økt TEGMax | Dannelse av tynnere og strammere fibrinfibre |
| Økt albuminnivå | Økt TurbMax, Redusert TEGMax | Dannelse av tykkere og løsere fibrinfibre |
Tabell 1: Resultater og tolkninger av TurbMax og TEGMax.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen viser utnyttelsen av to forskjellige koagulasjonstegneverktøy som tester en forenklet fibrinogen/trombinknektmodell ved hjelp av kommersielt tilgjengelige komponenter. Både TEG og turbiditetsanalyser er enkle å gjennomføre. De gir ikke bare endepunktklotundersøkelser som maksimal blodproppdannelse (TurbMax og TEGMax) og blodproppformasjonstider (TurbTime og TEGTime), men vurderer også den dynamiske koagulasjonsprosessen. Dette gjør TEG og turbiditet verdifulle verktøy for blodpropp karakterisering å legge til alternative metoder som: SEM, PT, aPTT, eller blodpropp reologi, som kan ha kompliserte eksperimentelle prosedyrer eller fokusere bare på testing av en enkelt blodpropp aspekt. Turbiditet og TEG resultater sammen tilbyr også en mer komplett profil av hvordan en koagulasjon variabel påvirker blodpropp egenskaper.
I tillegg til koagulasjonsvariablene som er beskrevet i denne protokollen, er det mange andre variabler som kan studeres ved hjelp av disse teknikkene. Denne protokollen kan endres ved å justere: temperatur, kalsiumnivåer, koagulasjonsfaktornivåer, tilsetning av koagulatorer eller hemmere, eller tilsetning av farmasøytiske midler, for å nevne noen. Disse variablene kan potensielt studeres ved hjelp av både forenklet fibrinogen/trombin modellsystem eller ved hjelp av plasma. Å studere koagulasjonsfaktorer krever nøye overveielse og oppsett som er sikker på å sørge for riktig oppstrøms koagulasjonsaktivering som initierer koagulasjonsveien. Turbiditet og TEG er også effektive verktøy som brukes til å overvåke blodpropp fordøyelsen. Protokollen kan endres for å karakterisere fibrin koagulasjon og lysis i nærvær av antikoagulantia eller trombolytiske midler. Det er viktig å merke seg at det terapeutiske middelet må tilsettes før koagulasjonsstart når du bruker TEG, da koagulasjonssystemet er funksjonelt lukket når instrumentet er i drift med pinnen som sitter i TEG-analysekoppen. Med det sagt, TEG er ikke i stand til å brukes til å teste den terapeutiske profilen til et trombolytisk middel i en eksisterende blodpropp.
I denne protokollen ble begge analysene utført under deres vanlige bruk av eksperimentelle forhold. TEG utføres vanligvis ved 37 °C, og turbiditetsanalyser utføres ved romtemperatur (RT). Vekten av denne karakteriseringsmetoden er å bestemme og tolke trendresultatene som en bestemt variabel har på koagulering. Viktigere, kontrollere temperatur utnytte TEG er grei som reagenser er pipetted direkte inn i en temperaturkontrollert TEG kopp. Temperaturkontroll i en turbiditetsanalyse er mindre grei etter hvert som koagulasjonsreagenser blandes og initieres i en brønnplate før de plasseres i et oppvarmet spektrometer. Hastigheten som platen og koagulasjonsløsningen varmes i kammeret er langsom i forhold til koagulasjonsdannelseshastigheten og opprettholde alle reagenser og platen ved forhøyet temperatur før den plasseres i det oppvarmede kammeret, kan være vanskelig og ofte resulterer i dårlig analyse reproduserbarhet. Å opprettholde en jevn annen temperatur enn romtemperatur for turbiditetsanalyser er ytterligere komplisert ved multipleksing på tvers av mange brønner. Et annet kritisk skritt for å sikre et pålitelig og reproduserbart turbiditetsresultat er å blande brønnen for å initiere koagulering. Som direkte trombin-fibrinogen cleavage er rask, blande brønnen før blodpropp initiering kan omgå ikke-ensartet fibrin dannelse.
Denne protokollen kan også enkelt endres for å karakterisere en blodpropp dannet av kliniske prøver som blodplaterik plasma eller blodplatefattig plasma. Citrated blodprøver anbefales som de har blitt validert tidligere av standard TEG protokoller. Blodplaterikt og blodplatefattig plasma kan skilles fra citrated fullblod via sentrifugering på henholdsvis 200 og over 2000 x g i 15 min ved RT. Ved turbiditet eller TEG-analyser kan koagulering initieres med tilsetning av overflødig kalsiumklorid (11 mM). Men siden fosfat kan binde seg til kalsium som resulterer i nedbør, bør PBS unngås når kalsium brukes som blodproppinitierator. Når man studerer blodplaterik plasmaklotdannelse, er det viktig å vurdere blodplatebestyring som en betydelig confounder når du kjører koagulasjonsformasjonsanalyser under forhold der koagulasjonsdannelse er treg. Problemer med blodplateoppgjør er mindre virkningsfulle når koagulasjonsdannelsen er rask. Dette er spesielt viktig for turbiditetsanalyser der analysens nøyaktighet og reproduserbarhet i stor grad er avhengig av homogeniteten til reagensene i brønnen. Hvis eksperimentell design tillater det, kan kaolin (ofte benyttes som koagulasjons initiator for TEG) eller andre negativt ladede partikkelaktivatorer brukes til å øke hastigheten på plasmaklotinitiering ved å gi ekstra overflateareal for raskere kontaktveiaktivering av koagulasjonskaskade. Viktigere, aktivator suspensjoner bør blandes grundig med koagulasjonsløsninger for å unngå å bosette seg. Ved bruk av et overflateareal eller ladet partikkelbasert koagulator må du sørge for at de nødvendige bakgrunnskontrollene tas i betraktning, da reagensene selv kan bidra til absorptivitet i turbiditetsanalyser. I tillegg kan bosetting være et problem med større partikkelbaserte tilsetningsstoffer som kaolin.
Fullblodsprøver bør behandles nøye når man vurderer bruk av turbiditetsanalyser, siden røde blodlegemer bidrar betydelig til absorbans ved standard turbiditetsbølgelengder. Av denne grunn overskrider målingen av fullblod via turbiditet ofte deteksjonsgrensen for de fleste spektrometre og er vanligvis ikke mulig. Alternative metoder for å karakterisere fullblod kan være nødvendig eller fortynning før du kjører turbiditetsanalyser på blodprøver som inneholder røde blodlegemer er også mulig. TEG og turbiditet, når den brukes sammen, sørger for omfattende koagulasjonsdannelse og fordøyelseskarakterisering ved å kombinere forskjellige målinger for koagulasjonsstyrke og fibrin fiber / nettverksmorfologi for både svært kontrollerte minimale protein koagulasjonsanalyser og kliniske plasmaprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
