本プロトコルでは、ブタ特異的プライマーを設計し、プラスミド含有ブタ特異的DNA断片を構築し、定量のための標準的な曲線を確立した。種特異的プライマーを用いて、cpsDNAを、豚からマウスへの細胞移植モデルおよびブタからサルへの動脈パッチ移植モデルにおいてqPCRによって定量化した。
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方法論記事
異種移植モデルの血液中の循環性豚特異的DNAの定量化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
異種移植は、臓器不全を治療するための実行可能な方法である。しかし、異種移植の免疫拒絶反応を効果的に監視する方法は、医師や研究者にとって問題です。本稿では、豚からマウスへの細胞移植モデルおよびサルからサルへの動脈パッチ移植モデルにおける免疫拒絶反応をモニタリングする、簡単で効果的な方法を説明する。循環DNAは、臓器損傷のための潜在的に非侵襲的なバイオマーカーです。本研究では、循環ブタ特異的DNA(cpsDNA)を、定量リアルタイムPCR(qPCR)による異種移植片拒絶反応中にモニタリングした。本プロトコルでは、ブタ特異的プライマーを設計し、プラスミド含有ブタ特異的DNA断片を構築し、定量のための標準的な曲線を確立した。次に、ブタからマウスへの細胞移植モデルおよび豚からサルへの動脈パッチ移植モデルにおいて、種特異的プライマーを使用してqPCRによってcpsDNAを定量化した。この方法の値は、異種移植の免疫拒絶反応を監視するための簡便で、便利で低コストで、侵襲性の低い方法として使用できることを示唆している。
概要
臓器不全は死の主な原因の1つである。細胞、組織、臓器の移植は、臓器不全2を治療する有効な方法である。それにもかかわらず、ドナー臓器の不足は、この方法の臨床応用を制限する 3,4.研究は、豚が臨床移植のための人間の臓器の潜在的な供給源として使用することができることを示しています 5,6.しかし、クロス種臓器移植は危険な免疫拒絶反応に直面している。したがって、異種移植の免疫拒絶反応を監視することが重要です。現在、免疫拒絶反応の臨床モニタリングは、主に患者の徴候および症状、ならびに実験室試験(例えば、生検、免疫生物化学分析、および超音波)7、8、9に依存する。ただし、これらの監視方法には多くの欠点があります。患者の免疫拒絶反応の徴候と症状は通常10年後半に現れるが、これは早期発見と早期介入を助長しない。生検は、患者が受け入れるのは容易ではない侵襲
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プロトコル
すべての実験は、深セン大学第一附属病院、深セン第二人民病院の機関審査委員会の関連ガイドラインと規制に従って行われました。
1. ブタ固有のプライマーを設計する
- 全ゲノムBLAST解析を行い、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)ソフトウェアを使用して、ヒト、サル、マウスとは異なるブタ特異的遺伝子を同定します。
- プライマー5のソフトウェアを用いて19個の豚特異的遺伝子(表1)に従ってプライマーを設計する。
2. ゲノムDNAの分離
注:ゲノムDNA(豚、サル、ボランティアの人間、豚移植片を持つサル、豚細胞を持つマウスからの血液を含む)を、市販のゲノムDNA抽出キット(材料表)を使用して抽出した。
- 上記サンプルの全血500μLをそれぞれ異なるマイクロ遠心チューブに入れます。
- 上記のマイクロ遠心分離チューブにプロテアーゼKと500μLのリシスバッファーを20 μL加え、十分に振って混ぜます。
- これらのマイクロ遠心分離管を56°Cの水浴に10分間入れ、溶液が明らかになるまでこのプロセスの間に2〜3回振ります。
- チューブカバーの内壁から液体ビーズを除去するために、遠....
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結果
このプロトコルでは、ブタ特異的プライマーを設計し、プラスミド含有ブタ特異的DNA断片を構築し、定量のための標準的な曲線を確立した(図4)。19のプライマーの種特異性はPCRによって確認された。次に、種特異的プライマー(プライマー#4およびプライマー#11)を使用して、豚からマウスへの細胞移植モデルおよび豚からサルへの動脈パッチ移植モデルにおいてqPCRによってcpsDNAを定量化した。
アガロース電気泳動を用いて、増幅したDNA断片を上記のサンプルから分離し、次いで紫外線画像で可視化した。PCRを用いて、増幅ブタゲノミックDNAに特異的なプライマーを最初に同定した(図2A)。また、サル/ヒトゲノムのコホートまたはマウスゲノムDNAのコホートにおいて豚DNAを特異的に増幅したこれらのプライマーの種特異的な特定の種が確認された(図2B)。最後に、2種特異的プライマーは、それぞれ、豚からサルへの動脈パッチおよび.......
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ディスカッション
ブタ循環DNAを定量化することは、異種移植の免疫拒絶反応を監視する実現可能なアプローチを表す。Gadi et al.24 は、急性拒絶反応を有する患者の血液中のドナー由来循環DNA(ddcfDNA)含有量が拒絶反応のない患者のそれよりも有意に高いことを発見した。これらの研究は、ddcfDNAが臓器移植片の損傷を監視するための一般的なバイオマーカーである可能性があることを示唆している。近年、qPCRは、その簡単な操作、高度な自動化、高感度、優れた特異性、および低コストのために核酸の分析にますます適用されています。
本研究では、ブタ特異的プライマーをバイオインフォマティクス解析の結果に基づいて設計した。その特異性は、通常のPCRによって検証された。豚から猿への動脈パッチモデルの血液サンプルのcpsDNAおよび豚からマウスへの細胞移植モデルは、種特異的プライマーを用いてqPCRによって正確に定量化することができる。このアプローチの主な利点は以下の通りです。まず、極めて特異的なプライマーに基づいて、DNAを定量するこの方法は、高感度かつ特異的.......
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開示事項
著者らは利益相反を報告していない。
謝辞
この研究は、中国国家主要R&Dプログラム(2017YFC1103704)、深セン科学技術財団(JCYJ20170817081717172116272)、広東省の高等病院建設のための特別基金からの助成金によって支えられました (2019年)、深センのサンミング医学プロジェクト(SZSM201412020)、深セン高レベル医療規律建設基金(2016031638)、深セン健康家族計画委員会(SZXJ2017021)、SZXJ2018059)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest, Barcelona, Spain | 111860 | |
| BamHI-HF | New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA | R3136S | |
| 1.5 mL 微量遠心チューブ | Axygen Biosciences, Union City, CA, USA | MCT-150-C | |
| 0.2 mL PCR チューブ | Axygen Biosciences、Union City、CA、USA | PCR-02-C | |
| C57BL / 6 | 広東省の医療動物センター、 中国 | 8~10週間 | |
| 遠心分離 | 機サーモ フィッシャー サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国 | マイクロ21R | |
| 2-ログDNAラダー | ニューイングランドバイオラボ、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国 | N3200S | 0.1–10.0 kb |
| マーカー I | 天元、北京、中国 | MD101-02 | 0.1–0.6 kb |
| DNA ミニカラム(HiBind DNA Mini Columns) | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | DNACOL-01 | |
| DNA loading buffer | Solarbio, Beijing, China | D1010 | |
| E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I and E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II | Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA | D6942 | |
| D6943 | |||
| EcoR I | 宝 バイオ、滋賀県、日本 | 1040S | |
| 雌のバマ ミニブタ | BGI Ark Biotechnology、深セン、中国 | 2~4 か月 | |
| ゲノム DNA 抽出キット ? | Tiangen, Beijing, China | DP304-02 | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | Toyobo, Osaka, Japan | QPK-201 | |
| Gel Doc XR | Bio-Rad, Hercules, USA | ||
| Male cynofrigus monkeys | Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, China | 8 years | |
| Nucleic acid dye(Gelred) | Biotium, Fremont, USA | 42003 | |
| ポリメラーゼ(プレミックスTaq) | タカラ バイオ、滋賀県、日本 | RR901A | |
| pMD19-T プラスミド | 宝 Bio, 滋賀県, 日本 | D102A | |
| qPCR装置 | Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA | ||
| Serum/Circulating DNA Extraction Kit | Tiangen, Beijing, China | DP339 | |
| TAE | sangon Biotech, Shanghai, China | B548101 |
参考文献
- Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
- Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2....
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