Summary
Une technique de ballonnement occidental à très grande vitesse est développée en améliorant la cinétique de la liaison antigène-anticorps grâce à la technologie cyclique de drainage et de réapprovisionnement (CDR) en conjonction avec un agent améliorant l’immunoréaction.
Abstract
Une tache occidentale (également connue sous le nom d’immunoblot) est une méthode canonique pour la recherche biomédicale. Il est couramment utilisé pour déterminer la taille relative et l’abondance de protéines spécifiques ainsi que les modifications des protéines post-translationnelles. Cette technique a une histoire riche et reste largement utilisée en raison de sa simplicité. Cependant, la procédure occidentale de ballonnement prend des heures, voire des jours, pour terminer, avec un goulot d’étranglement critique étant les longs temps d’incubation qui limitent son débit. Ces étapes d’incubation sont nécessaires en raison de la lente diffusion des anticorps de la solution en vrac aux antigènes immobilisés sur la membrane : la concentration d’anticorps près de la membrane est beaucoup plus faible que la concentration en vrac. Ici, nous présentons une innovation qui réduit considérablement ces intervalles d’incubation en améliorant la liaison antigène par drainage cyclique et réapprovisionnement (CDR) de la solution d’anticorps. Nous avons également utilisé une technologie d’amélioration de l’immunoréaction pour préserver la sensibilité de l’essai. Une combinaison de la méthode CDR avec un agent d’amélioration de l’immunoréaction commerciale a stimulé le signal de sortie et considérablement réduit le temps d’incubation des anticorps. La tache occidentale à très grande vitesse qui en résulte peut être réalisée en 20 minutes sans aucune perte de sensibilité. Cette méthode peut être appliquée aux taches occidentales en utilisant à la fois la détection chemiluminescente et fluorescente. Ce protocole simple permet aux chercheurs de mieux explorer l’analyse de l’expression des protéines dans de nombreux échantillons.
Introduction
Une tache occidentale (également connue sous le nom d’immunoblot) est une technique puissante et fondamentale dans un large éventail de disciplines scientifiques et cliniques. Cette technique est utilisée pour examiner la présence, l’abondance relative, la masse moléculaire relative et les modifications post-translationnelles des protéines1. Combinée à l’analyse d’images numériques, cette méthode peut analyser de manière fiable l’abondance des protéines et des modificationsprotéiques 2. Bien que la tache occidentale soit exécutée régulièrement, c’est une méthode longue et laborique. De longues incubations de l’anticorps avec membranes sont nécessaires. Ici, nous décrivons une modification de la méthode d’incubation qui surmonte cette limitation sans sacrifier la sensibilité.
Pendant l’incubation de la membrane, les anticorps flottent en solution tandis que les antigènes sont immobilisés sur la membrane. En raison de leur affinité élevée, le taux d’anticorps se liant à l’antigène est plus rapide que la diffusion d’anticorps de la solution en vrac à la membrane. Cela crée une « couche d’épuisement » à faible concentration (figure 1). Il peut prendre des heures pour que des anticorps plus éloignés atteignent la membrane par diffusion passive, qui est le principal facteur responsable des longs temps d’incubation dans cette technique. Cet effet est appelé la limitation de transport de masse (MTL)3. Il a été proposé que le drainage répétitif et le réapprovisionnement de la solution contenant des anticorps puissent perturber la couche d’épuisement et surmonter le MTL4. Ici, nous avons conçu une technique unique qui met en œuvre ce concept cyclique de drainage et de réapprovisionnement (CDR) pour diminuer l’effet du MTL dans un protocole traditionnel de ballonnement occidental et raccourcir de façon remarquée la période d’incubation requise.
Afin de maintenir la sensibilité à la détection avec un temps d’incubation court, nous avons utilisé une technologie d’amélioration de l’immunoréaction qui accélère la réaction antigène-anticorps, améliorant ainsi le rapport signal-bruit5. De nombreux agents d’amélioration de l’immunoréaction disponibles dans le commerce (IRE) se composent de 2 composants (solution 1 et 2, voir tableau des matériaux). La composition propriétaire ou le mécanisme d’action de l’IRE n’a pas été divulgué, mais nous avons déjà constaté que l’IRE a diminué la constante de dissociation entre l’antigène et l’anticorps dans les essais de liaison de phase solide, indiquant que l’affinité accrue est, au moins en partie, responsable de l’effet d’amélioration de l’IRE6. La combinaison du CDR et de l’IRE donne un protocole de ballonnement occidental à très grande vitesse qui réduit tout le temps de procédure sans sacrifier la sensibilité.
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Protocol
1. SDS-PAGE et transfert vers une membrane PVDF
- Effectuez SDS-PAGE pour séparer les protéines en fonction de la taille relative.
REMARQUE : Tout système de gel commercial ou fait maison est très bien. Veuillez suivre le protocole du fabricant. - Transférer les protéines séparées d’un gel sur une membrane PVDF.
REMARQUE : Les méthodes de transfert courantes (transfert semi-sec ou humide) conviennent. Veuillez suivre le protocole du fabricant.
2. Blocage des membranes PVDF
- Incuber les membranes dans des tampons de blocage appropriés pendant 1 h avec agitation à température ambiante.
REMARQUE : Selon le système primaire d’anticorps et de détection, un tampon de blocage approprié doit être sélectionné. Par exemple, les bloqueurs les plus typiques sont le BSA, le lait sec non gras, la caséine et les polymères synthétiques commerciaux. PBS et/ou TBS avec 0.1% Tween20 sont les tampons les plus couramment utilisés. Cette étape de blocage peut se faire pendant la nuit à 4 °C.
3. Incubation avec anticorps primaire
- Préparer 10% d’immunoréaction améliorant la solution agent-1 (IRE-1) avec de l’eau distillée. Vortex bien.
- Préparez l’anticorps primaire dilué avec 10% d’IRE-1. Mélanger délicatement et bien.
- Si vous utilisez une membrane plus grande (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), ajoutez 8 mL de la solution d’anticorps en tubes de centrifugeuse conique de 50 mL. Si vous utilisez une membrane plus petite (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), ajoutez 3 mL de la solution d’anticorps en tube de polypropylène rond de 14 mL(tableau des matériaux).
- Prenez la membrane PVDF avec des pinces à épiler et égouttez brièvement la solution de blocage. Insérez la membrane PVDF dans ce tube avec des doigts gantés et assurez-vous que toute la membrane adhère à la paroi du tube. Lorsque la membrane PVDF est insérée dans un tube, faire face au « côté protéine » de la membrane qui était à l’origine en contact avec le gel vers l’intérieur. Fermez bien le bouchon.
- Insérez le tube de 50 mL dans une bouteille en verre pour le four d’hybridation.
REMARQUE : Lorsque des tubes de 14 mL sont utilisés pour cette incubation, insérez un tube de 14 mL dans le tube de 50 mL, à l’aide d’une paire de supports d’anneau en plastique pour maintenir le tube intérieur au centre du tube de 50 mL. - Allumez le four d’hybridation.
- Incuber la membrane avec une rotation de 6 rpm pendant au moins 5 min.
REMARQUE : Assurez-vous que la membrane adhère au mur en tout temps et que le tube (intérieur) est horizontal pour couvrir la membrane avec la solution d’anticorps uniformément. Calibrer la dilution de l’anticorps et le temps d’incubation avant l’expérience proprement dite.
4. Lavage membranaire
- Arrêtez la rotation.
- Retirez soigneusement la membrane PVDF du tube à l’aide d’une pince à épiler et placez la membrane dans un récipient contenant 50 mL de PBS-T.
- Rincer brièvement la membrane avec du PBS-T.
- Rincer la membrane dans le récipient avec de l’eau distillée jusqu’à ce qu’aucune bulle n’apparaisse. Il s’agit d’enlever la majorité de l’anticorps.
- Transférer la membrane PVDF du récipient à l’essoreuse à salade qui contient 250 mL de PBS-T.
- Placer le panier de passoire dans la filature. Assurez-vous que le couvercle a été mis en sécurité.
- Activez la filature et exécutez-la pendant environ 20-30 s.
- Jeter la solution et rincer brièvement l’intérieur de la filature avec de l’eau distillée.
- Ajouter 250 mL de PBS-T dans la filature à nouveau.
- Répétez les étapes 4.6 et 4.7.
5. Incubation avec l’anticorps secondaire
- Préparer 10% d’immunoréaction améliorant la solution agent-2 (IRE-2) avec de l’eau distillée. Vortex bien.
- Préparer l’anticorps secondaire dilué avec 10% d’IRE-2. Mélanger délicatement et bien.
- Sélectionnez le volume de la solution et du tube d’anticorps tel qu’indiqué à l’étape 3.3.
- Ramasser la membrane PVDF avec des pinces à épiler et égoutter la solution brièvement. Insérez la membrane PVDF dans le tube comme indiqué à l’étape 3.4.
- Insérez le tube de 50 mL dans une bouteille en verre pour le four d’hybridation.
- Allumez le four d’hybridation.
- Incuber la membrane avec une rotation de 6 rpm pendant au moins 5 min. Assurez-vous que la membrane adhère au mur en tout temps et que le tube (intérieur) est horizontal pour couvrir uniformément la membrane avec la solution d’anticorps.
REMARQUE : Calibrer le temps d’incubation avant l’expérience proprement dite. Lorsque l’anticorps secondaire est conjugué fluorescent, effectuez l’incubation dans l’obscurité.
6. Lavage membranaire
- Suivez les étapes 4.1 à 4.10.
7. Acquisition d’images
- Détection chemiluminescente
- Placez un morceau de film flexible semi-transplant (10 cm x 15 cm) sur une surface plane.
- Mélanger 2 composants du substrat chimioluminescent dans un tube de 5 mL.
- Transférez immédiatement 1,5 mL du substrat mélangé au film flexible semi-transplanté et placez la membrane PVDF dessus. Ensuite, transférez le reste de la solution de substrat sur la membrane.
- Incuber la membrane PVDF avec le substrat mélangé sur un film flexible semi-transparent pendant 1 min.
- Ramassez la membrane PVDF avec des pinces à épiler et égouttez brièvement la solution de substrat.
- Sandwich la membrane entre une paire de films de transparence.
- Acquérir l’image en mode chemiluminescent.
- Détection fluorescente
- Ramasser la membrane PVDF avec des pinces à épiler et égoutter la solution brièvement.
- Sandwich la membrane entre une paire de films de transparence.
- Acquérir l’image en mode fluorescent.
REMARQUE : Les étapes 7.1 et 7.2 doivent être effectuées à proximité de la machine d’imagerie afin d’assurer une sensibilité maximale. - Lorsque le signal d’arrière-plan est élevé, effectuez une étape de lavage dans un récipient avec 80-100 mL de PBS-T: 10 min rincer 3 fois pour l’anticorps primaire et 5 min rincer 6 fois pour l’anticorps secondaire.
REMARQUE : Les anticorps primaires et secondaires dilués avec des solutions IRE à 10 % peuvent être utilisés jusqu’à 8 à 10 fois sans perte de sensibilité6. La solution doit être maintenue à 4 °C jusqu’à 1 mois.
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Representative Results
Cet exemple illustre l’efficacité de la méthode CDR ainsi que la technologie d’immunoenhancing sur la tache occidentale. L’incubation statique a été effectuée sur un film flexible semi-transparent où les membranes PVDF ont été incubées avec la solution d’anticorps, tandis que l’incubation du CDR était dans un four d’hybridation par des tubes rotatifs qui contenaient les membranes et la solution d’anticorps (Movie). La figure 2 a montré des quantités d’antigène et d’anticorps, respectivement, nécessaires à la détection de chimioluminescents sur les taches occidentales. Dans les incubations statiques et CDR, l’utilisation de la solution IRE a augmenté la sensibilité : l’IRE a réduit la plus faible quantité de lysates cellulaires (antigène) nécessaires pour détecter la ß-actine de 2,2 μg à 1,1 μg dans des conditions statiques et a encore diminué de 1,1 μg à 0,275 μg à l’aide du CDR(figure 2A). De même, la concentration minimale d’anticorps anti-6x Son anticorps a été abaissée de 100 ng/mL à 50 ng/mL dans des conditions statiques et de 100 ng/mL à 12,5 ng/mL sous condition de CDR (figure 2B). L’incubation de CDR pendant 5 min ou 10 min a considérablement abaissé la limite de détection par rapport à l’incubation statique (60 min avec primaire et 30 min avec des anticorps secondaires). Enfin, la combinaison du CDR et de l’IRE a révélé une sensibilité supérieure sur la tache occidentale (0,275 μg de lysates cellulaires pour la détection de la ß-actine et 12,5 ng/mL d’anticorps anti-6x Son étiquette) même pendant cette période d’incubation extrêmement courte.
Le deuxième exemple démontre l’application réussie de cette méthode à une tache occidentale avec détection fluorescente (Figure 3). La détection fluorescente, contrairement à la détection chimioluminescente, a la capacité unique de détecter plusieurs cibles sur la même tache en même temps sans décapage/re-sondage des anticorps. (Le sien) 6 AP et ß-actin marqués dans les lysates cellulaires ont été simultanément détectés à l’aide d’un fluorophore à deux couleurs. L’incubation du CDR avec l’IRE a non seulement accéléré la détection, mais a également augmenté la sensibilité, ce qui a entraîné le démasquage de la dégradation de (Son)6 a marqué AP (Figure 3A).
Figure 1 : Illustration schématique de la méthode cyclique de vidange-réapprovisionnement (CDR).
(A) Une couche d’épuisement près de la membrane se forme rapidement dans des conditions statiques quand une sonde a une affinité élevée pour l’antigène, mais une capacité limitée à diffuser à travers la solution. Ainsi, le déplacement de la sonde vers la membrane devient une étape limitant le taux et les longs temps d’incubation compensent la limitation du transfert de masse. (B) Méthode CDR en tournant le tube tandis que la membrane adhère à la paroi élimine la couche d’épuisement et réapprovisionne la même solution de sonde pour maintenir la concentration de la sonde près de la membrane constante. Ce chiffre a été modifié à partir de Higashi et coll.6. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : (A) Différentes quantités de 293 lysates cellulaires (1:2 dilutions en série de 8,8 μg/voie) ont été séparées par SDS-PAGE, suivies d’un transfert à une membrane PVDF et d’un blocage avec 5 % de lait écrémé dans le PBS-T. La tache a été sondée avec l’anticorps anti-ß-actin de souris (1:3.000 dilution). (B) Après la séparation des médias conditionnés dérivés de 293 cellules transfectées avec pAPTAG5 (GenHunter) contenant le (His)6 phosphatase alcalin marqué (AP, 8 x 10-14 mol/lane), les protéines ont été transférées aux membranes PVDF. Chaque membrane a été soumise à la tache occidentale avec différentes concentrations d’anti-6x son anticorps d’étiquette (1:2 dilutions périodiques de 400 ng/mL). Les membranes ont été photographiées comme une seule image et les lignes pointillées indiquent la bordure des membranes individuelles. Ce chiffre a été modifié à partir de Higashi et coll.6. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Détection simultanée de plusieurs cibles sur une tache occidentale à l’aide de la détection fluorescente et du CDR en conjonction avec l’IRE.
Différentes quantités de lysates (1:2 dilutions en série de 10 μg/voie) de 293 cellules transfectées avec pAPTAG5 ont été séparées et transférées à une membrane PVDF. Après avoir bloqué avec le tampon de blocage pour la détection fluorescente (BFD) pendant 1 h, la tache a été sondée avec anti-6X Son étiquette et anticorps anti-ß-actin, suivie par IRDye 800CW chèvre anti-lapin IgG et IRDye 680RD chèvre anti-souris IgG. R: anticorps dilués avec 10% de solution IRE sous condition de CDR, B: anticorps dilués avec BFD contenant 0,1% de Tween20 en état statique. En raison de la sensibilité plus élevée avec la combinaison de CDR et d’IRE, la dégradation de (Son)6 AP marqué a été vue. Ce chiffre a été modifié à partir de Higashi et coll.6. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Illustration schématique d’une tache occidentale améliorée et à très grande vitesse de CDR comparée à une méthode statique traditionnelle.
Ce chiffre a été modifié à partir de Higashi et coll.6. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Tache occidentale est une technique d’analyse largement utilisée pour détecter des protéines spécifiques qui a été développé ~ il ya 40 ans7,8. Depuis lors, la technique a continué d’évoluer, avec des innovations ultérieures améliorant la sensibilité, la vitesse et la quantitation de la technique2,9,10,11,12,13. Le protocole amélioré de ballonnement occidental à très grande vitesse présenté ici apporte plusieurs améliorations substantielles à la technique existante. Nous réduisons le temps d’incubation sans sacrifier la sensibilité en abaissant le seuil de détection avec l’IRE. Aucun équipement spécial ou coûteux n’est nécessaire : la rotation d’un tube dans un four d’hybridation est suffisante pour surmonter le MTL. L’innovation clé est que le CDR élimine efficacement la couche d’épuisement dans l’analyse. Bien qu’un appareil de culture à rouleaux soit couramment utilisé pour réduire le volume de solution, le potentiel de cette méthode pour surmonter le MTL et réduire les temps d’incubation n’a pas été illustré. En raison de la réduction drastique du temps global pour l’ensemble de la procédure (figure 4), des quantités beaucoup plus élevées de données de tache occidentale par jour peuvent être obtenues lorsque les membranes bloquées sont dans sa main, ce qui est presque impossible de le faire avec un protocole traditionnel de ballonnement occidental. Il convient de noter que l’incubation de la membrane sur un shaker de plate-forme de basculement est équivalente à l’incubationstatique 4,6. Le rinçage des membranes PVDF dans une essoreuse à salade commerciale domestique avec un grand volume de solution de lavage diminue également la durée de la procédure (Figure 4).
L’utilisation réussie de ce protocole repose sur l’optimisation de la dilution des anticorps avec la solution IRE et le temps d’incubation. Un large éventail de titration d’anticorps est recommandé au début des analyses puisque le CDR en conjonction avec l’IRE augmente considérablement la sensibilité (Figure 2). Le temps d’incubation est un autre facteur à prendre en considération. Quand on a de bons résultats occidentaux de tache avec l’incubation de 1 h avec des anticorps primaires dans des conditions statiques, le temps d’incubation pourrait être réduit à 5-10 min dans des conditions de CDR en général. Lorsque l’incubation pendant la nuit est nécessaire avec des anticorps primaires par exemple, un temps d’incubation du CDR légèrement plus long (30 min - 6 h) doit être évalué. La dilution et le temps d’incubation avec des anticorps secondaires sont également critiques. Les incubations supérieures à 30 min dans des conditions de CDR donnent habituellement un fond plus élevé. Ainsi, la titration soignive des anticorps secondaires est exigée avec jusqu’à 30 min d’incubation de CDR. Lorsque le signal de fond est élevé après titration soigneuse des anticorps, des étapes de lavage étendues (rinçage de 10 min 3 fois pour l’anticorps primaire et rinçage de 5 min 6 fois pour l’anticorps secondaire dans un récipient avec 80-100 mL de solution de lavage) devraient être effectuées.
La qualité des données occidentales sur les taches dépend souvent des anticorps utilisés. Quand nous avons eu un anticorps difficile employé pour la tache occidentale, les marqueurs de protéine ont parfois montré des signaux substantiels même après titration soigneuse d’anticorps et lavage étendu. Puisque nous avons remarqué que la méthode CDR avec IRE tend à augmenter la liaison non spécifique, l’ajout de reagents bloquants (tels que le lait écrémé et d’autres) dans les diluants d’anticorps peut améliorer le rapport signal-bruit14. Il s’agit d’une étape de dépistage qui prend beaucoup de temps, mais il vaut la peine d’essayer.
La tache occidentale est devenue importante pour les applications quantitatives2. Une semi-quantitation peut être effectuée avec la détection chemiluminescente. La procédure présentée ici s’applique au décapage et au redécoupage à cette fin6. En raison d’une gamme dynamique plus large, la détection fluorescente est la meilleure option. Avec ce protocole, la détection fluorescente fournit une plage dynamique linéaire pour l’analyse quantitative6. Il convient de mentionner que le temps d’incubation du CDR avec détection fluorescente semble plus long que celui avec la détection chemiluminescente.
La tache occidentale a un large éventail d’applications et reste une méthode universelle pour étudier l’abondance des protéines, les interactions protéines-protéines et les modifications post-translationnelles. Par exemple, les anticorps anti-glucides peuvent être facilement utilisés pour la tache occidentale avec ce protocole14. Étant donné qu’une variété de moieties de glucides exprimés à la surface externe du virus, du bactérien et du fugus sont spécifiques aux pathogènes, ils sont des cibles inestimables pour la reconnaissance des pathogènes et le diagnostic des maladies infectieuses. Ainsi, l’application de ce protocole simple pourrait avoir un impact sur de nombreux domaines d’investigation, rasant des heures de temps d’attente non seulement pour des expériences, mais aussi des immunodiagnostiques cliniques qui reposent sur la technologie occidentale de ballonnement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont déclaré aucun intérêt concurrent directement pertinent au contenu de cet article.
Acknowledgments
Ces travaux ont été appuyés par la Division de la recherche intra-muros, le National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. a reçu l’appui du Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, et H.N. et K.Y. ont reçu une bourse d’études valor et v drug overseas training scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
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