Summary
Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) является чувствительным и быстрым решением для обнаружения генетических вариантов. Это зависит от различий последовательностей, которые приводят к тому, что гетеродуплексы изменяют форму кривой плавления. Путем расчесывания HRM и электрофореза агарозного геля можно идентифицировать различные типы генетических вариантов, таких как индели.
Abstract
Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) является мощным методом генотипирования и сканирования генетических вариаций. Большинство применений HRM зависят от насыщения красителей ДНК, которые обнаруживают различия последовательностей, и гетеродуплексов, которые изменяют форму кривой плавления. Отличное разрешение прибора и специальное программное обеспечение для анализа данных необходимы для выявления небольших различий кривой плавления, которые идентифицируют вариант или генотип. Различные типы генетических вариантов с различными частотами могут наблюдаться в гене, специфичном для пациентов с конкретным заболеванием, особенно раком, и в гене CALR у пациентов с филадельфийскими хромосомно-отрицательными миелопролиферативными новообразованиями. Однонуклеотидные изменения, вставки и/или делеции (indels) в интересующем гене могут быть обнаружены с помощью анализа HRM. Идентификация различных типов генетических вариантов в основном основана на контроле, используемом в анализе qPCR HRM. Однако по мере увеличения длины продукта разница между кривыми дикого типа и гетерозигот становится меньше, а тип генетического варианта определить сложнее. Поэтому, где индели являются преобладающим генетическим вариантом, ожидаемым в интересующем гене, для уточнения результата HRM может быть использован дополнительный метод, такой как электрофорез агарозного геля. В некоторых случаях неубедительный результат должен быть повторно проверен / повторно диагностирован стандартным секвенированием Сэнгера. В этом ретроспективном исследовании мы применили метод к JAK2 V617F-отрицательным пациентам с MPN.
Introduction
Соматические генетические варианты в гене калретикулина(CALR)были признаны в 2013 году у пациентов с миелопролиферативными новообразованиями (MPN), такими как эссенциальная тромбоцитемия и первичный миелофиброз1,2. С тех пор было обнаружено более 50 генетических вариантов в гене CALR, индуцирующих сдвиг кадра +1 (−1+2)3. Двумя наиболее частыми генетическими вариантами CALR являются делеция 52 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs * 46)), также называемая мутацией типа 1, и вставка 5 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs * 47)), также называемая мутацией типа 2. Эти два генетических варианта составляют 80% всех генетических вариантов CALR. Другие были классифицированы как тип 1-подобный или тип 2-подобный с использованием алгоритмов, основанных на сохранении α спирали, близкой к дикому типу CALR4. Здесь мы представляем один из высокочувствительных и быстрых методов обнаружения генетических вариантов CALR, метод анализа плавления с высоким разрешением (HRM). Этот метод позволяет быстро обнаружить генетические варианты типа 1 и типа 2, которые представляют собой большинство мутаций CALR 5. HRM был введен в сочетании с «полимеразной цепной реакцией» в реальном времени (qPCR) в 1997 году как инструмент для обнаружения мутации в факторе V Лейдена6. По сравнению с секвенированием Сэнгера, которое представляет собой технику золотого стандарта, HRM является более чувствительным и менее специфическим методом5. Метод HRM является хорошим методом скрининга, который позволяет проводить быстрый анализ большого количества образцов с большой экономической выгодой5. Это простой метод ПЦР, выполняемый в присутствии флуоресцентного красителя и не требующий специфических навыков. Еще одно преимущество заключается в том, что сама процедура не повреждает и не разрушает анализируемый образец, что позволяет нам повторно использовать образец для электрофореза или секвенирования Сэнгера после процедуры HRM7. Единственным недостатком является то, что иногда трудно интерпретировать результаты. Кроме того, HRM не обнаруживает точную мутацию у пациентов с мутациями не типа 1 или типа 28. У этих пациентов следует выполнять секвенирование Сэнгера(рисунок 1).
HRM основан на амплификации специфической области ДНК в присутствии насыщенного ДНК флуоресцентного красителя, который включен в двухцепочечную ДНК (dsDNA). Флуоресцентный краситель излучает свет при включении в дцДНК. После прогрессивного повышения температуры дцДНК распадается на одноцепочечную ДНК, которая может быть обнаружена на кривой плавления как внезапное снижение интенсивности флуоресценции. Форма кривой плавления зависит от последовательности ДНК, которая используется для обнаружения мутации. Кривые плавления образцов сравниваются с кривыми плавления известных мутаций или CALR дикого типа. Отчетливые кривые плавления представляют собой другую мутацию, которая не относится к типу 1 илитипу 2 9.
Алгоритм обнаружения соматических генетических вариантов в гене CALR методом HRM, электрофореза агарозного геля и секвенирования(Рисунок 1)был использован и валидирован в ретроспективном исследовании, опубликованном до10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Республики Словении. Все процедуры соответствовали Хельсинкской декларации.
1. Флуоресцентный количественный анализ ПЦР в реальном времени (qPCR) и пост-qPCR с помощью HRM
- Повторное суспендирование грунтовок, перечисленных в Таблице материалов, до 100 мкМ со стерильными, РНКазными и ДНКазными свободнымиН2О(см. Таблицу материалов). Сделайте грунтовку рабочей концентрации 10 мкМ. Грунтовки, используемые в протоколе, были опубликованы до2.
- Количественное определение ДНК гранулоцитов методом флуоресцентного окрашивания в соответствии с инструкциейпроизводителя 11 (см. Таблицу материалов). Готовят раствор ДНК 20 нг/мкл, используя 10 мМ Tris-Cl, 0,5 мМ ЭДТА, рН 9,0 (см. Таблицу материалов).
- В дополнение к образцам ДНК, подготовьте по крайней мере три контрольных элемента ДНК: два положительных контроля с NM_004343,3(CALR):c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs * 46) (делеция 52 bp или мутация типа 1) и NM_004343,3(CALR):c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs * 47) (вставка 5 bp или мутация типа 2) генетический вариант, а также ДНК дикого типа и отрицательный контроль в качестве нешаблонного (NTC) контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выполнением настройки HRM убедитесь, что прибор qPCR откалиброван для экспериментов HRM.
- В дополнение к образцам ДНК, подготовьте по крайней мере три контрольных элемента ДНК: два положительных контроля с NM_004343,3(CALR):c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs * 46) (делеция 52 bp или мутация типа 1) и NM_004343,3(CALR):c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs * 47) (вставка 5 bp или мутация типа 2) генетический вариант, а также ДНК дикого типа и отрицательный контроль в качестве нешаблонного (NTC) контроля.
- Приготовьте qPCR HRM Master Mix по протоколу производителя (см. Таблицу материалов)следующим образом: 10 мкл 2x qPCR Master Mix с красителем, 0,2 мкл 10 мкМ Прямой грунтовки, 0,2 мкл обратной грунтовки 10 мкМ, 8,6 мкл стерильной, РНКазы и ДНКазы свободнойH2O.Используйте грунтовки из Таблицы материалов. Запустите три реплики для каждого образца ДНК и контроля.
- Подготовьте qPCR HRM Master Mix в соответствии с количеством обрабатываемых образцов. Включить избыточный объем не менее 10% в расчеты, чтобы обеспечить избыточный объем для потерь, возникающих при переносе реагентов.
- Перемешайте реакционное содержимое, осторожно постукивая и переворачивая трубку и вихря в течение 2-3 с. Соберите все разбросанные капли от стенки трубки до дна коротким вращением.
- Подготовьте реакционную пластину, подходящую для прибора и эксперимента HRM (см. Таблицу материалов). Перенос 19 мкл qPCR HRM Master Mix в соответствующие скважины 96-луночной оптической реакционной пластины.
- Пипетировать 1 мкл отрицательных контрольных, положительных контрольных и проб в соответствующие скважины оптической реакционной пластины. Для NTC перенесите 1 мкл стерильной, свободной от РНКазы и ДНКазыH2O, используемой для приготовления qPCR HRM Master Mix вместо ДНК.
- Запечатайте реакционную пластину оптической клейкой пленкой. Делайте это твердо, чтобы предотвратить испарение во время пробега. Убедитесь, что оптическая клейкая пленка находится на плоскости по всем скважинам реакционной пластины, чтобы обеспечить правильное обнаружение флуоресценции.
- Раскрутите реакционную пластину при 780 х г при комнатной температуре (RT) в течение 1 минуты. Убедитесь, что жидкость находится на дне скважин в реакционной пластине. Приступайте к выполнению анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить пластину при температуре 4 °C не более 24 ч. Дайте пластине, хранящейся при 4 °C, нагреться до RT, а затем ненадолго вращайте пластину перед запуском. - В соответствии с инструкцией производителя подготовьте и начните запуск для амплификации и расплавления ДНК и получения данных флуоресценции HRM в приборе qPCR. В программном обеспечении приборной системы назначьте элементы управления и пробы соответствующим скважинам.
- Для обнаружения генетического варианта CALR измените протокол амплификации прибора по умолчанию и амплируйте ДНК, используя следующий протокол теплового цикла: 95 ° C в течение 10 минут, а затем 50 циклов 95 ° C в течение 10 с и 62,5 ° C в течение 60 с.
- Выполняют стадию кривой/диссоциации расплава (HRM) сразу после qPCR в соответствии с инструкциямипроизводителя 12 следующим образом: 95 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 1 мин, а затем скорость рампы 0,025 °C/с до 95 °C. Держите температуру при 95 °C в течение 15 с и при 60 °C в течение 15 с.
- Запуск заканчивается автоматически. Сначала просмотрите и проверьте график усиления(рисунок 2).
- В меню эксперимента программного обеспечения приборной системы выберите опцию графика усиления. Если данные не отображаются, нажмите зеленую кнопку Анализ.
- На вкладке графика усиления в раскрывающемся меню тип диаграммы выберите график, который отображает данные усиления в виде необработанных показаний флуоресценции, нормализованных до флуоресценции от пассивного эталона (ΔRn) в зависимости от числа цикла (ΔRn vs Cycle). В раскрывающемся меню цвет графика выберите Образец.
- В раскрывающемся меню тип графика выберите тип графика линейного усиления. Отображение базового начального и конечного цикла на графике линейного усиления путем выбора параметра начала базовой линии. Убедитесь, что базовый план задан правильно. Конечный цикл должен быть установлен за несколько циклов до номера цикла, в котором обнаруживается значительный флуоресцентный сигнал. Базовая линия обычно устанавливается от 3 до 15 циклов(рисунок 2).
- В раскрывающемся меню Тип диаграммы выберите тип диаграммы усиления log10. Отобразите пороговую линию на графике, выбрав параметр порога. Отрегулируйте пороговое значение соответствующим образом, если оно установлено неправильно. Правильно установленное пороговое значение означает, что пороговая линия пересекает экспоненциальную фазу кривых qPCR(рисунок 2).
- Убедитесь, что нормальные кривые усиления находятся во всех пробных и положительных контрольных скважинах. Убедитесь, что в скважинах NTC нет усиления перед циклом 40. График нормального усиления показывает экспоненциальное увеличение флуоресценции, которое превышает порог между циклами 15 и 35(рисунок 2). Исключить пробные скважины из анализа, если в позиции скважины нет усиления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если график усиления выглядит ненормальным или NTC хорошо указывает на усиление, определите и решите проблему в соответствии с руководством по поиску и устранению неисправностей производителя. - Исключить выброс со значением цикла количественной оценки (Cq), которое отличается от реплик более чем на 2 в программном обеспечении приборной системы12. Выбросы могут привести к ошибочным результатам HRM.
- В кривых производного расплава просмотрите области/температурные линии до и после расплава. Области до и после расплава должны находиться в пределах плоской области, где нет больших пиков или склонов в флуоресцентных уровнях(рисунок 3). При необходимости отрегулируйте его соответствующим образом. Установите старт и остановку температурных линий до и после расплава примерно на расстоянии 0,5 °C друг от друга(рисунок 3). Перезапустите анализ, если параметры настроены, нажав на кнопку Анализ.
- На вкладке «Разностный график» на вкладке настроек графика выберите один из элементов управления дикого типа (гомозигота), реплицируемых в качестве эталонной ДНК, и перезапустите анализ, нажав кнопку «Анализировать».
- На вкладке Выровненные кривые расплава подтвердите, что все положительные элементы управления имеют правильный генотип, а NTC не удалось усилить(рисунок 4). Из таблицы скважин выберите скважины, содержащие положительный контроль, чтобы выделить соответствующую кривую расплава на графиках анализа. Убедитесь, что цвет линии соответствует правильному генотипу. Повторите шаги для скважин, содержащих другие положительные контрольные элементы и NTC.
- На вкладке Выровненные кривые расплава внимательно просмотрите отображение графиков для неизвестных образцов и сравните их с отображением графиков для элементов управления(рисунок 4). Из таблицы скважин выберите скважины, содержащие неизвестные реплики образцов, проверьте цвет кривой расплава и выровняйте их с контрольными элементами в упорядоченной последовательности, выбрав скважины, содержащие положительные контрольные значения один за другим. Повторите этот процесс для всех неизвестных образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неизвестный образец содержит вариант одного из элементов управления, если его кривая плавления плотно выровнена с ним. Могут отображаться различные группы вариантов (разные цвета), указывающие на то, что неизвестный образец состоит из неизвестного варианта, не соответствующего элементам управления(рисунок 8). Низкий уровень соматического генетического варианта может присутствовать в образце пациента. Это может повлиять на интерпретацию результата HRM, особенно на пределе обнаружения анализа(рисунок 9). В этих случаях цвет или даже форма линии могут очень напоминать цвет генотипа дикого типа.- Когда результат окажется неубедительным, объедините результаты HRM с результатами электрофореза агарозного геля и методов секвенирования. Повторно протестируйте образец или запрос и при необходимости повторно протестируйте новый образец.
- Внимательно просмотрите набор данных для реплицированных кривых и убедитесь, что выравнивание каждой реплики внутри группы является жестким. Исключите репликат, если он не выровнен плотно с другими образцами в группе (выброс). Повторно протестируйте образец, если присутствует больше выбросов, и результаты неубедительны. Имейте в виду, что количество и качество образца ДНК влияют на результаты HRM.
- Проанализируйте результат для неизвестного образца на вкладке Разностная диаграмма. Повторите процедуру, описанную в шаге 1.21, и убедитесь, что результаты, полученные для неизвестного образца, совпадают.
- Затем запустите продукты qPCR HRM на агарозном геле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить пластину при температуре 4 °C не более 24 часов или при -20 °C в течение более длительного периода времени, но не более 7 дней. Дайте пластине, хранящейся при 4 °C, нагреться до RT, а затем ненадолго вращайте пластину перед запуском. Дайте пластине, хранящейся при -20 °C, оттаять и нагреться до RT, а затем ненадолго вращайте пластину перед запуском.
2. Электрофорез агарозного геля
- Запускайте продукты qPCR HRM на 4% агарозном предварительно литом геле, содержащем флуоресцентное пятно нуклеиновой кислоты, используя соответствующую систему гелевого электрофореза (см. Таблицу материалов, рисунок 5). Запустите только одну положительную, отрицательную реплика NTC и образец qPCR HRM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перчатки всегда следует носить при обращении с гелями. Любая другая система гелевого электрофореза может выполнить эту задачу, если выбран эквивалентный процент агарозы, окрашивание флуоресцентной нуклеиновой кислоты и формат скважины. - Запустите систему гелевого электрофореза в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов). Извлеките из упаковки готовый гель в кассете, извлеките гребень и вставьте его в аппарат согласно инструкции производителя (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите гель в течение 15 минут после вскрытия упаковки. - Разбавить образец от 10 мкл до 20 мкл стерильным, свободным от РНКазы и ДНКазыН2О. Загрузите каждую скважину 20 мкл разбавленного образца.
- Разбавляют 3 мкл стандартного раствора ДНК до 20 мкл стерильным, РНКазой и ДНКазой свободнымН2О(см. Таблицу материалов). Загрузите скважину М 20 мкл разбавленного стандартного раствора ДНК(рисунок 6).
- Заполните любые пустые колодцы 20 мкл стерильной, свободной от РНКазы и ДНКазыH2O.
- Сразу же выберите программу в соответствии с процентом запускаемого геля и установите время работы на аппарате на 10 минут.
- Запустите электрофорез в течение 1 минуты после загрузки образца, нажав кнопку GO. Время электрофореза может быть увеличено, если получено недостаточное разрешение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте максимальное рекомендуемое время работы электрофореза агарозы в соответствии с инструкциями производителя. - Когда электрофорез завершен, визуализируйте ДНК в геле с помощью синего света или УФ-трансиллюминации. Визуализация, анализ и хранение изображений электрофореза в основном выполняются гелевым тепловизором с системой фотодокументации(рисунок 5).
- Анализ и интерпретация визуализированного геля продуктов qPCR HRM путем сравнения результатов неизвестного образца с положительными контрольными элементами(рисунок 7 и рисунок 8).
- Если неизвестный образец HRM и результаты гелевого электрофореза указывают на наличие неизвестного генетического варианта, секвенируйте продукт qPCR HRM с использованием праймеров, описанных в Таблице материалов в соответствии с протоколом, описанным13.
ВНИМАНИЕ: Агарозные гели, содержащие флуоресцентное пятно нуклеиновой кислоты, должны быть надлежащим образом утилизированы в соответствии с правилами учреждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешно амплифицированная область ДНК, представляющая интерес с экспоненциальным увеличением флуоресценции, которая превышает порог между циклами 15 и 35 и очень узкими значениями цикла количественной оценки (Cq) во всех реплицированных образцах и контрольных группах(Рисунок 2),является предпосылкой для надежной идентификации генетических вариантов методом анализа HRM. Это достигается путем использования точного определения ДНК с флуоресцентным окрашиванием и равным количеством ДНК в эксперименте qPCR HRM (см. шаг 1.2). На рисунке 2 показана успешная амплификация интересующей области ДНК, где значения Cq всех образцов и контрольных элементов находятся в очень узком интервале. В скважинах НТЦ нет усиления.
Этап HRM выполняется сразу после qPCR с использованием протокола, описанного в шаге 1.11. Активные областирасплава (рисунок 3,метка (c)) образцов, контрольные элементы управления и NTC используются для создания их выровненных графиков кривой расплава(рисунок 4). Поэтому правильно заданные области/температурные линии до и после расплава(рисунок 3А)важны для правильной визуализации и идентификации генетических вариантов в образцах. На рисунках 4A и 4B показаны выровненные кривые расплава и графики различий соответственно, где возможна идентификация генетических вариантов. Неизвестные образцы плотно выровнены с одним из положительных контрольных элементов. На рисунке 3B показаны неправильно заданные области/температурные линии до и после расплава. Это приводит к выровненной кривой расплава и разностным графикам, где правильная идентификация генетических вариантов затруднена(рисунок 4C и рисунок 4D).
Для подтверждения результатов HRM и определения того, требуется ли стандартный или следующий метод секвенирования для идентификации генетического варианта, присутствующего в образце, используется электрофорез агарозного геля. На рисунке 7 показан электрофорез агарозного геля тех же образцов и элементов управления, которые показаны на рисунке 4. Генетический вариант в образце может быть идентифицирован путем сравнения полосового рисунка образца с контрольной группой и путем объединения HRM и электрофореза агарозного геля. Тем не менее, правильная идентификация генетического варианта может быть выполнена только для образцов, которые содержат тот же генетический вариант, что и один из контрольных элементов, используемых в анализе HRM(рисунок 7). Образцы, содержащие редкие генетические варианты CALR, различаются по результату HRM и схеме полосы электрофореза(рисунок 8). В этом случае секвенирование Сэнгера или даже метод секвенирования следующего поколения используются для идентификации точного генетического варианта.
Рисунок 1: Схематическое представление алгоритма обнаружения соматического генетического варианта в гене CALR методами HRM, электрофореза агарозного геля и секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: График амплификации анализа qPCR HRM для обнаружения генетических вариантов в гене CALR. График усиления отображается как необработанная флуоресценция, нормализованная до флуоресценции от пассивного эталона (ΔRn), и как функция числа цикла. Исходный уровень установлен от 3 до 15 циклов, когда интересующая область ДНК была эффективно амплифицирована с использованием 20 нг высококачественной ДНК в реакции qPCR. Нормальные графики амплификации интересующей области ДНК всех образцов показаны зелеными линиями. Графики показывают экспоненциальное увеличение флуоресценции, которая превышает порог между циклами 15 и 35 в эксперименте с использованием 20 нг высококачественной ДНК в реакции qPCR. На графике не видно усиления в нешаблонных пробных скважинах (NTC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Кривые производного расплава в анализе qPCR HRM для обнаружения генетических вариантов в гене CALR. A) Пример правильно заданных областей/температурных линий до и после расплава. Температурная линия предварительного расплава должна находиться рядом с началом области перехода расплава. Линия температуры после начала расплава должна быть примыкать к концу области перехода расплава. Метка а) указывает пару линий слева от пиков, где устанавливаются температуры предварительного расплава и остановки. Каждый ампликон двухцепочечный. Метка (b) указывает пики данных активной области расплава, используемой для создания графика выровненных кривых расплава. Метка (c) указывает пару линий справа от пиков, где установлены температуры начала и остановки после расплава. Каждый ампликон одноцепочечный. B)Пример неправильно заданных областей/температурных линий до и после расплава. Начало и остановка температурных линий до и после расплава не примыкают к областям перехода расплава и находятся на расстоянии более 0,5 °C друг от друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Выровненные кривые расплава и графики различий в анализе qPCR HRM для обнаружения генетических вариантов в гене CALR. A) и B) показывают выровненные кривые расплава и графики разности после того, как области/температурные линии до и после расплава правильно установлены. A) Выровненные кривые расплава положительных контрольных групп с делецией 52 bp (мутация типа 1), вставкой 5 bp (мутация типа 2) и диким типом показаны оранжевым, фиолетовым и красным цветом соответственно. B) График различий одних и тех же образцов, описанных на панели А. C) и D) показывают выровненные кривые расплава и графики разности после неправильно заданных областей/температурных линий до и после расплава для одного и того же набора образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Система гель-электрофореза. А)Основные узлы системы гель-электрофореза (см. Таблицу материалов). B)Показан гель-тепловизор с системой фотодокументации, состоящей из ПЗС-камеры, камеры с подходящими транс/осветительными огнями и фотографического фильтра (см. Таблицу материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Загрузка геля разбавленными образцами и стандартным раствором днк или РНКазой и ДНКазой безH2Oдля пустых скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Анализ продуктов qPCR HRM на гелевом электрофорезе. Гель подвергали воздействию УФ-трансиллюминатора. Снимок был сделан системой фотодокументации(рисунок 5В). Скважины от 1 до 3 показывают контроль: 52 bp делеция (мутация типа 1), 5 bp вставка (мутация типа 2) и вариант дикого типа соответственно. Полосовой рисунок неизвестных образцов в скважинах 4-10 указывает на них как на генетический вариант дикого типа. Скважина M представляет собой раствор разбавленного размера ДНК стандартного размера (от 100 до 2000 bp). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Анализ HRM и гелевого электрофореза генетических вариантов в гене CALR. A) HRM анализ. Выровненные кривые расплава положительных контрольных групп с делецией 52 bp (мутация типа 1), вставкой 5 bp (мутация типа 2) и диким типом показаны оранжевым, фиолетовым и красным цветом соответственно. Неизвестный образец с различным генетическим вариантом обозначен темно-синим цветом. Б)Анализы гель-электрофореза. Скважины от 1 до 3 показывают контроль: 52 bp делеция (мутация типа 1), 5 bp вставка (мутация типа 2) и вариант дикого типа соответственно. Полосовой рисунок неизвестного образца в полосе 9 указывает на различный генетический вариант в качестве контроля. Другие неизвестные образцы являются вариантом дикого типа. Скважина M представляет собой разбавленный стандартный раствор ДНК (от 100 до 2000 bp). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Предел обнаружения HRM-анализа. Представлено серийное разбавление образца делеции 52 bp (мутация типа 1) и вставки 5 bp (мутация типа 2), демонстрирующее нагрузку на генетический вариант аллеля приблизительно 50% в соответствии с анализом секвенирования Сэнгера и анализом hrM qPCR в соответствии с протоколом, описанным в этой статье. A) и B) показывают выровненные кривые расплава и графики различий для дикого типа и последовательных разбавлений делеции 52 bp (мутация типа 1). C) и D) показывают выровненные кривые расплава и графики различий для диких и последовательных разбавлений вставки 5 bp (мутация типа 2). В любом случае генетический вариант CALR может быть обнаружен в разведении до 1,56%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Расплавление ДНК с высоким разрешением является простым решением для генотипирования и сканирования генетических вариантов14. Это зависит от различий последовательностей, которые приводят к гетеродуплексам, которые изменяют форму кривой плавления. Различные типы генетических вариантов с различными частотами могут наблюдаться в гене, специфичном для определенной группы больных раком1,2,15,16,10. Делеции или вставки в интересующем гене могут быть обнаружены с помощью анализа HRM, как мы показали на рисунке 4A. При внедрении анализа qPCR HRM в рутинное тестирование мы провели первоначальное оценочное исследование, включающее 21 JAK2 V617F-отрицательных ET пациентов со средним возрастом 63 года (диапазон от 24 до 90 лет). Генетический вариант в гене CALR был обнаружен у 12 из 21 JAK2 V617F-отрицательных ET-пациентов (пропорция 0,57). Делеция 52 bp (мутация типа 1) была обнаружена у 9 из 21 (пропорция 0,43), вставка 5 bp (мутация типа 2) была обнаружена у 3 из 21 (пропорция 0,143) JAK2 V617F-отрицательных ET пациентов. Результаты согласуются с данными из литературы1,2,17.
Надежная идентификация генетических вариантов с помощью HRM-анализа может быть достигнута путем правильной разработки анализа, который гарантирует, что эксперимент оптимизирован для HRM. Факторы, отличные от последовательности, могут быть источником небольших различий в кривых HRM, таких как конструкция грунтовки, длина ампликона, выбор красителя, выбор реагента qPCR HRM и температурные и временные профили шагов hrM qPCR. Это часть очень ранней разработки и оптимизации анализа qPCR HRM и уже обсуждалось в других местах12,14,18. Однако надежная идентификация генетических вариантов в гене CALR с сопоставимой чувствительностью анализов может быть достигнута на разных платформах HRM с использованием одних и тех же последовательностей праймеров19. Наиболее критическим моментом в процессе оптимизации анализа qPCR HRM была оптимизация температуры плавления и удлинения на шаге qPCR анализа qPCR HRM. Никаких изменений в отношении этапа12УЛР не требовалось. В рутинном тестировании другие факторы, влияющие на результаты HRM, становятся более важными.
Высококачественная ДНК, повторно суспендированная в низкосолевом буфере, таком как TE (10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА или более низкая концентрация) и такое же количество ДНК в анализе hrM qPCR являются важными факторами для успешно амплифицированной области ДНК интересов с высоким плато сигнала в фазе амплификации qPCR(рисунок 2). Это приводит к достоверной идентификации генетических вариантов методом HRM-анализа(Рисунок 4A,4B)12,14. Буфер с высоким содержанием соли, используемый для элюирования ДНК в протоколе экстракции, может тонко изменять термодинамику перехода плавления ДНК. Осаждение и повторное суспендирование в низкосолевом буфере TE или разбавление образца могут решить проблему примесей в образце ДНК. Низкокачественная ДНК может производить неспецифические продукты ПЦР или неудачную амплификацию. Все это может привести к более низкой воспроизводимости и более высокой частоте ошибок при обнаружении вариантов HRM. Дополнительная оптимизация для сложных образцов, таких как ДНК, извлеченная из образцов, встроенных в парафин, может потребоваться для получения оптимального результата HRM15.
Большие различия в количестве ДНК, используемом в анализе qPCR HRM, могут повлиять на результирующую температуру плавления (Tm) и, следовательно, привести к неубедительным результатам. Поэтому точное определение концентрации ДНК и разбавление всех образцов ДНК являются обязательными20. Методы ультрафиолетового (УФ) абсорбционного и флуоресцентного окрашивания точно определяют концентрации высокочистых растворов ДНК21. Метод поглощения УФ-излучения может быть использован для оценки чистоты растворов ДНК путем проведения измерений коэффициента поглощения при A260/A280 и A260/230. Однако метод флуоресцентного окрашивания более чувствителен к деградации ДНК, чем метод поглощения ультрафиолета, и может более точно определять концентрацию ДНК21. Поэтому более целесообразно для стандартизации количественной оценки и разбавления всех образцов ДНК в HRM-анализе20,21.
Индели являются основными генетическими вариантами в гене CALR, наблюдаемым у пациентов MPN1. По мере изменения и увеличения длины продукта разница между кривыми дикого типа и гетерозигот становится меньше, а обнаружение варианта становится сложнее7. Поэтому следует использовать дополнительный метод уточнения такого генетического варианта.
Хорошим примером является электрофорез агарозного геля. Это простой и эффективный метод разделения фрагментов ДНК разных размеров22,23. Молекулы ДНК разделены по размеру внутри агарозного геля таким образом, что пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму его молекулярной массы24. На рисунке 4A, рисунке 4B и рисунке 7 показаны примеры, в которых два наиболее распространенных типа генетического варианта CALR, делеция 52 bp и вставка 5 bp, идентифицируются путем объединения результатов электрофореза hrm и агарозного геля. Однако, когда результат HRM и рисунок полосы электрофореза агарозного геля указывают на другой генетический вариант (включая изменение одного нуклеотида), как в контрольнойгруппе (рисунок 8),секвенирование Сэнгера все еще необходимо для идентификации точного генетического варианта10.
Низкий уровень соматического генетического варианта в гене CALR может присутствовать в образце пациента, что делает интерпретацию qPCR HRM, электрофореза агарозного геля и результатов секвенирования Сэнгера более требовательными, особенно на пределе обнаружения анализа(рисунок 9). Любая линия формы кривой плавления, отличающаяся от линии дикого типа, указывает на генетический вариант, присутствующий в образце. Чувствительность анализа HRM qPCR ниже 5%(Рисунок 9 и ссылка19)и более чувствительна, чем метод секвенирования Сэнгера, чувствительность которого, как сообщалось, составляла 15-20%19. В этих случаях может быть применен метод глубокого секвенирования следующего поколения, который обнаруживает более крупные инделы и подтверждает результат HRM. В заключение, HRM-анализ является мощным методом генотипирования и сканирования генетических вариаций соматических генетических вариантов в гене CALR. Идентификация различных типов генетического варианта в основном основана на контроле, используемом в анализе qPCR HRM. Более достоверные результаты получаются путем объединения результатов HRM с результатами электрофореза агарозного геля. В случае неубедительных результатов для правильной идентификации генетического варианта может быть использовано стандартное секвенирование Сэнгера или даже более чувствительный метод секвенирования следующего поколения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить всех академических экспертов и сотрудников специализированной гематологической лаборатории, отделения гематологии, отделения внутренней медицины, Университетского медицинского центра Любляны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al.
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D.
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
