Summary
Un protocollo per la coltura del parassita microsporidiano Edhazardia aedis. Il parassita viene trasferito da una generazione di zanzare Aedes aegypti all'altra tramite trasferimento orizzontale nella fase larvale seguita da trasmissione verticale nella fase adulta. Gli sporoplasmi vivi sopravvivono a lungo termine nelle uova infette.
Abstract
Edhazardia aedis è un parassita microsporidiano delle zanzare Aedes aegypti, un vettore di malattia che trasmette più arbovirus che causano milioni di casi di malattia ogni anno. E. aedis causa mortalità e ridotta idoneità riproduttiva nel vettore di zanzara ed è stato esplorato per il suo potenziale come agente di biocontrollo. Il protocollo che presentiamo per la lavorazione di E. aedis si basa sul suo ciclo di infezione naturale, che prevede la trasmissione sia orizzontale che verticale in diverse fasi della vita dell'ospite delle zanzare. Le zanzare Aegypti sono esposte alle spore nella fase larvale. Queste larve infette poi maturano negli adulti e trasmettono il parassita verticalmente alla loro prole. La prole infetta viene quindi utilizzata come fonte di spore per la futura trasmissione orizzontale. Coltivare E. aedis può essere impegnativo per i non iniziati data la complessità del ciclo di vita del parassita, e questo protocollo fornisce indicazioni dettagliate e ausili visivi per il chiarimento.
Introduction
Aedes aegypti è il vettore di zanzara di più arbovirus (ad esempio, dengue, Zika, febbre gialla) che insieme sono stimati per rappresentano centinaia di milioni di casi di malattia ogni anno e più di 30.000 decessi1,2. Il trattamento per le malattie causate da questi agenti patogeni è limitato alle cure di supporto ed è probabile che altri arbovirus emergeranno in futuro3. Il controllo del vettore di zanzara è quindi di primaria importanza, in quanto impedisce efficacemente la trasmissione di agenti patogeni attuali ed emergenti4. Tradizionalmente, le strategie di controllo vettoriale utilizzano principalmente insetticidi chimici, ma la resistenza a molti insetticidi comunemente usati ha spinto la domanda di nuovi metodi di controllo vettoriale. Un potenziale agente che è stato esplorato per le sue proprietà di biocontrollo contro Ae. aegypti è il parassita Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, identificato per la prima volta come Nosema aedis da Kudo nel 1930, è un parassita microsporidiano delle zanzare Ae. aegypti 7. Lo sviluppo e la riproduzione di E. aedis è relativamente complesso e il suo ciclo di vita può procedere inpiù modi 7,8,9. Un ciclo di sviluppo comune è descritto in modo approfondito in Becnel et al., 19897 ed è utilizzato per la propagazione di laboratorio (Figura 1)8. In breve, il ciclo inizia quando le uova di Ae. aegypti infettate verticalmente da E. aedis si schiudono in larve infette che sviluppano spore uninucleate nel corpo grasso e di solito muoiono come larve o pupe. Le spore uninucleate rilasciate dalle larve morte contaminano l'habitat e vengono ingerite da larve di Ae. aegypti sane. Queste spore germinano principalmente nel tratto digestivo, infettando il tessuto digestivo delle larve esposte, con conseguente trasmissione orizzontale. Le larve infettate orizzontalmente si sviluppano in adulti (generazione dei genitori) dove si formano spore binucleate. Nella femmina, queste spore binucleate invadono il tratto riproduttivo e il loro sporoplasma associato infetta lo sviluppo di ovociti. Queste uova si schiudono quindi in larve infette (generazione filiale), con conseguente trasmissione verticale del parassita e continuazione del ciclo come descritto sopra.
Molteplici studi hanno studiato il potenziale di E. aedis per il biocontrollo. È stato dimostrato che l'infezione da E. aedis si traducono in una ridotta capacità riproduttiva delle femmine Ae. aegypti 10. Inoltre, in un esperimento semi-campo, il rilascio inondativo di E. aedis ha portato all'eradicazione totale di una popolazione di Ae. aegypti di prova tenuta all'interno di un recintoschermato 6. Mentre è in grado di subire alcune fasi di sviluppo in un insieme diversificato di specie di zanzare, E. aedis viene trasmesso solo verticalmente in Ae. aegypti, indicando un alto grado di specificità dell'ospite11,12. Allo stesso modo, in una valutazione di laboratorio del potenziale rischio ambientale associato a E. aedis, il parassita microsporidiano non è riuscito a infettare la fauna acquatica non bersaglio, compresi i predatori che hanno ingerito larve di Ae. aegypti infettate da E. edi13. Questi risultati evidenziano il potenziale di E. aedis da utilizzare nelle strategie di controllo biologico rivolte alle popolazioni naturali di Ae. aegypti.
Nonostante il fatto che E. aedis mostri una promessa per l'uso nel controllo vettoriale, ci sono sfide per coltivarlo e distribuirlo su larga scala. Le spore di E. edi perdono l'infettività in meno di un giorno a temperature fredde (cioè 5 °C). Anche a temperature più calde (cioè 25 °C), le spore perdono rapidamente l'infettività nel corso di tre settimane14. Inoltre, E. aedis deve essere coltivato in zanzare Ae. aegypti vive e il dosamento controllato di zanzare larvali sane è necessario per garantire il completamento del ciclo di vita e prevenire il collasso della popolazione utilizzata perla coltura 8. Il requisito della coltivazione in vivo rappresenta una sfida; tuttavia, i recenti progressi nell'allevamento di massa delle zanzare e nella robotica (ad esempio, Massaro et al.15) potrebbero consentire la generazione su larga scala di spore di E. aedis. Prevediamo che la visualizzazione di questa metodologia aumenterà l'accessibilità al protocollo di allevamento di E. aedis e consentirà a più ricercatori di indagare la biologia di base e il potenziale applicato di questo sistema. Prevediamo inoltre che faciliterà una maggiore collaborazione con ingegneri, robotici e il più ampio settore tecnologico, che può servire a migliorare l'allevamento di massa di E. aedis.
Figura 1: Propagazione di E. edi in Ae. aegypti. La propagazione di E. aedis inizia con la schiusa di uova infette da E. aedis. Le larve infette vengono allevate fino al4 ° instar, le spore di E. aedis sono isolate da quelle larve e le spore sono utilizzate per infettare per via orale larve sane 2°/ 3rd instar allevate da una frizione non infetta di uova (trasmissione orizzontale). Queste larve infettate per via orale vengono quindi allevate fino all'età adulta (generazione dei genitori) e depongono le uova infettate da E. aedis (trasmissione verticale). Le uova infette (generazione filiale) vengono quindi schiuse per continuare il ciclo di infezione e la coltura dei parassiti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
1. Giorno 0
- Hatch Ae. uova di aegypti infettate da E. aedis mettendo in vassoio di allevamento larvale con 1 L di acqua deionizzata (DI). Aggiungere 50 mg di cibo per pesci.
NOTA: Al momento della pubblicazione, un ceppo di laboratorio di E. aedis è disponibile solo presso laboratori che studiano attivamente il parassita, poiché E. aedis non è suscettibile di stoccaggio a lungo termine e le uova infette non sono attualmente immagazzinate in depositi. I ricercatori interessati a lavorare con E. aedis possono contattare l'autore corrispondente per richiedere uova infette.
NOTA: La schiusa di un gran numero di uova infette non è generalmente necessaria; dieci larve di Ae. ae. aegypti infettate da E. aedis sono sufficienti a dosare ≥ 1000 larve sane.
NOTA: Per tutte le parti di questo protocollo, abbiamo alloggiato le zanzare alle seguenti condizioni: 14 h / 10 h ciclo chiaro / scuro, 27 ° C di temperatura e 80% umidità relativa.
2. Giorno 1
- Dopo la schiusa, ridurre la densità delle larve a ~ 100 larve per vassoio, realizzando nuovi vassoi se necessario (anche con 1 L di acqua).
- Aggiungere un pezzo di cibo secco per gatti a ogni vassoio. Reintegrare il cibo quando è esaurito, ma non fornire un eccesso di cibo. Un pezzo di cibo per gatti (~ 200 mg) ogni tre giorni è sufficiente.
NOTA: Regolare la quantità di cibo a seconda delle specifiche condizioni di allevamento (ad esempio, ridurre il cibo se l'acqua diventa torbida o le larve stanno morendo, aumentare il cibo se le larve sono gravemente ritardate nello sviluppo). Possono essere utilizzati altri regimi di alimentazione e/o condizioni di allevamento diversi da quelli qui suggeriti, ma possono essere necessarie modifiche alla tempistica di questo protocollo standard.
3. Giorni 4\u20125
- Quando le larve infette sono 3° - 4° instars, schiudere uova Ae. ae. aegypti sane / non infette in un nuovo vassoio.
- Posteriore a densità tali che la sana Ae. aegypti raggiungeil 2 ° - 3° instar in 48-72 h. Nelle nostre mani, questo può essere ottenuto utilizzando densità di 200 \ u2012300 larve per 1 L di acqua con accesso ad libitum al cibo. La schiusa di lotti di uova sane per più giorni può garantire che le larve siano nella fase corretta quando necessario.
4. Giorni 7\u20128: Trasmissione orizzontale
NOTA: Il dosamento di larve sane con E. aedis non può essere eseguito fino a quando le spore uninucleate sono ad alto numero in larve infette (1 x 104 - 1 x 106 per larva). Ciò avviene alla fine della4a fase instar(figura 2).
- Raccogliere e quantificare le spore uninucleate.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento (potrebbe essere necessario tagliare la punta a un diametro più ampio) per spostare 10 larve infette in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
- Rimuovere l'acqua di riproduzione con una pipetta di trasferimento e lavare una volta aggiungendo ~ 1 mL di acqua DI pulita. Rimuovere l'acqua di lavaggio con una pipetta, aggiungere 500 μL di acqua DI pulita alle 10 larve e omogeneizzare utilizzando un pestello e un omogeneizzatore meccanico.
- Quantificare le spore usando un emocitometro con un ingrandimento di 400x.
NOTA: Le spore uninucleate possono essere identificate dalla loro forma piriforme distinta (cioè la forma della pera; Figura 2A).
- Dose sana di larve di Ae. aegypti con E. aedis.
- Preparare liquami alimentari larvali freschi mescolando 1,2 g di polvere di fegato, 0,8 g di lievito di birra e 100 mL di acqua.
NOTA: Il cibo non deve essere fresco se è autoclavato e conservato a 4 °C fino all'uso. - Trasferire 100 2° - 3rd instar sano Ae. larve di Aegypti in becher da 150 mL o tazze di campioni.
- Dose ogni becher di 100 larve con 5 x 104 – 1 x 105 spore.
- Aggiungere 2 mL di liquami alimentari larvali e acqua DI a un volume finale di 100 mL.
- Preparare liquami alimentari larvali freschi mescolando 1,2 g di polvere di fegato, 0,8 g di lievito di birra e 100 mL di acqua.
- Dopo 12-24 ore di esposizione, trasferire le larve esposte in vassoi di allevamento e posteriore fino all'età adulta seguendo un protocollo di allevamento standard16.
5. Monitoraggio e trasmissione verticale
- Monitora le larve dosate per la pupa e trasferisci le pupe mentre si sviluppano in una tazza di emergenza in una gabbia. Lo zucchero alimenta gli adulti ad libitum (come da16,17). Gli adulti che racchiudono saranno infettati da E. aedis.
- Il sangue nutre gli adulti (come da16,17) e raccoglie le uova. La trasmissione verticale di E. aedis avviene in questa fase.
NOTA: Se vengono forniti ulteriori pasti nel sangue non appena l'ovideposizione è completa, le femmine possono deporre almeno una frizione aggiuntiva di uova prima che gli adulti soffrano (spesso improvvisi) alti livelli di mortalità. - Utilizzare queste uova Ae. aegypti infettate da E. aedis per continuare la propagazione a partire dal passaggio 1 di questo protocollo.
NOTA: Le uova possono essere conservate per 2 - 3 mesi in condizioni appropriate16. - Pulire tutti i materiali che sono venuti a contatto con E. aedis con candeggina al 10% e autoclave (se possibile) per prevenire la contaminazione.
Representative Results
E. aedis ha infettato le uova di Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12)sono state schiuse come descritto nel protocollo precedente. Nella fase 4th instar, si potrebbero osservare segni visivi di infezione, comprese le cisti delle spore bianche in tutti i corpi grassi delle larve infette (un esempio di questo fenotipo è mostrato nella figura 2B). Le spore uninucleate sono state raccolte da4 larve instar omogeneizzando 10 larve in 500 μL di acqua. Queste spore erano piriformi (a forma di pera) e facilmente visibili a 400x(Figura 2A). Usando un emocitometro, fu calcolato un conteggio delle spore di 4,05 x10 3 spore/μL. Cento larve di Ae. aegypti sane sono state poi infettate orizzontalmente da ~ 50.000 spore in acqua da 100 mL per una dose finale di ~ 500 spore / larva. Le larve sono state allevate fino all'età adulta (generazione dei genitori) e il sangue alimentato con sangue di coniglio defibrinato più 1% (v/v) 100 mM di adenosina trifosfato. Le uova infettate verticalmente sono state raccolte (generazione filiale) e schiuse per continuare la propagazione di E. aedis e quantificare il successo dell'infezione.
A sette giorni dalla schiusa, 25 larve di generazione filiale sono state trasferite in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 ml e lavate una volta con acqua DI. Le singole larve sono state omogeneizzate in 250 μL di acqua DI e stato di infezione e i carichi di E. aedis sono stati valutati utilizzando un emocitometro. Il tasso di infezione verticale di E. aedis nella generazione filiale è stato riscontrato essere del 96% e il carico medio di spore di individui infetti a sette giorni dopo la schiusa è stato di 3,31 x 105 (Range: 3,25 x 104 – 1,47 x 106; Figura 3).
Figura 2: Visualizzazione dell'infezione da E. aedis nelle zanzare Ae. aegypti. (A) Spore piriformi uninucleate E. aedis uninucleate. Dieci larveinstar infette da E. aedis sono state omogeneizzate in 500 μL di acqua DI circa sette giorni dopo la schiusa. 10 μL dell'omogeneato sono stati caricati su un emocitometro e visti a 400X. Le frecce rosse indicano le spore rappresentative uninucleate E. aedis. (B) E. aedis infetto 4th larve instar sviluppano cisti distintive di spore bianche in tutto il loro corpo grasso18. Comunemente hanno anche segmenti addominali malformati e distensi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il protocollo cultura porta ad un'efficace infezione da E. aedis nella generazione filiale. Le larve di aegypti (n = 25) della generazione filiale sono state omogeneizzate individualmente in 250 μL di acqua e 10 μL dell'omogeneato sono state caricate su un emocitometro. La presenza di spore uninucleate ha indicato un'infezione positiva e le spore sono state quantificate per tutti i campioni positivi. (A) Prevalenza dell'infezione tra le larve filiale. Il grigio corrisponde alle larve non infette e dal nero all'infetto. I numeri visualizzati su ogni segmento danno il conteggio assoluto degli individui in ogni gruppo. (B) Carico di spore per ogni individuo infetto. I punti neri rappresentano il conteggio delle spore uninucleate trasformate log10 per ogni larva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Presentiamo qui il metodo originariamente descritto in Hembree e Ryan, 19828 per l'allevamento di E. aedis microsporidia nelle zanzare Ae. aegypti. Il ceppo di E. aedis utilizzato in questo studio è stato derivato dalla collezione originale sul campo di Stephen Hembree in Thailandia nel 19791919. Il metodo capitalizza la trasmissione orizzontale, che si verifica naturalmente nel ciclo di trasmissione di E. aedis7, per propagare il parassita in modo controllato. Questo metodo può essere impegnativo per i nuovi arrivati che non hanno familiarità con l'aspetto delle spore, i sintomi di infezione nelle larve o la coordinazione necessaria per completare con successo il protocollo di allevamento / dosing multi-stadio. La nostra speranza è che gli ausili visivi che accompagnano questo protocollo riducano le barriere all'ingresso per i ricercatori che desiderano cultura E. aedis.
Abbiamo propagato E. aedis in Ae. aegypti come descritto sopra e quantificato il successo del parassitismo nella generazione filiale. In breve, abbiamo covato le uova di E. aedis infettate da Ae. aegypti, le abbiamo allevate fino al4 ° instar e raccolto spore uninucleate di E. aedis dalle larve infette. Abbiamo quindi infettato orizzontalmente larve sane con queste spore tramite ingestione orale e allevato le larve infette orizzontalmente fino all'età adulta. Abbiamo nutrito sangue gli adulti infetti (generazione dei genitori) e raccolto uova (generazione filiale), che abbiamo ipotizzato sarebbe stato infettato verticalmente dal parassita E. aedis. Abbiamo schiuso le uova della generazione filiale e raccolto e omogeneizzato un sottoinsieme delle larve quando erano 4° instars. Abbiamo quantificato la percentuale di larve infettate da E. aedis e il conteggio totale delle spore in tutti gli individui infetti. La Corte ha riscontrato che la stragrande maggioranza (96%) di individui sono stati infettati e il carico medio di spore di larve infette era ~ 105. Concludiamo che il nostro protocollo di allevamento ha portato a una propagazione di grande successo delle zanzare E. aedis in Ae. aegypti.
Esistono diversi aspetti di questo protocollo che possono essere particolarmente impegnativi per l'utente non inizializzato. Di seguito offriamo alcune informazioni aggiuntive che potrebbero essere di aiuto. Per domande riguardanti l'allevamento generale delle zanzare, una guida completa alla manutenzione della colonia Ae. aegypti esula dall'ambito di questo protocollo. Tuttavia, molte domande comuni possono essere affrontate da risorse del Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository16,17 tracui la schiusa delle uova, le esigenze dietetiche generali, le condizioni abitative e ambientali e l'alimentazione del sangue. Per quanto riguarda la tempistica dell'infezione, le larve tratteggiate da uova infette non mostrano segni di infezione fino alla fine del 4° stadio instar. Le spore uninucleate appaiono rapidamente, nel corso di 1-2 giorni. Le larve possono apparire praticamente non infette a 6 giorni dopo la schiusa ma altamente infette dal giorno 7 o 8 dopo la schiusa. Inoltre, può essere difficile visualizzare le spore in campioni omogeneizzati perché ci sono molti altri microbi presenti in omogeneati di zanzare interi, inclusi altri organismi eucarioti unicellulari (ad esempio, lievito) di dimensioni simili alle spore uninucleate E. aedis. La forma distintiva delle spore di E. aedis (Figura 2A)è un metodo altamente affidabile per l'identificazione e aiuterà a differenziare E. aedis dagli altri microbi nell'omogeneato. Sebbene non sia necessario per l'identificazione o la quantificazione, se si desidera la purificazione delle spore, può essere ottenuta tramite centrifugazione del gradiente di densità della silice colloidale che consentirà la separazione delle spore di E. edi da altri elementi contaminanti nell'omogeneato. Questo processo è descritto in dettaglio in Solter etal.
La temperatura e la dieta utilizzate nelle pratiche di allevamento differiscono comunemente tra i laboratori, ma le variazioni probabilmente produrranno ancora una propagazione dei parassiti di successo. Piccole differenze nel tipo di cibo larvale non interferiscono con l'infezione di successo, anche se non abbiamo testato esplicitamente diversi tipi di cibo in questo protocollo. L'effetto della temperatura sull'infezione è stato testato e l'infezione da E. aedis è risultata robusta a un'ampia gamma ditemperature 21. La produzione massima di spore si è verificata a 30,8 °C, ma era ancora robusta a temperature di allevamento fino a 20 °C. Il numero di spore è stato drasticamente ridotto a temperature di allevamento più elevate (36 °C), quindi queste temperature dovrebbero essere evitate per questo protocollo.
La contaminazione è sempre un problema quando si lavora con i parassiti. E. aedis è un parassita di successo di Ae. aegypti e deve quindi essere tenuto separato dalle colonie di laboratorio non infette per prevenire la contaminazione. Si consiglia la conservazione delle zanzare infette in un'incubatrice separata, se possibile. Abbiamo anche raccomandato che i materiali utilizzati per il lavoro di microsporidia (ad esempio, vassoi larvali, pipette di trasferimento, gabbie, tazze per la raccolta delle uova) siano designati per il lavoro di microsporidia e non utilizzati in modo più ampio in tutto l'insetto. Tutti i materiali di allevamento devono essere sterilizzati con candeggina al 10% dopo l'uso e l'autoclave può essere utilizzata per integrare la sterilizzazione della candeggina.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare Spencer Blankenship per l'aiuto con l'allevamento delle zanzare. Ringraziamo anche James N. Radl e M. Dominique Magistrado per l'utile feedback sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
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