Summary
En ultra-high-speed vestlige blotting teknik er udviklet ved at forbedre kinetik af antigen-antistof bindende gennem cyklisk dræning og genopfyldning (CDR) teknologi i forbindelse med en immunoreaktion styrke agent.
Abstract
En vestlig skamplet (også kendt som en immunoblot) er en kanonisk metode til biomedicinsk forskning. Det er almindeligt anvendt til at bestemme den relative størrelse og overflod af specifikke proteiner samt post-translationelle protein modifikationer. Denne teknik har en rig historie og forbliver i udbredt brug på grund af sin enkelhed. Men den vestlige blotting procedure berømt tager timer, selv dage, at fuldføre, med en kritisk flaskehals er den lange inkubation gange, der begrænser dens gennemløb. Disse inkubationstrin er påkrævet på grund af den langsomme diffusion af antistoffer fra bulkopløsningen til de immobiliserede antigener på membranen: antistofkoncentrationen nær membranen er meget lavere end bulkkoncentrationen. Her præsenterer vi en innovation, der dramatisk reducerer disse inkubationsintervaller ved at forbedre antigenbinding via cyklisk dræning og genopfyldning (CDR) af antistofopløsningen. Vi har også brugt en immunoreaktion styrke teknologi til at bevare følsomheden af analysen. En kombination af CDR-metoden med et kommercielt immunoreaktionsforbedrende middel øgede udgangssignalet og reducerede antistofinkubationstiden betydeligt. Den resulterende ultra-high-speed vestlige skamplet kan opnås på 20 minutter uden tab i følsomhed. Denne metode kan anvendes på vestlige blots ved hjælp af både chemiluminescent og fluorescerende detektion. Denne enkle protokol giver forskere mulighed for bedre at udforske analysen af proteinudtryk i mange prøver.
Introduction
En vestlig skamplet (også kendt som en immunoblot) er en kraftfuld og grundlæggende teknik på tværs af en bred vifte af videnskabelige og kliniske discipliner. Denne teknik bruges til at undersøge tilstedeværelsen, relativ overflod, relativ molekylmasse og postoversættelsesændringer af proteiner1. Kombineret med digital billedanalyse kan denne metode pålideligt analysere overfloden af proteiner og proteinmodifikationer2. Selvom vestlig skamplet udføres rutinemæssigt, er det en tidskrævende og arbejdskrævende metode. Lange inkubationer af antistoffet med membraner er påkrævet. Her beskriver vi en ændring af inkubationsmetoden, der overvinder denne begrænsning uden at ofre følsomhed.
Under inkubation af membranen flyder antistoffer i opløsning, mens antigener immobiliseres på membranen. På grund af deres høje affinitet er antistofbindingshastigheden for antigenet hurtigere end diffusionen af antistoffer fra bulkopløsningen til membranen. Dette skaber en lav koncentration "udtømning lag" (Figur 1). Det kan tage timer for fjernere antistoffer at nå membranen via passiv diffusion, som er den vigtigste faktor, der er ansvarlig for lange inkubationstider i denne teknik. Denne effekt kaldes massetransportbegrænsningen (MTL)3. Det er blevet foreslået, at gentagen dræning og genopfyldning af den antistofholdige opløsning kan forstyrre udtømningslaget og overvinde MTL4. Her har vi udtænkt en unik teknik, der implementerer dette cykliske drænings- og genopfyldningskoncept (CDR) for at mindske effekten af MTL i en traditionel vestlig blotting-protokol og markant forkorte den krævede inkubationsperiode.
For at opretholde detektionsfølsomheden med en kort inkubationstid gjorde vi brug af en immunoreaktionsfremmende teknologi, der fremskynder antigen-antistofreaktionen og derved forbedrede signal-til-støj-forholdet5. Mange kommercielt tilgængelige immunoreaktionsfremmende midler (IRE) består af 2 komponenter (løsning 1 og 2, se materialetabel). IRE's proprietære sammensætning eller virkningsmekanisme er ikke blevet afsløret, men vi har tidligere konstateret, at IRE reducerede dissociationskonstanten mellem antigenet og antistoffet i faste fasebindingsanalyser, hvilket indikerer øget affinitet er i det mindste delvis ansvarlig for den forstærkende virkning af IRE6. Kombinationen af CDR med IRE giver en ultra-high-speed vestlige blotting protokol, der reducerer hele proceduren tid uden at ofre følsomhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SDS-PAGE og overføres til en PVDF-membran
- Udfør SDS-PAGE for at adskille proteiner baseret på relativ størrelse.
BEMÆRK: Ethvert kommercielt eller hjemmelavet gelsystem er fint. Følg producentens protokol. - Overfør adskilte proteiner fra en gel på en PVDF-membran.
BEMÆRK: Almindelige overførselsmetoder (halvtørre eller våde overførsler) er egnede. Følg producentens protokol.
2. Blokering af PVDF membraner
- Inkuber membranerne i passende blokeringsbuffere i 1 time med omrøring ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Afhængigt af det primære antistof- og detektionssystem skal der vælges en passende blokeringsbuffer. For eksempel er de mest typiske blokkere BSA, fedtfri tør mælk, kasein og kommercielle syntetiske polymerer. PBS og/eller TBS med 0,1% Tween20 er de mest anvendte buffere. Dette blokeringstrin kan udføres natten over ved 4 °C.
3. Inkubation med primært antistof
- Forbered 10% immunoreaktionsforbedrende middel-1 opløsning (IRE-1) med destilleret vand. Vortex godt.
- Forbered det fortyndede primære antistof med 10% IRE-1. Bland det forsigtigt og grundigt.
- Hvis du bruger en større membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), tilsættes 8 ml af antistofopløsningen til 50 ml koniske centrifugerør. Hvis du bruger en mindre membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), tilsættes 3 ml af antistofopløsningen i 14 mL rundbundet polypropylenrør (Tabel over materialer).
- Tag PVDF-membranen op med pincet, og dræn blokeringsopløsningen kortvarigt. Sæt PVDF-membranen i dette rør med behandskede fingre, og sørg for, at hele membranen klæber til rørets væg. Når PVDF-membranen indsættes i et rør, skal du vende mod "proteinsiden" af membranen, der oprindeligt var i kontakt med gelen indad. Luk hætten tæt.
- Sæt 50 mL røret i en glasflaske til hybridiseringsovnen.
BEMÆRK: Når der anvendes 14 mL rør til denne inkubation, skal du indsætte et 14 mL rør i 50 mL-røret ved hjælp af et par plastringholdere for at holde slangen i midten af 50 mL-røret. - Tænd hybridiseringsovnen.
- Inkuber membranen med 6 omdrejninger i minuttet i mindst 5 min.
BEMÆRK: Sørg for, at membranen til enhver tid klæber til væggen, og at det (indre) rør er vandret for at dække membranen med antistofopløsningen jævnt. Kalibrere fortyndingen af antistoffet og inkubationstiden inden selve forsøget.
4. Membran vask
- Stop rotationen.
- Fjern forsigtigt PVDF-membranen fra røret med pincet, og læg membranen i en beholder med 50 mL PBS-T.
- Skyl membranen kort med PBS-T.
- Skyl membranen i beholderen med destilleret vand, indtil der ikke vises bobler. Dette er for at fjerne størstedelen af antistoffet.
- Overfør PVDF-membranen fra beholderen til salatspinneren, der indeholder 250 mL PBS-T.
- Læg sikurven i spinneren. Sørg for, at låget er sat på forsvarligt.
- Aktivér spinneren og kør den i ca. 20-30 s.
- Opløsningen kasseres, og indersiden af spinneren skylles kortvarigt med destilleret vand.
- Tilsæt 250 mL PBS-T i spinneren igen.
- Gentag trin 4.6 og 4.7.
5. Inkubation med det sekundære antistof
- Forbered 10% immunoreaktionsforbedrende middel-2 opløsning (IRE-2) med destilleret vand. Vortex godt.
- Forbered det fortyndede sekundære antistof med 10% IRE-2. Bland det forsigtigt og grundigt.
- Antistofopløsningens og -rørets volumen vælges som angivet i trin 3.3.
- Tag PVDF membranen op med pincet, og dræn opløsningen kortvarigt. PVDF-membranen indsættes i røret som angivet i trin 3.4.
- Sæt 50 mL røret i en glasflaske til hybridiseringsovnen.
- Tænd hybridiseringsovnen.
- Inkuber membranen med 6 omdrejninger i minuttet i mindst 5 min. Sørg for, at membranen klæber til væggen hele tiden, og at det (indre) rør er vandret for jævnt at dække membranen med antistofopløsningen.
BEMÆRK: Kalibrer inkubationstiden før selve eksperimentet. Når det sekundære antistof er fluorescerende konjugeret, skal du udføre inkubationen i mørket.
6. Membranvask
- Følg trin 4.1 til 4.10.
7. Erhvervelse af billeder
- Chemiluminescent afsløring
- Placer et stykke semi-transplantation fleksibel film (10 cm x 15 cm) på en flad overflade.
- Bland 2 komponenter af chemiluminescent substrat i et 5 mL rør.
- Overfør straks 1,5 mL af det blandede substrat til den fleksible film til halvtransplantation, og placer PVDF-membranen på den. Derefter overføres resten af substratopløsningen på membranen.
- Inkubat PVDF membranen med det blandede substrat på en halvgennemsigtig fleksibel film i 1 min.
- Tag PVDF-membranen op med pincet, og dræn kort substrateopløsningen.
- Sandwich membranen mellem et par gennemsigtighed film.
- Anskaf billedet i chemiluminescent mode.
- Fluorescerende detektion
- Tag PVDF membranen op med pincet, og dræn opløsningen kortvarigt.
- Sandwich membranen mellem et par gennemsigtighed film.
- Hent billedet i fluorescerende tilstand.
BEMÆRK: Trin 7.1 og 7.2 skal udføres i nærheden af billedmaskinen for at sikre maksimal følsomhed. - Når baggrundssignalet er højt, skal du udføre et vasketrin i en beholder med 80-100 mL PBS-T: 10 min skylles 3 gange for det primære antistof og 5 min skylles 6 gange for det sekundære antistof.
BEMÆRK: Både primære og sekundære antistoffer fortyndet med 10% IRE-opløsninger kan bruges op til 8-10 gange uden tab af følsomhed6. Opløsningen skal opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette eksempel illustrerer effektiviteten af CDR-metoden sammen med immunoenhancing-teknologi på western blot. Statisk inkubation blev udført på en halvgennemsigtig fleksibel film, hvor PVDF-membraner blev inkuberet med antistofopløsningen, mens CDR-inkubation var i en hybridiseringsovn ved at rotere rør, der indeholdt membranerne og antistofopløsningen (Movie). Figur 2 viste de mængder antigen og antistof, der var nødvendige for chemiluminescentdetektion på vestlige blots. I både statiske og CDR-inkubationer øgede brugen af IRE-opløsning følsomheden: IRE reducerede den laveste mængde cellelysater (antigen), der var nødvendig for at detektere ß-actin fra 2,2 μg til 1,1 μg under statiske forhold og yderligere reduceret fra 1,1 μg til 0,275 μg ved hjælp af CDR (Figur 2A). På samme måde blev minimumskoncentrationen af anti-6x Hans mærkeantistof sænket fra 100 ng/mL til 50 ng/mL under statiske forhold og fra 100 ng/mL til 12,5 ng/mL under CDR-tilstand(figur 2B). CDR-inkubation i enten 5 min. eller 10 min. sænkede detektionsgrænsen dramatisk sammenlignet med statisk inkubation (60 min. med primær og 30 min. med sekundære antistoffer). Endelig afslørede kombinationen af CDR med IRE overlegen følsomhed på den vestlige skamplet (0,275 μg cellelysater til ß-actindetektion og 12,5 ng/mL anti-6x Hans mærkeantistof) selv inden for denne ekstremt korte inkubationsperiode.
Det andet eksempel viser en vellykket anvendelse af denne metode på en vestlig skamplet med fluorescerende detektion (figur 3). Fluorescerende detektion, i modsætning til chemiluminescent afsløring, har den unikke evne til at opdage flere mål på samme skamplet på samme tid uden stripning / re-sondering antistoffer. ( Hans) 6 mærkede AP og ß-actin i celle lysater blev samtidig opdaget ved hjælp af en to-farve fluorophore. CDR inkubation med IRE accelererede ikke kun detektionen, men øgede også følsomheden, hvilket resulterede i at afsløre nedbrydningen af (Hans)6 mærkede AP (Figur 3A).
Figur 1: Skematisk illustration af cdr-metoden (Cyclic Draining-replenishing).
(A) Et udtømningslag nær membranen dannes hurtigt under statiske forhold, når en sonde har en høj affinitet for antigenet, men en begrænset evne til at sprede sig gennem opløsningen. Således bliver sondens rejse til membranen et hastighedsbegrænsende trin, og lange inkubationstider kompenserer for masseoverførselsbegrænsning. (B) CDR-metoden ved at dreje røret, mens membranen klæber til væggen, eliminerer udtømningslaget og genopfylder den samme sondeopløsning for at holde sondekoncentrationen i nærheden af membrankonstanten. Dette tal er blevet ændret fra Higashi et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: (A) Forskellige mængder 293 cellelysater (1:2 serielle fortyndinger fra 8,8 μg/lane) blev adskilt af SDS-PAGE efterfulgt af overførsel til en PVDF-membran og blokering med 5% skummetmælk i PBS-T. Skamplet blev undersøgt med mus anti-ß-actin antistof (1:3,000 fortynding). (B) Efter adskillelse af konditionerede medier, der stammer fra transfected 293 celler med pAPTAG5 (GenHunter), der indeholder udskilles (Hans)6 mærkede alkaliske fosfatase (AP, 8 x 10-14 mol / lane), proteiner blev overført til PVDF membraner. Hver membran blev udsat for vestlige skamplet med forskellige koncentrationer af anti-6x Hans tag antistof (1:2 serielle fortyndinger fra 400 ng / mL). Membranerne blev afbildet som et enkelt billede, og stiplede linjer angiver kanten af individuelle membraner. Dette tal er blevet ændret fra Higashi et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Samtidig påvisning af flere mål på en vestlig skamplet ved hjælp af fluorescerende detektion og CDR i forbindelse med IRE.
Forskellige mængder lysater (1:2 serielle fortyndinger fra 10 μg/lane) fra 293 celler transfected med pAPTAG5 blev adskilt og overført til en PVDF membran. Efter at have blokeret med blokeringsbufferen for fluorescerende detektion (BFD) i 1 time, blev skamplet undersøgt med anti-6X Hans mærke og anti ß-actin antistoffer, efterfulgt af IRDye 800CW ged anti-kanin IgG og IRDye 680RD ged anti-mus IgG. A: antistoffer fortyndet med 10% IRE-opløsning under CDR-tilstand, B: antistoffer fortyndet med BFD indeholdende 0,1% Tween20 under statisk tilstand. På grund af højere følsomhed med CDR og IRE kombination, nedbrydningen af (Hans)6 mærkede AP blev set. Dette tal er blevet ændret fra Higashi et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Skematisk illustration af en forbedret cdr-western blot med ultrahøj hastighed sammenlignet med en traditionel statisk metode.
Dette tal er blevet ændret fra Higashi et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Western blot er en udbredt analytisk teknik til at opdage specifikke proteiner, der blev udviklet ~ 40 år siden7,8. Siden da har teknikken fortsat med at udvikle sig, med efterfølgende innovationer, der forbedrer følsomheden, hastigheden og kvantantitationen af teknikken2,9,10,11,12,13. Den forbedrede ultra-high-speed vestlige blotting protokol præsenteret her gør flere væsentlige forbedringer af den eksisterende teknik. Vi reducerer inkubationstiden uden at gå på kompromis med følsomheden ved at sænke detektionstærsklen med IRE. Intet specielt eller dyrt udstyr er nødvendigt: at dreje et rør i en hybridiseringsovn er tilstrækkeligt til at overvinde MTL. Den vigtigste nyskabelse er, at CDR effektivt eliminerer udtømning lag i analysen. Selv om et rullekulturapparat er almindeligt anvendt til at reducere mængden af opløsning, er potentialet i denne metode til at overvinde MTL og reducere inkubationstider ikke blevet illustreret. På grund af den drastiske reduktion af den samlede tid for hele proceduren (figur 4) kan der opnås meget større mængder vestlige blotdata om dagen, når de blokerede membraner er i ens hånd, hvilket er næsten umuligt at gøre det med en traditionel vestlig blotting-protokol. Det skal bemærkes, at inkubation af membranen på en rokkende platform shaker svarer til statisk inkubation4,6. Skylning af PVDF-membraner i en kommerciel salatspinner i hjemmet med en stor mængde vaskeopløsning reducerer også varigheden af proceduren (Figur 4).
Den vellykkede brug af denne protokol er afhængig af optimering af antistoffortynding med IRE-opløsning og inkubationstid. En bred vifte af antistoftitrering anbefales i begyndelsen af analysen, da CDR sammen med IRE øger følsomheden betydeligt (figur 2). Inkubationstiden er en anden faktor, der skal overvejes. Når man har gode vestlige blot resultater med 1 h inkubation med primære antistoffer under statiske forhold, kan inkubationstiden reduceres til 5-10 min under CDR-betingelser generelt. Når der f.eks. er behov for inkubation natten over med primære antistoffer, skal der evalueres en lidt længere CDR-inkubationstid (30 min- 6 timer). Fortyndings- og inkubationstiden med sekundære antistoffer er også kritisk. Inkubationer, der er større end 30 min. under CDR-forhold, giver normalt højere baggrund. Således kræves omhyggelig titrering af sekundære antistoffer med op til 30 minutters CDR-inkubation. Når baggrundssignalet er højt efter omhyggelig titrering af antistoffer, skal der udføres omfattende vasketrin (10 minutters skyl 3 gange for det primære antistof og 5 min. skyl 6 gange for det sekundære antistof i en beholder med 80-100 ml vaskeopløsning).
Kvaliteten af de vestlige blot data afhænger ofte af de anvendte antistoffer. Når vi havde et vanskeligt antistof, der anvendes til vestlige blot, protein markører undertiden viste betydelige signaler, selv efter omhyggelig antistof titrering og omfattende vask. Da vi bemærkede, at CDR-metoden med IRE har tendens til at øge den ikke-specifikke binding, kan tilsætning af blokerende reagenser (såsom skummetmælk og andre) i antistofdiluenter forbedre signal-til-støj-forholdet14. Det er et tidskrævende screeningstrin, men det er værd at prøve.
Den vestlige skamplet er blevet vigtig for kvantitative anvendelser2. En semi-quantitation kan udføres med chemiluminescent detektion. Den her beskrevne procedure finder anvendelse på stripning og fornyet undersøgelse med henblik herpå6. På grund af et bredere dynamisk område er fluorescerende detektion den bedste mulighed. Med denne protokol giver fluorescerende detektion et lineært dynamisk område til kvantitativ analyse6. Det er værd at nævne, at CDR inkubationstid med fluorescerende detektion synes længere end med chemiluminescent afsløring.
Den vestlige skamplet har en bred vifte af applikationer og forbliver en universel metode til at studere protein overflod, protein-protein interaktioner, og post-translationelle modifikationer. For eksempel kan anti-kulhydratantistoffer let bruges til vestlig skamplet med denne protokol14. Da en række kulhydratmoieties udtrykt på ydersiden af viral, bakteriel og fugus er patogenspecifikke, er de uvurderlige mål for patogengenkendelse og diagnose af smitsomme sygdomme. Anvendelsen af denne enkle protokol kan således påvirke mange undersøgelsesområder, barberingstimer af ventetid ikke kun for eksperimenter, men også kliniske immundiagnostiske, der er afhængige af vestlig blotting-teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke erklæret nogen konkurrerende interesser direkte relevante for indholdet af denne artikel.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Division of Intramural Research, National Heart, Lung, og Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. blev støttet af Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, og H.N. og K.Y. var af Valor og V Drug Overseas Training Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
