Summary
Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.
Abstract
El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la meiosis y la espermatogénesis. Aunque existen protocolos de aislamiento celular establecidos que utilizan la tinción Hoechst 33342 en combinación con la clasificación celular activada por fluorescencia, requiere clasificadores celulares equipados con un láser ultravioleta. Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV), un tinte de unión de ADN de baja citotoxicidad estructuralmente similar a Hoechst 33342. DcV puede ser excitado por láseres ultravioleta y violeta, lo que mejora la flexibilidad de la elección del equipo, incluyendo un clasificador de células no equipado con un láser ultravioleta. Usando este protocolo, uno puede aislar tres subpoblaciones de células vivas en la profase meótica I, incluyendo leptoteno/zygotene, paquiteno y espermatozoides diploteno, así como espermatozoides redondos post-meyóticos. También describimos un protocolo para preparar la suspensión de una sola célula a partir de testículos de ratón. En general, el procedimiento requiere un corto tiempo para completarse (4-5 horas dependiendo del número de celdas necesarias), lo que facilita muchas aplicaciones posteriores.
Introduction
La espermatogénesis es un proceso complejo en el que una pequeña población de células madre espermatogoniales sostiene la producción continua de un gran número de espermatozoides a lo largo de la vida adulta1,2. Durante la espermatogénesis, la remodelación dinámica de la cromatina tiene lugar cuando las células espermatogénicas se someten a meiosis para producir espermatozoides haploideos3,4,5. El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para la investigación molecular, y se han establecido varios enfoques diferentes para aislar los espermatocitos meyóticos, incluyendo la separación basada en sedimentación6,7 y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones técnicas. Mientras que la separación basada en sedimentación produce un gran número de células5,6,7,es intensiva en mano de obra. El método establecido basado en FACS utiliza Hoechst 33342 (Ho342) para separar los espermatocitos meyóticos basados en el contenido de ADN y las propiedades de dispersión de luz y requiere clasificadores celulares FACS equipados con un láser ultravioleta (UV)8,9,10,11. Los métodos alternativos basados en FACS requieren líneas de ratón transgénicas que expresen proteínas florescentes, sincronización de espermatogénesis12o fijación celular y etiquetado de anticuerpos que no sea compatible con el aislamiento de células vivas13. Si bien hay otro método alternativo utilizando un tinte de unión de ADN permeable a las células, DyeCycle Green stain14,15,16,17, este método se recomienda para el aislamiento de células espermatogénicas de testículos juveniles. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar un método de aislamiento simple y robusto para los esperatocitos meyóticos vivos que se pueden aplicar a cualquier cepa de ratón de cualquier edad y que se puede realizar utilizando cualquier clasificador celular FACS.
Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular tan buscado desde hace mucho tiempo utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV). El DCV es un tinte de unión de ADN permeable a la célula de baja citotoxicidad estructuralmente similar al Ho342, pero con un espectro de excitación desplazado hacia el rango violeta18. Además, DCV tiene un espectro de emisiones más amplio en comparación con DCG. Por lo tanto, puede ser excitado por láseres UV y violeta, lo que mejora la flexibilidad del equipo, permitiendo el uso de un clasificador de células FACS no equipado con un láser UV. El protocolo DCV presentado aquí utiliza la separación bidimensional con azul DCV y rojo DCV, imitando la ventaja del protocolo Ho342. Con esta ventaja, nuestro protocolo DCV nos permite aislar células germinales altamente enriquecidas de los testículos adultos. Proporcionamos un protocolo detallado para aislar las células espermatogénicas vivas de los testículos adultos de ratón de un ratón (de dos testículos). También describimos un protocolo eficiente y rápido para preparar la suspensión de una sola célula a partir de pruebas de ratón que se pueden utilizar para este aislamiento de celda. El procedimiento requiere un corto tiempo para completar (preparación de la suspensión de una sola célula - 1 hora, tinción de tinte - 30 min, y clasificación celular - 2-3 horas: total - 4-5 horas dependiendo del número de células necesarias; Figura 1). Después del aislamiento celular, se puede completar una amplia gama de aplicaciones posteriores, incluyendo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq y cultivo celular.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo no. IACUC2018-0040) en Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Configuración de equipos y reactivos para la preparación de la suspensión de células testiculares
- Preparar cada stock enzimático en 1x Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks y almacenar a -20 oC.(Tabla1).
NOTA: Prepárese en cualquier momento antes del experimento. - Un día antes del experimento: Recubrir tubos recolectan (1,5 ml de tubos) con suero bovino fetal (FBS) a 4oC durante la noche.
- El día del experimento: Ajuste el baño de agua a 37 oC.
- Precalentar el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco a 37 oC y preparar 2 ml de tampón de disociación 1x para cada muestra antes de su uso (Tabla 1) en tubo centrífugo de 15 ml.
NOTA: El búfer de disociación de 2 ml está preparado para dos testículos. Para la receta del tampón de disociación, consulte la Tabla 1.
2. Disección animal y preparación de la suspensión de células testiculares
- Sacrificar un ratón macho de 8 semanas de edad dejando en una cámara de dióxido de carbono durante al menos 10 minutos.
- Retire ambos testículos y colóquelos en una placa Petri de 60 mm que contenga 2 ml de solución salina con fosfato helado (PBS).
- Retire la tunica albuginea de los testículos. Dispersa ligeramente los túbulos seminiferos separando suavemente con fórceps.
- Transfiera los túbulos seminíferos a un plato de Petri de 100 mm con una nueva gota de PBS helado y desenredar los túbulos seminíferos suavemente con fórceps. Repita este lavado 3 veces para eliminar las células intersticiales tanto como sea posible.
- Incubar túbulos seminiferos desenredados en un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de tampón de disociación a 37oC durante 20 min.
- Pipetee suavemente los túbulos 20 veces con una micropipeta de 1000 l.
- Incubar durante 6 min. Repita el pipeteo suave 20 veces.
- Incubar durante 3 min. Repita el pipeteo suave 10 veces hasta que no queden trozos visibles.
- Añadir 10 mL de tampón FACS a la suspensión. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
- Repita el paso 2.9 dos veces para extraer los espermatozoides y tantos desechos como sea posible.
3. Mancha de células
- Resuspender el pellet celular con 3 ml de tampón FACS (Tabla 1) y filtrar la suspensión celular a través de un colador de células de nylon de 70 m en un tubo de 50 ml.
NOTA: El rendimiento celular esperado es de aproximadamente 100 millones de células por dos testículos (de un ratón de tipo salvaje B6 de 8 semanas de edad). - Cuente el número de celda y divida el 10% de las células en un nuevo tubo como el control negativo no manchado y salga en hielo.
- Añadir 6 l de mancha de DCV (la concentración original es de 5 mM) a la suspensión celular restante y mezclar bien. La concentración final es de 10 m, y la capacidad es de aproximadamente 100 millones de células.
- Incubar a 37oC durante 30 minutos en la oscuridad. Agitar suavemente la suspensión celular cada 10 min.
- Después de la incubación, sin un paso de lavado, añadir directamente 5 sl de DNase I (la concentración de stock es de 10 mg/ml) a la suspensión celular y filtrar las células en un tubo FACS de 5 ml a través de la tapa de malla de nylon de 35 m. Mantenga las muestras sobre hielo hasta su clasificación.
4. Citometría de flujo y puertas experimentales
- Prepare el clasificador de células FACS. Asegúrese de que el clasificador de células FACS esté equipado con óptica de excitación: láser violeta (405 nm); Óptica de detección: combinación de filtros de paso de banda 450/50 [mismo conjunto de filtros de 4o,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para la detección DCV-azul] y paso de banda 665/30 [mismo conjunto de filtros de aloficocian (APC) para la detección DE DCV-rojo]. Aquí utilizamos el clasificador de celdas SH800S de Sony como ejemplo.
- Cree un nuevo experimento y configure las siguientes gráficas de trabajo que muestren los parámetros que se van a optimizar: Haga clic en "Nueva densidad" en la barra de menús " Herramientas de hojade trabajo"para crear un trazado de densidad de dispersión hacia delante - área (FSC-A) frente a dispersión posterior - área (BSC-A) en una escala lineal. Haga clic en "Nuevo histograma" para crear una gráfica de histograma dcV-azul en escala logarítmica.
- Vórtice brevemente el control negativo no manchado (del paso 3.2) y cargue la muestra.
- Haga clic en "Iniciar" y "Grabar" para comenzar a procesar la muestra no manchada. Mientras la muestra se está ejecutando, haga clic en"Configuración de detector y umbral"para optimizar los voltajes FSC y BSC ajustando los voltajes del tubo fotomultiplicador (PMT) hacia arriba o hacia abajo para colocar las celdas no manchadas en la escala de la gráfica FSC/BSC.
- Ajuste la tensión PMT hacia arriba y hacia abajo en "FL1: DAPI" mientras la muestra se está ejecutando para localizar la posición de la población negativa DCV en la primera década de la gráfica logarítmica del histograma DCV-azul (Figura 2A). Después de completar el ajuste de voltaje PMT, haga clic en "Detener" para descargar la muestra no mantenida.
- Vórtice brevemente la muestra (del paso 3.5) y cargue la muestra.
- Haga clic en "Siguiente tubo" para crear una nueva hoja de trabajo para la muestra manchada de DCV; y haga clic en"Iniciar"y"Grabar"para adquirir la muestra manchada de DCV, registre ≥ 1 x 106 eventos. Agregue las siguientes gráficas de trabajo: Haga clic en "Nueva densidad" en la barra de menús " Herramientas de hoja detrabajo" para crear un trazado de densidad FSC-H (altura) frente a FSC-W (ancho) en una escala lineal; Haga clic en "Nueva densidad"para crear una gráfica de densidad DCV-azul frente a DCV-rojo en una escala lineal. Después de grabar ≥ 1 x 106 eventos, haga clic en"Detener"y descargue la muestra.
- En la gráfica de densidad FSC-A frente a BSC-A, haga clic en "Polígono" en la barra de menús "Herramientas de trazado" para dibujar una puerta grande "Celdas" para incluir la mayoría de las celdas y excluir pequeños desechos (Figura 2B). Aplique la puerta"Células"a la gráfica de densidad FSC-H frente a FSC-W. Haga clic en "Rectángulo" para dibujar una puerta "Celdas individuales" para excluir celdas no individuales(Figura 2C).
- Aplique la puerta "Single Cells" a dcV-blue vs. DCV-rojo trama de densidad y ajuste la escala para capturar un perfil extendido como se muestra en la Figura 2D. Haga clic en "Polígono" en la barra de menús "Herramientas de trazado" para dibujar una puerta "DCV" para excluir las celdas no manchadas y la población lateral (Figura 2D).
- Aplique la puerta "DCV" a la gráfica del histograma dcV-azul en una escala lineal. Los tres picos principales se refieren a diferentes contenidos de ADN: 1C, 2C y 4C(Figura 2E).
- Haga clic en "Nueva densidad" para crear una gráfica de densidad DCV-azul frente a DCV-rojo en una escala lineal y aplique la puerta "DCV" para realizar el desplazamiento desde la Figura 2E para localizar las poblaciones 1C y 4C (Figura 2F). Haga clic en "Elipse" para dibujar una puerta en la población 1C, que se encuentra dentro de un área condensada (puerta 1C). Haga clic en"Polígono"para dibujar una puerta en la población 4C que es una curva continua (puerta 4C).
- Haga clic en"Nueva densidad"para crear una gráfica de densidad DCV-azul frente a DCV-rojo en una escala lineal y aplicar la puerta "4C"; ajuste la escala para acercar y haga clic en"Polígono"para dibujar una puerta "4C_1" para una selección más precisa (Figura 2G).
- Haga clic en"Nueva densidad"para crear una nueva gráfica de densidad FSC-A frente a BSC-A en una escala lineal y aplicar la puerta "4C_1"; habrá tres poblaciones enriquecidas separadas por tamaño correspondientes a leptoteno (L) /zygoteno (Z), paquiteno (P) y diploteno (D) espermatozoides. Haga clic en "Polígono" o "Elipse" para dibujar 3 puertas: "L/Z", "P" y "D" en función del tamaño creciente (Figura 2H).
- Haga clic en"Nueva gráfica de puntos"para crear una gráfica de puntos dcV-azul frente a DCV-rojo en una escala lineal para aplicar la puerta y asegurarse de que las tres poblaciones están en un orden continuo dentro de la puerta "4C_1"(Figura 2I).
- Del mismo modo, para la población 1C, haga clic en"Nueva densidad"para crear una nueva gráfica de densidad FSC-A frente a BSC-A en una escala lineal y aplique la puerta "1C", seleccione el tamaño unificado de las células como población de espermatozoides redonda pura, y haga clic en "Elipse"para dibujar una puerta"RS"(Figura 2J).
5. Ordenar subpoblaciones de células germinales masculinas
- Preparar tubos de 1,5 ml que contengan 500 l 50% FBS para la recolección celular y cargar el tubo de recogida en el colector y haga clic en "Cargar colección".
- Haga clic en "Siguiente tubo", "Iniciar", "Grabar" y "Ordenar inicio". Para utilizar un sistema bidireccional que permita clasificar dos poblaciones de interés al mismo tiempo en el dispositivo de recolección, siga combinaciones por pares: leptoteno (L) /zygotene (Z) y esperatocitos de paquiteno (P) basados en puertas traseras L/Z y P; Espermatodes redondos (RS) y espermatozoides diploteno (D) basados en puertas traseras RS y D.
- Mientras se ejecuta el ejemplo, ajuste el caudal a 3000 eventos/s para obtener la clasificación más eficiente.
6. Análisis de pureza de células ordenadas
- Recoger ≥ 10.000 células/cada población. Realice inmunosuchación celular para confirmar el substage.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 oC y deseche cuidadosamente el sobrenadante, manteniendo alrededor de 110 l del líquido en la parte inferior del tubo.
- Tome una gota de 10 l de suspensión celular para observar bajo el microscopio y evaluar la morfología celular de visión general y el número.
- Aplique 100 l de suspensión celular a cada uno de los portaobjetos de la cámara de muestra (ver Tabla de materiales)y cargue las cámaras en el Cytospin.
- Girar las muestras a 30 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Dibuja un círculo alrededor de la célula con una pluma hidrófoba. Seque los toboganes en el banco del laboratorio durante unos minutos a temperatura ambiente.
- Suelte 50 l de PBS en el círculo de la diapositiva y puntee.
- Añadir solución de anticuerpos primarios (Diluir anticuerpos primarios con 5% de suero de burro en PBS con 0,02% de polisorbato 20) en el círculo de la diapositiva e incubar a 4 oC durante la noche.
NOTA: Para juzgar la subsestación de los espermatocitos meóticos, se detectó SYCP3, que es un marcador de ejes cromosómicas meyóticos, y el S2AX, que es un marcador de la respuesta al daño del ADN. (Para conocer la concentración de trabajo de anticuerpos, consulte la Tabla de materiales). - Toque la solución de anticuerpos primarios de las diapositivas.
- Suelte 50 l de PBS en el círculo de la diapositiva y puntee. Repite una vez.
- Añadir solución secundaria de anticuerpos (diluir anticuerpos secundarios en PBS con 0,02% de polisorbato 20) en el círculo del portaobjetos e incubar a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.
- Suelte 50 l de PBS en el círculo de la diapositiva y puntee. Repite una vez.
- Añadir 50 l de DAPI (la concentración de la población es de 0,1 g/ml) mancha durante 5 min y cortar.
- Agregue 1-2 gotas de soporte de montaje en las diapositivas. Cubra cuidadosamente el medio de montaje con un cristal de cubierta y presione suavemente el cristal de la cubierta para eliminar los medios de montaje adicionales y la burbuja de aire. Las diapositivas están listas para la evaluación de la microscopía.
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Representative Results
Un resultado representativo de este protocolo de clasificación se muestra en la Figura 3. El tiempo total de clasificación de dos testículos (un ratón) suele ser de alrededor de 3 horas, lo que depende de la concentración de la suspensión celular y de la velocidad de clasificación. Después de la clasificación, la pureza de los espermatocitos se confirma mediante la inmunostaining de SYCP3 y de laFigura 3A ( Figura 3A). La pureza representativa de las fracciones de espermatozoides L/Z, P, D ordenadas es de alrededor del 80,4%, 90,6% y 87,6%, respectivamente(Figura 3C). Hemos determinado las subetapas en función de los criterios que publicamos anteriormente19. Brevemente, en la etapa de leptoteno y cigeno, la sinapsis entre cromosomas homólogos es incompleta, lo que se indica mediante finos hilos de tinción SYCP3. A lo largo de la cromatina nuclear se observan dominios amplios de H2AX debido a las roturas programadas de adn de doble cadena. En la etapa del paquiteno, los cromosomas homólomos se han sinácido por completo, y el OH2AX se acumula específicamente en los cromosomas sexuales. En la etapa de diploteno, los cromosomas homólogos se someten progresivamente a desyspsis. La pureza de RS se confirma mediante tinción del núcleo con DCV (Figura 3B). RS se puede juzgar con precisión con tinción de ADN: un cromocentro único de DAPI intenso rodeado de eucromatina; o combinar con marcadores específicos, como Sp56 que se expresa dentro del gránulo acrosomal en desarrollo de espermatozoides y la variante de histona H1T que se expresa altamente en el núcleo después de la etapa media del paquiteno (Figura 3B).
La pureza de RS es de alrededor del 90,1% después de la clasificación (Figura 3C). El tamaño de la muestra del análisis de pureza es de más de 1.000 células para cada experimento; la pureza de las poblaciones de L/P y D se promedia de 6 experimentos independientes; la pureza de las poblaciones de P y RS se promedia de 3 experimentos independientes. La viabilidad de estas células aisladas suele ser superior al 95%(Figura S1). El rendimiento total de cada fracción de un solo ratón adulto se estima y se enumera en la Figura 3C, que proporciona células suficientes para diversos análisis posteriores. Recientemente, hemos utilizado este protocolo para aislar espermatozoides paquitene de tipo salvaje para el análisis ChIP-seq20,21.
| Reactivo | Ingrediente | Concentración de stock | Volumen |
| (base HBSS) | |||
| Búfer de disociación | DMEM | - | 2 ml |
| (base DMEM) | Fbs | - | 40 l |
| Hialuronidasa | 100 mg/ml | 30 l | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 l | |
| Collagenase Tipo I | 100 mg/ml | 40 l | |
| Collagenasa recombinante | 14000 unidad/ml | 100 l | |
| Búfer FACS | Pbs | - | 980 ml |
| (base PBS) | Fbs | - | 20 ml |
Tabla 1: Receta de reactivos. El búfer de disociación debe prepararse justo antes de su uso. DMEM precalentado antes de iniciar la disección. Las existencias de enzimas se pueden preparar en cualquier momento antes del experimento y almacenarse a -20 oC. El tampón FACS debe filtrarse al vacío y almacenarse a 4 oC; precalentar a temperatura ambiente antes de su uso.
Figura 1: Flujo de trabajo del aislamiento de células espermatogénicas murinas en la clasificación basada en DCV. Esta imagen ilustra el procedimiento general, desde la disociación de tejidos hasta la clasificación FACS, hasta la recolección de células espermatogénicas aisladas en el plazo de un día. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis FACS de células testiculares murinas adultas a base de fluorescencia DCV y dispersión de la luz. (A) Células no manchadas adquiridas en la primera década de una gráfica de histograma dcV-azul (lado izquierdo de la barra roja). (B) (C) Escombros y celdas no individuales excluidas por dispersión de luz. (D) Exclusión de células y poblaciones laterales no manchadas basada en fluorescencia DCV. (E) Determinación del contenido de ADN basada en fluorescencia DCV-azul. El pico izquierdo (verde) y el pico derecho (rosa) corresponden a las poblaciones de 1C y 4C. (F) Gating en poblaciones testiculares 1C y 4C basadas en fluorescencia DCV-azul/DCV-rojo. (G) Gating preciso en poblaciones testiculares 4C. (H) Back-gating de la puerta 4C de la gráfica DCV en una gráfica FSC/BSC. Sobre la base de regiones de superposición mínima en la gráfica FSC/BSC, las puertas L/Z, P y D se crean para enriquecer sus respectivas poblaciones de espermatozoides. (I) La gráfica de puntos de color que muestra las poblaciones L/Z, P y D está en orden continuo dentro de la puerta 4C. (J) Back-gating de la puerta 1C desde la gráfica DCV en una gráfica FSC/BSC. La compuerta RS fue creada para enriquecer la población de espermatozoides redondas con un tamaño uniforme, lo que resulta en una mayor pureza de las poblaciones durante la clasificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de resultados representativos y estadísticas de células espermatogénicas obtenidas a partir de la clasificación. (A) Caracterización de inmunofluorescencia de espermatozoides clasificados. Panel superior: Tinción DCV que muestra el patrón del núcleo de los espermatozoides vivos justo después de la clasificación; L/Z (leptoteno/zygoteno), P (paquiteno) y D (diploteno). Panel inferior: Confirmación de subetapas meíticas para cada población mediante inmunosumanidad para SYCP3 (verde) y H2AX (rojo). (B) Imagen DCV representativa que muestra el patrón del núcleo de RS. Barras de escala: 50 m (paneles superiores) y 10 m (paneles ampliados inferiores). Paneles derecho: Confirmación de inmunofluorescencia de espermatozoides redondos manchados con Sp56 y H1T. (C) La pureza de L/Z, P y D se confirmó mediante inmunosumanidad, el tamaño de la muestra fue de más de 1.000 células para cada experimento independiente, en total 6 experimentos independientes. La pureza RS fue confirmada por la tinción del núcleo con un total de 3 experimentos independientes. El número total de células de la suspensión de células testiculares de un ratón WT B6 de 8 semanas de edad era de alrededor de 100 millones de células antes de la clasificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura S1: La viabilidad de los espermatozoides paquiteos aislados. Una imagen representativa muestra la viabilidad celular de los espermatocitos de paquiteno aislados (Rojo: PI; Azul: DCV). PI no se pudo combinar con DCV durante la clasificación. Sin embargo, bajo el microscopio, la señal de color rojo DCV era bastante baja; por lo tanto, las células muertas con PI positivos se distinguían fácilmente de otras células vivas. La viabilidad suele ser superior al 95%. Barras de escala: 10 m. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura S2: Disociación incompleta o escombros perturba el gating. La población A (círculo rojo) contiene escombros y polímeros de espermatozoides (indicados por flecha). La población A más grande cruzará con la población B (círculo amarillo) y eventualmente contaminará a la población 4C. Barras de escala: 200 m. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Aquí presentamos un protocolo práctico y simple para aislar las subpoblaciones de espermatozoides y espermatozoides de un solo ratón macho adulto. Para garantizar la reproducibilidad de este protocolo, hay algunos pasos críticos que necesitan atención. Antes de la digestión enzimática, el paso de lavado tiene como objetivo eliminar las células intersticiales; después de la digestión, este paso ayuda a eliminar los espermatozoides y los desechos. Lavar/centrifugar 3 veces es importante. En nuestra receta de tampón de disociación, la combinación de varias enzimas diferentes facilita la disociación de los testículos en la suspensión de una sola célula sin daño celular excesivo. El pipeteo suave para evitar causar burbujas de aire también ayuda a proteger la integridad celular. Compruebe la suspensión celular bajo un microscopio después de la disociación para asegurarse de que la suspensión alcanza el nivel de una sola célula. La disociación incompleta o la contaminación de escombros por digestión excesiva afectarán la pureza de las células clasificadas; como se muestra en la Figura S2,la población vertical contiene escombros y tetrámeros de espermatozoides. La tinción del DCV requiere incubación en la oscuridad y no lavarse después.
Para solucionar posibles dificultades en el gating y back-gating de subpoblaciones de espermatozoides, como una opción para la optimización, se recomienda utilizar un ratón de tipo salvaje sincronizado para ayudar a localizar una etapa específica de espermatozoides22,23,24. También vale la pena señalar que algunas cepas de ratón knockout con fenotipos de detención de espermatogénesis pueden tener perfiles de DCV poco comunes porque faltan algunas subpoblaciones. En este caso se recomienda encarecidamente un control adecuado de los tipos de salvajes. Además, este protocolo se puede aplicar potencialmente a ratones adultos de cualquier edad. Sin embargo, la edad del ratón experimental podría ser un factor de confusión debido a la proporción variable de células germinales.
A lo largo de los años, se han desarrollado varios protocolos para purificar las células germinales. Como uno de los métodos más populares, la sedimentación por velocidad STA-PUT separa las células germinales por el gradiente BSA y proporciona un buen rendimiento de células germinales intactas6,7. Sin embargo, STA-PUT no sólo requiere dispositivos especiales que pueden no estar fácilmente disponibles para muchos laboratorios, sino que también requiere mucho tiempo y requiere mucha mano de obra para llevar a cabo en una sala fría a 4 oC. A diferencia de STA-PUT, que es adecuado para la separación a gran escala, este método basado en FACS podría proporcionar una alta pureza y una fracción precisa para un experimento a pequeña escala. Una clasificación a gran escala utilizando nuestro protocolo es posible, pero prolongará el tiempo de clasificación significativamente y puede comprometer la viabilidad celular. Por lo tanto, STA-PUT sigue siendo una opción práctica cuando se necesita un gran número de celdas5,25,26.
En comparación con el método FACS anterior basado en la tinción de colorante Ho3428,9,10,11, nuestro protocolo utiliza DCV, que tiene un espectro de excitación más amplio y se puede aplicar a la mayoría de los clasificadores FACS actuales equipados con un láser violeta UV o 405 nm18. Aunque hay otro protocolo que utiliza DCG14,15,16,17, la diferencia entre nuestro protocolo y el protocolo DCG es que nuestro protocolo DCV utiliza la separación bidimensional con AZUL DCV y rojo DCV, imitando la ventaja del protocolo Ho342. Con esta ventaja, nuestro protocolo DCV nos permite aislar células germinales altamente enriquecidas de testículos adultos. El protocolo DCG no emplea separación bidimensional y se recomienda para el aislamiento de células germinales de ratones juveniles. La separación bidimensional puede tener una mejor resolución para separar las subetapas de los esperatocitos. Sin embargo, nuestro método sigue siendo incapaz de aislar los espermatozoides de leptoteno y cigono por separado, así como los tipos de células "2C", incluyendo espermatozoides, espermatozoides preleptotenos y espermatozoides secundarios.
Dado que el amplio espectro de emisión de la mancha DCV causa fugas a otros canales, la mayoría de los tintes de viabilidad celular como PI y 7AAD no se pueden combinar debido a señales falsas positivas. Otros tintes de viabilidad celular con emisión en canales de infrarrojo lejano o cercano podrían valer la pena intentarlo en el futuro. Pero en nuestra experiencia, las células ordenadas suelen mostrar ≥ 95% de viabilidad después de 2 horas de clasificación FACS (Figura S1), que es suficiente para el análisis posterior.
Las células ordenadas obtenidas de nuestro procedimiento se pueden utilizar para varios experimentos posteriores, incluido el análisis de secuenciación de próxima generación (RNA-seq, ATAC-seq y ChIP-seq). Las células obtenidas aquí también se pueden utilizar para el cultivo a corto plazo27. En conclusión, proporcionamos un protocolo simple pero eficiente que incluye un procedimiento de preparación de suspensión de una sola célula de una hora y la estrategia detallada de gating para FACS basada en la tinción de tinte DCV, que es adecuado para el aislamiento celular espermatogénico a pequeña escala y puede ser adoptado rápidamente por muchos investigadores, incluso los principiantes de la citometría de flujo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros de los laboratorios Namekawa, Yoshida y Maezawa por su ayuda; Katie Gerhardt por editar el manuscrito; Mary Ann Handel por compartir el anticuerpo H1T, el Núcleo de Citometría de Flujo de Investigación del Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) para compartir el equipo FACS apoyado por NIH S10OD023410; Subvención en Ayuda para la Investigación Científica (KAKENHI; 17K07424) a T.N.; Beca Postdoctoral de la Fundación Lalor a A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) a S.Y.; la Beca de Proyectos de Investigación de la División de Servicios de Investigación de la Universidad de Azabu, Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT)-Programa apoyado para el Proyecto de Marca de Investigación de Universidades Privadas (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019), y la Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) a S.M;; Instituto Nacional de Salud R01 GM122776 a S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
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