方法文章

小鼠派伊尔集合淋巴结生发中心B细胞JH4内含子体细胞高频突变分析

7.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61551

⸱

2021年4月20日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, The City College of New York and The Graduate Center of The City University of New York, 2Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用小鼠派伊尔集合淋巴结中的生发中心B细胞，对免疫球蛋白重链基因位点内的体细胞高频突变进行定量检测的方法。

摘要

在淋巴器官的生发中心内，成熟的B细胞通过向免疫球蛋白（Ig）重链和轻链基因位点的可变编码外显子中引入非模板依赖的突变，来改变其表达的免疫球蛋白。这一过程称为体细胞高频突变（SHM），依赖于活化诱导的胞苷脱氨酶（AID）的作用，该酶可将脱氧胞苷（C）转化为脱氧尿苷（U）。随后，碱基切除修复和错配修复通路对AID产生的U:G错配进行加工，从而引入新的Ig编码序列，可能产生亲和力更高的免疫球蛋白。AID基因或DNA修复基因的突变可能阻断或显著改变在Ig位点中观察到的突变类型。本文描述了一种定量JH4内含子突变的实验方案，该方法结合荧光激活细胞分选（FACS）、PCR和Sanger测序技术。尽管该检测不能直接测量Ig亲和力成熟过程，但它可反映Ig可变区编码序列中的突变情况。此外，这些方法利用了常见的分子生物学技术， 可分析 多个B细胞克隆中Ig序列的突变。因此，该检测方法在研究体细胞高频突变及免疫球蛋白多样性方面具有重要价值。

引言

B细胞是适应性免疫系统的成员，通过产生抗体（也称为免疫球蛋白，Ig）来识别并清除抗原。每个Ig由两条重链（IgH）和两条轻链（IgL）多肽组成，通过二硫键连接形成Ig典型的“Y”形结构1。IgH和IgL的N端构成每条多肽的可变区（V区），二者共同形成Ig的抗原结合位点，而IgH的恒定区则赋予Ig效应功能。骨髓中发育中的B细胞通过一种称为V(D)J重组的过程，对IgH和IgL的V编码外显子进行重排2,3,4。重排后的V外显子与相应的恒定区外显子共同转录，形成mRNA，随后翻译为Ig蛋白。

表达膜结合型 Ig（也称为 B 细胞受体，BCR）的成熟 B 细胞会循环至次级淋巴器官，例如脾脏、淋巴结或派尔集合淋巴结，以监测环境中是否存在抗原，并与免疫系统的其他细胞相互作用1。在次级淋巴器官的生发中心（GC）内，通过 BCR 识别抗原的 B 细胞被激活。在滤泡树突状细胞和滤泡辅助性 T 细胞的协助下，活化的 B 细胞可增殖并分化为浆细胞和记忆细胞，这两类细胞是介导强效免疫应答的重要效应细胞5,6,7,8,9。此外，这些活化的 B 细胞还可经历二次免疫球蛋白（Ig）基因多样化过程——类别转换重组（CSR）和体细胞高频突变（SHM）。在 CSR 过程中，B 细胞通过一种 DNA 缺失-重组反应，将 IgH 多肽链默认的 μ 恒定区替换为其他恒定区（γ、α、ε）（图 1）。这一过程使得不同的恒定外显子得以表达，并翻译生成新的 Ig，从而使 B 细胞从表达 IgM 转变为表达其他同种型（IgG、IgA、IgE）。CSR 在不改变 Ig 抗原特异性的前提下，改变了其效应功能10,11,12。而在 SHM 过程中，B 细胞对 IgH 和 IgL 的 V 编码区进行突变，从而促进高亲和力 Ig 的产生与筛选，使其更有效地清除抗原13,14,15（图 1）。重要的是，CSR 和 SHM 均依赖于同一种酶的功能：活化诱导的胞苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）16,17,18。缺乏 AID 的人类和小鼠无法完成 CSR 或 SHM，表现为血清 IgM 滴度升高，即高 IgM 综合征17,19。

在类别转换重组（CSR）中，AID 对每个恒定区编码外显子上游的重复性转换区中的脱氧胞苷（C）进行脱氨，将其转化为脱氧尿苷（U）。20,21，导致脱氧尿苷与脱氧鸟苷之间形成错配碱基对（U:G）。这些U:G错配可通过碱基切除修复（BER）或错配修复（MMR）途径转化为双链DNA断裂，而双链DNA断裂是DNA重组所必需的22,23,24,25,26,27,28,29在体细胞超突变（SHM）中，AID在V编码外显子内对胞嘧啶（C）进行脱氨。在DNA复制过程中，U:G错配的持续存在会导致C:G到T:A的转换突变；而在DNA复制之前，由碱基切除修复（BER）蛋白尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）切除尿嘧啶碱基，则会产生转换和颠换突变。16. 功能丧失性突变在 UNG 显著增加C:G到T:A的转换突变21,22与类别转换重组（CSR）类似，体细胞超突变（SHM）也需要错配修复（MMR）和碱基切除修复（BER）的协同作用。在SHM过程中，MMR在A:T碱基对处产生突变。MutS同源物2（MutS homology 2, MSH2）基因发生失活突变时MSH2）或DNA聚合酶η（Polη) 显著减少了 A:T 碱基位点的突变以及复合突变 MSH2 和 Polη 几乎完全消除A:T碱基处的突变21,30,31. 与BER和MMR在将AID产生的尿嘧啶（U）转化为转换或颠换突变中的关键作用一致，缺乏MSH2和UNG的小鼠（MSH2-/-UNG-/-) 仅显示由U:G错配复制导致的C:G到T:A的转换突变21.

对V编码区中体细胞高频突变（SHM）的分析仍然较为复杂，因为发育中的B细胞可以在IgH和IgL基因座中重组任意的V(D)J编码外显子1,2,4。准确分析这些独特重组且发生体细胞突变的V区，需要鉴定并分离B细胞克隆或Ig mRNA11,13。位于IgH基因座最后一个J编码外显子下游的JH4内含子，由于突变从V区启动子向3'端扩散，常携带体细胞突变32,33,34，因此常被用作V区SHM的替代标志物31,35（图1）。为了实验性阐明特定基因或遗传突变如何改变SHM的模式或速率，可从派伊尔集合淋巴结（PP）生发中心B细胞（GCBCs）中扩增并测序JH4内含子，这类细胞经历高水平的SHM36,37,38。GCBCs可通过针对细胞表面标志物（B220+PNAHI）的荧光标记抗体进行快速识别和分离17,39。

本文提供了一种详细的实验方案，通过结合使用FACS（荧光激活细胞分选）、PCR和Sanger测序技术，对小鼠PP GCBCs中JH4内含子突变进行表征（图2）。

方案

所有突变小鼠均维持在C57BL/6遗传背景上。所有实验均使用年龄匹配（2-5月龄）的雄性和雌性小鼠。小鼠的饲养和实验操作均依照纽约市立学院机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 派尔集合淋巴结的解剖

  1. 以3 L/min的速度通入100% CO2，持续5分钟，对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位以确认死亡。使用70%乙醇对解剖工具（剪刀、镊子、精细镊子）及戴手套的手部进行消毒。
  2. 将小鼠仰卧于解剖垫上，暴露腹部。在进行任何切口前，充分喷洒70%乙醇于小鼠体表，以消毒解剖区域。
  3. 沿腹部横向切开皮肤，用镊子（或已消毒的手套）同时向头部和尾部方向拉扯切口两侧，剥离腹部皮肤。
  4. 固定小鼠的前肢和后肢。
  5. 用剪刀剪开腹膜腔，暴露内脏器官。
  6. 在胃与盲肠之间定位小肠（结肠附近呈“J”形的结构）。在胃下方和盲肠上方剪断，取出小肠。
  7. 去除连接小肠皱襞之间的结缔组织和脂肪。
    注意：脂肪呈明显的白色，与小肠的粉红色不同。
  8. 检查小肠外表面是否存在派伊尔结（PPs），其为位于半透明上皮细胞层下方、约1 mm大小的白色椭圆形结构。
  9. 用剪刀小心地切除所有可见的派伊尔结。
    注意：一只C57BL/6野生型（WT）小鼠通常可获得4–8个派伊尔结，而AID-/-小鼠则可获得6–10个。
  10. 将派伊尔结收集至含有1 mL FACS缓冲液并置于冰上的1.5 mL微量离心管中。
    注意：派伊尔结会下沉，而脂肪会浮于表面，可被移除。

2. 用于流式细胞术的细胞分离

  1. 将一个40 μm滤膜置于6孔板中，并加入1 mL冰冷（4 °C）的FACS缓冲液。
  2. 将1.5 mL离心管中的派伊尔结（PPs）倒入滤膜上。
  3. 用1 mL冰冷的FACS缓冲液洗涤PPs，确保其始终浸没在液体中并置于冰上。
  4. 使用1 mL注射器推杆的平头端作为研杵，在滤膜上研磨PPs，直至滤膜上仅剩结缔组织。
  5. 用1 mL冰冷的FACS缓冲液冲洗滤膜和推杆，使细胞释放至6孔板中。
  6. 收集约4 mL含细胞的冰冷FACS缓冲液，并通过带40 μm滤帽的FACS管进行过滤。
  7. 用1 mL冰冷的FACS缓冲液冲洗滤帽。
  8. 在4 °C下，以600 x g离心5分钟（使用摆桶式离心机）沉淀细胞。
  9. 弃去上清液。
  10. 将细胞重悬于0.4 mL冰冷的FACS缓冲液中。
  11. 取10 μL用于细胞计数，以确认得率（预期约为每只小鼠5 × 106个细胞，见图3A）。
  12. 将剩余细胞通过40 μm滤帽过滤至FACS管中，随后进行FACS染色。

3. 用于流式细胞术的 GCBC 染色

  1. 向400 μL细胞悬液中加入1 μL Fc阻断剂（未标记的抗小鼠CD16/CD32抗体），并将细胞置于冰上孵育15分钟。
  2. 加入2 mL冷FACS缓冲液洗涤细胞。
    1. 在4 °C下以600 x g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液。
  3. 将细胞重悬于80 μL冷FACS缓冲液中。
  4. 从野生型PP样本中取出10 μL细胞用于每个染色对照（共4个，包括3个单染对照和1个未染色对照）。保留40 μL野生型PP样本用于下一步。或者，可使用补偿微珠作为染色对照。
  5. 将每个实验样本（例如野生型和AID-/-）用500 μL冷FACS缓冲液重悬，并加入2.5 μL花生凝集素（PNA）-生物素，在冰上避光孵育15分钟。
  6. 加入2 mL冷FACS缓冲液洗涤细胞。
    1. 在4 °C下以600 x g离心5分钟，沉淀细胞，弃去上清液。
  7. 将每个实验样本与500 μL抗体混合液在冰上避光孵育15分钟，进行染色 （表1）。确保细胞在染色混合液中充分重悬。
  8. 制备用于补偿矩阵的单染对照。
    1. 使用表2中指定的稀释比例，在500 μL冷FACS缓冲液中对细胞进行染色。
    2. 将染色对照在冰上避光孵育15分钟。
  9. 向步骤3.7和3.8中的所有管中加入2 mL冷FACS缓冲液，离心沉淀细胞，弃去上清液，以去除未结合的抗体或DAPI。
  10. 将细胞重悬于500 μL冷FACS缓冲液中，并置于冰上。
  11. 使用细胞分选仪，从每个染色后的实验样本中分选B220+PNAHI细胞。图3B展示了从野生型和AID-/- PP样本中通常获得的B220+ PNAHI细胞百分比。图3C展示了FACS设门策略。

4. 从 GCBCs 中提取 DNA

  1. 在 4 °C 条件下以 600 x g 离心 5 分钟，收集分选后的细胞沉淀，并弃去上清液。
  2. 将细胞重悬于 1 mL 冷 FACS 缓冲液中，然后转移至 1.5 mL 微量离心管中。
    1. 在 4 °C 条件下以 600 x g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀，并弃去上清液。
  3. 将细胞重悬于 500 μL DNA 提取缓冲液和 5 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K 中。
  4. 在 56 °C 下孵育过夜。
  5. 加入 500 μL 异丙醇和 1 μL 20 mg/mL 甘油原沉淀 DNA，通过反复倒置 5–6 次充分混匀管内液体。
  6. 室温孵育 10 分钟。
  7. 在微量离心机中于 25 °C 以 21,000 x g 离心 15 分钟。
    1. 弃去上清液，保留沉淀，其中含有沉淀的 DNA 和甘油原。
  8. 用 1 mL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。
    1. 在微量离心机中于 25 °C 以 21,000 x g 离心 10 分钟，收集 DNA 沉淀。
    2. 去除 70% 乙醇，将 DNA 沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。
      注意：避免过度干燥，否则 DNA 可能无法完全重新水合。
  9. 将 DNA 重悬于 30 μL TE 缓冲液中，并在 56 °C 下孵育过夜。

5. JH4 内含子序列的扩增与分析

  1. 通过测量260 nm波长处的吸光度（A260）来定量DNA。
    注意：从小鼠C57BL/6的分选B220+PNAHI GCBCs中回收的DNA典型浓度为20–40 ng/μL。
  2. 对JH4内含子进行巢式PCR（表3，表4）。将第一次PCR中使用的基因组DNA总量归一化至浓度最低的样本。（例如，若最低浓度样本为5 ng/μL，则在PCR #1中所有样本均使用58.75 ng DNA，并补足水至最大体积11.75 μL）。
  3. 在1.5%琼脂糖凝胶上以200 V电泳20分钟分离PCR产物。预期扩增片段大小为580 bp。
  4. 从凝胶中切下扩增片段，并根据试剂盒说明书使用凝胶回收试剂盒提取DNA（参见补充图1）。
    1. 用30 μL水洗脱DNA，并通过测量A260定量DNA含量。
      注意：纯化后PCR产物的典型浓度为3–10 ng/μL。
  5. 将纯化的PCR产物连接至平末端质粒中。标准化每次连接反应所用PCR产物的总量（表5）。
    1. 在室温下孵育连接反应5分钟，或在16 °C过夜孵育。
  6. 取2 μL连接产物转化电感受态细菌细胞。
    1. 在1.65 kV条件下进行电穿孔。
    2. 在37 °C、225 rpm摇床中用600 μL SOC培养基复苏1小时。
    3. 取100 μL转化后的菌液涂布于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB琼脂平板，37 °C过夜培养。
  7. 将细菌菌落平板送样进行Sanger测序，使用T7正向引物。或者，可对每个菌落培养过夜培养物并进行质粒纯化。
    1. 如有必要，重复PCR、连接和/或转化步骤以优化菌落产量。
      注意：每个平板应至少挑取30个菌落。
  8. 标准化.txt文件中的序列数据
    1. 删除质粒序列。
    2. 根据JH4内含子参考序列（NG_005838），确保每条序列方向为5’至3’。必要时生成反向互补序列。
  9. 使用Clustal Omega软件将每个PCR获得的序列与JH4内含子参考序列（NG_005838）比对（图4A）。
    1. 将与参考序列的差异识别为突变。
    2. 通过检查Sanger测序的电泳图谱确认所有突变为真实的点突变。如有必要，重复测序（图4B,C）。
  10. 统计并量化每种基因型JH4内含子中的独特突变（图5）。
    1. 相同突变的序列仅计数一次。
      注意：无法判断相同序列是在PCR过程中产生，还是不同B细胞中发生的相同体细胞高频突变（SHM）事件。
    2. 将所有野生型种系JH4内含子序列（即无突变序列）的每一次出现均计为一个独特序列。

结果

流式细胞术
成熟的B细胞循环至生发中心，在此经历亲和力成熟、克隆扩增，并分化为浆细胞或记忆细胞40,41,42,43,44。这些生发中心B细胞（GCBCs）可通过多种细胞表面标志物进行鉴定，包括高表达CD45R/B220受体以及花生凝集素（PNA）的结合能力45,46。为了分离活化的GCBCs，对PP细胞使用与藻红蛋白（PE）偶联的抗B220抗体以及生物素标记的PNA进行染色，随后加入与APC-eFluor780偶联的链霉亲和素。通过荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）排除死细胞，该染料可标记正在死亡或已死亡细胞的核酸47,48。染色后的细胞随后通过流式细胞术进行分析和分选。PP组织中约含有80%的B220+细胞49,50。野生型（WT）PP平均每只小鼠含有4 × 106个细胞（图3A）。其中约8%的野生型PP细胞为B220+PNAHI，仅为AID-/-小鼠中观察到数量的一半（图3B）。因此，分选后可获得0.3–0.6 × 106个B220+PNAHI的GCBCs，足以用于分析JH4内含子中的突变。

JH4序列分析
使用嵌套PCR扩增JH4内含子，首先采用VHJ558家族通用引物（J558FR3Fw和VHJ558.2），随后使用跨越JH4内含子的引物VHJ558.3和VHJ558.435,37。从野生型GCBC中获得的105条独特序列中共发现226个突变（图5A）。对野生型小鼠GCBC突变谱的分析显示，转换和颠换的发生率为4 × 10-3 突变/碱基对，该数值通过将突变碱基总数除以测序碱基总数计算得出32,36,37,38。此外，每条来自野生型GCBC的JH4 PCR产物包含1–25个突变（图5B），且经常在单条序列上发现多个突变33,36。在113条AID-/-序列中仅检测到两个突变（图5A）。AID-/- B细胞的突变率为1.66 × 10-5 突变/碱基对，显著低于野生型B细胞（p <0.05）36，与高保真DNA聚合酶的错误率（5.3 × 10-7 错误/碱基/复制）相近51,52。因此，AID-/- B细胞在此实验中作为有效的阴性对照。

figure-results-1
图1：IgH基因位点的示意图以及AID在类别转换重组（CSR）和体细胞高频突变（SHM）过程中所靶向的区域。 红色条带表示位于VDJH4重排下游的580 bp JH4内含子，本实验方案中将对该区域进行分析。在类别转换重组（CSR）过程中，AID依赖性的转换区（Sμ和Sε）脱氨作用促进双链断裂（DSB）的形成，从而实现删除性重组并表达新的抗体同种型（如从IgM转换为IgE）。在体细胞高频突变（SHM）过程中，V区（灰色框）会积累突变（蓝色线条），可能导致产生更高亲和力的Ig。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：分析从PPs中分离的GCBCs中JH4内含子体细胞超突变（SHM）的工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：PP GCBCs的表征。 (A) 来自野生型（WT）和AID-/-小鼠的PP细胞总数（每种基因型n = 4）。误差条表示均值的标准差。(B) 从野生型和AID-/-小鼠PP中获得的B220+PNAHI GCBCs百分比（每种基因型n = 4）36。误差条表示均值的标准差，*p<0.05，采用学生t检验。(C) 从PP中分选B220+PNAHI GCBCs的代表性FACS图。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图4：JH4 Sanger测序数据分析。 (A) WT（上）和AID-/-（下）GCBCs中JH4 PCR产物的Sanger测序数据与参考基因组序列（NG_005838）的样本比对结果，参考序列位于编号刻度线正下方。比对使用Clustal Omega软件生成。(B) 高质量Sanger测序数据的电泳图谱，显示每个碱基均有清晰分明的峰。(C) 低质量测序数据的电泳图谱，显示峰形模糊及未确定的碱基（N）。红色标示的核苷酸需在序列文本文件中手动注释。  请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图5：WT 和 AID-/- GCBCs 中 JH4 内含子突变的分析。 (A) 表格中汇总了每种基因型在 A、C、G 和 T 碱基上发生的转换（红色）和颠换（蓝色）突变总数。表格下方标明了分析的序列总数。(B) 饼图显示了每种基因型每个 PCR 扩增子的突变数量。该图改编自 Choi 等人36，版权所有 2020 年，美国免疫学家协会。 请点击此处查看此图的放大版本。

GCBCs 染色试剂混合液体积：500 μL
抗体或染料荧光素稀释倍数μL
B220PE10000.5
StreptavidinAPC-eFluor7805001
DAPIN/A5001

表1：GCBCs染色试剂组合。 使用指定抗体或染料（以斜体表示）按指定稀释比例配制的染色液，在500 μL体积中对PP细胞进行染色，用于流式细胞术分析。

   

用于补偿的单染对照体积：500 μL
抗体或染料荧光素稀释倍数μL
B220PE10000.5
B220APC-eFluor780 7500.67
DAPIN/A5001

表2：用于补偿的单染对照。 使用与所示荧光染料偶联的B220抗体进行单染对照，以校正光谱重叠。

   

PCR #1
试剂体积热循环仪条件
5x 缓冲液4 μL195 °C3 min
10 mM dNTP2 μL294 °C30 秒
10 μM J558FR3Fw1 μL355 °C30 秒
10 μM VHJ558.21 μL472 °C1分30秒
高保真DNA聚合酶0.25 μL循环 2-4，9 次
DNAx（以最低浓度样本为基准进行标准化）
H2O到 20 μL572 °C5 min
将PCR产物用H稀释至1:52在进行PCR #2之前

表3：JH4内含子的巢式PCR。 第一次扩增反应的PCR组分及PCR仪循环条件。用去离子水将第一次PCR产物按1:5比例稀释，并取1 μL该稀释产物用于第二次PCR。

   

PCR #2
试剂体积PCR仪程序条件 #2
5x 缓冲液4 μL194 °C3 min
10 mM dNTP2 μL294 °C30 sec
10 μM VHJ558.31 μL355 °C30 sec
10 μM VHJ558.41 μL472 °C30 sec
高保真DNA聚合酶0.25 μL循环步骤2-4，重复21次
稀释后的PCR#1产物1 μL
H2O加至20 μL572 °C5 min

表4：第二次PCR的PCR组分及PCR仪反应条件。

   

试剂体积
2x 缓冲液10 μL
纯化的 PCR 产物x（标准化至浓度最低的样品）
平末端质粒1 μL
T4 DNA 连接酶1 μL
H2O加至 20 μL
室温孵育 5 分钟，或 16ºC 过夜

表5：连接反应。 将纯化的JH4内含子PCR产物连接至质粒所需的组分。

   

FACS 缓冲液
56℃热灭活胎牛血清 ˚C，使用前孵育一小时。在 PBS（pH 7.4，Gibco，#10010049）中添加 2.5%（v/v）热灭活的 FBS 作为补充。4 ℃ 保存˚C.
DNA提取缓冲液（100 mM Tris pH 8.0，0.1 M EDTA，0.5% (w/v) SDS）
加入50 mL 1 M Tris（pH 8.0）、100 mL 0.5 M EDTA 和12.5 mL 20% SDS，加蒸馏水至500 mL。室温保存。
TE缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA）
加入2.5 mL 1 M Tris（pH 8.0）和500 mL 0.5 M EDTA，加蒸馏水至250 mL。室温保存。

表6：缓冲液配方。

   

寡核苷酸列表
J558FR3Fw5’-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3’
VHJ558.25’-CTGGACTTTCGGTTTGGTG-3’
VHJ558.35’-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3’
VHJ558.45’-TCTCTAGACAGCAACTAC-3’

表7：检测中使用的寡核苷酸。

   

补充图1：完成步骤5.4后的代表性琼脂糖凝胶图像。 JH4内含子嵌套PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离，切下580 bp的扩增片段。WT PP表示使用WT PP GCBC基因组DNA作为第一次PCR的模板，AID PP表示使用AID-/- PP GCBC基因组DNA作为第一次PCR的模板。ɸ表示无模板PCR对照，-表示未向琼脂糖凝胶孔中加样。最后一道为100 bp DNA Marker。请点击此处下载该图。

讨论

在异质性B细胞群体中，对IgH和IgL V编码序列内的体细胞高频突变（SHM）进行表征具有挑战性，因为每个B细胞在V(D)J重排过程中会独特地重组V编码片段34。本文中，我们描述了一种用于鉴定生发中心B细胞（GCBCs）中JH4内含子突变的方法。JH4内含子位于IgH基因座中最后一个J编码片段的3’端，可作为V区体细胞高频突变的替代指标（图1）31,33,34,35。为了系统记录这些JH4内含子突变，并评估特定基因对突变产生或突变模式的影响，我们重点分析PP来源的GCBCs。这些细胞由于受到肠道微生物群的长期刺激，会积累JH4内含子突变53。此外，未免疫小鼠PP中的B220+PNAHI GCBCs所携带的突变谱与经免疫动物脾脏GCBCs的突变谱相似54,55。然而，由于JH4内含子的突变属于非编码区突变，因此无法将其与免疫球蛋白亲和力成熟过程相关联。

为了确定体细胞高频突变（SHM）是否改变免疫球蛋白（Ig）亲和力，应使用抗原（如NP（4-羟基-3-硝基苯乙酰）偶联的CGG（鸡γ球蛋白）或KLH（钥孔血蓝蛋白））对小鼠进行腹腔免疫56。随后，可从脾脏B220+PNAHI生发中心B细胞（GCBCs）中纯化mRNA，以检测VH186.2中的体细胞高频突变（SHM），该V区编码外显子最常识别NP，并在NP-CGG或NP-KLH免疫后发生突变31,57,58,59,60。VH186.2中色氨酸-33突变为亮氨酸已被证实可使Ig亲和力提高达10倍59,60，因此是SHM与克隆选择产生高亲和力Ig的一个指标。通过ELISA测定NP7和NP20特异性血清Ig滴度，并在免疫过程中计算Ig特异性的NP7/NP20比值，也可记录由V区SHM引起的Ig亲和力成熟过程17,21,36。这两种检测方法均可用于将VH186.2编码序列内的SHM与NP特异性Ig亲和力成熟的变化相关联。

无论使用已免疫还是未免疫的动物来分析 VH186.2 或 JH4 内含子的体细胞高频突变（SHM），都必须准确鉴定生发中心 B 细胞（GCBCs）。我们提出一种基于流式细胞术（FACS）的方法，用于分离 B220+PNAHI 的 GCBCs。此外，也可使用 Fas 和非硫酸化的 α2-6-唾液酸化-LacNAc 抗原（该抗原可被 GL7 抗体识别61,62,63,64）来分离 GCBCs，这些细胞可被鉴定为 B220+Fas+GL7+65 或 CD19+Fas+GL7+37。在淋巴结中活化的 GCBCs 中，GL7 的表达水平与 PNA 染色高度一致64,65,66。除了使用针对 GCBCs 的特异性抗体标记外，染色体系应尽可能优化荧光染料的激发和生物标志物的检测，同时最小化荧光发射光谱的重叠。对于低水平表达的抗原，应选用与强荧光发射性能的荧光染料偶联的抗体进行检测67。本推荐的染色方案已针对配备四种激光器（405 nm、488 nm、561 nm、633 nm）和 12 个滤光片的细胞分选仪进行了优化；然而，不同流式细胞仪的滤光片配置和激光器可用性存在差异。为根据实际试剂和设备条件调整方案，建议读者参考其他资源、在线光谱查看工具以及已发表的文献67,68,69,70,71,72,73。本文所述的多色染色方案需要进行光谱重叠补偿，以确保分选出的细胞群体确为 GCBCs，而非因荧光信号误检所致。B220 可作为本方案中所述 FACS 分析的有效染色对照（表 1B），因为派伊尔集合淋巴结（PPs）中存在明显的 B220 阴性和阳性细胞群（图 3C），从而有助于正确进行光谱重叠补偿。图 3C 中所示的设门策略应作为参考指南。流式细胞术图谱可能因染色条件和仪器设置的不同而有所变化。尽管如此，在活细胞中，B220+PNAHI 35, 52 的比例通常应占 4–10%。

必须对PP GCBCs中JH4内含子内的所有突变进行验证，以确保所观察到的突变真实反映了体细胞超突变（SHM），而非PCR或测序过程中产生的假象。AID-/- B细胞在分析其他突变小鼠模型的SHM表型时可作为有效的阴性对照，因为这些细胞无法完成SHM17,19。在AID-/- GCBCs中，JH4内含子的突变率（1.66×10-5 突变/碱基对）20,21,36,37,38,50,74 与用于嵌套PCR扩增DNA的高保真聚合酶的错误率（5.3×10-7 错误/碱基/复制）51,52 相当。若无法获得AID-/-小鼠，可将所观察到的突变模式和频率与已发表文献进行比较。免疫球蛋白V区每碱基对分裂可累积10-3–10-4个突变，比其他基因位点的突变率高出约106倍73,75。实验结果可能因动物年龄不同而有所差异76。作为替代方案，在缺乏AID-/-小鼠的情况下，可使用标记非GCBCs的B220+PNALO细胞作为阴性对照52。如果野生型（WT）GCBCs中的突变频率低于预期，则可能有过多的WT种系JH4内含子序列被扩增。此时应确保GCBCs的染色与分选操作正确，并排除PCR过程中WT种系JH4内含子污染的可能性。此外，应仔细分析电泳图谱中的原始测序数据，以确认序列文本中的突变并非测序错误所致。例如，较差的Sanger测序结果可能降低序列数据的可靠性（图4）。对Sanger测序数据进行此类质量控制，将提高JH4内含子突变分析的准确性与可重复性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Tasuku Honjo提供的AID-/-小鼠。本研究由美国少数族裔健康与健康差异研究所（5G12MD007603）、国家癌症研究所（2U54CA132378）和国家普通医学科学研究所（1SC1GM132035-01）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 ml PCR 8管FLEX-FREE条状管，带透明平盖，混合装USA Scientific1402-4708
氨苄青霉素钠盐FisherBP1760-5
APC-eFluor780标记抗CD45R/B220抗体eBioscience47-0452-80克隆号 RA3-6B2
BD FACSAria IIBD643186四激光（405 nm、488 nm、561 nm、633 nm）和12个滤光片（PacBlue（450/50）、
AmCyan（502LP；530/30）、SSC（488/10）、FITC（502LP；530/30）、PerCP-Cy5.5（655LP；695/40）、
PE（585/15）、PE-Texas Red（600LP；610/20）、PE-Cy5（630LP；670/14）、PE-Cy7（735LP；780/60）、APC（660/20）、Alexa700（710LP；730/45）、APC-Cy7（755LP；780/60））
BD 1 mL滑动式针头注射器Fisher14-823-434无菌
生物素标记花生凝集素（PNA）Vector LabsB-1075-5
C57BL/6J小鼠Jackson Laboratories664
Corning Falcon带细胞筛网卡扣盖试管Fisher08-771-23
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）FisherD13060.5 mg/ml
dNTPNEBN0447L10 mM
ElectroMAX DH10B感受态细胞Fisher18-290-015
Falcon 40 mm细胞筛网Fisher08-771-1
Falcon圆底聚苯乙烯管（FACS管）Fisher14-959-5
Falcon圆底聚苯乙烯管（带盖）Fisher149591A
胎牛血清R&D Systems (Atlanta Biologicals)S11150
Gibco磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4Fisher10-010-049
糖原Sigma10901393001
Lasergene分子生物学软件（MegAlign Pro）DNA Star版本 15
PE标记抗CD45R/B220抗体BD553090克隆号 RA3-6B2
蛋白酶KFisherBP1700-100
Q5高保真DNA聚合酶NEBM0491L
QIAquick凝胶回收试剂盒Qiagen28706
Seal-Rite 1.5 mL微量离心管USA Scientific1615-5500
链霉亲和素APC-eFluor 780偶联物eBioscience47-4317-82
T4 DNA连接酶NEBM020L
Thermo Scientific CloneJET PCR克隆试剂盒ThermoFisherFERK1231
组织培养板，6孔Fisher08-772-1B无菌
未标记抗小鼠CD16/CD32抗体（Fc阻断剂），BDFisherBDB553142克隆号 2.4G2

参考文献

  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeyway's Immunobiology. , Garland science. (2016).
  2. Alt, F. W., et al. VDJ recombination. Immunology Today. 13 (8), 306-314 (1992).
  3. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V (D) J recombination. Nature Reviews Immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
  4. Oettinger, M. A., Schatz, D. G., Gorka, C., Baltimore, D. RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V (D) J recombination. Science. 248 (4962), 1517-1523 (1990).
  5. Berek, C., Berger, A., Apel, M. Maturation of the immune response in germinal centers. Cell. 67 (6), 1121-1129 (1991).
  6. Linterman, M. A., et al. Foxp3+ follicular regulatory T cells control the germinal center response. Nature Medicine. 17 (8), 975(2011).
  7. Shulman, Z., et al. T follicular helper cell dynamics in germinal centers. Science. 341 (6146), 673-677 (2013).
  8. Good-Jacobson, K. L., et al. PD-1 regulates germinal center B cell survival and the formation and affinity of long-lived plasma cells. Nature Immunology. 11 (6), 535(2010).
  9. Kerfoot, S. M., et al. Germinal center B cell and T follicular helper cell development initiates in the interfollicular zone. Immunity. 34 (6), 947-960 (2011).
  10. Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 541-552 (2004).
  11. Alt, F. W., Zhang, Y., Meng, F. L., Guo, C., Schwer, B. Mechanisms of programmed DNA lesions and genomic instability in the immune system. Cell. 152 (3), 417-429 (2013).
  12. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nature Reviews Immunology. 12 (7), 517-531 (2012).
  13. Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annual Reviews of Biochemistry. 76, 1-22 (2007).
  14. Peled, J. U., et al. The biochemistry of somatic hypermutation. Annual Review of Immunology. 26, 481-511 (2008).
  15. Liu, M., Schatz, D. G. Balancing AID and DNA repair during somatic hypermutation. Trends in Immunology. 30 (4), 173-181 (2009).
  16. Methot, S., Di Noia, J. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advances in Immunology. 133, 37-87 (2017).
  17. Muramatsu, M., et al. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102 (5), 553-563 (2000).
  18. Petersen-Mahrt, S. K., Harris, R. S., Neuberger, M. S. AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature. 418 (6893), 99(2002).
  19. Revy, P., et al. Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell. 102 (5), 565-575 (2000).
  20. Petersen-Mahrt, S. DNA deamination in immunity. Immunological Reviews. 203 (1), 80-97 (2005).
  21. Rada, C., Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. Mismatch recognition and uracil excision provide complementary paths to both Ig switching and the A/T-focused phase of somatic mutation. Molecular Cell. 16 (2), 163-171 (2004).
  22. Rada, C., et al. Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice. Current Biology. 12 (20), 1748-1755 (2002).
  23. Schrader, C. E., Vardo, J., Stavnezer, J. Role for mismatch repair proteins Msh2, Mlh1, and Pms2 in immunoglobulin class switching shown by sequence analysis of recombination junctions. The Journal of Experimental Medicine. 195 (3), 367-373 (2002).
  24. Martin, A., et al. Msh2 ATPase activity is essential for somatic hypermutation at AT basepairs and for efficient class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1171-1178 (2003).
  25. Imai, K., et al. Human uracil-DNA glycosylase deficiency associated with profoundly impaired immunoglobulin class-switch recombination. Nature Immunology. 4 (10), 1023-1028 (2003).
  26. Masani, S., Han, L., Yu, K. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 is the essential nuclease during immunoglobulin class switch recombination. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1468-1473 (2013).
  27. Guikema, J. E., et al. APE1-and APE2-dependent DNA breaks in immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3017-3026 (2007).
  28. Schrader, C. E., Guikema, J. E., Wu, X., Stavnezer, J. The roles of APE1, APE2, DNA polymerase β and mismatch repair in creating S region DNA breaks during antibody class switch. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1517), 645-652 (2009).
  29. Roa, S., et al. MSH2/MSH6 complex promotes error-free repair of AID-induced dU: G mispairs as well as error-prone hypermutation of A: T sites. PLoS One. 5 (6), 11182(2010).
  30. Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. DNA polymerase η is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 17-23 (2007).
  31. Maul, R. W., Gearhart, P. J. AID and somatic hypermutation. Advances in Immunology. 105, 159-191 (2010).
  32. Shen, H. M., Tanaka, A., Bozek, G., Nicolae, D., Storb, U. Somatic hypermutation and class switch recombination in Msh6-/- Ung-/- double-knockout mice. The Journal of Immunology. 177 (8), 5386-5392 (2006).
  33. Cheng, H. L., et al. Integrity of the AID serine-38 phosphorylation site is critical for class switch recombination and somatic hypermutation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (8), 2717-2722 (2009).
  34. Lebecque, S. G., Gearhart, P. J. Boundaries of somatic mutation in rearranged immunoglobulin genes: 5'boundary is near the promoter, and 3'boundary is approximately 1 kb from V (D) J gene. The Journal of Experimental Medicine. 172 (6), 1717-1727 (1990).
  35. Jolly, C. J., Klix, N., Neuberger, M. S. Rapid methods for the analysis of immunoglobulin gene hypermutation: application to transgenic and gene targeted mice. Nucleic Acids Research. 25 (10), 1913-1919 (1997).
  36. Choi, J. E., Matthews, A. J., Michel, G., Vuong, B. Q. AID Phosphorylation Regulates Mismatch Repair-Dependent Class Switch Recombination and Affinity Maturation. The Journal of Immunology. 204 (1), 13-22 (2020).
  37. McBride, K. M., et al. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. The Journal of Experimental Medicine. 205 (11), 2585-2594 (2008).
  38. Liu, M., et al. Two levels of protection for the B cell genome during somatic hypermutation. Nature. 451 (7180), 841-845 (2008).
  39. Ross, M., Birbeck, M., Wills, V., Forrester, J., Davis, A. Peanut lectin binding properties of germinal centers of mouse lymphoid tissues. Nature. 284, 364-366 (1980).
  40. Zhang, J., MacLennan, I. C., Liu, Y. J., Lane, P. J. Is rapid proliferation in B centroblasts linked to somatic mutation in memory B cell clones. Immunology Letters. 18 (4), 297-299 (1988).
  41. Nieuwenhuis, P., Opstelten, D. Functional anatomy of germinal centers. American Journal of Anatomy. 170 (3), 421-435 (1984).
  42. Lau, A. W., Brink, R. Selection in the germinal center. Current Opinion in Immunology. 63, 29-34 (2020).
  43. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  44. Mesin, L., Ersching, J., Victora, G. D. Germinal center B cell dynamics. Immunity. 45 (3), 471-482 (2016).
  45. Reichert, R. A., Gallatin, W. M., Weissman, I. L., Butcher, E. C. Germinal center B cells lack homing receptors necessary for normal lymphocyte recirculation. The Journal of Experimental Medicine. 157 (3), 813-827 (1983).
  46. Rose, M., Birbeck, M., Wills, V., Forrester, J., Davis, A. Peanut lectin binding properties of germinal centers of mouse lymphoid tissues. Nature. 284, 364-366 (1980).
  47. Hamada, S., Fujita, S. DAPI staining improved for quantitative cytofluorometry. Histochemistry. 79 (2), 219-226 (1983).
  48. Otto, F. DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  49. Butcher, E., et al. Surface phenotype of Peyer's patch germinal center cells: implications for the role of germinal centers in B cell differentiation. The Journal of Immunology. 129 (6), 2698-2707 (1982).
  50. Rogerson, B. J., Harris, D. P., Swain, S. L., Burgess, D. O. Germinal center B cells in Peyer's patches of aged mice exhibit a normal activation phenotype and highly mutated IgM genes. Mechanisms of Ageing and Development. 124 (2), 155-165 (2003).
  51. Potapov, V., Ong, J. L. Examining sources of error in PCR by single-molecule sequencing. PloS One. 12 (1), 0169774(2017).
  52. Gonzalez-Fernandez, A., Milstein, C. Analysis of somatic hypermutation in mouse Peyer's patches using immunoglobulin kappa light-chain transgenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (21), 9862-9866 (1993).
  53. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer's patches: organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  54. Betz, A. G., Rada, C., Pannell, R., Milstein, C., Neuberger, M. S. Passenger transgenes reveal intrinsic specificity of the antibody hypermutation mechanism: clustering, polarity, and specific hot spots. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (6), 2385-2388 (1993).
  55. Rada, C., Gupta, S. K., Gherardi, E., Milstein, C. Mutation and selection during the secondary response to 2-phenyloxazolone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (13), 5508-5512 (1991).
  56. Heise, N., Klein, U. Somatic Hypermutation and Affinity Maturation Analysis Using the 4-Hydroxy-3-Nitrophenyl-Acetyl (NP) System. Methods in Molecular Biology. 1623, 191-208 (2017).
  57. Smith, F., Cumano, A., Licht, A., Pecht, I., Rajewsky, K. Low affinity of kappa chain bearing (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl (NP)-specific antibodies in the primary antibody repertoire of C57BL/6 mice may explain lambda chain dominance in primary anti-NP responses. Molecular Immunology. 22 (10), 1209-1216 (1985).
  58. Takahashi, Y., Dutta, P. R., Cerasoli, D. M., Kelsoe, G. In situ studies of the primary immune response to (4-hydroxy-3-nitrophenyl) acetyl. V. Affinity maturation develops in two stages of clonal selection. The Journal of Experimental Medicine. 187 (6), 885-895 (1998).
  59. Allen, D., Simon, T., Sablitzky, F., Rajewsky, K., Cumano, A. Antibody engineering for the analysis of affinity maturation of an anti-hapten response. The EMBO Journal. 7 (7), 1995-2001 (1988).
  60. Cumano, A., Rajewsky, K. Clonal recruitment and somatic mutation in the generation of immunological memory to the hapten NP. The EMBO Journal. 5 (10), 2459-2468 (1986).
  61. Smith, K., Nossal, G., Tarlinton, D. M. FAS is highly expressed in the germinal center but is not required for regulation of the B-cell response to antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (25), 11628-11632 (1995).
  62. Hao, Z., et al. Fas receptor expression in germinal-center B cells is essential for T and B lymphocyte homeostasis. Immunity. 29 (4), 615-627 (2008).
  63. Cervenak, L., Magyar, A., Boja, R., László, G. Differential expression of GL7 activation antigen on bone marrow B cell subpopulations and peripheral B cells. Immunology Letters. 78 (2), 89-96 (2001).
  64. Naito, Y., et al. Germinal center marker GL7 probes activation-dependent repression of N-glycolylneuraminic acid, a sialic acid species involved in the negative modulation of B-cell activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  65. Olson, W. J., et al. Orphan Nuclear Receptor NR2F6 Suppresses T Follicular Helper Cell Accumulation through Regulation of IL-21. Cell Reports. 28 (11), 2878-2891 (2019).
  66. Dorsett, Y., et al. MicroRNA-155 suppresses activation-induced cytidine deaminase-mediated Myc-Igh translocation. Immunity. 28 (5), 630-638 (2008).
  67. Goetz, C., Hammerbeck, C., Bonnevier, J. Flow Cytometry Basics for the Non-Expert. , Springer. (2018).
  68. Hawley, T. S., Herbert, D. J., Eaker, S. S., Hawley, R. G. Flow Cytometry Protocols. , Springer. (2004).
  69. Costa, E., et al. A new automated flow cytometry data analysis approach for the diagnostic screening of neoplastic B-cell disorders in peripheral blood samples with absolute lymphocytosis. Leukemia. 20 (7), 1221-1230 (2006).
  70. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).
  71. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. , 139-150 (2018).
  72. Lucchesi, S., et al. Computational Analysis of Multiparametric Flow Cytometric Data to Dissect B Cell Subsets in Vaccine Studies. Cytometry Part A. 97, 259-267 (2019).
  73. Longerich, S., Tanaka, A., Bozek, G., Nicolae, D., Storb, U. The very 5' end and the constant region of Ig genes are spared from somatic mutation because AID does not access these regions. The Journal of Experimental Medicine. 202 (10), 1443-1454 (2005).
  74. Retter, I., et al. Sequence and characterization of the Ig heavy chain constant and partial variable region of the mouse strain 129S1. The Journal of Immunology. 179 (4), 2419-2427 (2007).
  75. Shen, H. M., Peters, A., Baron, B., Zhu, X., Storb, U. Mutation of BCL-6 gene in normal B cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes. Science. 280 (5370), 1750-1752 (1998).
  76. Richter, K., et al. Altered pattern of immunoglobulin hypermutation in mice deficient in Slip-GC protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (38), 31856-31865 (2012).

重印与许可

标签

DNA B220
小鼠派伊尔集合淋巴结生发中心B细胞JH4内含子体细胞高频突变分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。