Summary
Здесь мы представляем простой и эффективный метод изоляции живых мейотических и постмейотических зародышевых клеток от взрослых мышей. Используя низкоцитотоксичность, фиолетовый возбужденный краситель связывания ДНК и флуоресценцию активированной сортировки клеток, можно изолировать высокообогащеные популяции сперматозоидов для многих нисходящих приложений.
Abstract
Изоляция мейотических сперматозоидов имеет важное значение для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе мейоза и сперматогенеза. Хотя существуют установленные протоколы изоляции клеток с использованием Hoechst 33342 окрашивания в сочетании с флуоресценции активированной сортировки клеток, он требует сортировки клеток оснащен ультрафиолетовым лазером. Здесь мы описываем протокол изоляции клеток с использованием пятна DyeCycle Violet (DCV), низкого цитотоксичности ДНК связывания красителя структурно похож на Hoechst 33342. DCV может быть возбужден как ультрафиолетовых, так и фиолетовых лазеров, что повышает гибкость выбора оборудования, в том числе сортера клеток, не оснащенных ультрафиолетовым лазером. Используя этот протокол, можно изолировать три живых клеток субпопуляции в мейотической профазы I, в том числе лептотен / зиготен, пахитен, и диплотен сперматоцитов, а также пост-мейотических круглых сперматозоидов. Мы также описываем протокол для подготовки одноклеточной подвески от мышей-тестов. В целом, процедура требует короткого времени для завершения (4-5 часов в зависимости от количества необходимых ячеек), что облегчает многие приложения вниз по течению.
Introduction
Сперматогенез является сложным процессом, в котором небольшая популяция сперматозоидов стволовых клеток поддерживать непрерывное производство большого количества спермы на протяжениивсей взрослой жизни 1,2. Во время сперматогенеза, динамическая хроматин ремоделирование происходит, когда сперматозоидные клетки проходят мейоз для производства гаплоидныхсперматозоидов 3,4,5. Изоляция мейотических сперматозоидов имеет важное значение для молекулярного исследования, и несколько различных подходов к изоляции меиотических сперматозоидов были созданы, в том числеосадочных основе разделения 6,7 и флуоресценции активированныхклеток сортировки(FACS) 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Однако эти методы имеют технические ограничения. В то время как разделение на основе осадочных пород даетбольшое количество клеток 5,6,7,это трудоемкий. Установленный facS-основанный метод использует Hoechst 33342 (Ho342) для того чтобы отделить meiotic сперматиноциты основанные на содержании ДНАА и светлых scattering свойствах и требует сортеров клетки FACS оборудованных с ультрафиолетовым (УФ)лазером 8,9,10,11. Альтернативные методы на основе FACS требуют трансгенных линий мыши, которые выражают флуоресцентныебелки, синхронизация сперматогенеза 12, или фиксации клеток и маркировки антител, что не совместимо с изоляцией живыхклеток 13. Хотя есть еще один альтернативный метод с использованием клеток проницаемой ДНК связывания красителя, DyeCycle Зеленыйпятно 14,15,16,17, этот метод рекомендуется для изоляции сперматозоидных клеток от несовершеннолетних яичка. Таким образом, существует критическая необходимость разработки простого и надежного метода изоляции живых мейотических сперматозоидов, которые могут быть применены к любому штамму мыши любого возраста и которые могут быть выполнены с помощью любого сортера клеток FACS.
Здесь мы описываем такой давно испрашиваемый протокол изоляции клеток с использованием пятна DyeCycle Violet (DCV). DCV является низкой цитотоксичности, клеток проницаемой ДНК связывания красителя структурно похож на Ho342, но с возбуждением спектра смещается в сторону фиолетовогодиапазона 18. Кроме того, DCV имеет более широкий спектр выбросов по сравнению с DCG. Таким образом, он может быть возбужден как УФ, так и фиолетовые лазеры, что повышает гибкость оборудования, что позволяет использовать сортер клеток FACS, не оборудованный УФ-лазером. Протокол DCV, представленный здесь, использует двумерное разделение с dcV синим и DCV красным, имитируя преимущество протокола Ho342. С этим преимуществом, наш протокол DCV позволяет нам изолировать высокообогащеные зародышевые клетки от взрослого яичка. Мы предоставляем подробный протокол закрытости, чтобы изолировать живые сперматозоидные клетки от взрослых мышей яички одной мыши (из двух яище). Мы также описываем эффективный и быстрый протокол для подготовки одноклеточной подвески от мышей испытаний, которые могут быть использованы для этой изоляции клеток. Процедура требует короткого времени (подготовка одноклеточной суспензии - 1 час, окрашивания красителя - 30 мин, а сортировки клеток - 2-3 часа: всего - 4-5 часов в зависимости от количества необходимых клеток; Рисунок 1). После изоляции ячеек может быть завершен широкий спектр приложений ниже по течению, включая РНК-сек, ATAC-seq, ChIP-seq и культуру клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол соответствует руководящим принципам Институционального комитета по уходу за животными и использованию (протокол No. IACUC2018-0040) в медицинском центре детской больницы Цинциннати.
1. Установка оборудования и реагентов для подготовки подвески яичек
- Подготовье каждого ферментного запаса в 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) и храните при -20 градусах по Цельсию (Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьтесь в любое время перед экспериментом. - За день до эксперимента: Пальто, собирающих трубки (1,5 мл трубок) с сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) при 4 градусах цельсия за ночь.
- В день эксперимента: Установите водяную баню до 37 градусов по Цельсию.
- Предварительно теплый Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) при 37 градусов по Цельсию и подготовить 2 мл 1x диссоциации буфера для каждого образца прямо перед использованием (Таблица 1) в 15 мл центрифуги трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2 mL диссоциации буфер подготовлен для двух испытаний. Для рецепта буфера диссоциации, пожалуйста, обратитесь к таблице 1.
2. Вскрытие животных и подготовка суспензии яичек
- Пожертвуй 8-недельной мышонок, оставив в камере двуокиси углерода, по крайней мере 10 мин.
- Удалите оба яичка и поместите на 60 мм чашку Петри, содержащую 2 мл ледяного фосфатно-буферного солевого раствора (PBS).
- Удалите туника альбугинеа из яивок. Слегка рассейте семенные трубочки, аккуратно отделив их типсами.
- Перенесите семенные трубочки в чашку Петри диаметром 100 мм с новой каплей ледяного PBS и аккуратно распутайте семенные трубочки с типсами. Повторите эту стирку 3 раза, чтобы удалить интерстициальные клетки как можно больше.
- Инкубировать распутанные семенные трубочки в трубке 15 мл, содержащей 2 мл буфера диссоциации при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
- Аккуратно пипетки трубочные трубы 20 раз с помощью микропипюты 1000 йл.
- Инкубировать в течение 6 минут. Повторите нежный пипетки 20 раз.
- Инкубировать в течение 3 минут. Повторите нежный пипетки 10 раз, пока не останется видимых кусков.
- Добавьте 10 мл буфера FACS к подвеске. Центрифуга при температуре 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
- Повторите шаг 2.9 дважды, чтобы удалить сперматозоиды и как можно больше мусора, как это возможно.
3. Окрашивание клеток
- Переусердуйте гранулы клетки с 3 мл буфера FACS(таблица 1) и фильтровать подвеску клетки через 70 мкм нейлоновых клеток ситечко в 50 мл трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход клеток составляет около 100 миллионов клеток на два яичка (от 8-недельной мыши дикого типа B6). - Подсчитайте количество клеток и разделите 10% клеток на новую трубку, как необлитробленное отрицательное управление и оставьте на льду.
- Добавьте 6 МКЛ пятна DCV (первоначальная концентрация 5 мМ) к оставшейся клеточной подвеске и хорошо перемешайте. Окончательная концентрация составляет 10 МКМ, а емкость составляет около 100 миллионов клеток.
- Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут в темноте. Аккуратно встряхните подвеску клетки каждые 10 минут.
- После инкубации, без шага мытья, непосредственно добавьте 5 л DNase I (концентрация запасов составляет 10 мг/мл) к клеточной подвеске и проинфильтруйте клетки в трубку 5 мл FACS через 35 мкм нейлоновой сетки крышки. Держите образцы на льду до сортировки.
4. Цитометрия потока и экспериментальные ворота
- Подготовь сортер ячейки FACS. Убедитесь, что сортер клеток FACS оснащен оптикой Возбуждения: фиолетовый (405-нм) лазер; Оптика обнаружения: комбинация фильтра 450/50 bandpass (тот же набор фильтров 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для DCV-голубого обнаружения) и 665/30 bandpass (тот же набор фильтров Allophycocyanin (APC) для dcV-красного обнаружения. Здесь мы используем Sony SH800S сортировки клеток в качестве примера.
- Создайте новый эксперимент и навейте следующие рабочие участки, отображающие параметры, которые будут оптимизированы: Нажмите "Новаяплотность " на " Рабочий листИнструменты" меню бар для создания вперед рассеяния - область (FSC-A) против задней рассеяния - область (BSC-A) плотность участка в линейном масштабе. Нажмите« New Histogram», чтобы создать сюжет DCV-голубой гистограммы в логаритмическом масштабе.
- Кратко вихрь необлитого отрицательного контроля (от шага 3.2) и загрузить образец.
- Нажмите "Start" и "Record ",чтобы начать обработку незапачканного образца. В то время как образец работает, нажмите "Детектор и Порог Настройки" для оптимизации FSC и BSC напряжения путем корректировки как photomultiplier трубки (PMT) напряжения вверх или вниз, чтобы разместить незапачканные клетки в масштабе участка FSC / BSC.
- Отрегулируйте напряжение PMT вверх и вниз на "FL1: DAPI", в то время как образец работает, чтобы найти положение DCV-отрицательной популяции в первом десятилетии DCV-голубой гистограммы логаритмического участка (Рисунок 2A). После завершения регулировки напряжения PMT нажмите кнопку«Стоп», чтобывыгрузить необитый образец.
- Кратко вихрь образца (от шага 3.5) и загрузить образец.
- Нажмите" Следующаятрубка ", чтобы создать новый лист для DCV-окрашенных образца; и нажмитекнопку"Старт"и "Запись",чтобы приобрести dcV-окрашенный образец, запись ≥ 1 х 106 событий. Добавьте следующие рабочие графики: Нажмите «Новая плотность»на меню«Инструментылиста», чтобы создать участок плотности FSC-H (высота) против FSC-W (ширина) в линейном масштабе; Нажмите" Новая плотность", чтобы создать DCV-синий против DCV-красный участок плотности на линейном масштабе. После записи ≥ 1 х 106 событий, нажмите кнопку"Стоп"и разгрузите образец.
- На участке плотности FSC-A vs. BSC-A щелкните «Polygon»на меню«Plot Tools»,чтобы нарисовать большие ворота «Cells», чтобы включить большинство ячеек и исключить мелкий мусор(рисунок 2B). Применить ворота "Клетки" на FSC-H против FSC-W плотности участка. Нажмите« Rectangle», чтобы нарисовать ворота«Одиночных ячеек»,чтобы исключить не одиночные ячейки(рисунок 2C).
- Применить "Одиночные клетки" ворота DCV-синий против DCV-красной плотности участка и настроить шкалу, чтобы захватить расширенный профиль, как показано на рисунке 2D. Нажмите" Polygon" на "Участок Инструменты" меню бар, чтобы нарисовать "DCV" ворота, чтобы исключить незапачканные клетки и боковой населения (Рисунок 2D).
- Применить "DCV" ворота DCV-голубой сюжет гистограммы в линейном масштабе. Три основных пика относятся к различному содержанию ДНК: 1C, 2C и 4C(рисунок 2E).
- Нажмите «Новая Плотность», чтобы создать DCV-синий против DCV-красный участок плотности в линейном масштабе и применить »DCV» ворота для выполнения обратно gating от рисунка 2E, чтобы найти 1C и 4C населения (Рисунок 2F). Нажмите" Ellipse", чтобы нарисовать ворота на 1C населения, который находится в сжатой области (ворота 1C). Нажмите" Polygon", чтобы нарисовать ворота на 4C населения, которое является непрерывной кривой (ворота 4C).
- Нажмите"Новая плотность",чтобы создать DCV-синий против DCV-красный участок плотности в линейном масштабе и применить "4C" ворота; отрегулируйте шкалу, чтобы увеличить инажмите кнопку"Полигон", чтобы нарисовать ворота "4C_1" для более точного выбора(рисунок 2G).
- Нажмите"Новая плотность",чтобы создать новый участок плотности FSC-A против BSC-A в линейном масштабе и применить "4C_1" ворота; будет три обогащенные популяции, разделенные по размеру, соответствующему лептотену (L) /зиготену (яп.), пахитене (P) и диплотену (D) сперматозоидам. Нажмите"Полигон"или"Эллипс",чтобы нарисовать 3 ворота: "L / З", "P", и "D" на основе растущего размера(рисунок 2H).
- Нажмите "New Dot Plot", чтобы создать DCV-синий против DCV-красный цвет точка участок на линейной шкале, чтобы применить ворота и обеспечить три популяции находятся в непрерывном порядке в "4C_1" ворота (Рисунок 2I).
- Аналогичным образом, для населения 1С нажмите кнопку"Новаяплотность", чтобы создать новый участок плотности FSC-A против BSC-A в линейном масштабе и применить ворота "1С", выберите единый размер ячеек как чисто круглую сперматозоидовую популяцию,и нажмите кнопку "Эллипс",чтобы нарисовать ворота"RS"(рисунок 2J).
5. Сортировать мужские субпопуляции зародышевых клеток
- Подготовь 1,5 мл трубок, содержащих 500 йл 50% FBS для сбора клеток и загрузить трубку сбора в коллектор и нажмите "Нагрузка Коллекция".
- Нажмите" Next Tube","Старт","Запись"и "Сортировать Начало". Для использования двухй способной системы, которая позволяет двум популяциям, представляющим интерес, быть отсортированы в то же время в устройство сбора, следуйте парным комбинациям: лептотен (L) /зиготен (я) и пахитен (P) сперматозоиды на основе L / Я и P задние ворота; Круглые сперматозоиды (RS) и диплотен (D) сперматозоиды на основе RS и D задних ворот.
- Пока выборка работает, отрегулируйте скорость потока до 3000 евро, чтобы получить наиболее эффективную сортировку.
6. Анализ чистоты отсортированных клеток
- Соберите ≥ 10 000 ячеек населения. Выполните клеточный иммуностепенинг, чтобы подтвердить подступень.
- Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и тщательно отбросить супернатант, сохраняя около 110 МКЛ жидкости в нижней части трубки.
- Возьмите 10 йл капли клеточной подвески, чтобы наблюдать под микроскопом и оценить обзор морфологии клеток и число.
- Нанесите 100 МКЛ клеточной подвески на каждый из слайдов камеры образца (см. Таблицу материалов)и загрузите камеры на Цитоспина.
- Спин образцов на 30 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Нарисуйте круг вокруг клетки гидрофобной ручкой. Сухие слайды на лабораторной скамейке в течение нескольких минут при комнатной температуре.
- Падение 50 йл PBS в круг слайда и нажмите.
- Добавить первичный раствор антитела (Разбавить первичные антитела с 5% ослиной сыворотки в PBS с 0,02% полисорбата 20) в круг слайда и инкубировать при 4 градусов по Цельсию в одночасье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы судить substage meiotic spermatocytes, SYCP3 было обнаружено, которое будет маркером топоров meiotic хромосомы, и qH2AX, который будет маркером реакции повреждения дна. (Для концентрации антител, пожалуйста, обратитесь к таблице материалов). - Нажмите на основной раствор антитела со слайдов.
- Падение 50 йл PBS в круг слайда и нажмите. Повторите один раз.
- Добавить вторичный раствор антитела (разбавить вторичные антитела в PBS с 0,02% полисорбат 20) в круг слайда и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте.
- Падение 50 йл PBS в круг слайда и нажмите. Повторите один раз.
- Добавьте 50 МКЛ DAPI (концентрация запасов составляет 0,1 мкг/мл) пятно в течение 5 мин и нажмите.
- Добавьте 1-2 капли монтажа мультимедиа на слайды. Тщательно накройте монтажные средства с крышкой стекла и осторожно нажмите на крышку стекла, чтобы удалить дополнительные монтажные средства массовой информации и пузырь воздуха. Слайды готовы к оценке микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативный результат этого протокола сортировки показан на рисунке 3. Общее время сортировки двух яищей (одна мышь) обычно составляет около 3 часов, что зависит от концентрации клеточной подвески и скорости сортировки. После сортировки чистота сперматозоидов подтверждается иммуностимуляторами SYCP3 и NO2AX(рисунок 3A). Репрезентативная чистота отсортированных фракций L/Q, P, D сперматозоидов составляет около 80,4%, 90,6% и 87,6% соответственно(рисунок 3C). Мы определили подступены на основе критериев, которые мы опубликовали ранее19. Короче говоря, на стадии лептотена и зиготена синапсис между гомологичными хромосомами является неполным, о чем свидетельствуют тонкие нити окрашивания SYCP3. Широкие домены NO2AX наблюдаются по всему ядерному хроматину из-за запрограммированных двухтягнулых разрывов ДНК. На стадии пахитена гомологичные хромосомы полностью синапсируются, а на половых хромосомах специально накапливается х2AX. На стадии диплотена гомологичные хромосомы постепенно подвергаются дезинапсии. Чистота RS подтверждается окрашивание ядра с DCV (Рисунок 3B). RS можно точно судить с окрашивание ДНК: уникальный DAPI-интенсивный хромоцентр, окруженный эвхроматином; или в сочетании с конкретными маркерами, такими как Sp56, который выражается в развивающейся акросомальной грануле сперматозоидов и гистон вариант H1T, который высоко выражен в ядре после середины стадии pachytene (Рисунок 3B).
Чистота RS составляет около 90,1% после сортировки(рисунок 3C). Размер выборки анализа чистоты составляет более 1000 клеток для каждого эксперимента; чистота популяций L/P и D усреднается от 6 независимых экспериментов; чистота популяций P и RS усреднается от 3 независимых экспериментов. Жизнеспособность этих изолированных клеток, как правило, более 95% (Рисунок S1). Общий выход каждой фракции от одной взрослой мыши оценивается и перечислены в рис 3C, который обеспечивает достаточно клеток для различных анализов вниз по течению. Недавно мы использовали этот протокол, чтобы изолировать диких типа пахитена сперматозоидов для анализа ChIP-seq20,21.
| Реагента | Ингредиент | Концентрация запасов | Объем |
| (База HBSS) | |||
| Буфер диссоциации | ДМЭМ | - | 2 мл |
| (База DMEM) | Fbs | - | 40 мкл |
| Гиалуронидаза | 100 мг/мл | 30 мкл | |
| DNase I | 10 мг/мл | 50 мкл | |
| Коллагеназа типа I | 100 мг/мл | 40 мкл | |
| Рекомбинантная коллагеназа | 14000 единиц/мл | 100 мкл | |
| Буфер FACS | Pbs | - | 980 мл |
| (База PBS) | Fbs | - | 20 мл |
Таблица 1: Рецепт реагента. Буфер диссоциации должен быть подготовлен прямо перед использованием. Довоенная DMEM перед началом вскрытия. Запасы ферментов могут быть подготовлены в любое время перед экспериментом и храниться при буфере -20 градусов по Цельсию. довоенная до комнатной температуры перед использованием.
Рисунок 1: Рабочий процесс изоляции сперматогенных клеток мурина на основе DCV сортировки. Это изображение иллюстрирует общую процедуру, от диссоциации тканей до сортировки FACS, до сбора изолированных сперматозоидов в течение одного дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: FACS анализ взрослых клеток яичка мурина на основе флуоресценции DCV и рассеяния света. (A) Приобретенные неокрасленные клетки в первом десятилетии DCV-голубой гистограммы участка (левая сторона красной полосы). (B) (C)Мусор и нео одиночка ячейки исключены путем рассеяния света. (D)Необлемная ячейка и боковое исключение популяции на основе флуоресценции DCV. (E) определениесодержания ДНК на основе DCV-голубой флуоресценции. Левый пик (зеленый) и правый пик (розовый) соответствуют популяциям 1С и 4С. (F) Gating на 1C и 4C яичек населения на основе DCV-синий / DCV-красный флуоресценции. (G)Точное gating на 4C яичек населения. (H) Задняя часть ворот 4C от участка DCV на участке FSC/BSC. На основе областей минимального перекрытия на участке FSC/BSC создаются L/я, P и D ворота для обогащения соответствующих популяций сперматозоидов. (I) Цвет точка участок, показывающий L / Я, P, и D населения находятся в непрерывном порядке в воротах 4C. (J) Back-gating ворот 1C от dcV участок на участке FSC / BSC. Ворота RS были созданы для обогащения круглой популяции сперматозоидов с единым размером, что привело к большей чистоте популяций во время сортировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения результатов и статистика сперматозоидных клеток, полученных в результате сортировки. (A)Иммунофлуоресценция характеристика отсортированы сперматозоидов. Верхняя панель: DCV окрашивание, показывающее модель ядра живых сперматозоидов сразу после сортировки; L/З (лептотен/зиготен), P (пахитене) и D (диплотен). Нижняя панель: Подтверждение мейотических подступен для каждой популяции путем иммуностепенинга для SYCP3 (зеленый) и NOH2AX (красный). (B)Представитель DCV изображение, показывающее шаблон ядра RS. Шкала баров: 50 мкм (верхние панели) и 10 мкм (нижние увеличенные панели). Правые панели: Подтверждение иммунофлуоресценции круглых сперматозоидов, окрашенных Sp56 и H1T. C) Чистота L/ q, P и D была подтверждена иммуностимулятором, размер выборки составил более 1000 клеток для каждого независимого эксперимента, в общей сложности 6 независимых экспериментов. Чистота RS была подтверждена окрашивание ядра в общей сложности 3 независимых экспериментов. Общее количество клеток суспензии яичек от одной 8-недельной мыши WT B6 составило около 100 миллионов клеток перед сортировкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок S1: Жизнеспособность изолированных пахитенов сперматозоидов. Репрезентативное изображение показывает клеточную жизнеспособность изолированных пахитенов сперматозоидов (красный: PI; Синий: DCV). PI не может быть объединен с DCV во время сортировки. Тем не менее, под микроскопом, DCV-красный сигнал был довольно низким; таким образом, PI-положительные мертвые клетки легко отличить от других живых клеток. Жизнеспособность, как правило, более 95%. Шкала баров: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Рисунок S2: Неполная диссоциация или мусор нарушает gating. Популяция А (красный круг) содержит мусор и полимер сперматозоидов (указывается стрелкой). Чем больше население будет пересекать с населением B (желтый круг) и в конечном итоге загрязняют 4C населения. Шкала баров: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем практический и простой протокол для изоляции субпопуляций сперматозоидов и сперматозоидов от одного взрослого самца мыши. Для обеспечения воспроизводимости этого протокола необходимо принять некоторые важные меры. Перед перевариванием ферментов, мыть шаг направлен на удаление интерстициальных клеток; после пищеварения, этот шаг помогает удалить сперматозоиды и мусор. Мытье/ центрифугирование 3 раза имеет важное значение. В нашем рецепте буфера диссоциации, сочетание нескольких различных ферментов облегчает диссоциацию яиц в одноклеточную подвеску без чрезмерного повреждения клеток. Аккуратно трубчатые, чтобы избежать вызывая пузырьки воздуха также помогает защитить целостность клеток. Пожалуйста, проверьте подвеску клетки под микроскопом после диссоциации, чтобы убедиться, что подвеска достигает одноклеточного уровня. Неполная диссоциация или загрязнение мусора от чрезмерного пищеварения повлияет на чистоту отсортированных клеток; как показано на рисунке S2, вертикальная популяция содержит мусор и тетрапера сперматозоидов. DCV окрашивание требует инкубации в темноте и не мыть потом.
Для устранения потенциальных трудностей на gating и обратно-gating субпопуляций сперматозоидов, в качестве опции для оптимизации, мы рекомендуем использовать синхронизированные дикие мыши типа, чтобы помочь найти конкретную стадию сперматозоидов22,23,24. Стоит также отметить, что некоторые штаммы нокаут мыши с сперматозоидов арест фенотипы могут иметь необычные профили DCV, потому что они отсутствуют некоторые субпопуляции. Правильный контроль дикоготипа настоятельно рекомендуется в этом случае. Кроме того, этот протокол потенциально может применяться к взрослым мышам любого возраста. Тем не менее, возраст экспериментальной мыши может быть смешанным фактором из-за переменной доли зародышевых клеток.
На протяжении многих лет, несколько протоколов для очистки зародышевых клеток были разработаны. Как один из самых популярных методов, отложения скорости STA-PUT отделяет зародышевые клетки градиентом BSA и обеспечивает хороший выход нетронутыхзародышевых клеток 6,7. Тем не менее, STA-PUT не только требует специальных устройств, которые не могут быть легко доступны для многих лабораторий, но и трудоемким и трудоемким для проведения в холодной комнате при 4 градусов по Цельсию. В отличие от STA-PUT, который подходит для крупномасштабного разделения, этот метод на основе FACS может обеспечить высокую чистоту и точную фракцию для мелкомасштабного эксперимента. Масштабная сортировка с использованием нашего протокола возможна, но значительно продлит время сортировки и может поставить под угрозу жизнеспособность ячейки. Таким образом, STA-PUT по-прежнему практический вариант, когда большое количество клеток необходимо5,25,26.
По сравнению с предыдущим методом FACS на основе Ho342красителя окрашивания 8,9,10,11, наш протокол использует DCV, который имеет более широкий спектр возбуждения и может быть применен к большинству современных сортеров FACS оснащен УФ или 405 нм фиолетовый лазер18. Хотя есть еще один протокол с использованием DCG14,15,16,17, разница между нашим протоколом и протоколом DCG являетсято,что наш протокол DCV использует двумерное разделение с DCV синий и DCV красный, имитируя преимущество протокола Ho342. С этим преимуществом, наш протокол DCV позволяет нам изолировать высокообогащеные зародышевые клетки от взрослого яичка. Протокол DCG не использует двумерное разделение и рекомендуется для изоляции зародышевых клеток от несовершеннолетних мышей. Двухмерное разделение может иметь лучшее разрешение, чтобы отделить подступены сперматозоидов. Тем не менее, наш метод по-прежнему не в состоянии изолировать лептотен и zygotene сперматозоидов отдельно, а также "2C" типы клеток, включая сперматогонии, прелептотен сперматоцитов, и вторичных сперматозоидов.
Поскольку широкий спектр выбросов пятна DCV вызывает утечку в другие каналы, большинство красителей жизнеспособности клеток, таких как PI и 7AAD, не могут быть объединены из-за ложных положительных сигналов. Другие красители жизнеспособности клеток с выбросами в далеко-красных или ближнего инфракрасных каналов может быть стоит попробовать в будущем. Но по нашему опыту, отсортированные ячейки обычно показывают ≥ 95% жизнеспособности после 2 часов сортировки FACS(рисунок S1), что достаточно для анализа вниз по течению.
Отсортируемые ячейки, полученные в ходе нашей процедуры, могут использоваться для различных экспериментов ниже по течению, включая анализ секвенирования следующего поколения (РНК-сек, ATAC-seq и ChIP-seq). Клетки, полученные здесь, также могут быть использованы для краткосрочнойкультуры 27. В заключение, мы предоставляем простой, но эффективный протокол, включая один час одноклеточной процедуры подготовки подвески и подробные стратегии gating для FACS на основе DCV красителя окрашивания, который подходит для мелкомасштабной сперматогенной изоляции клеток и может быть быстро принят многими следователями, даже поток цитометрии начинающих.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим сотрудников лабораторий Намекава, Есида и Маэдзава за помощь; Кэти Герхардт для редактирования рукописи; Мэри Энн Гендель для обмена H1T антитела, Цинциннати Детская больница медицинский центр (CCHMC) Научно-исследовательский поток цитометрии ядро для обмена оборудование FACS при поддержке NIH S10OD023410; Грант-в-помощи для научных исследований (KAKENHI; 17K07424) к T.N.; Постдокторантство Фонда Лалора А.С.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) до S.Y.; грант исследовательского проекта, предоставленный Отделом исследовательских услуг Университета Азабу, Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT) - поддерживаемая программа проекта по брендингу частных университетов (2016-2019), Грант-в-помощи для научно-исследовательской деятельности Start-up (19K21196), Научный фонд Такеды (2019), и Uehara Memorial Foundation Research Incentive Грант (2018) для S.M.; Национальный институт здравоохранения R01 GM122776 до S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
