Summary
本プロトコルでは、ブタ特異的プライマーを設計し、プラスミド含有ブタ特異的DNA断片を構築し、定量のための標準的な曲線を確立した。種特異的プライマーを用いて、cpsDNAを、豚からマウスへの細胞移植モデルおよびブタからサルへの動脈パッチ移植モデルにおいてqPCRによって定量化した。
Abstract
異種移植は、臓器不全を治療するための実行可能な方法である。しかし、異種移植の免疫拒絶反応を効果的に監視する方法は、医師や研究者にとって問題です。本稿では、豚からマウスへの細胞移植モデルおよびサルからサルへの動脈パッチ移植モデルにおける免疫拒絶反応をモニタリングする、簡単で効果的な方法を説明する。循環DNAは、臓器損傷のための潜在的に非侵襲的なバイオマーカーです。本研究では、循環ブタ特異的DNA(cpsDNA)を、定量リアルタイムPCR(qPCR)による異種移植片拒絶反応中にモニタリングした。本プロトコルでは、ブタ特異的プライマーを設計し、プラスミド含有ブタ特異的DNA断片を構築し、定量のための標準的な曲線を確立した。次に、ブタからマウスへの細胞移植モデルおよび豚からサルへの動脈パッチ移植モデルにおいて、種特異的プライマーを使用してqPCRによってcpsDNAを定量化した。この方法の値は、異種移植の免疫拒絶反応を監視するための簡便で、便利で低コストで、侵襲性の低い方法として使用できることを示唆している。
Introduction
臓器不全は死の主な原因の1つである。細胞、組織、臓器の移植は、臓器不全2を治療する有効な方法である。それにもかかわらず、ドナー臓器の不足は、この方法の臨床応用を制限する 3,4.研究は、豚が臨床移植のための人間の臓器の潜在的な供給源として使用することができることを示しています 5,6.しかし、クロス種臓器移植は危険な免疫拒絶反応に直面している。したがって、異種移植の免疫拒絶反応を監視することが重要です。現在、免疫拒絶反応の臨床モニタリングは、主に患者の徴候および症状、ならびに実験室試験(例えば、生検、免疫生物化学分析、および超音波)7、8、9に依存する。ただし、これらの監視方法には多くの欠点があります。患者の免疫拒絶反応の徴候と症状は通常10年後半に現れるが、これは早期発見と早期介入を助長しない。生検は、患者が受け入れるのは容易ではない侵襲的な11の欠点を有する。免疫生物化学分析は感度や特異性を欠き、超音波は補助的で高価です。したがって、免疫拒絶反応を監視する効果的かつ便利な方法を見つけることが急務である。
循環DNAは、血液中に見られる細胞外タイプのDNAです。マンデルとメタイス12は、1948年に末梢血中の循環DNAの存在を最初に報告した。正常な生理学的条件下では、健常者の血液中の循環DNAはベースラインにおいて比較的低い。しかし、腫瘍、心筋梗塞、自己免疫疾患、移植拒絶反応などのいくつかの病態では、アポトーシスおよび壊死によって引き起こされる循環DNAの大量放出により、血液中の循環DNAのレベルが13,14に有意に増加する可能性がある。循環DNAの起源は、異種移植片拒絶反応16の特徴であるアポトーシスおよび壊死15と関連している。
循環DNAは、癌17、18、19を検出するための低侵襲バイオマーカーであることが証明されている。ドナー由来循環DNAの高いスループットシーケンシングは、臓器移植20,21の後の拒絶反応の検出に対して信頼できる。しかし、この方法では、高濃度の抽出DNAの品質が必要です。高いコストおよび時間消費に加えてDNAの条件は、この方法は、日常的な臨床使用のために不適格になります。ドナー由来の循環DNAは、特異的かつ感度の高い定量リアルタイムPCR(qPCR)によって正確に定量することができます。従って、qPCRによるブタ循環DNAの定量化は、異種移植の免疫拒絶反応をモニタリングする実現可能な方法である。これは、侵襲性が低く、高感度で特定の、低コストで時間を節約します。豚と人間は、遺伝的に全く異なるゲノム配列と分離されている(図1)。したがって、循環性ブタDNAは、異種拒絶反応のためにレシピエントの血液異種移植後に放出され得る。CpsDNAは、レシピエントの血液中の種特異的プライマーを用いてqPCRによって正確に定量することができる。これまで、我々は異種移植22,23のバイオマーカーとしてのcpsDNAの根拠と実現可能性を実証した。ここでは、より実験的なヒントと詳細を開示します。実験は、次の手順で構成されます。まず、ブタ特異的プライマーを設計し、ゲノムDNAを単離し、通常PCRによりプライマーの特異性を検証するために使用した。第二に、cpsDNAの標準曲線を構築し、サンプル血液からcpsDNAを単離する。最後に、循環するブタ特異的DNAをqPCRを用いて定量した。
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Protocol
すべての実験は、深セン大学第一附属病院、深セン第二人民病院の機関審査委員会の関連ガイドラインと規制に従って行われました。
1. ブタ固有のプライマーを設計する
- 全ゲノムBLAST解析を行い、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)ソフトウェアを使用して、ヒト、サル、マウスとは異なるブタ特異的遺伝子を同定します。
- プライマー5のソフトウェアを用いて19個の豚特異的遺伝子(表1)に従ってプライマーを設計する。
2. ゲノムDNAの分離
注:ゲノムDNA(豚、サル、ボランティアの人間、豚移植片を持つサル、豚細胞を持つマウスからの血液を含む)を、市販のゲノムDNA抽出キット(材料表)を使用して抽出した。
- 上記サンプルの全血500μLをそれぞれ異なるマイクロ遠心チューブに入れます。
- 上記のマイクロ遠心分離チューブにプロテアーゼKと500μLのリシスバッファーを20 μL加え、十分に振って混ぜます。
- これらのマイクロ遠心分離管を56°Cの水浴に10分間入れ、溶液が明らかになるまでこのプロセスの間に2〜3回振ります。
- チューブカバーの内壁から液体ビーズを除去するために、遠心分離機を簡単に。無水エチルアルコール500μLを加え、十分に振ります。
- 混合物を吸着カラムに移し、遠心分離機を12,000rpm(〜13,400 x g)で2分間移動します。
- 各吸着カラムに800 μLのリンス溶液を追加します。12,000 rpmで1分間の遠心分離機(〜13,400 x g)。カラムを室温で数分間置き、残りのすす水を乾燥させます。
注: リンスソリューションは製造元によって提供されています。 - 吸着カラムを別のきれいな遠心管に移し、吸着フィルムの中央に50μLの溶出バッファーを加え、室温で2〜5分間置きます。遠心分離機 6,200 x g 1 分 12,000 rpm (〜13,400 x g).
注: 溶出バッファーはメーカーによって提供されますが、10 mM Tris-HCl (pH 8.0) および 0.1 mM EDTA を含む TE バッファーも DNA を溶出できます。 - DNA溶液を-20°Cに保存します。
3. プライマーの特異性を確認する
注:上記19のプライマーの種特異性は、ポリメラーゼ(材料表)および 表1に示すプライマーを用いて行ったPCRによって確認された。
- 12.5 μLの2x PCRプレミックス(材料表)、5'プライマー(10 μM)の1 μL、3'プライマー(10 μM)の1 μL、および8.5 μLのddH2Oのプレミックス溶液を調製し、2つの余分なサンプルを含むミックスを準備します。
- 23 μLのプレミックス溶液を0.2 mLマイクロ遠心分離チューブに分割し、2 μLのゲノムDNAを加え、慎重にキャップします。その後、少し遠心分離機を混ぜます。
- 0.2 mLマイクロ遠心分離チューブをPCRサイクラーに入れ、次の手順を実行します: 変性: 95 °C(5 s)アニーリング:30sのための60°C;延長:72 °C 30 s.
- アガロース電気泳動を次のように行います。
- アガロース1.2gを1x TAEの100mLを含むフラスコに秤量し、電子レンジで5分間沸騰させます。約70°Cに冷却した後、フラスコに5μLの核酸色素(材料表)を加えます。 端に沿ってゆっくりとプレートに注ぎ、ゲルに固まるまで室温に置きます。
- 6x DNAローディングバッファーの1 μLを含む5 μLのサンプルと2-Log DNAラダー(0.1~10.0 kb)またはマーカーI(0.1~0.6 kb)をアガロースゲルに加えます。その後、バンドが分離されるまで120mAでエレクトロフォレス。
- 紫外線イメージャーでDNA断片を含む寒天ゲルを可視化します。
- アガロース電気泳動を行い、上記のサンプルから増幅されたDNA断片を単離し、紫外線画像装置で可視化した。PCRを用いて、増幅ブタゲノムDNAに特異的なプライマーを最初に同定した(図2A)。また、サル/ヒトゲノムのコホートまたはマウスゲノムDNAのコホートにおいて豚DNAを特異的に増幅したこれらのプライマーの種特異的な特定の特異性が確認された(図2B)。最後に、ブタからサルへの動脈パッチおよび/または豚からマウス細胞への移植モデルで、それぞれブタDNAを特異的に増幅することがさらに証明された2種の特異性プライマー(図2C)
4. cpsDNAの標準曲線
- ブタDNAの断片を含むpMD19-TプラスミドをDH5aに変換し、プライマー#4またはプライマー#11によって特異的に増幅することができる(表1)。50 μg/mL アンピシリンを用いた正の細菌のスクリーニング。
ヒト/サルコホートのプライマー#4(フォワード:5'-TTCAATCCCA CTTCTCCACCTTAA-3'、逆:5'-CTTCATTATCTTCATAATAAC CCTGT-3')
マウスモデルのプライマー#11(前方:5'-TGCCGTGTTTTCC GTTGCTTG-3′、逆:5'-TCACATTGATGGTCGTCTGtGtGtC T-3')
注: すべてのプライマーの詳細は 、表 1を参照してください。 - 以下のプロトコルに従って上記のプラスミドを収穫する。
- 単一コロニーを新しく縞にした選択的プレートから分離し、適切な選択的抗生物質を含むLB培地の1〜5mLの培養物を接種する。激しい振盪(300rpm)で37°Cで12〜16時間インキュベートする。
- 室温で1分間10,000xgで遠心分離機。デカントまたは吸引し、培養培地を廃棄する。
- 250 μLのソリューション I/RNase A. Vortex またはパイプを上下に加えて、完全に混合します。細胞ペレットの完全な再懸濁は、良好な収率を得るために不可欠です。
注: RNase A は、使用する前にソリューション I に追加する必要があります。 - サスペンションを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。250 μLのソリューションIIを追加します。チューブを数回反転して軽く回転させて、明確なライセートを得ます。2~3分のインキュベーションが必要な場合があります。
注:染色体DNAを剪断し、プラスミドの純度を下げるので、激しい混合は避けてください。5分以上のリシス反応を進行させてはなりません。 - 350 μLのソリューション III を追加します。凝集白の沈殿物が形成されるまで、すぐに数回反転します。
注: 局所的な沈殿を避けるために、溶液を完全に、溶液IIIの添加直後に混合することが重要です。 - 最大速度(≥13,000 x g)で10分間遠心分離機。コンパクトな白いペレットが形成されます。速やかに次のステップに進みます。
- DNAミニカラムを2mLのコレクションチューブに挿入します。
- 取り出した上清を4.2.7から慎重に吸引してDNAミニカラムに移します。ペレットを乱さないで、細胞の破片がDNAミニカラムに移らないよう注意してください。
- 1分間の最高速度で遠心分離機。濾液を捨てて、回収管を再利用してください。
- 500 μL の HBC バッファを追加します。1分間の最高速度で遠心分離機。濾液を捨てて、回収管を再利用します。
注:HBCバッファは使用前に100%イソプロパノールで希釈する必要があります。 - 700 μLのDNA洗浄バッファーを追加します。1分間の最高速度で遠心分離機。濾液を捨てて、回収管を再利用してください。
注:DNAウォッシュバッファーは、使用前に100%エタノールで希釈する必要があります。- オプション: 2 番目の DNA 洗浄バッファーの洗浄ステップに対して繰り返します。
- 空のDNAミニカラムを最大速度で2分間遠心分離し、カラムマトリックスを乾燥させます。
注: 溶出前にDNAミニカラムマトリックスを乾燥させることが重要です。残留エタノールは下流の適用を妨げる。 - DNAミニカラムをクリーンな1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。
- 30~100 μLの溶出バッファーまたは滅菌脱イオン水をカラム膜の中心に直接加えます。
注:DNA MiniカラムからDNAを溶出する効率はpHに依存します。滅菌脱イオン水を使用する場合は、pHが8.5前後であることを確認してください。 - 室温で1分間座らせます。
- 1分間の最高速度で遠心分離機。
注: これは結合DNAの約70%を表します。オプションの第二溶出は、より低い濃度で、任意の残留DNAをもたらす。
- EcoR I(15 U/μL)とBam H1(15 U/μL)22を用いて二重制限酵素消化を用いて上記のプラスミドを検証する。
- 氷の上でメイクアップステップを実行します。EcoR I(15 U)の1μL、バムH1(15 U)の1μL、10xバッファの2μL、プラスミド1μgの反応系を調製する。合計容積の20 μLにddH2Oを加える、完全に混ぜる。37°Cの水浴中で2時間インキュベートします。
- 消化した製品を1%のアガロースで分離し、その後電気泳動を行い、以前と同様にUV光にさらします。
- ddH2Oを使用して、2 x 1011コピー/mLに濃縮プラスミドを希釈します。例えばコピー計算のブタDNAの断片を含むプラスミド(P2)を取る:
- 開始標準溶液の1 mLのプラスミド数を計算する: N = (2x 10 11)/(6.02 x 1023)mol。
- P2の分子量を計算する:M = 2810 bp x 650 D/bp = 2810 x 650 D(g/mol)を計算します。
- P2の質量を計算: m=N*M= (2 x 1011)/ (6.02 x 1023)モル x 2810 x 650 g/mol.
- P2: V = m/C = [(2 x 1011)/(6.02 x 1023)x 2810 x 650] g/Cの体積を計算します(CはP2(ng/μL)の濃度で、分光光度計で測定されます。
- 開始標準溶液を10倍に連続して2 x10 10 コピー/mL、2 x 109 コピー/mL、2 x 108 コピー/mL、2 x 107 コピー/mL.、および2 x 100 コピー/mLを希釈して、希釈中に完全にddH2O.V/Vtexを使用して標準溶液にします。
- 標準曲線を確立します。
- qPCRの反応系を準備する(すべてのステップは光から保護されている):325 μLのqPCRミックス(材料表)、5'プライマーの13 μL、3'プライマーの13 μL、および169 μLのddH2Oを1.5 mLマイクロ遠心チューブに加え、その後十分に混合し、わずかに遠心分離したチューブに加えます。
- 40 μL以上のプレミックス溶液を8チューブストリップに分割し、異なる濃度の標準DNAを10 μL加えます。慎重にキャップし、混ぜ、遠心分離機を少し。
- 図 3に示す手順に従って、8 チューブ ストリップを qPCR マシンに入れます。
5. 血液サンプルから循環DNAを分離する
- EDTAチューブを使用して、豚から猿への動脈パッチモデルおよび豚からマウスへの細胞移植モデルのさまざまな時点で血液サンプルを収集します。
- 約400μL(豚からサルへの動脈パッチモデルから)または100μL(豚からマウスへの細胞移植モデルから)の血液サンプルを収集し、1.5 mLマイクロ遠心分離管に移管します。血液サンプルから、低温・高速(3,000 x g、4°C、5分)で遠心分離して血液細胞を除去します。
- 上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、16,000 x g で10分間遠心分離して細胞の破片を取り除きます。
- 上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心分離管に移します。上記上清から、分離ゲノムDNA製造業者のプロトコルのプロトコル2に従って市販の血清/循環DNA抽出キットを使用して循環DNAを抽出する。
- 循環DNAの体積を40μLに凝縮し、-20°Cで保存します。
6. 循環する豚特異的DNAの定量
- 25 μLのqPCRミックス(材料表)、1 μLの5'プライマー、1 μLの3'プライマー、10 μLのサンプルDNA、および13 μLのddH2Oのプレミックス溶液を準備し、2つの余分なサンプルを含むミックスを準備します。
- 40 μLプレミックス溶液を8チューブストリップに分割し、10 μLのサンプルDNAを追加し、続いて慎重なキャッピングを行います。必要以上に2つの反応を準備します。
- 8チューブストリップを標準曲線と同じ手順に従ってqPCRマシンに入れます。事前に定量化に重要な反応を確認するために、最初に標準を実行することをおいましいです。qPCRの反応系の手順を 図3に示した。
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Representative Results
このプロトコルでは、ブタ特異的プライマーを設計し、プラスミド含有ブタ特異的DNA断片を構築し、定量のための標準的な曲線を確立した(図4)。19のプライマーの種特異性はPCRによって確認された。次に、種特異的プライマー(プライマー#4およびプライマー#11)を使用して、豚からマウスへの細胞移植モデルおよび豚からサルへの動脈パッチ移植モデルにおいてqPCRによってcpsDNAを定量化した。
アガロース電気泳動を用いて、増幅したDNA断片を上記のサンプルから分離し、次いで紫外線画像で可視化した。PCRを用いて、増幅ブタゲノミックDNAに特異的なプライマーを最初に同定した(図2A)。また、サル/ヒトゲノムのコホートまたはマウスゲノムDNAのコホートにおいて豚DNAを特異的に増幅したこれらのプライマーの種特異的な特定の種が確認された(図2B)。最後に、2種特異的プライマーは、それぞれ、豚からサルへの動脈パッチおよび/または豚からマウス細胞への移植モデルにおいてブタDNAを特異的に増幅することがさらに証明された(図2C)。
図1:ブタ(sus scrofa、ssc)とヒト(ホモサピエンス、有る)またはサル(マカカ・ファシキュラリス、mfa)の間の遺伝子同一性。3つの異なる種からの遺伝子配列をBLAST分析により比較した。BLAST配列解析は、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)からダウンロードした3種からゲノムアノテーション情報(mRNA配列)を用いた。ヒト、サル、およびブタ遺伝子のmRNA配列は、それぞれ139116、65927、および71498であった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:通常PCRはブタ特異的プライマーの特異性を検証する。(A豚ゲノムDNA断片をプライマー1〜19で増幅した。(B) ゲノムDNA断片のゲノムフラグメントは、一部のプライマー(プライマー#4および#11)では増幅できなかった。星(*)は、ヒト/サルゲノムDNAの増幅がないことを示す。ポンド記号(#)は、マウスゲノムDNAの増幅がないことを示しています。(C)2種特異性プライマー(プライマー#4および#11)は、それぞれ22のブタからサルへの動脈パッチおよび/またはブタからマウスへの細胞移植モデルにおいてブタDNAを特異的に増幅することがさらに証明された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:qPCR反応22の手順この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:絶対定量化のための標準曲線の確立増幅プロット、メルト曲線プロット、および(A)プライマー#4および(B)プライマーの標準曲線ビューは、qPCRマシンから#11( 材料表を参照)を示しています。良い標準(R値が1に近い、増幅効率は100%±5%以内である)半年まで22のために使用することができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ブタ循環DNAを定量化することは、異種移植の免疫拒絶反応を監視する実現可能なアプローチを表す。Gadi et al.24 は、急性拒絶反応を有する患者の血液中のドナー由来循環DNA(ddcfDNA)含有量が拒絶反応のない患者のそれよりも有意に高いことを発見した。これらの研究は、ddcfDNAが臓器移植片の損傷を監視するための一般的なバイオマーカーである可能性があることを示唆している。近年、qPCRは、その簡単な操作、高度な自動化、高感度、優れた特異性、および低コストのために核酸の分析にますます適用されています。
本研究では、ブタ特異的プライマーをバイオインフォマティクス解析の結果に基づいて設計した。その特異性は、通常のPCRによって検証された。豚から猿への動脈パッチモデルの血液サンプルのcpsDNAおよび豚からマウスへの細胞移植モデルは、種特異的プライマーを用いてqPCRによって正確に定量化することができる。このアプローチの主な利点は以下の通りです。まず、極めて特異的なプライマーに基づいて、DNAを定量するこの方法は、高感度かつ特異的である。さらに、このアプローチのプロトコルは、特定のプライマーの設計、DNAの単離、および1営業日のqPCR分析で構成され、時間を節約する非常に簡単です。これは、血清または血漿材料の少量から始まる非侵襲的な方法です。一方、我々は、この方法が非常に再現性の高い22であることを実証した。ハイスループットシーケンシングやフライト質量分析とは対照的に、この方法は低コストです。
qPCRを用いた豚から猿への動脈パッチモデルおよび豚からマウスへの細胞移植モデルの血液中の循環ブタ特異的DNAの定量化による免疫拒絶反応のモニタリングは、ブタヒト異種移植の基礎研究と臨床応用の基礎を築いた。
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Disclosures
著者らは利益相反を報告していない。
Acknowledgments
この研究は、中国国家主要R&Dプログラム(2017YFC1103704)、深セン科学技術財団(JCYJ20170817081717172116272)、広東省の高等病院建設のための特別基金からの助成金によって支えられました (2019年)、深センのサンミング医学プロジェクト(SZSM201412020)、深セン高レベル医療規律建設基金(2016031638)、深セン健康家族計画委員会(SZXJ2017021)、SZXJ2018059)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR tube | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | PCR-02-C | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province, China | 8~10 weeks | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Walt- ham, MA, USA | Micro 21R | |
| 2-Log DNA Ladder | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| Marker I | Tiangen, Beijing, China | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA Mini Column(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | Takara Bio, Shiga, Japan | 1040S | |
| Female Bama mini pigs | BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China | 2~4 months | |
| Genomic DNA Extraction Kit ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynomolgus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| polymerase(Premix Taq) | Takara Bio, Shiga, Japan | RR901A | |
| pMD19-T plasmid | Takara Bio, Shiga, Japan | D102A | |
| qPCR machine | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
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