Presentert her er en analyse for å kvantifisere somatisk hypermutasjon i immunglobulin tungt kjede gen locus ved hjelp av germinal senter B celler fra musen Peyers flekker.
Innenfor de germinale sentrene av lymfoide organer endrer modne B-celler deres uttrykte immunglobulin (Ig) ved å introdusere ikke-templaterte mutasjoner i de variable kodingseksonene til Ig heavy and light chain gene loci. Denne prosessen med somatisk hypermutasjon (SHM) krever enzymet aktiveringsindusert cytidin deaminase (AID), som konverterer deoksycytidiner (C), til deoksyuridiner (U). Behandling av AID-genererte U:G-uoverensstemmelser i mutasjoner av de grunnleggende eksisjons- og mismatchreparasjonsveiene introduserer nye Ig-kodesekvenser som kan gi en høyere affinitet iG. Mutasjoner i AID- eller DNA-reparasjonsgener kan blokkere eller endre mutasjonstypene som observeres i Ig loci betydelig. Vi beskriver en protokoll for å kvantifisere JH4 intronmutasjoner som bruker fluorescensaktivert cellesortering (FACS), PCR og Sanger-sekvensering. Selv om denne analysen ikke direkte måler Ig affinitetsmodning, indikerer den mutasjoner i Ig-variable kodesekvenser. I tillegg bruker disse metodene vanlige molekylærbiologiske teknikker som analyserer mutasjoner i Ig-sekvenser av flere B-cellekloner. Dermed er denne analysen et uvurderlig verktøy i studiet av SHM og Ig diversifisering.
B-celler, medlemmer av det adaptive immunsystemet, gjenkjenner og eliminerer antigener ved å produsere antistoffer, også kjent som immunglobuliner (Ig). Hver Ig består av to tunge (IgH) og to lette (IgL) kjedepolypeptider, som holdes sammen av disulfidbindinger for å danne den karakteristiske “Y” formstrukturen til Ig1. N-termini av IgH og IgL utgjør variabelen (V) regionen av hvert polypeptid og sammen danner de antigenbindingsstedet til Ig, mens den konstante regionen IgH gir effektorfunksjonen til Ig. Utvikling av B-celler i benmargen omorganiserer V-kodeeksonene til IgH og IgL i en prosess kjent som V(D)J rekombinasjon2,3,4. Transkripsjon av de rekombinerte V-eksonene, kombinert med de respektive konstante region exons, danner mRNA som er oversatt til Ig.
Eldre B-celler som uttrykker en membranbundet Ig, også kjent som en B-cellereseptor (BCR), sirkulerer til sekundære lymfoide organer, for eksempel milten, lymfeknuten eller Peyers flekker, hvor de kartlegger miljøet for antigener og samhandler med andre celler i immunsystemet1. Innenfor germinalsentrene (GC) av sekundære lymfoide organer blir B-celler som gjenkjenner antigen gjennom BCR aktivert. Støttet av follikulære dendrittiske celler og follikulære hjelper T-celler, kan aktiverte B-celler deretter spre seg og skille seg ut i plasma- og minneceller, som er viktige effektorer av en robust immunrespons5,6,7,8,9. I tillegg kan disse aktiverte B-cellene gjennomgå sekundære Ig-gendiversifiseringsprosesser – klassebryterrekombinasjon (CSR) og somatisk hypermutasjon (SHM). Under CSR utveksler B-celler standard μ konstant region i IgH-polypeptidet med et annet konstant område (γ, α, ε) gjennom en DNA-slette-rekombinasjonsreaksjon (figur 1). Dette gjør det mulig å uttrykke en annen konstant exon og oversettelse av en ny Ig. B-cellen bytter fra å uttrykke IgM til en annen isotype (IgG, IgA, IgE). CSR endrer effektorfunksjonen til Ig uten å endre dens antigenspektifisitet10,11,12. Under SHM muterer imidlertid B-celler V-kodeområdene IgH og IgL for å muliggjøre produksjon og valg av høyere affinitets-Igs, noe som mer effektivt kan eliminere et antigen13,14,15 ( figur1). Det er viktig at både CSR og SHM er avhengige av funksjonen til ett enzym: aktiveringsindusert cytidindeaminase (AID)16,17,18. Mennesker og mus mangelfull i AID kan ikke fullføre CSR eller SHM og presentere med forhøyede IgM serumtitler eller Hyper-IgM17,19.
I CSR deaminerer AID deoksycytidiner (C) i de repeterende bryterområdene som kommer før hver konstante kodeeksoner, og konverterer dem til deoksyuridiner (U)20,21, som skaper uovertruffen baseparing mellom deoksyuridiner og deoksyguanosiner (U:G). Disse U:G-uoverensstemmelsene konverteres til dobbeltstrengede DNA-pauser, som kreves for DNA-rekombinasjon, enten ved base excision repair (BER) eller mismatch repair (MMR) pathway22,23,24,25,26,27,28,29. I SHM deaminerer AID C i V-kodeeksonene. Replikasjon på tvers av U:G-uoverensstemmelsen genererer C:G til T:A-overgangsmutasjoner, mens fjerning av uracil-basen av BER-proteinet, uracil DNA glykosylase (UNG), før DNA-replikasjon produserer både overgangs- og transversjonsmutasjoner16. Nullmutasjoner i UNG øker C:G til T:A-overgangsmutasjoner21,22. I likhet med CSR krever SHM de komplementære rollene til MMR og BER. Under SHM genererer MMR mutasjoner ved A:T-basispar. Aktivering av mutasjoner i MutS-homologi 2 (MSH2) eller DNA-polymerase η (Polη) reduserer mutasjoner betydelig ved A:T-baser og sammensatte mutasjoner i MSH2 og Polη avskaffer nesten mutasjoner ved A:T-baser21,30,31. I samsvar med den kritiske rollen ber og MMR har i konverteringen av AID-generert U til overgangs- eller transversjonsmutasjoner, viser musene som mangler for både MSH2 og UNG (MSH2-/-UNG-/-) bare C:G til T:A-overgangsmutasjoner som følge av replikering på tvers av U:G-konflikten21.
Analysen av SHM i V-koderegioner forblir komplisert fordi utvikling av B-celler kan rekombinere noen av V (D)J-kodeeksonene i IgH og IgL loci1,2,4. Nøyaktig analyse av disse unikt rekombinerte og somatisk muterte V-områdene krever identifisering og isolering av kloner av B-celler eller Ig mRNA11,13. JH4 intron, som er 3 ‘ av den siste J-koding exon i IgH locus, havner somatiske mutasjoner på grunn av spredning av mutasjoner 3’ av V-promotoren32,33,34 og brukes derfor ofte som surrogatmarkør for SHM i V-regioner31,35 ( Figur1). For å eksperimentelt belyse hvordan spesifikke gener eller genetiske mutasjoner endrer SHM-mønstre eller -rater, kan JH4-intronen sekvenseres fra Peyers patcher (PP) germinalsenter B-celler (GCBCer), som gjennomgår høye hastigheter på SHM36,37,38. GCBCer kan lett identifiseres og isoleres med fluorescerende konjugerte antistoffer mot celleoverflatemarkører (B220+PNAHI)17,39.
En detaljert protokoll presenteres for å karakterisere JH4-intronmutasjoner i PP GCBCer fra mus ved hjelp av en kombinasjon av FACS (fluorescensaktivert cellesortering), PCR- og Sanger-sekvensering (figur 2).
Karakterisering av SHM i IgH- og IgL V-kodesekvensene til en heterogen B-cellepopulasjon utgjør en utfordring, gitt at hver B-celle unikt omorganiserer V-kodingssegmenter under V (D)J rekombinasjon34. I dette dokumentet beskriver vi en metode for å identifisere mutasjoner i JH4-intronet til GCBCer. JH4-intronen, som ligger 3 av det siste J-kodesegmentet i IgH-locus, brukes som surrogat for SHM i V-regioner (figur 1)31,33,34,35. For å katalogisere disse JH4 intronmutasjonene og vurdere hvordan spesifikke gener påvirker produksjonen eller mønsteret av mutasjoner, analyseres PP GCBC-er spesielt. Disse cellene akkumulerer JH4 intronmutasjoner som følge av kronisk stimulering ved tarmmikrobiota53. Videre har B220+PNAHI GCBC fra PPs av uimmuniserte mus et mutasjonsspektra som sammenligner med miltika GCBCer fra immuniserte dyr54,55. Mutasjoner i JH4-intronen kan imidlertid ikke korreleres med Ig-affinitetsmodning fordi disse mutasjonene ikke er koding.
For å avgjøre om SHM endrer Ig affinitet, bør mus immuniseres intraperitonealt med et antigen, for eksempel NP (4-hydroksy-3-nitrophenylacetyl) konjugert til CGG (kylling gamma globulin) eller KLH (nøkkelhull limpet hemocyanin)56. Deretter kan mRNA renses fra milt B220+PNAHI GCBCer for å undersøke SHM innen VH186.2, V-kodeeksonen som oftest gjenkjenner NP og er mutert etter NP-CGG eller NP-KLH-immunisering31,57,58,59,60. Mutasjon av tryptofan-33 til en leucin i VH186.2 har blitt karakterisert for å øke Ig affinitet opp til 10-fold59,60 og er derfor en indikator på at SHM og klonisk utvalg har generert høy affinitet Ig. Måling av NP7- og NP20-spesifikke serum-Ig-titere av ELISA og beregning av det Ig-spesifikke NP7/NP20-forholdet i løpet av immuniseringen dokumenterer også Ig affinitetsmodning som følge av SHM i V-region17,21,36. Begge disse analysene kan brukes til å korrelere SHM innenfor VH186.2-kodesekvensene med endringer i NP-spesifikk Ig affinitetsmodning.
Enten immuniserte eller uimmuniserte dyr brukes til å analysere SHM av VH186.2 eller JH4-intronen, må GCBC-er identifiseres nøyaktig. Vi presenterer en FACS-basert tilnærming for å isolere B220+PNAHI GCBCer. Alternativt kan Fas og ikke-sulfaterte α2-6-sialyl-LacNAc-antigenet, som er anerkjent av GL7-antistoffet61,62,63,64, også brukes til å isolere GCBCer, som er identifisert som B220+Fas+GL7+65 eller CD19+Fas+GL7+37. GL7-uttrykket speiler PNA tett i aktiverte GCBCer i lymfeknuter64,65,66. I tillegg til å bruke antistoffmarkører som er spesifikke for GCBCer, bør farging av cocktailer maksimere eksitasjonen av en fluorofor og deteksjon av en biomarkør samtidig som spektral overlapping av fluorescensutslipp minimeres. Antigener uttrykt ved lave nivåer bør påvises med et antistoff som konjugeres til en fluorofor med en robust utslipp fluorescens67. Den anbefalte fargingsprotokollen ble optimalisert for analyse på en cellesortering utstyrt med fire lasere (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) og 12 filtre; Filterkonfigurasjoner og lasertilgjengelighet varierer imidlertid mellom cytometere. For å endre protokollen i henhold til reagens- og utstyrstilgjengelighet henvises leseren til flere ressurser, online spektrumvisere og publisert litteratur67,68,69,70,71,72,73. Den flerfargede fargingsprotokollen som er beskrevet her, krever kompensasjon av spektral overlapping for å sikre at de sorterte cellepopulasjonene er GCBCer i stedet for unøyaktig påvisning av fluorescensutslipp. B220 fungerer som en nyttig fargekontroll for den beskrevne FACS (Tabell 1B) fordi PPer vil ha særegne B220 negative og positive populasjoner (figur 3C), som gir mulighet for passende kompensasjon av spektral overlapping. Gatingstrategien som presenteres i figur 3C, bør brukes som en retningslinje. Strømningscytometriplottene kan variere avhengig av fargingsforholdene og cytometerinnstillingene. Likevel bør 4-10% av levende celler være B220+PNAHI 35, 52.
Alle mutasjoner i JH4-intronet til PP GCBCer må valideres for å sikre at de observerte mutasjonene virkelig reflekterer SHM og ikke en artefakt av PCR eller sekvensering. AID-/- B-celler kan fungere som en nyttig negativ kontroll når du undersøker SHM-fenotypen i andre mutante musemodeller fordi disse cellene ikke kan fullføre SHM17,19. JH4 intronmutasjonsraten i AID-/- GCBCene (1,66 x 10-5 mutasjoner/bp)20,21,36,37,38,50,74 kan sammenlignes med feilfrekvensen til den høye gjengivelsespolymerasen (5,3×10-7 sub/base/dobling)51,52 som brukes til å forsterke DNA-et i nestet PCR. Hvis AID-/- mus ikke er tilgjengelige, sammenligner du det observerte mutasjonsmønsteret og frekvensen med den publiserte litteraturen. Ig V-regioner akkumulerer 10-3-10 -4 mutasjoner per basepardivisjon, som er omtrent 106ganger høyere enn mutasjonsraten til andre genloci73,75. Resultatene kan variere med dyrets alder76. Alternativt kan B220+PNALO-celler, som markerer ikke-GCBCer, brukes som en negativ kontroll i fravær av AID-/- mus52. Hvis mutasjonsfrekvensen i WT GCBC er lavere enn forventet, kan WT-bakterien JH4 intronisk sekvens være uforholdsmessig representert. I dette tilfellet må du sørge for at GCBCene ble farget og sortert på riktig måte, og at PCR-er er fri for WT-bakterie JH4 intronforurensning. I tillegg bør rå sekvenseringsdata i elektroferogrammer analyseres grundig for å sikre at mutasjoner i sekvenstekstdataene ikke er gjenstander av sekvensfeil. Dårlige Resultater av Sanger-sekvensering kan for eksempel redusere påliteligheten til sekvensdataene (Figur 4). Denne kvalitetskontroll av Sanger-sekvensdataene vil øke nøyaktigheten og reproduserbarheten til JH4 intronmutasjonsanalysen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tasuku Honjo for AID-/- mus. Dette arbeidet ble støttet av National Institute on Minority Health and Health Disparities (5G12MD007603), National Cancer Institute (2U54CA132378) og National Institute of General Medical Sciences (1SC1GM132035-01).
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |