Summary
Un protocolo para cultivar el parásito microsporidiano Edhazardia aedis. El parásito pasa de una generación de mosquitos Aedes aegypti a la siguiente a través de la transferencia horizontal en la etapa larval seguida de la transmisión vertical en la etapa adulta. Los esporoplasmos vivos sobreviven a largo plazo en huevos infectados.
Abstract
Edhazardia aedis es un parásito microsporidiano de los mosquitos Aedes aegypti, un vector de enfermedad que transmite múltiples arbovirus que causan millones de casos de enfermedad cada año. E. aedis causa mortalidad y disminución de la aptitud reproductiva en el mosquito vector y ha sido explorado por su potencial como agente de biocontrol. El protocolo que presentamos para el cultivo de E. aedis se basa en su ciclo de infección natural, que implica tanto la transmisión horizontal como vertical en diferentes etapas de vida del huésped del mosquito. Los mosquitos Ae. aegypti están expuestos a esporas en la etapa larval. Estas larvas infectadas maduran en adultos y transmiten el parásito verticalmente a su descendencia. La descendencia infectada se utiliza entonces como fuente de esporas para la futura transmisión horizontal. Culturing E. aedis puede ser un desafío para los no iniciados dadas las complejidades del ciclo de vida del parásito, y este protocolo proporciona orientación detallada y ayudas visuales para la clarificación.
Introduction
Aedes aegypti es el mosquito vector de múltiples arbovirus (por ejemplo, dengue, zika, fiebre amarilla) que en conjunto se estima que representan cientos de millones de casos de enfermedad cada año y más de 30.000 muertes1,2. El tratamiento de las enfermedades causadas por estos patógenos se limita a la atención de apoyo y es probable que surjan arbovirus adicionales en el futuro3. Por lo tanto, el control del vector de mosquitos es de importancia primordial, ya que impide eficazmente la transmisión de patógenos actuales y emergentes4. Tradicionalmente, las estrategias de control de vectores utilizan principalmente insecticidas químicos, pero la resistencia a muchos insecticidas de uso común ha impulsado la demanda de nuevos métodos de control de vectores. Un agente potencial que ha sido explorado por sus propiedades de biocontrol contra Ae. aegypti es el parásito Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, identificado por primera vez como Nosema aedis por Kudo en 1930, es un parásito microsporidiano de los mosquitos Ae. aegypti 7. El desarrollo y reproducción de E. aedis es relativamente complejo y su ciclo de vida puede proceder de múltiples maneras7,8,9. Un ciclo de desarrollo común se describe en profundidad en Becnel et al., 19897 y se utiliza para la propagación de laboratorio (Figura 1)8. Brevemente, el ciclo comienza cuando los huevos de Ae. aegypti infectados verticalmente con E. aedis eclosionan en larvas infectadas que desarrollan esporas sin inuclear en el cuerpo graso, y generalmente mueren como larvas o pupas. Las esporas no inucleadas liberadas de larvas muertas contaminan el hábitat y son ingeridas por larvas sanas de Ae. aegypti. Estas esporas germinan principalmente en el tracto digestivo, infectando el tejido digestivo de las larvas expuestas, lo que resulta en la transmisión horizontal. Las larvas infectadas horizontalmente se convierten en adultos (generación parental) donde se forman esporas de binucleo. En la hembra, estas esporas de binucleo invaden el tracto reproductivo y su esporoplasma asociado infecta el desarrollo de células de óvulos. Estos huevos entonces eclosionan en larvas infectadas (generación filial), lo que resulta en la transmisión vertical del parásito y la continuación del ciclo como se describió anteriormente.
Múltiples estudios han investigado el potencial de E. aedis para el biocontrol. Se ha demostrado que la infección por E. aedis reduce la capacidad reproductiva de las hembras de Ae. aegypti 10. Además, en un experimento de campo semi-campo, la liberación inundativa de E. aedis dio lugar a la erradicación total de una población de prueba de Ae. aegypti mantenida dentro de un recinto con mostero6. Si bien es capaz de pasar por algunas etapas de desarrollo en un conjunto diverso de especies de mosquitos, E. aedis sólo se transmite verticalmente en Ae. aegypti,lo que indica un alto grado de especificidad del huésped11,12. Del mismo modo, en una evaluación de laboratorio del riesgo ambiental potencial asociado con E. aedis, el parásito microsporotián no infectó la fauna acuática no objetivo, incluidos los depredadores que ingirió larvas de Ae. aegypti infectadas con E. aedis13. Estos resultados ponen de relieve el potencial de E. aedis para ser utilizado en estrategias de control biológico dirigidas a poblaciones naturales de Ae. aegypti.
A pesar del hecho de que E. aedis es prometedor para su uso en el control de vectores, hay desafíos para cultivarlo y desplegarlo a gran escala. E. aedis esporas pierden infectividad en menos de un día a temperaturas frías (es decir, 5 oC). Incluso a temperaturas más cálidas (es decir, 25 oC), las esporas pierden rápidamente la infectividad en el transcurso de tres semanas14. Además, E. aedis debe cultivarse en mosquitos vivos de Ae. aegypti y la dosificación controlada de mosquitos larvarios sanos es necesaria para garantizar la finalización del ciclo de vida y para evitar el colapso de la población utilizada para el cultivo8. El requisito del cultivo in vivo presenta un desafío; sin embargo, los recientes avances en la cría masiva de mosquitos y la robótica (por ejemplo, Massaro et al.15) podrían permitir la generación a gran escala de esporas de E. aedis. Anticipamos que la visualización de esta metodología aumentará la accesibilidad al protocolo de cría de E. aedis y permitirá que más investigadores investiguen la biología básica y el potencial aplicado de este sistema. También prevemos que facilitará una mayor colaboración con ingenieros, robóticos y el sector tecnológico más amplio, lo que puede servir para mejorar la cría masiva de E. aedis.
Figura 1: E. aedis propagation in Ae. aegypti. La propagación de E. aedis comienza con la eclosión de los huevos infectados por E. aedis. Las larvas infectadas se crían a4o instar, E. aedis esporas se aíslan de esas larvas, y las esporas se utilizan para infectar por vía oral 2nd/3rd instar larvas criadas de una puesta de huevos no infectada (transmisión horizontal). Estas larvas infectadas por vía oral se crían hasta la edad adulta (generación parental) y ponen huevos infectados con E. aedis (transmisión vertical). Los huevos infectados (generación filial) se incuban para continuar el ciclo de infección y el cultivo de parásitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
1. Día 0
- Huevos Hatch Ae. ae. aegypti infectados con E. aedis mediante la colocación en bandeja de cría larvaria con 1 L de agua desionizada (DI). Añadir 50 mg de pescado.
NOTA: En el momento de la publicación, una cepa de laboratorio de E. aedis sólo está disponible en laboratorios que investigan activamente el parásito, ya que E. aedis no es susceptible de almacenamiento a largo plazo y los huevos infectados no se almacenan actualmente en repositorios. Los investigadores interesados en trabajar con E. aedis pueden ponerse en contacto con el autor correspondiente para solicitar huevos infectados.
NOTA: Por lo general, no es necesario incubar un gran número de huevos infectados; diez larvas de E. aedis infectadas de Ae. ae. aegypti son suficientes para dosificar ≥ 1000 larvas sanas.
NOTA: Para todas las partes de este protocolo, alojamos mosquitos en las siguientes condiciones: 14 h/10 h de ciclo de luz/oscuridad, 27 oC de temperatura y 80% de humedad relativa.
2. Día 1
- Después de la eclosión, reduzca la densidad de las larvas a 100 larvas por bandeja, haciendo bandejas nuevas según sea necesario (también con 1 L de agua DI).
- Agregue un trozo de comida seca para gatos a cada bandeja. Reponer los alimentos cuando se agoten, pero no proporcionen un exceso de alimentos. Un pedazo de alimento para gatos (200 mg) cada tres días es suficiente.
NOTA: Ajuste la cantidad de alimentos dependiendo de las condiciones específicas de cría (es decir, reducir los alimentos si el agua se vuelve turbia o las larvas están muriendo, aumentar los alimentos si las larvas se retrasan gravemente en el desarrollo). Se pueden utilizar otros regímenes de alimentación y/o condiciones de cría que los sugeridos aquí, pero pueden ser necesarios ajustes en la sincronización de este protocolo estándar.
3. Días 4-u20125
- Cuando las larvas infectadas son3a –4o en las estrellas, eclosionan huevos saludables/no infectados de Ae. ae. aegypti en una bandeja nueva.
- Trasera en densidades tales que Ae. aegypti saludable alcanza2o – 3rd instar en 48–72 h. En nuestras manos, esto se puede lograr utilizando densidades de 200-u2012300 larvas por 1 L de agua con acceso ad libitum a los alimentos. La eclosión de lotes de huevos sanos durante varios días puede garantizar que las larvas estén en la etapa correcta cuando sea necesario.
4. Días 7-u20128: Transmisión horizontal
NOTA: La dosificación de larvas sanas con E. aedis no se puede realizar hasta que las esporas sin inucleares estén en números altos en larvas infectadas (1 x 104 – 1 x 106 por larva). Esto ocurre tarde en la etapa 4de instar (Figura 2).
- Cosechar y cuantificar esporas uninuleas.
- Utilice una pipeta de transferencia (es posible que tenga que cortar la punta a un diámetro más ancho) para mover 10 larvas infectadas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Retire el agua de reproducción con una tubería de transferencia y lave una vez añadiendo 1 ml de agua de DI limpia. Retire el agua de lavado con una tubería, agregue 500 l de agua DI limpia a las 10 larvas y homogeneice utilizando un homogeneizador mecánico y pestillo.
- Cuantifique las esporas utilizando un hemocicómetro a una ampliación de 400x.
NOTA: Las esporas sin inuclear se pueden identificar por su forma piriforme distinta (es decir, la forma de la pera; Figura 2A).
- Dosis saludables larvas de Ae. aegypti con E. aedis.
- Hacer purines de alimentos larvarios frescos mezclando 1,2 g de polvo de hígado, 0,8 g de levadura de cerveza y 100 ml de agua.
NOTA: Los alimentos no necesitan ser frescos si se autoclava y se almacenan a 4 oC hasta su uso. - Transfiera 1002 nd – 3a instar saludables larvas de Ae. aegypti en vasos de 150 ml o tazas de muestras.
- Dosis de cada vaso de 100 larvas con 5 x 104 – 1 x 105 esporas.
- Añadir 2 ml de purines de alimentos larvarios y agua DI a un volumen final de 100 ml.
- Hacer purines de alimentos larvarios frescos mezclando 1,2 g de polvo de hígado, 0,8 g de levadura de cerveza y 100 ml de agua.
- Después de 12–24 h de exposición, transfiera las larvas expuestas a las bandejas de cría y de la parte trasera a la edad adulta siguiendo un protocolo de cría estándar16.
5. Monitoreo y transmisión vertical
- Monitoree las larvas dosificadas para detectar pupas y transfiera las pupas a medida que se desarrollan a una taza de emergencia en una jaula. Azúcar feed adultos ad libitum (según16,17). Los adultos que eclosión estén infectados por E. aedis.
- La sangre alimenta a los adultos (según16,17) y recoge los huevos. La transmisión vertical de E. aedis se produce en este paso.
NOTA: Si se proporcionan comidas de sangre adicionales tan pronto como se completa la oviposición, las hembras pueden poner al menos un embrague adicional de huevos antes de que los adultos sufran (a menudo repentinas) altos niveles de mortalidad. - Utilice estos huevos Ae. aegypti infectados con E. aedis para continuar la propagación a partir del paso 1 de este protocolo.
NOTA: Los huevos se pueden almacenar durante 2 – 3 meses en condiciones apropiadas16. - Limpie todos los materiales que entraron en contacto con E. aedis con 10% de lejía y autoclaving (si es posible) para evitar la contaminación.
Representative Results
E. aedis infectado Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12) huevos fueron incubados como se describe en el protocolo anterior. En la etapa 4de la estrella, se pudieron observar signos visuales de infección, incluyendo quistes de esporas blancas en todo el cuerpo graso de las larvas infectadas (un ejemplo de este fenotipo se muestra en la Figura 2B). Las esporas uninuizadoras se cosecharon a partir de larvas de4o instar mediante la homogeneización de 10 larvas en agua DI de 500 l. Estas esporas eran piriformes (en forma de pera) y fácilmente visibles a 400x(Figura 2A). Usando un hemociclomekil, se calculó un recuento de esporas de 4.05 x10 3 esporas/L. Cien larvas sanas de Ae. aegypti se infectaron horizontalmente con 50.000 esporas en 100 ml de agua para una dosis final de 500 esporas/larva. Las larvas fueron criadas hasta la edad adulta (generación parental) y la sangre alimentada con sangre de conejo desfibrinada más 1% (v/v) 100 mM de trifosfato de adenosina. Los huevos infectados verticalmente fueron recogidos (generación filial) y eclosionados para continuar la propagación de E. aedis y cuantificar el éxito de la infección.
A los siete días posteriores a la eclosión, 25 larvas de generación filial fueron transferidas a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 ml y lavadas una vez con agua DI. Las larvas individuales se homogeneizaron en 250 ml de agua DI y el estado de infección y las cargas de E. aedis se evaluaron utilizando un hemociclomekil. La tasa de infección vertical de E. aedis en la generación filial se encontró que era del 96% y la carga media de esporas de individuos infectados a los siete días después de la eclosión fue de 3,31 x10 5 (Rango: 3,25 x 104 – 1,47 x 106; Figura 3).
Figura 2: Visualización de la infección por E. aedis en mosquitos Ae. aegypti. (A) E. aedis esporas piriformes no inulíleas. Diez larvas de E. aedis infectadas 4o instar fueron homogeneizadas en 500 l de agua DI aproximadamente siete días después de la eclosión. 10 l del homogeneato se cargó en un hemocitoómetro y se visualizó a 400X. Las flechas rojas indican uninuclete representativo E. aedis esporas. (B) E. aedis infectados 4th instar larvas desarrollan quistes distintivos de esporas blancas en todo su cuerpo de grasa18. También suelen tener segmentos abdominales malformados y distendidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El protocolo de cultivo conduce a una infección efectiva de E. aedis en la generación filial. Las larvas de Ae. aegypti (n.o 25) de la generación filial se homogeneizaron individualmente en agua DI de 250 l y 10 l del homogeneato se cargaron en un hemocitociómetro. La presencia de esporas inéucleas indicaron una infección positiva y se cuantificaron esporas para todas las muestras positivas. (A) Prevalencia de infección entre larvas filiales. El gris corresponde a larvas no infectadas, y negro a infectado. Los números mostrados en cada segmento dan el recuento absoluto de individuos en cada grupo. (B) Carga de esporas para cada individuo infectado. Los puntos negros representan elrecuento de esporas sin inucletes transformados para cada larva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aquí presentamos el método descrito originalmente en Hembree y Ryan, 19828 para la cría de E. aedis microsporidia en mosquitos Ae. aegypti. La cepa de E. aedis utilizada en este estudio se derivó de la colección de campo original de Stephen Hembree en Tailandia en 197919. El método aprovecha la transmisión horizontal, que se produce naturalmente en el ciclo de transmisión de E. aedis7, para propagar el parásito de manera controlada. Este método puede ser un desafío para los recién llegados que no están familiarizados con la apariencia de las esporas, los síntomas de infección en las larvas o la coordinación necesaria para completar con éxito el protocolo de cría/dosificación de varias etapas. Nuestra esperanza es que las ayudas visuales que acompañan a este protocolo reduzcan las barreras de entrada para los investigadores que deseen cultivar E. aedis.
Propagamos E. aedis en Ae. aegypti como se describió anteriormente y cuantificamos el éxito del parasitismo en la generación filial. Brevemente, incubamos E. aedis infectados Ae. aegypti huevos, los criamos a 4a estrella, y recogimos esporas sin inuclear E. aedis de las larvas infectadas. Luego infectamos horizontalmente larvas sanas con estas esporas a través de la ingestión oral, y criamos las larvas infectadas horizontalmente hasta la edad adulta. Alimentamos a los adultos infectados (generación parental) y recogimos óvulos (generación filial), que hipotetizamos que estarían infectados verticalmente con el parásito E. aedis. Eclosionamos huevos de la generación filial y recolectamos y homogeneizamos un subconjunto de las larvas cuando eran4o en las estrellas. Cuantificamos el porcentaje de larvas que estaban infectadas con E. aedis y el recuento total de esporas en todos los individuos infectados. Encontramos que la gran mayoría (96%) de los individuos se infectaron y la carga media de esporas de larvas infectadas fue de 105. Concluimos que nuestro protocolo de cría dio lugar a una propagación muy exitosa de E. aedis en mosquitos Ae. aegypti.
Hay varios aspectos de este protocolo que pueden ser particularmente difíciles para el usuario no iniciado. A continuación ofrecemos información adicional que puede ser de ayuda. Para preguntas sobre la cría general de mosquitos, una guía completa para el mantenimiento de la colonia Ae. aegypti está fuera del alcance de este protocolo. Sin embargo, muchas preguntas comunes pueden ser abordadas por los recursos del Repositorio de Recursos de Investigación sobre Biodefensas e Infecciones Emergentes16,17 incluyendo la eclosión de huevos, las necesidades dietéticas generales, las condiciones ambientales y de vivienda, y la alimentación de la sangre. En cuanto a la línea de tiempo de la infección, las larvas nacidas a partir de huevos infectados no muestran signos de infección hasta tarde en la etapa 4de instar. Las esporas sin inuclear aparecen rápidamente, en el transcurso de 1-2 días. Las larvas pueden aparecer prácticamente no infectadas a los 6 días después de la eclosión, pero altamente infectadas por el día 7 u 8 después del rayado. Además, puede ser difícil visualizar las esporas en muestras homogeneizadas porque hay muchos otros microbios presentes en homogeneizados de mosquitos enteros, incluyendo otros organismos monocelulares eucariotas (por ejemplo, levaduras) de un tamaño similar al de E. aedis esporas inucleadas. La forma distintiva de E. aedis esporas (Figura 2A) es un método altamente confiable para la identificación y ayudará a diferenciar E. aedis de otros microbios en el homogeneizado. Aunque no es necesario para la identificación o cuantificación, si se desea purificación de esporas, se puede lograr a través de la centrifugación de gradiente de densidad de sílice coloidal que permitirá la separación de E. aedis esporas de otros elementos contaminantes en el homogeneato. Este proceso se describe en detalle en Solter et al.20.
La temperatura y la dieta utilizadas en las prácticas de cría suelen diferir entre los laboratorios, pero es probable que las variaciones sigan produciendo una propagación exitosa del parásito. Las diferencias menores en el tipo de alimento larval no interfieren con la infección exitosa, aunque no probamos explícitamente diferentes tipos de alimentos en este protocolo. El efecto de la temperatura sobre la infección se ha probado y la infección por E. aedis se ha encontrado para ser robusto en una amplia gama de temperaturas21. La producción máxima de esporas se produjo a 30,8 oC, pero todavía era robusta a temperaturas de cría tan bajas como 20 oC. El recuento de esporas se redujo drásticamente a temperaturas de cría más altas (36 oC), por lo que estas temperaturas deben evitarse para este protocolo.
La contaminación es siempre una preocupación cuando se trabaja con parásitos. E. aedis es un parásito exitoso de Ae. aegypti y por lo tanto debe mantenerse separado de las colonias de laboratorio no infectadas para evitar la contaminación. Si es posible, recomendamos el almacenamiento de mosquitos infectados en una incubadora separada. También recomendamos que los materiales utilizados para el trabajo de microsporidia (por ejemplo, bandejas larvales, pipetas de transferencia, jaulas, tazas de recolección de huevos) se designen para trabajos de microsporidia y no se utilicen de manera más amplia en todo el insectío. Todos los materiales de cría deben esterilizarse con 10% de lejía después de su uso y el autoclaving se puede utilizar para complementar la esterilización de lejía.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Queremos agradecer a Spencer Blankenship por ayuda con la cría de mosquitos. También agradecemos a James N. Radl y M. Dominique Magistrado por sus comentarios útiles sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 - 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 - 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 - 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 - 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
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