Summary
Burada sunulan, genç vahşi tip farelerde doğrulanmış bilişsel açık ve anksiyete benzeri davranışlara neden olabilecek, elektrik kontrollü bir yörünge rotorunun elde ettiği kronik uyku parçalanması (CSF) modeli için bir protokoldür. Bu model kronik uyku bozukluğu ve ilgili bozuklukların patogenezini keşfetmek için uygulanabilir.
Abstract
Uyku bozukluğu genellikle kronik bir hastalık veya şikayet edilen bir olay olarak popülasyonlarda yaygındır. Kronik uyku bozukluğunun, hastalıkların patogenezine, özellikle nörodejeneratif hastalıklara yakından bağlanması önerilmektedir. Son zamanlarda, 2 aylık uyku parçalanmasının genç vahşi tip farelerde davranışsal ve patolojik değişiklikler gibi Alzheimer hastalığı (AD) başlattığını bulduk. Burada, kronik uyku parçalanması (CSF) elde etmek için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Kısaca, CSF, 110 rpm'de titreşen ve 10 s-on, 110 s-off tekrarlayan bir döngü ile çalışan bir yörünge rotor tarafından, ışık-ON aşamasında (8:00 AM-8:00 PM) 2 aya kadar sürekli olarak indüklendi. Mekansal öğrenme ve hafıza bozuklukları, CSF modellemesinin sonuçları olarak farelerde anksiyete benzeri ancak depresyon benzeri olmayan davranışlar, Morris su labirenti (MWM), Novel nesne tanıma (NOR), Açık alan testi (OFT) ve Zorla yüzme testi (FST) ile değerlendirildi. Diğer uyku manipülasyonlarına kıyasla, bu protokol işleme emeklerini en aza indirir ve modelleme verimliliğini en üst düzeye çıkarır. Genç vahşi tip farelerde kararlı fenotipler üretir ve çeşitli araştırma amaçları için potansiyel olarak üretilebilir.
Introduction
Uyku bozukluğu, hem uykuyu rahatsız eden rahatsızlıkları olan hastalarda hem de uykuyu rahatsız eden olayları olan sağlıklı kişilerde giderek daha yaygındır. Nörodejeneratif hastalıklar, kronik ağrı, duygusal stres, solunum sistemi hastalıkları, üriner sistem hastalıklarıvb. Obstrüktif uyku apnesi (OSA), uykuda periyodik uzuv hareketleri (PLMS), diğer uyku bozuklukları arasında uyku bakım uykusuzluğu, uyku parçalanmasına neden olan en yaygın nedenlerdir6,7. Gelişmiş ülkelerde, OSA yetişkin popülasyonda% 5 ila% 9 ve çocuk nüfusta% 2'nin üzerinde yaygınlığa sahiptir8,9,10. Bu arada, akıllı telefonların aşırı kullanımı, düzensiz uyku alışkanlıkları, rahatsız edici sesler ve bakıcılar için gece vardiyaları gibi iş görevleri nedeniyle uyku bozukluğu yaşayan sağlıklı nüfusun giderek artan bir oranı vardır. Uykunun beyin atıklarının temizlenmesi için önemli olduğu kabul edilir11,12, hafıza konsolidasyonu13,14, metabolik denge15,16, diğer birçok fizyolojik süreç arasında. Bununla birlikte, uzun süreli uyku bozukluğunun sağlıklı insanlarda geri dönüşü olmayan patogenez değişikliklerine yol açıp açmayacağı ve bunun etiyoloji mi yoksa birkaç yıl içinde nörodejeneratif hastalıklar gibi merkezi sinir sistemi hastalıkları geliştirmenin katkıda bulunan bir faktörü mü olduğu hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Amacımız, 2 aylık bir uyku parçalanma tedavisinden sonra genç vahşi tip farelerde istikrarlı ve belirgin bilişsel açık ve anksiyete benzeri davranışlar üreten deneysel bir model bildirmektir. Bu model, yukarıda listelenen bilimsel soruların cevaplaması için uygulanacaktır.
Uyku bozukluğu, Alzheimer hastalığı (AD) veya demans gelişimi için potansiyel bir risk faktörü olarak listelenmiştir. Kang ve arkadaşları ilk olarak AD patolojisinin alevlenmesini 6 h akut uyku yoksunluğu17ile buldu ve tanımladı. Bundan sonra, diğer birçok çalışma, transgenik AD fare modellerinde uyku yoksunluğu veya parçalanmasının patogenezi ağırlaştırabileceğini bildirdi18,19,20. Bununla birlikte, çok az araştırmacı genç vahşi tip farelerde uyku bozukluğunun sonucunu inceledi; yani, uyku bozukluğunun AD benzeri davranışlara veya genç vahşi tip farelerde patolojik değişikliklere yol açıp açmayacağı. Son yayınımızda, 2 aylık uyku parçalanmasının belirgin mekansal hafıza eksikliği ve anksiyete benzeri davranışların yanı sıra, 2-3 aylık vahşi tip farelerde hem korteks hem de hipokampusta hücre içi Amiloid-β (Aβ) birikiminin arttığını bildirdik21. Ayrıca, APP / PS1 farelerinde bildirilen patolojik değişikliklere benzer olan endozom-otofagozom-lizozom yol belirteçlerinin ve mikroglia aktivasyonunun değiştirilmiş ifade seviyelerini gözlemledik21,22.
Sunulan bu uyku parçalanma (SF) protokolü Sinton ve ark.23 tarafından doğrulandı ve Li ve ark.24tarafından değiştirildi. Kısacası, 110 rpm'de titreşen bir yörünge rotor, light-ON fazı (8:00 AM–8:00 PM) sırasında her 2 dakikada bir 10 sn uykuyu keser. Bu modeldeki uyku yapısı değişikliği daha önce elektrofizyolojik uyku kayıtları ile karakterize edildi ve Li ve ark.24tarafından rapor edildi, ışık-ON aşamasında uyanma süresinde önemli bir artış ve hızlı göz hareketi (REM) uykusunda azalma olduğunu gösteren, toplam uyku ve uyanma süreleri (24 saat içinde) 4 haftadan fazla modellemeden etkilenmedi24. Şu anda, toplam uyku veya kısmi uyku yoksunluğu en sık kullanılan uyku manipülasyon modelleridir. Toplam uyku yoksunluğu genellikle hayvanı sürekli nazik bir şekilde elleçleme veya yeni nesnelere maruz bırakma, alternatif olarak bir çubuğu veya çalışan bir koşu bandını sürekli döndürerek25 , 26,27,28,29ilegerçekleştirilir. Etik nedenlerden dolayı, toplam uyku yoksunluğu genellikle 24 saatten kısadır. En sık uygulanan kısmi uyku yoksunluğu modeli, öncelikle REM uyku30 , 31,32'yiortadanleyen su platformu yöntemidir. Bir koşu bandı veya kafesin altını süpüren bir çubuk kullanan diğer yaklaşımlar, sabit aralıklarla ayarlandığında uyku parçalanmasına neden olabilir33 , 34,35,36,37,38. SF'nin uykuyu kesmesi ve zaman zaman tüm uyku aşamalarında uyarılmalara neden olması dikkat çekicidir24. Orbital rotor uygulayan bu CSF modelinin öne çıkan avantajlarından biri, düzenli izleme dışında günlük olarak sık işlem işçiliğini önleyen makineler tarafından otomatik olarak kontrol edilen aylarca sürekli olarak yapılabilmesidir. Ayrıca, cihaz aynı anda üniformalı müdahaleler altında birden fazla fare kafesini modellemeye izin verecektir. Tüm modelleme seansları sırasında, fareler ev kafeslerinde normal yatak takımları ve yuva malzemeleri ile barındırılırken, diğer bazı yöntemler çeşitlendirilmiş ortamlara ve kaçınılmaz strese maruz kalmayı gerektirir.
Uyku parçalanması daha önce uyku evresinde sık uyarılmayı ve uyanma aşamasında önemli uyku geri tepmesini taklit eden uyku manipülasyon yöntemi ile karakterize edildi. Bazı literatürlerde CSF, OSA39,40için hayvan modeli olarak kabul edildi. Bu çalışmada, seçilen uyarılma sıklığının saatte 30 kez olmasının gerekçesi, orta ila şiddetli uyku apnesi olan hastalarda uyarılma indekslerinin gözlemlenmesine dayanmaktadır. 4 haftalık uyku parçalanmasının hiperkapik uyarılma gecikmesini ve dokunsal uyarılma eşiğini önemli ölçüde artırdığı gözlendi, bu da iyileşmeden en az 2 hafta sonrasürebilir 24. Bu fenotip, hiperkapniye yanıt olarak noradrenerjik, orexinergic, histaminerjik ve kolinerjik wake-active nöronlarda c-fos aktivasyonunun azaltılmasının yanı sıra cingulate korteksine azaltılmış katekolaminerjik ve orexinerjik projeksiyonların24. Bununla birlikte, OSA'daki en önemli özelliğin hava yolu tıkanıklığının neden olduğu hipoksi olduğunu ve bunun uyku bozulmasına neden olduğunu belirtmek gerekir41,42. OSA patogenezinde uyku bozukluğu ve tekrarlayan hipoksi karşılıklı olarak birbirleriyle etkileşime girer. Bu nedenle, uyku parçalanması tek başına farelerde OSA'nın tüm temel özelliklerini tam olarak gösteremeyebilir.
Burada, genç vahşi tip farelerde kronik uyku parçalanmasını modellemek için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bilişsel eksiklik ve anksiyete benzeri ve CSF tedavisinden sonra depresyon benzeri davranışlar Morris su labirenti, Novel nesne tanıma, Açık alan testi ve Zorla yüzme testi ile değerlendirildi. Bu modelin düzensiz uyku düzeni, bilişsel eksiklik ve anksiyete benzeri davranışların fenotiplerini üreten bir bütün olarak alınması gerektiğini belirtmek önemlidir. Mevcut model potansiyel olarak uygulanabilir, ancak sınırlı olmamak üzere aşağıdaki amaçlarla uygulanabilir: 1) Genetik yatkınlığı olmayan genç farelerde kronik uyku bozukluğunun neden olduğu fonksiyonel veya moleküler patogenez mekanizmalarının daha fazla araştırılması, 2) Uyku bozukluğunun başlattığı nörodejenerasyona giden doğrudan yolu belirlemek, 3) Kronik uyku bozukluğunun neden olduğu fenotipleri iyileştirmek için terapötikleri keşfetmek, 4) Kronik uyku bozukluğu üzerine vahşi tip farelerde içsel koruyucu/telafi edici mekanizmaların incelenmesi, 5) Uyku-uyanıklık regülasyonunun ve devlet geçiş mekanizmalarının incelenmesi için uygulanacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Tongji Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, Tongji Tıp Koleji, Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi tarafından onaylandı.
1. Fare taraması ve deneye hazırlık
- Tüm deney için 20-28 g ağırlığında vahşi tip yetişkin (8-10 haftalık) erkek fareleri seçin.
NOT: Vahşi tip C57BL/6 fareler Hubei Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi, Hubei, Çin'den elde edilir. - Tüm fareleri CSF'ye ve kontrol grubuna rastgele atayın. Sosyal izolasyon stresini önlemek için her kafeste 3-5 fare barındırın. Kontrol kafeslerinde bulunan farelerin sayısı, eşleştirilmiş CSF kafeslerinde bulunanlarla eşleştirilir.
NOT: Aynı grup kafeslerindeki fareler, takip davranış deneyleri yapmak için birikmiş. - Çevredeki çevreyi ve işçilik etkilerini aynı tutmak için kontrol kafeslerini CSF kafesleriyle aynı odada bulun.
- İzleme amacıyla bir kulak etiketi kullanarak her gruptaki fareleri kulaklarında numaralandırma ve işaretleme.
- Ortam sıcaklığını ve nemini %21-23 °C ile %35-%60 arasında koruyun.
- Farelerde normal uyku ritmi üzerinde önyargılı etkiyi önlemek için ortam ortamını 12 saatlik açık-karanlık döngüde (08:00-20:00 arası açık,8:00 PM-8:00 light-OFF) koruyun.
- Araştırmacı modelleme odasında bulunurken gürültüyü ve paraziti en aza indirin.
- Farelere yeterli yiyecek ve su sağlayın. Platform hareketlerinde su sızıntısını önlemek için su şişelerinde küresel vana uçları ile uzun nozüller kullanın. Rotor çalışması sırasında şişenin yerinden çıkmasın diye su şişesini bir yay ile kafesin üzerine sabitleyin.
2. Yörünge rotorunun hazırlanması ve ayarlanması
- Üzerine en fazla 10 kafes yerleştirilebilen genişlemiş platformlu (67 cm x 110 cm) elektrik kontrollü bir yörünge rotor hazırlayın.
- Farelerin günlük uykularının çoğunu sergilediği zaman olan bir program zamanlayıcısı tarafından kontrol edilen ışık AÇIK fazı (8:00 AM-8:00 PM) sırasında yörünge rotorunun açık olduğunu ayarlayın.
- Yörünge rotorunu 110 rpm hıza ve katı hal zamanlayıcı ile kontrol edilen 10 s-on, 110 s-off tekrarlayan bir döngüye sahip ayarlayın.
NOT: Platformun yük kapasitesi 50 kg'dır. Rotor ufkunun titreşen sabit genliği 2,5 cm'dir. - Platform dönüşlerinde kafeslerin yerinden çıkmasını önlemek için CSF kafeslerini rotor platformunun üzerine kalın yaylarla sabitleyin.
3. Kronik uyku parçalanması modelleme ve izleme
- Farelerin ortam ortamına uyum sağlaması için CSF ve kontrol farelerinin kafeslerini deneylerden önce bir hafta boyunca modelleme odasına yerleştirin.
- Modellemenin başlangıcında, tüm farelerin yörüngesel dönüşler sırasında yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olduğundan emin olun.
- Modellemenin başında, yörünge rotorunun dişli olarak çalıştığından emin olmak için en az 1 saat gözlemleyin.
- Modelleme sırasında, yörünge rotorunun düzgün çalıştığını ve farelerin yeterli yiyecek ve suya sahip olduğundan emin olmak için her 2 günde bir fare koşullarını kontrol edin. Kafes yataklarını haftalık olarak değiştirin.
- Modelleme sırasında, yatakları değiştirirken fareleri haftalık olarak 08:00'de tartın. Önemli kilo kaybı olan fareleri modellemeden ve ayrıca deneysel gruplardan çıkarın.
NOT: Önemli kilo kaybı, 2 hafta süren 20 g'dan daha az ağırlık olarak tanımlanır. - Tüm modelleme seansları sırasında, varsa saldırganı kafesten ve ayrıca deneysel gruplardan çıkarın.
- Modellemenin sona ermesinden sonra, fareleri orijinal odada korumaya ve beslemeye devam edin.
4. Morris su labirenti (MWM) testi
- Teste hazırlık
- Ilık suyla (20-23 °C) dolu dairesel bir tankın aparatını hazırlayın.
- Uzaktan görüş referansı olarak tankı çevreleyen perdede farklı şekil ve renklere sahip dört işareti dört çeyrek yönde askıya alın. Toz süt ilavesi ile suyun opak görünmesini sağlayın.
- Güneybatı çeyreğinin ortasında bir platform bulun.
- Eğitim testi
- Fareleri 5 günlük bir eğitim süresi boyunca her gün 08:00 ile 12:00 arasında ardışık dört denemeye tabi edin.
- Her fareyi dört denemede dört kadrandan birinde yan duvara bakan suya bırakın. Her denemede, platformu bulmak için farenin 60 s yüzmesine izin verin. Fare platforma 60 s içinde ulaşamazsa, platforma yönlendirin ve 15 s boyunca orada kalmaya devam edin.
- Gizli platformu bulmak için farelerin kaçış gecikmesini otomatik olarak kaydetmek için bir video izleme sistemi kullanın.
- Prob testi
- Prob testini 5 eğitim gününden sonraki altıncı günde gerçekleştirin.
- Platformu kaldırın. Her fareyi kuzeydoğu çeyreğinden serbest bırakın ve 60 sn yüzmesine izin verin
- Farelerin izleme verilerini otomatik olarak kaydetmek için bir video izleme sistemi kullanın.
5. Yeni nesne tanıma (NOR) testi
- Tanıdık aşama
- Fareleri, iki nesne kopyası (A1 ve A2) içeren sırayla bir tanka (uzunluk 30 cm, genişlik 28 cm, yükseklik 35 cm) yerleştirin. Farelerin serbestçe keşfetmesine izin verin (deneme başına 10 dk).
- Farelerin izleme verilerini otomatik olarak kaydetmek için bir video izleme sistemi kullanın.
- Test aşaması
- Tanıdık fazın 1 saat gecikmesi sonrasında test denemesini gerçekleştirin. Orijinal nesnelerden birini, diğerini değiştirmeden tanktaki yeni bir nesneyle ("roman") değiştirin. Fareleri tanka geri verin ve deneme başına 5 dakika boyunca keşfetmesine izin verin.
- Her fare tarafından her nesnenin keşfinde harcanan zamanı otomatik olarak kaydetmek için bir video izleme sistemi kullanın.
NOT: Nesnenin keşfi, burnu nesneye doğru ve nesneden 1 cm'den daha az bir mesafeye doğru yönlendirirken vibrissae'yi yalayarak, koklayarak, çiğneyerek veya hareket ettirerek belirlenir. Ayrımcılık Endeksi (DI), TN = "novel" nesnesini keşfetmek için harcanan zaman ve TF = "tanıdık" nesneyi keşfetmek için harcanan zaman olan denklem (TN − TF)/(TN + TF) ile hesaplanır.
6. Açık alan testi (OFT)
- Bir tankın aparatını hazırlayın (30 cm x 28 cm x 35 cm).
- Test sırasında, her fareyi tankın ortasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin. Önceki farenin arta kalan etkilerini önlemek için her denemeden sonra tankı% 75 etanol ile temizleyin.
- Farelerin izleme verilerini otomatik olarak kaydetmek için bir video izleme sistemi kullanın.
7. Zorla yüzme testi (FST)
- 15 cm derinliğinde su (20-23 °C) içeren açık silindirik bir kabın aparatını hazırlayın.
- Test sırasında, her fareyi silindire yerleştirin ve 6 dakika boyunca orada kalmasına izin verin.
- Her fare tarafından testin son 4 dakikası boyunca hareketsizlik süresini otomatik olarak kaydetmek için bir video izleme sistemi kullanın.
NOT: Fare, çırpınma durduğunda ve suda yüzdüğünde hareketsiz olmaya kararlıdır, bu da sadece başını suyun üzerinde tutmak için gerekli hareketleri sağlar.
8. Veri Analizi
- İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak verileri analiz edin (örneğin, GraphPad Prizması 6.0).
- Tüm verileri ortalama ± SEM olarak ifade edin.
- İki yönlü ANOVA kullanan iki grup arasındaki MWM testinde kaçış gecikmesini tekrarlanan önlemlerle ve ardından Bonferroni posttestleriyle karşılaştırın. CSF ve denetim grupları arasındaki diğer karşılaştırmalar eşleşmeyen t testleri ile belirlenir.
- Tüm testlerde P < 0.05 ise farkları önemli olarak düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm temsili sonuçlar ve rakamlar son yayınımızdan çoğaltıldı21. Rakamların yeniden kullanımına orijinal dergi tarafından izin verildi.
Tüm deneysel tasarım, CSF modellemesinin, MWM, NOR, OFT ve FST'nin davranış testlerinin zamanlamasını gösteren zaman sırasına göre gösterilmiştir (Şekil 1A). Modelleme seansları sırasında genel durumlarını izlemek için CSF ve kontrol gruplarından her hafta fare ağırlıkları elde ettik. Modelleme sırasında iki grup arasındaki farelerdeki ağırlık artışında belirgin bir fark bulunmadı (Şekil 1B).
CSF'nin mekansal öğrenme ve bellek performansı üzerindeki etkilerini değerlendirmek için MWM davranışsal deneme43,44. CSF grubu, kontrol grubuna kıyasla 5 eğitim günü boyunca platformu bulmak için daha zayıf kaçış kapasiteleri gösterdi (Şekil 2A). Prob testinde, CSF fareleri hedeflenen çeyrekte önemli ölçüde daha az zaman harcadılar ve önceki platform konumunu yüzme hızı farkı olmadan daha az kez geçtiler (Şekil 2B,C). Yukarıdaki sonuçlar, farelerin mekansal öğrenme ve hafıza alma yeteneklerinin CSF'den sonra bozulmuş olduğunu gösterdi.
Ayrıca CSF45'densonra nesne tanıma ve kısa süreli çalışma belleğini değerlendirmek için NOR testi yaptık. Bilindik aşamada, CSF ve kontrol grubu arasındaki toplam keşif süresinde önemli bir fark yoktu (Şekil 3A). Buna bağlı olarak, A1 ve A2 nesneleri arasındaki keşif süresinde sırasıyla iki grupta herhangi bir fark bulunmadı (Şekil 3B). Yukarıdaki sonuçlar, farelerin keşif yeteneklerinde ve konum tercihlerinde herhangi bir fark olmadığını garanti etti. Test aşamasında, CSF farelerinin Ayrımcılık Endeksi (DI), CSF'den sonra nesne tanıma ve kısa süreli çalışma belleğindeki açıkları açıkça gösteren kontrollere (Şekil 3C) göre önemli ölçüde azaltılmıştır.
Farelerin anksiyete ve depresyon benzeri davranışlarını incelemek için sırasıyla OFT ve FST'yi gerçekleştirdik46,47. İlginçtir ki, OFT'de, CSF grubunun merkezi bölgede kontrol grubundan daha az zaman geçirdiği bulunmuştur (Şekil 4A), bu da uyku parçalanmasının belirli bir ölçüde anksiyete benzeri davranışlara neden olabileceğini göstermektedir. Ek olarak, CSF fareleri tankta taşınan daha uzun toplam mesafe sergiledi (Şekil 4B), modellemeden sonra spontan aktivitenin arttığını düşündürdü. Bununla birlikte, bu CSF modellemesi, FST'ye tabi tutulan iki grup arasındaki hareketsizlik süresindeki önemli olmayan farkla doğrulanan depresyon benzeri davranışlara neden olamazdı (Şekil 4C).
Şekil 1: Deneysel tasarım prosedürünün akış çizelgesi. (A) CSF modelleme ve davranış testlerinin (örneğin, MWM, NOR, OFT ve FST) zamanlamasını gösteren deneysel tasarım prosedürü. (B) CSF modeli kurulduktan sonraki ilk ay boyunca CSF ve kontrol farelerinin vücut ağırlığı eğrileri. Bu rakam Xie ve ark.21'dendeğiştirilmiştirBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MWM testi ile değerlendirilen CSF bozulmuş mekansal öğrenme ve hafıza yetenekleri. (A) CSF fareleri, 5 günlük eğitim testi sırasında kontrol farelerine kıyasla daha uzun kaçış gecikmesi gerçekleştirdi. **p < 0,01. (B) Prob testinde, CSF fareleri kontrol farelerinin aksine platform çeyreğinde daha az zaman harcadı. Üst panelde iki grubun temsili izlemeleri gösterilir. p < 0,0001. (C) Prob testinde, CSF grubu kontrol grubuna kıyasla platform konumunu daha az kez geçti. *p < 0,05. (D) Prob testinde iki grubun yüzme hızı. n.s. farklı gruplar arasındaki değişikliklerin önemli olmadığını gösterir. Verilerin tümü grup başına ortalama ± SEM. n = 10 olarak sunuldu. Bu rakam Xie ve ark.21'dendeğiştirilmiştirBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CSF bozulmuş nesne tanıma ve nor testi tarafından değerlendirilen kısa süreli çalışma belleği. (A) CSF ile tanıdık fazdaki kontrol fareleri arasındaki toplam keşif süresi, n.s. farklı gruplar arasında önemli bir değişiklik olmadığını gösterir. (B) Tanıdık fazdaki iki grup arasında sırasıyla A1 ve A2 nesnelerinin keşif süresi. n.s. farklı gruplar arasında önemli bir değişiklik olmadığını gösterir. (C) Test aşamasında, CSF grubunun Ayrımcılık Endeksi (DI) kontrol grubuna göre önemli ölçüde azaldı. *p < 0,05. Verilerin tümü grup başına ortalama ± SEM. n = 10 olarak sunuldu. Bu rakam Xie ve ark.21'dendeğiştirilmiştirBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CSF, OFT ve FST tarafından değerlendirilen anksiyete benzeri ancak depresyon benzeri olmayan davranışları şiddetlendirdi. (A) CSF fareleri, gözlenen 5 dakika boyunca oft'taki kontrol farelerine kıyasla merkez bölgede daha az zaman geçirdi. *p < 0,05. (B) CSF grubu tankta taşınan toplam mesafeyi OFT'deki kontrol grubuna göre daha uzun süre görüntüledi. *p < 0,05. (C) CSF ile FST'deki kontrol grupları arasındaki hareketsizlik süresi. n.s. farklı gruplar arasında önemli bir değişiklik olmadığını gösterir. Verilerin tümü grup başına ortalama ± SEM. n = 10 olarak sunuldu. Bu rakam Xie ve ark.21'dendeğiştirilmiştirBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokoldeki kritik adımlar arasında, çalışma amacına göre optimize edilmiş parametrelerle uyku parçalanma makinelerinin kurulması ve tüm modelleme seansları boyunca farelerin rahat ve sessiz bir yaşam ortamında tutulması yer almaktadır. Uyku parçalanmasını kesmek veya durdurmak ve bu fareler için davranış testleri düzenlemek için uygun zamanlamaya karar vermek de çok önemlidir. Diğer uyku manipülasyon modelleri gibi, protokolü kontrollü ışık döngüleri ve olası tüm gereksiz parazitlerin boşluğu ile özel bir odada gerçekleştirmek önemlidir. Gürültüyü önlemek ve araştırmacıların kontrol etmek, yiyecekleri doldurmak ve su temini, yatak takımlarını değiştirmek vb. Nadir durumlarda, özellikle rahatsız edici uyku kesintisi seanslarının başlatılmasında çöp arkadaşlarına saldıran saldırganlar vardır. Mevcut olduğunda saldırgan, deneysel grupların yanı sıra ev kafeslerinden çıkarılmalıdır. Deneyimlerimiz dışında deney hayvanlarının çoğu, tedaviye uyum sağlayacak ve gerektiğinde suya ve yiyeceğe erişmeyi başaracaktı. Deforme olmuş dişler, az kilolu ve cilt yaraları gibi içsel sorunları olan fareler kilo kaybına veya zayıflığa neden olabilir. Ayrıca modelleme için kullanılmaktan kaçınılması gerekir. Bu protokol potansiyel olarak kronik strese ve metabolik düzensizliği teşvik edebileceği için, modelleme ve deneyler için vücut ağırlığı gibi tek tip kriterlerle taranmış farelerin kullanılması esastır.
Açıklanan protokolde, yörünge rotorunun günlük 08:00-20:00 (LIGHT-ON) sırasında otomatik olarak açılacağı, bu da farelerin günlük yaşamlarının çoğunu sergiledikleri zamandır. Rotor, sık uyarılmalara neden olmak için light-ON fazı sırasında 10 s-on, 110 s-off tekrarlayan bir döngüde çalıştırıldı. Çeşitli modelleme süreleri farklı fenotiplere yol açtır. Akut uyku parçalanması, uyku süresinde mutlak azalmaya, kortizon seviyelerinin yükselmesi ve insülin duyarlılığının bozulması gibi sempatik sinir sistemi aktivitelerinin artmasına neden olabilir23,24. Bununla birlikte, kronik uyku parçalanması etkilenmemiş kortizon seviyeleri gösterdi ve dengeli toplam uyku süresi24. Işık döngüleri, eşleşen titreşim ayarları (hız, genlik, tekrarlayan döngü vb.) ve modelleme süreleri gibi mevcut protokole dayalı herhangi bir değişiklik, fenotipleri potansiyel olarak değiştirebilir. Uyku fenotiplerini tanımlamak için farklı modelleme ayarları altında uyku kaydı ve uyku yapısı analizi yapılması gerekmektedir. Ayrıca belirgin davranışsal ve patolojik değişikliklere neden olabilir. Bir gecelik uyku parçalanması yerine uzun süreli uyku parçalanmasının ardından bilişsel açığı araştırdığımız ve aralıklı uyku parçalanmasının MWM ve NOR'deki fare davranışları üzerindeki önyargılı etkilerinden kaçınma eğiliminde olduğumuz için, CSF protokolünü 60. günde sonlandırdıktan sonra bu iki davranışsal testi gerçekleştirdik. Bununla birlikte, kaçınılmaz olarak, farelerde iyileşme uykusunun etkisi MWM ve NOR için sonuçları karıştırmış olabilir.
Bu model uyku parçalanma modeli ile hak kazansa da, aslında ışık-ON aşamasında parçalanmış uyku düzenlerinden, sirkadiyen ritmin düzensizliğinden ve ışık-KAPI aşamasında telafi edici uyku geri tepmelerinden oluşur. Bu protokol sadece uyku düzeni değişikliklerine değil, aynı zamanda önemli nöroinflamasyon, metabolik dengesizlik, bağışıklık sistemi bozukluğuvb. Tüm bu patolojik süreçler birbiriyle etkileşime girebilir ve bir orkestra gibi fenotiplere aracılık edebilir. Bu model, genç vahşi tip farelerde düzensiz uyku düzeni, bilişsel açık ve anksiyete benzeri davranış fenotipleri olan fareleri oluşturmak için bir bütün olarak alınmalıdır. Önceki bölümde belirtildiği gibi, bu model tekrarlayan hipoksi eksikliği nedeniyle OSA'yı tam olarak yansıtmıyor. Başka bir sınırlama, aynı farelerde doğru patolojik değişiklikler ve uyku fenotipleri üretmenin zor olmasıdır. Uyku kaydı için yaygın olarak uygulanan EEG/ EMG elektrot implantasyonu, kortekste kaçınılmaz olarak indüklenen şiddetli glioz48. Son yıllarda, invaziv elektrot implantasyonu olmadan hassas uyku bilgilerini toplayacak uyku çalışmalarında yapay zekaya dayalı video izleme ve görüntü analizi teknikleri uygulanmıştır49,50,51.
Bu CSF yönteminin mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında önemi şunlardır: 1) Genellikle saatlerce veya günlerce gerçekleştirilen uyku yoksunluğu protokollerinden farklı olarak, mevcut protokol sağlıklı insanlarda uzun süreli uyku bozukluğunı daha iyi taklit eder. Uyku parçalanmış farelerde telafi edici uyku ribaundu, gece boyunca düşük uyku kalitesine sahip kişilerde gündüz somnolence ve geciktirici çalışma performansını mükemmel bir şekilde yansıtır52,53. 2) Şimdiye kadar, doğrulanmış bilişsel eksikliği ve anksiyete benzeri ancak depresyon benzeri davranış fenotipleri olmayan genç vahşi tip farelerde ve beyin dokusunda belirgin moleküler patolojik değişikliklere sahip tek kronik uyku parçalanma modelidir. 3) Bu tedavi farelere daha hafif tahrişlere neden olur, böylece modelleme daha uzun sürelerde yapılma olasılığı olsa bile aylarca sürebilir. 4) Uygun ayarlarla, bu model, farklı çalışma tasarımları için hastalık modelleri veya müdahaleler olarak kullanılabilecek uyku bozukluğu, bilişsel eksiklik ve anksiyete benzeri davranışların kararlı fenotiplerini oluşturabilir. 5) Bazı uyku yoksunluğu modelleri, nazik kullanım veya yeni nesneler uygulamak için araştırmacılar tarafından tam oturum paraziti gerektirir. Düzenli izleme dışında, bu yöntem işleme emeklerini en aza indirir, bu da yapay önyargıyı ortadan kaldırır.
Bu CSF protokolü, kronik uyku bozukluğu nörodejeneratif hastalıkların nedeni veya sonucu mudur gibi bir dizi önemli bilimsel soruyu yanıtlama fırsatı sağlar? Genç yaşta kronik uyku bozukluğuna bağlı patogenez geri dönüşümlü mü? Kronik uyku bozukluğu üzerine telafi edici mekanizmalar gençler ve yaşlılar, sağlıklı insanlar ve hastalar arasında farklılık gösterir mi? Bu protokol, davranışsal ve moleküler fenotiplerin şiddetini ve iyileşmesini değerlendirerek terapötikleri araştırmak için de uygulanabilir. Ayrıca, fonksiyonel kayıtlar için kronik kraniektomi, optik fiber implantasyon preparatları olan fareleri modellemek için de uygulanacaktır. Ayrıca, muhtemelen önceden var olan koşulların üzerine fenotipleri teşvik etmek veya ağırlaşmak için girişimsel strateji olarak kullanılabilir. Son olarak, uyku-uyanıklık durumu geçiş mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. İlginçtir ki, mevcut CSF modeli farelerde depresyon benzeri davranışlar yerine anksiyete benzeri davranışlara neden olabilir, bu da hastalardaki uyku bozukluğunun muhtemelen depresyondan çok daha fazla anksiyete ile ilişkili olacağı klinik gözlemi ile uyumludur54,55. Kemirgenlerdeki duygusal bozuklukları incelemek için pratik bir model sağlar.
Özetle, genç vahşi tip farelerde kararlı fenotipler üretebilen ve modelleme emeklerini yüksek verimlilikle en aza indirebilen titreşimli bir yörünge rotor kullanılarak kronik uyku parçalanmasını modelleme protokolünü sunuyoruz. Çeşitli araştırma amaçları için potansiyel olarak üretilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (W. Wang'a 61327902-6 ve F.F. Ding'e 81801318) tarafından desteklendi. Dr. Sigrid Veasy'yi SF deneysel sistemini kurduğu ve teknik detayları sağladığı için kabul ediyoruz. Dr. Maiken Nedergaard'ı ilgili deneyler için öğretici yorumları için kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Any-maze behavior tracking system | Stoelting,Inc,USA | - | A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice. |
| C57BL/6J mice | Hubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China. | - | healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals |
| Graphpad Prism 6.0 Software | Graphpad Software,Inc.USA | - | Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs. |
| Morris water maze system | Shanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,China | XR-XM101 | The system was used to perform Morris water maze test |
| Orbial rotor | Shanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,China | SPH-331 | The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model |
| Solid state timer | OMRON Corporation, Kyoto, Japan | H3CR-F8-300 | The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running |
| Wooden Lusterless Tank | - | - | length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test |
References
- Peter-Derex, L., Yammine, P., Bastuji, H., Croisile, B.
- Mathias, J. L., Cant, M. L., Burke, A. L. J. Sleep disturbances and sleep disorders in adults living with chronic pain: a meta-analysis. Sleep Medicine. 52, 198-210 (2018).
- Murphy, M. J., Peterson, M. J.
- Walter, L. M., et al. Sleep disturbance in pre-school children with obstructive sleep apnoea syndrome. Sleep Medicine. 12 (9), 880-886 (2011).
- Helfand, B. T., et al. The relationship between lower urinary tract symptom severity and sleep disturbance in the CAMUS trial. Journal of Urology. 185 (6), 2223-2228 (2011).
- Kimoff, R. J. Sleep fragmentation in obstructive sleep apnea. Sleep. 19 (9), Suppl 61-66 (1996).
- Dhondt, K., et al. Sleep fragmentation and periodic limb movements in children with monosymptomatic nocturnal enuresis and polyuria. Pediatric Nephrology. 30 (7), Berlin, Germany. 1157-1162 (2015).
- Young, T., Peppard, P. E., Gottlieb, D. J. Epidemiology of obstructive sleep apnea: a population health perspective. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (9), 1217-1239 (2002).
- Peppard, P. E., et al. Increased prevalence of sleep-disordered breathing in adults. American Journal of Epidemiology. 177 (9), 1006-1014 (2013).
- Marcus, C. L., et al. Diagnosis and management of childhood obstructive sleep apnea syndrome. Pediatrics. 130 (3), 714-755 (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), New York, N.Y. 373-377 (2013).
- Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. 65 (2), 106-119 (2019).
- Stickgold, R., Walker, M. P. Memory consolidation and reconsolidation: what is the role of sleep. Trends in Neurosciences. 28 (8), 408-415 (2005).
- Stickgold, R.
- Aalling, N. N., Nedergaard, M., DiNuzzo, M. Cerebral Metabolic Changes During Sleep. Current Neurology and Neuroscience Reports. 18 (9), 57 (2018).
- Rempe, M. J., Wisor, J. P. Cerebral lactate dynamics across sleep/wake cycles. Frontiers in Computational Neuroscience. 8, 174 (2014).
- Kang, J. E., et al. Amyloid-beta dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (5955), New York, N.Y. 1005-1007 (2009).
- Minakawa, E. N., et al. Chronic sleep fragmentation exacerbates amyloid beta deposition in Alzheimer's disease model mice. Neuroscience Letters. 653, 362-369 (2017).
- Qiu, H., et al. Chronic Sleep Deprivation Exacerbates Learning-Memory Disability and Alzheimer's Disease-Like Pathologies in AβPP(swe)/PS1(ΔE9) Mice. Journal of Alzheimer's Disease : JAD. 50 (3), 669-685 (2016).
- Holth, J. K., et al. The sleep-wake cycle regulates brain interstitial fluid tau in mice and CSF tau in humans. Science. 363 (6429), New York, N.Y. 880-884 (2019).
- Xie, Y., et al. Chronic sleep fragmentation shares similar pathogenesis with neurodegenerative diseases: Endosome-autophagosome-lysosome pathway dysfunction and microglia-mediated neuroinflammation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 26 (2), 215-227 (2020).
- Ba, L., et al. Distinct Rab7-related Endosomal-Autophagic-Lysosomal Dysregulation Observed in Cortex and Hippocampus in APPswe/PSEN1dE9 Mouse Model of Alzheimer's Disease. Chinese Medical Journal (England). 130 (24), 2941-2950 (2017).
- Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
- Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
- Misrani, A., et al. Differential effects of citalopram on sleep-deprivation-induced depressive-like behavior and memory impairments in mice. Progress Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 88, 102-111 (2019).
- Xu, A., et al. Roles of hypothalamic subgroup histamine and orexin neurons on behavioral responses to sleep deprivation induced by the treadmill method in adolescent rats. Journal of Pharmacological Sciences. 114 (4), 444-453 (2010).
- Saito, L. P., et al. Acute total sleep deprivation potentiates amphetamine-induced locomotor-stimulant effects and behavioral sensitization in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 117, 7-16 (2014).
- Spano, G. M., et al. Sleep Deprivation by Exposure to Novel Objects Increases Synapse Density and Axon-Spine Interface in the Hippocampal CA1 Region of Adolescent Mice. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (34), 6613-6625 (2019).
- Morrow, J. D., Opp, M. R. Sleep-wake behavior and responses of interleukin-6-deficient mice to sleep deprivation. Brain, Behavior, and Immunity. 19 (1), 28-39 (2005).
- Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
- Aleisa, A. M., Alzoubi, K. H., Alkadhi, K. A. Post-learning REM sleep deprivation impairs long-term memory: reversal by acute nicotine treatment. Neuroscience Letters. 499 (1), 28-31 (2011).
- Zagaar, M., Dao, A., Alhaider, I., Alkadhi, K. Regular treadmill exercise prevents sleep deprivation-induced disruption of synaptic plasticity and associated signaling cascade in the dentate gyrus. Molecular and Cellular Neurosciences. 56, 375-383 (2013).
- McKenna, J. T., et al. Sleep fragmentation elevates behavioral, electrographic and neurochemical measures of sleepiness. Neuroscience. 146 (4), 1462-1473 (2007).
- Tartar, J. L., et al. Hippocampal synaptic plasticity and spatial learning are impaired in a rat model of sleep fragmentation. The European Journal of Neuroscience. 23 (10), 2739-2748 (2006).
- Guzman-Marin, R., Bashir, T., Suntsova, N., Szymusiak, R., McGinty, D. Hippocampal neurogenesis is reduced by sleep fragmentation in the adult rat. Neuroscience. 148 (1), 325-333 (2007).
- Nair, D., et al. Sleep fragmentation induces cognitive deficits via nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-dependent pathways in mouse. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (11), 1305-1312 (2011).
- McCoy, J. G., et al. Experimental sleep fragmentation impairs attentional set-shifting in rats. Sleep. 30 (1), 52-60 (2007).
- Dumaine, J. E., Ashley, N. T. Acute sleep fragmentation induces tissue-specific changes in cytokine gene expression and increases serum corticosterone concentration. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (12), 1062-1069 (2015).
- Carreras, A., et al. Chronic sleep fragmentation induces endothelial dysfunction and structural vascular changes in mice. Sleep. 37 (11), 1817-1824 (2014).
- Khalyfa, A., et al. Circulating exosomes potentiate tumor malignant properties in a mouse model of chronic sleep fragmentation. Oncotarget. 7 (34), 54676-54690 (2016).
- Ferreira, C. B., Cravo, S. L., Stocker, S. D. Airway obstruction produces widespread sympathoexcitation: role of hypoxia, carotid chemoreceptors, and NTS neurotransmission. Physiological Reports. 6 (3), (2018).
- Tripathi, A., et al. Intermittent Hypoxia and Hypercapnia, a Hallmark of Obstructive Sleep Apnea, Alters the Gut Microbiome and Metabolome. mSystems. 3 (3), (2018).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research. Brain Research Reviews. 36 (1), 60-90 (2001).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. Examining object location and object recognition memory in mice. Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).
- Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Open Field Test for Measuring Locomotor Activity and Anxiety-Like Behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
- Porsolt, R. D., Bertin, A., Blavet, N., Deniel, M., Jalfre, M. Immobility induced by forced swimming in rats: effects of agents which modify central catecholamine and serotonin activity. European Journal of Pharmacology. 57 (2-3), 201-210 (1979).
- Hauglund, N. L., Kusk, P., Kornum, B. R., Nedergaard, M. Meningeal Lymphangiogenesis and Enhanced Glymphatic Activity in Mice with Chronically Implanted EEG Electrodes. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- Nguyen-Michel, V. H., et al. Rapid eye movement sleep behavior disorder or epileptic seizure during sleep? A video analysis of motor events. Seizure. 58, 1-5 (2018).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31 (11), 1587-1598 (2008).
- Abad, J., et al. Automatic Video Analysis for Obstructive Sleep Apnea Diagnosis. Sleep. 39 (8), 1507-1515 (2016).
- Sandlund, C., Hetta, J., Nilsson, G. H., Ekstedt, M., Westman, J. Impact of group treatment for insomnia on daytime symptomatology: Analyses from a randomized controlled trial in primary care. International Journal of Nursing Studies. 85, 126-135 (2018).
- Shekleton, J. A., Rogers, N. L., Rajaratnam, S. M. Searching for the daytime impairments of primary insomnia. Sleep Medicine Reviews. 14 (1), 47-60 (2010).
- Dixon, L. J., Lee, A. A., Gratz, K. L., Tull, M. T. Anxiety sensitivity and sleep disturbance: Investigating associations among patients with co-occurring anxiety and substance use disorders. Journal of Anxiety Disorders. 53, 9-15 (2018).
- Press, Y., Punchik, B., Freud, T. The association between subjectively impaired sleep and symptoms of depression and anxiety in a frail elderly population. Aging Clinical and Experimental Research. 30 (7), 755-765 (2018).
