Summary
Hier beschreiben wir Protokolle zur Durchführung von Live-Bildgebung und quantitativer Analyse der Chemoattraktanrezeptordynamik in Zebrafisch-Neutrophilen
Abstract
Leukozytenführung durch chemische Gradienten ist essentiell für Immunantworten. Neutrophile sind die ersten Zellen, die an Stellen von Gewebeschäden rekrutiert werden, wo sie entscheidende antimikrobielle Funktionen ausführen. Ihr Handel zu diesen Loci wird durch mehrere entzündliche Chemoattraktantien, einschließlich Chemokine, orchestriert. Auf molekularer Ebene wird die Chemoattraktus-Signalgebung durch den intrazellulären Transport der entsprechenden Rezeptoren reguliert. Es bleibt jedoch unklar, wie subzelluläre Veränderungen in Chemokinrezeptoren die Migrationsdynamik von Leukozyten auf Zell- und Gewebeebene beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Live-Bildgebung und quantitative Analyse der Chemokinrezeptordynamik in Neutrophilen während Entzündungsreaktionen auf Gewebeschäden. Diese Werkzeuge haben gezeigt, dass der differentielle Chemokinrezeptor-Verkehr in Zebrafisch-Neutrophilen die Neutrophilen-Clusterbildung und -Ausbreitung an Orten der Gewebeschädigung koordiniert. Dies hat Auswirkungen auf unser Verständnis, wie Entzündungsreaktionen selbstgelöst werden. Die beschriebenen Werkzeuge könnten verwendet werden, um neutrophile Migrationsmuster in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Umgebungen zu verstehen, und die Methodik könnte auf andere Signalrezeptoren ausgeweitet werden.
Introduction
Die Leukozytenmigration ist von größter Bedeutung für die Immunantwort. Immunzellen sind prototypische wandernde Zellen, die bemerkenswert in der Lage sind, Gewebe und Blutgefäße zu durchqueren und eine Reihe von chemischen Führungshinweisen zu erfassen, um in Richtung Mikroben oder andere wichtige Wirtszellen zu wandern. Die korrekte Führung beruht auf der Erkennung von Chemolockstoffen, unter denen Chemokine die prominenteste Kategorie1 darstellen. Chemokine werden von hochspezifischen sieben-transmembranigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren erkannt. Bei der Chemokinbindung ändern Chemokinrezeptoren die Konformation, was zur Aktivierung assoziierter trimeraler G-Proteine und deren Dissoziation in funktionelle Signaluntereinheiten führt, die zytoskelettale Veränderungen und gerichtete Migration fördern1. Sekundär werden Chemokinrezeptoren phosphoryliert, und diese Modifikation führt zu einer Desensibilisierung des Lockstoffs, der eine schnelle Resensibilisierung / Recycling oder intrazellulärer Abbau und Herunterregulierung von der Zelloberfläche folgenkann 2. Diese Rezeptordynamik beeinflusst die Dauer und Dosis der Signalübertragung, die von den Zellen empfangen wird, aber wie sie das Migrationsverhalten der Leukozyten beeinflussen, war in vivo schwer zu erklären.
Die Verfolgung der Rezeptordynamik in lebenden Leukozyten in traditionellen Säugetiersystemen steht vor mehreren Herausforderungen. Für Lebendstudien müssen Rezeptorfusionen mit fluoreszierenden Proteinen in den Zellen exprimiert werden. Dies ist in primären Leukozyten, insbesondere bei Neutrophilen, eine Herausforderung, und Studien haben bisher Surrogat-Neutrophilen-Zelllinien verwendet, um Chemokinrezeptorenzu exprimieren 3,4. Die Generierung transgener Mausmodelle, in denen Leukozyten einen fluoreszierenden Rezeptor oder mutierte Rezeptoren mit informativen Trafficking-Defekten5,6 exprimieren, ist mit einem erheblichen Zeit- und Ressourcenaufwand verbunden. Selbst in diesen Fällen können die Bildgebungsauflösung und der Kontrast für die bildgebende Rezeptordynamik im lebenden Tier begrenzt sein, und Studien haben Immunhistochemie an fixierten Gewebeabschnitten5 verwendet. Angesichts dieser technischen Herausforderungen ist unser Verständnis darüber, wie die Dynamik von Chemoattraktorrezeptoren das Zellverhalten in einem lebenden Gewebe beeinflusst, derzeit begrenzt.
Hier stellen wir eine Methodik zur Überwachung des Rezeptorhandels in Zebrafisch-Neutrophilen vor. Zebrafische sind genetisch behandelbar, wie Mäuse, aber die Transgenese ist durch den Einsatz effizienter Transposonsysteme und direkter Zygotenmanipulation relativ einfach7. Die transparente Larve ist ideal bildgebend. Die Dynamik des Chemokinrezeptors wurde in primordialen Keimzellen und der Laterallinie Primordium durch Expression entsprechender Fusionen mit fluoreszierenden Reporternvisualisiert 8,9,10. Zebrafischlarven sind mit reifen Neutrophilen ausgestattet, die hochgradig konservierte genetische und zelluläre Eigenschaften in Bezug auf Neutrophile von Säugetieren aufweisen. Subzelluläre Signaldynamiken wie zytoskelettale Dynamik und Polaritätsregulatoren wurden in diesen Zellen durch die Erzeugung entsprechender transgener Linien11,12,13 visualisiert. Kürzlich haben wir die Chemokinrezeptordynamik in Neutrophilen im Verlauf von Entzündungsreaktionen auf Gewebeschäden visualisiert und funktionell analysiert14. Hier beschreiben wir die Erzeugung transgener Reporterlinien für die Chemokinsignalisierung in Neutrophilen, die Vorbereitung von Embryonen für die Live-Bildgebung, einen Wundassay zur Untersuchung der Neutrophilensignalisierung und das Protokoll für die Aufnahme und Analyse von Bildern. Wir bieten auch ein Nebenprotokoll zum Testen von Chemokinrezeptorreaktionen auf Kandidatenliganden, was nützlich ist, wenn versucht wird, Ligandenerkennungsmuster in nicht charakterisierten Rezeptoren zu etablieren. Diese Techniken können in Kombination mit weiteren genetischen Manipulationen, wie der Hemmung der endogenen Chemokinexpression oder der Erzeugung mutierter Rezeptoren mit verändertem Liganden-induziertem Trafficking, verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich spezifische Signaldynamiken auf das Verhalten von Leukozyten in vivo auswirken. Die transgenen Linien, die fluoreszierend markierte Chemokinrezeptoren exprimieren, können auch als Reporter für endogene Chemokingradienten verwendet werden, die sonst durch direkte Antikörperfärbung schwer nachzuweisen sind. Die beschriebene Methodik bietet Spielraum für die Ausweitung der Erzeugung von Reportern auf andere Immunsignalrezeptoren.
Protocol
HINWEIS: Alle Zebrafische wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien und den Vorschriften des britischen Innenministeriums, dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, gehalten.
1. Generierung transgener Reporter-Zebrafischlarven für den Handel mit bildgebenden Rezeptoren in Leukozyten
- Generieren Sie ein Tol2-basiertes Konstrukt für die gewebespezifische Expression des fluoreszierend markierten Rezeptors von Interesse. Für Neutrophile verwenden Sie Promotorsequenzen aus dem Lysozym C15 und dem Myeloperoxidase-Gen16. Das Konstrukt kann als Fusion mit einem einzelnen fluoreszierenden Protein (z. B. GFP), einem Tandemfluoreszenztimer (z. B. einem schnell faltenden GFP und einem langsamer reifenden TagRFP 8,14,17) oder einer bizistronischen Expression von Reporter-GFP und einem Kontrollmembranmarker 9 (siehe Diskussion für Überlegungen bei der Auswahl des Ansatzes) ausgelegt werden.
HINWEIS: Dieses Konstrukt rekapituliert nicht die endogenen Ebenen der Rezeptorexpression, ist aber nützlich, um ein hohes Maß an Rezeptorexpression im interessierenden Zelltyp zu erhalten. Konsultieren Sie die Literatur über ähnliche Rezeptoren 3,5,6,8,9,10,14, um über die Position des fluoreszierenden Tags zu entscheiden. - Stellen Sie einen Tank mit erwachsenen Wildtyp-Männchen und -Weibchen nach den üblichen Haltungspraktiken18 auf, die am Tag vor dem Laichen von Eiern durch eine Barriere getrennt sind.
- Am Tag des Eilaichens ist eine Transgenesemischung für die Mikroinjektion vorzubereiten, die 12,5 ng/μL Tol2-DNA-Konstrukt und 17,5 ng/μL Transposase-mRNA7 enthält. Heben Sie Barrieren aus Fischbecken an, kurz nachdem die Lichter am Morgen kommen (dies kann in verschiedenen Fischeinrichtungen variieren) und sammeln Sie Eier innerhalb von 15 Minuten für die mRNA-Injektion.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die DNA-Lösung RNase-frei ist, um einen Abbau der Transposase-mRNA in der Mischung zu vermeiden. Eine Möglichkeit, dies zu umgehen, besteht darin, Eier mit separaten Lösungen von Tol2-Konstrukt und Transposase zu injizieren. - Befolgen Sie die Standardprotokolle für die Transgenese und Mikroinjektion von Zebrafischeiern19.
- Injizieren Sie 1 nL der Lösung in die Zelle von Embryonen im Einzellstadium.
HINWEIS: Die Expressionsergebnisse sind konsistenter, wenn sie in die Zelle injiziert werden und die Injektionen verworfen werden, die sich möglicherweise nicht eindeutig in der Zelle befinden. Embryonen im Einzellstadium werden wegen der Variabilität der Volumeninjektion pro Zelle bei der Injektion von 2-16 Embryonen im Zellstadium angestrebt. Eine Möglichkeit wäre, die einzelligen Injektionen von Chargen späterer Injektionen zu trennen, falls diese unterschiedliche Wirkungsgrade haben. - Überprüfen Sie die injizierten Embryonen später am Tag und entfernen Sie unbefruchtete oder tote Eier, um das Gelege gesund zu halten.
- Nach 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) screenen Larven unter einem fluoreszierenden Mikroskop. Der Marker wird in Neutrophilen sichtbar sein, insbesondere im kaudalen hämatopoetischen Gewebe (CHT), das reich an diesen Zellen ist.
HINWEIS: Der Prozentsatz der markierten Zellen variiert mit verschiedenen Konstrukten, aber normalerweise wird erwartet, dass 20-60% der Neutrophilen das Konstrukt exprimieren. Niedrigere Prozentsätze sagen in der Regel mehr Screening im Erwachsenenstadium voraus. Es ist eine gute Praxis, auch die korrekte Lokalisation des Rezeptors an der Membran mit einem höher aufgelösten Bildgebungsansatz in einer Probe dieser Embryonen zu überprüfen, bevor der Fisch gezüchtet wird. - Züchten Sie positive Larven nach Standardhaltungspraktiken20. Diese repräsentieren die F0-Generation.
- Im Alter von 3 Monaten suchen Sie F0 nach Gründern. Kreuzen Sie einzelne Fische mit einem nicht-transgenen Wildtyp und screenen Sie ihre Nachkommen bei 3 dpf auf die Expression des Rezeptors, indem sie unter dem Sezierbereich betrachten. Abhängig vom Transgeneseerfolg, der mit jedem Konstrukt variiert, beobachten Sie einen Prozentsatz positiver Nachkommen in einer Teilmenge der Kreuze.
HINWEIS: Für eine gute Transgenese geben etwa ein Drittel bis die Hälfte der Erwachsenen positive Nachkommen. Der Prozentsatz der Nachkommen, die in einer Kupplung positiv sind, variiert mit der Kopienzahl der eingefügten Transgene und kann zwischen 10-60% liegen. Es ist hilfreich, die Mendelschen Verhältnisse innerhalb der Kupplungen im Auge zu behalten, um Transgene mit einfacher Einfügung zu identifizieren (diese sind in F2-Kupplungen leichter zu identifizieren, indem nach einem Verhältnis von 50% positiver Larven gesucht wird)20. - Wachsen Sie die positiven Nachkommen, die die F1-Generation repräsentieren.
- Im Alter von 3 Monaten screenen Sie F1-Erwachsene auf die gleiche Weise, um eine stabile transgene F2-Linie herzustellen.
- Führen Sie Experimente an F2-Larven durch, nachdem Sie die neutrophilenspezifische Expression des Transgens validiert haben.
HINWEIS: Während der Transgenese kann man unterschiedliche Ebenen der Rezeptorexpression beobachten und es ist ratsam, verschiedene transgene Klauen zu halten, um das am besten geeignete Expressionsniveau für die biologischen Fragen zu erhalten. Erste Ergebnisse können bei F0- oder F1-Larven erzielt werden.
2. Sammeln von Zebrafischembryonen zur Beurteilung der Wundreaktionen von Leukozyten
- Nachdem Sie eine stabile transgene Reporterlinie eingerichtet haben, richten Sie eine Kreuzung zwischen erwachsenen und weiblichen transgenen Fischen ein und sammeln Sie am nächsten Morgen Eier.
- Züchten Sie Embryonen bei 28,5 °C in E3-Medium (oder Eiwasser18).
- Optional werden bei 24 hpf Embryonen in einem Zentrifugenröhrchen mit 50 ml E3-Medium, ergänzt mit 0,003% Bleichmittel, für 5 min inkubiert. Anschließend 3 Mal in E3-Medium spülen, indem Sie die Tube einige Minuten stehen lassen, damit sich die Embryonen im Boden absetzen können, und dann das Medium dekantieren und ersetzen.
HINWEIS: Dies bietet ein gewisses Maß an Kontrolle über die Infektionsexposition der Larven, die das Verhalten von Leukozyten während der Wunde beeinflussen kann. - Halten Sie nach dem Bleichen die Embryonen in E3-Medium, ergänzt mit 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff, um die Melaninsynthese zu verhindern. Methylenblau, das häufig zur Vorbeugung von Pilzinfektionen eingesetzt wird, wird hier nicht zugesetzt, um die Autofluoreszenz des Gewebes zu minimieren.
- Lassen Sie Larven auf natürliche Weise schlüpfen und verwenden Sie sie bei 3 dpf, wenn Neutrophile reichlich vorhanden sind21.
3. Bauchflossenverwundung von Larven
- Bereiten Sie Larven auf die Verwundung vor. Verwenden Sie Larven bei 2,5-3,5 dpf, wenn reichlich Neutrophile beobachtet werden. Transferlarven auf E3-Medium, ergänzt mit 160-200 mg/L Tricain MS222.
HINWEIS: Konzentrierte Lösungen von Tricain sollten im Voraus in Aliquots zubereitet und eingefroren und am Tag aufgetaut werden. - Lassen Sie die Larven 15 Minuten in E3 + Tricain-Medium, um sicherzustellen, dass sie betäubt werden. Überprüfen Sie ihre Antworten, indem Sie sie vorsichtig mit einem kleinen Pinsel oder einem ähnlichen Werkzeug berühren.
- Wählen Sie Larven mit transgener Rezeptorexpression unter einem fluoreszierenden Sezierbereich.
- Larven zur Verwundung in eine 120 mm Petrischale in E3 + Tricain überführen. Mit einem sterilen Skalpell schnitt die Bauchflosse der Larve ab, während unter dem Sezierbereich beobachtet wurde (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Idee ist, einen tiefen Schnitt durchzuführen, um eine erhebliche Neutrophilenrekrutierung zu verursachen, ohne jedoch die Gefäße der CHT zu schneiden. Der Schnitt erfolgt senkrecht zur CHT-Achse, so dass der Schnitt fast die Gefäße der CHT erreicht. Dies erfordert etwas Übung und sollte zunächst unter Aufsicht an Larven durchgeführt werden, die nicht für diesen Zweck erzeugt werden (z. B. überschüssige Larven aus einem anderen Experiment).
4. Vorbereitung von Larven für die Live-Bildgebung
- Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) in E3-Medium durch Erhitzen auflösen, um eine flüssige 2%ige Agaroselösung zu erhalten.
- Lassen Sie diese Lösung auf 60 °C abkühlen.
HINWEIS: Bewahren Sie einen Kolben oder Schlauch mit Agarose in einem Inkubator bei 60 °C auf, um die Agaroseeinstellung zwischen der Montage verschiedener Larven zu vermeiden. - Pipette 0,5 ml der Flüssigkeit LMP + E3 in einer Glasbodenschale für die mikroskopische Bildgebung.
- Pipettieren Sie eine verwundete, betäubte Zebrafischlarve zusammen mit 0,5 ml E3 + 2x Tricain in der Glasbodenschale.
- Mischen Sie die beiden Lösungen vorsichtig, um eine 1% ige LMP / 1x Tricain Agarose / E3-Lösung zu erhalten, wobei die Erzeugung von Blasen vermieden wird. Orientieren Sie den Embryo seitlich und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, so dass der kaudale Teil des Fisches so nah wie möglich am Glas ist.
HINWEIS: Das abzubildende Gewebe muss bei der Bildgebung mit einem inversen Mikroskop so nah wie möglich am Glasboden liegen. Die Einstellung der Orientierung für die Larve muss schnell sein, damit die Agarose nicht abnimmt, bevor die Larve positioniert ist. - Lassen Sie die Agaroselösung abkühlen und 5-10 min erstarren. Testen Sie, ob die Agarose gesetzt ist, indem Sie das Agarosegel mit einem kleinen Pinsel oder einer Spitze vorsichtig berühren.
- Sobald die Agarose fest ist, fügen Sie 2 ml E3 mit 0,2 mg / ml Tricain zur Bildplatte hinzu.
5. Konfokale Live-Bildgebung
HINWEIS: Stellen Sie Embryonen auf einem konfokalen Mikroskop der rotierenden Scheibe oder einem gleichwertigen Mikroskop dar (Abbildung 2). Ein Laser-Scanning-Mikroskop kann ebenfalls verwendet werden, aber die zeitliche Auflösung der Dynamik wird einschränkender sein. Bereiten Sie die Bildgebungseinstellungen vor, bevor Sie die verwundete Larve bringen, damit die Reaktion nach der Wunde so schnell wie möglich abgebildet werden kann. Neutrophile kommen innerhalb von 5 Minuten in die Wunde und Rezeptoren in den zuerst ankommenden Zellen können sich innerhalb dieses Zeitrahmens internalisieren. Mit Übung ist es möglich, bereits 15 Minuten nach der Verwundung zu fotografieren.
- Schalten Sie das Mikroskop ein: Laser, Kamera und Computer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie die Erfassungssoftware, um die Bildverarbeitungseinstellungen einzurichten. Wählen Sie Laser für die geeigneten Fluorophore und ungefähre Belichtungszeiten basierend auf früheren Experimenten (erfassen Sie GFP mit 488 nm und tagRFP mit 561 nm Laser).
- Übertragen Sie die Platte mit dem montierten Embryo so schnell wie möglich nach dem Einsetzen der Agarose auf die konfokale Bildgebungs-Spinnscheibenplattform.
- Verwenden Sie das Mikroskop-Okular, um den Fisch in der Schale mit dem Bühnenjoystick zu finden.
- Konzentrieren Sie sich mit dem Fokussierknopf auf den Wundbereich.
HINWEIS: Um das Interessengebiet zu finden, kann es einfacher sein, ein Luftobjektiv mit geringer Vergrößerung (10x) zu verwenden. - Wählen Sie das Feld aus, das um die Wunde herum dargestellt werden soll. Verwenden Sie ein 30x/40x Objektiv mit hoher numerischer Blende, um eine ausreichende Auflösung zu erhalten.
- Verwenden Sie die Softwaretasten, um die Belichtungszeit so einzustellen, dass der fluoreszierende Marker mit gutem Kontrast, aber ohne das Signal zu sättigen, gesehen werden kann.
HINWEIS: Die Belichtungszeit muss so niedrig wie möglich sein, um die Fluoreszenzexposition zu minimieren und die zeitliche Auflösung im Zeitraffer zu maximieren. Die Laserleistung hängt vom Zustand des Lasers ab, muss jedoch auf ein Niveau eingestellt werden, das eine ausreichend niedrige Belichtungszeit für dynamische Bildgebung ermöglicht. - Verwenden Sie die Softwaretasten, um die Lautstärke auszuwählen, die als Z-Stack abgebildet werden soll
- Richten Sie alle 30 s einen Zeitraffer für die gewünschte Dauer ein.
HINWEIS: Bei sterilen ventralen Flossenwunden wird die maximale Rekrutierung um 2-3 h beobachtet. - Bevor Sie den Zeitraffer starten, erstellen Sie einen hellen Feldschnappschuss, um das Sichtfeld zu dokumentieren. Wenn möglich, erfassen Sie ein helles Feld innerhalb des Zeitrafferfilms.
6. Quantifizierung der Rezeptorinternalisierung in Zebrafisch-Neutrophilen
- Notieren Sie das Zeitintervall der Bildaufnahme und die Pixelgröße des Bildes. Zeichnen Sie auf, wie viele Minuten nach der Verwundung die Bildgebung begonnen hat.
- Öffnen Sie die Bilddatensätze mit Fidschi, indem Sie das Bild auf die Softwareoberfläche ziehen, wählen Sie mit dem Zeitschieberegler einen repräsentativen Frame von Interesse für jeden Datensatz aus, z. B. bei 1-1,5 h nach der Verwundung, und speichern Sie ihn.
- Fahren Sie mit MATLAB fort, um das Bild-Dataset zu verarbeiten.
- Erstellen Sie ein neues Skript und fügen Sie Funktionen zum Lesen von Bildern (Zeile 6 im Skript "select_neutrophils.m" für die Schwerpunktdefinition in der Zusatzdatei 1), zum Öffnen (Zeile 11 in der Zusatzdatei 1) und zur manuellen Auswahl der Punkte auf dem Bild (Zeile 12 in der Zusatzdatei 1) hinzu.
- Öffnen Sie den interessierenden Rahmen, indem Sie dieses Skript ausführen (Ergänzungsdatei 1), identifizieren Sie die zu analysierenden Neutrophilen durch visuelle Inspektion, klicken Sie auf sie und zeichnen Sie eine Schätzung ihrer Schwerpunkte auf, sowohl in der Bauchflossenwunde als auch in der CHT.
HINWEIS: Die nicht mobilisierten Neutrophilen in der CHT dienen als interne Referenz für Neutrophile, deren Rezeptorverteilung konstant bleibt. Dies ermöglicht die Normalisierung der Kontrastwerte von Zellen an der Wunde auf eine interne Referenz. - Fahren Sie mit der Segmentierung der Neutrophilen in jedem Frame mit der aktiven Konturtechnik22 fort, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
- Erstellen Sie eine Funktion, um die Metadaten aufzunehmen, die für die Segmentierung nach aktiven Konturen erforderlich sind (z. B. Anzahl der Iterationen, Verzerrung der Kontur, geschätzter Schwerpunkt usw.). 22 (siehe "Wunddaten.m" in der Zusatzakte 2).
- Erstellen Sie ein Skript, das die Funktion 'wound_data.m' aufruft, um die notwendigen Informationen für die Segmentierung jedes Neutrophilen einzugeben (Zeile 28 im Skript 'calc_contrast.m' in Supplementary File 3).
- Fügen Sie in das Skript Befehle zum Lesen von Bildern ein (Zeile 32 in Supplementary File 3).
- Fügen Sie die Generierung eines schwarzen Bildes (d. h. eines Bildes, bei dem Pixelwerte Nullen sind) mit einer gleichen Größe zum Eingabebild hinzu (Zeile 44 in der Zusatzdatei 3) und die Definition eines Quadrats von 10 × 10 Pixeln um den Schwerpunkt jedes Neutrophilen (Zeile 45 in der Zusatzdatei 3).
- Schließen Sie die Neutrophilensegmentierung unter Verwendung aktiver Konturen (Zeilen 48-49 in der Ergänzungsdatei 3) und die Entfernung kleiner falsch erkannter Objekte (Zeile 52 in der Zusatzdatei 3) ein.
HINWEIS: Die anfängliche Segmentierungskontur ist das Quadrat um den Schwerpunkt, das sich durch aktive Konturtechnik basierend auf den Pixelintensitäten, der Anzahl der Iterationen und der Verzerrung der Kontur entwickelt. Das Ergebnis der Segmentierung ist eine binäre Maske, bei der alle Pixel den Wert 0 haben, mit Ausnahme des neutrophilen Bereichs, dessen Pixel den Wert 1 haben. - Fügen Sie die Multiplikation des segmentierten Binärbildes mit dem Original hinzu, um nur die Pixelintensitäten des Neutrophilen zu erhalten, wobei der Rest des Bildes keine Nummer ist, so dass es nicht zu Berechnungen beiträgt (Zeilen 56-57 in der Zusatzdatei 3).
- Addieren Sie die Berechnung der Graustufen-Co-Occurrence-Matrix für jedes Neutrophil (GLCM)14,23 (Zeile 61 in Supplementary File 3). GLCM ist eine weitere Darstellung des Bildes, die die relative Position der Pixel in Bezug auf die Pixelintensität anzeigt.
- Schließen Sie die Berechnung des Kontrastes des Neutrophilen auf der Grundlage des GLCM ein (Zeilen 62,65 in der Zusatzdatei 3). Die Kontrastmetrik misst Intensitätsunterschiede zwischen benachbarten Pixeln. Pixel werden mit Pixeln in einem bestimmten Abstand verglichen, was empirisch anhand der Größe lokaler Intensitätsspitzen angepasst werden kann. Als Indiz für die Bilder mit einer Pixelgröße von 0,389 μm, wenn der Rezeptor eine vesikuläre Verteilung zeigte, lag jeder helle Punkt im Bereich von 5 Pixeln. Daher wurden die Intensitäten in Pixeln im Abstand von 5 Pixeln verglichen.
- Fügen Sie Befehle hinzu, um die Werte für einzelne Neutrophile in der Bauchflosse separat zu speichern (Zeile 68 in Supplementary File 3).
- Schließen Sie die Berechnung des mittleren Neutrophilenkontrastwerts aus allen CHT-Neutrophilen auf die gleiche Weise ein wie für Neutrophile an der Wunde (Zeilen 72-119 in der Ergänzungsdatei 3). Für CHT-Neutrophile rufen Sie die Funktion 'cht_data.m' auf (Zeile 77 in der Ergänzungsdatei 4).
- Schließen Sie die Normalisierung des Kontrastwerts einzelner Neutrophilen an der Wunde auf den mittleren Kontrast der CHT-Neutrophilen ein, der oben in Schritt 6.16 (d. h. Division) berechnet wurde (Zeile 122 in der Ergänzungsdatei 3). Dies ergibt einen normalisierten Kontrast, der widerspiegelt, wie "dotty" das Aussehen des Rezeptors in einzelnen reagierenden Zellen im Verhältnis zu nicht reagierenden Kontrollzellen ist (Abbildung 3 und Abbildung 4).
- Führen Sie das Skript (Supplementary File 3) aus, indem Sie in der Software auf das Ausführen-Symbol klicken.
- Wiederholen Sie alle Schritte für verschiedene Bedingungen.
- Verwenden Sie eine Statistiksoftware (siehe Materialverzeichnis), um die Ergebnisse für die verschiedenen Bedingungen zu importieren, indem Sie eine Spaltentabelle erstellen, die Ergebnisse plotten und statistische Tests durchführen, um die Signifikanz der Differenz zwischen den Mittelwerten zu überprüfen.
HINWEIS: Die Codes für die Analyse finden Sie auch in GitHub unter https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. Chemokin-Antwort-Assays in frühen Embryonen
HINWEIS: Dies ist ein optionales Nebenexperiment, das das Testen von Rezeptorverteilungsänderungen als Reaktion auf ein Kandidaten-Chemokin ermöglicht und unabhängig von den oben beschriebenen Experimenten bezüglich der neutrophilen Expression der Rezeptorkonstrukte ist. Unterschiede im ligandeninduzierten Verkehr zwischen Rezeptoren sind mit dieser Technik schwer festzustellen, da die Ligandenspiegel gesättigt sind14. Wenn man jedoch eine Liganden-Internalisierung eines Rezeptors in diesem System sieht, kann dies ein Hinweis darauf sein, dass der Ligand vom Rezeptor in Fällen erkannt wird, in denen die Ligandenidentität unklar ist. Dies ist nützlich, da die Expression von Chemokinrezeptoren in etablierten Zelllinien wie HEK293T-Zellen14 umständlich sein kann.
- Stellen Sie eine Kreuzung von Wildtypfischen (z. B. AB) auf und sammeln Sie Eier am nächsten Morgen kurz nach dem Anheben der Separatoren (wie oben beschrieben).
- Injizieren Sie 100 pg fluoreszierend markierte Rezeptor-mRNA (z. B. Cxcr1-FT) zusammen mit 100 pg mRNA für einen Membranmarker (z. B. Membran-CFP). Nehmen Sie in die Mischung unterschiedliche Dosen von mRNA für den Chemokinliganden auf.
HINWEIS: Als Indikation ergaben 150 pg Cxcl8a mRNA eine prominente Internalisierung von fluoreszierendem Cxcr1-FT (siehe Abbildung 5). - Spülen Sie die Embryonen mit E3-Medium aus und inkubieren Sie sie bei 28 °C.
- Testen Sie bei etwa 7 hpf die Expression der mRNA auf einem fluoreszierenden Sezierbereich und wählen Sie die Embryonen aus, um sie abzubilden.
- 0,8 % LMP-Agarose im Voraus zubereiten und in einem Glasrohr in einem Heatblock bei 60 °C aufbewahren. Verwenden Sie eine Glaspipette, um die Embryonen zu manipulieren. Dechorionieren Sie Embryonen sanft mit einer Pinzette in jeder Hand.
- Saugen Sie einen einzelnen dechorionierten Embryo mit der Glaspipette ab, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen an der Spitze befinden. Lassen Sie den Embryo vorsichtig in die Röhre der Agarose frei, so dass er in die Röhre sinken kann.
- Saugen Sie den Embryo aus der Agaroseröhre ab und sammeln Sie unterwegs etwas flüssige Agarose. Lassen Sie den Embryo vorsichtig auf die Mitte einer bildgebenden Schale mit Glasboden frei. Drehen Sie den Embryo schnell so, dass der Tierpfahl dem Boden der Schale zugewandt ist (diese Seite muss dem Ziel am nächsten sein, wenn ein umgekehrtes Mikroskop verwendet wird).
HINWEIS: Möglicherweise muss die Ausrichtung der Embryonen neu eingestellt werden, während sich die Agarose noch festsetzt. - Nachdem die Agarose abgesetzt ist, mit 2 ml E3-Medium ergänzen.
HINWEIS: Die Embryonen in diesem Stadium sind im Vergleich zu Larven sehr zerbrechlich und es braucht etwas Übung, um zu dechorionieren und zu montieren. Es ist wichtig, so sanft wie möglich abzusaugen und freizusetzen, um einen Embryonalbruch zu vermeiden. - Wiederholen Sie den Vorgang, um 3-5 Embryonen pro Schale zu laden.
- Embryonen auf einem invertierten konfokalen Mikroskop abbilden (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie ein 40x/1,3 NA Ölobjektiv, um eine ausreichend hohe Auflösung zu erhalten. Visualisieren Sie mCFP, sfGFP und tagRFP mit 405, 488 bzw. 552 nm auf dem Scope. Passen Sie Filter und Einstellungen so an, dass sie einen hohen Kontrast aufweisen, während Sättigungen vermieden und Leckagen zwischen den Kanälen minimiert werden.
- Wiederholen Sie die Montage und Bildgebung für verschiedene Bedingungen.
Representative Results
Auf die ventrale Flossenverwundung folgt eine schnelle Neutrophilenmobilisierung von der CHT in die Bauchflosse und eine Häufung am Wundrand innerhalb von 30-60 Minuten (Abbildung 1). Wir haben die Verteilung von zwei Chemokinrezeptoren, Cxcr1 und Cxcr2, visualisiert, die von Zebrafisch-Neutrophilen24 exprimiert werden und Cxcl8a und Cxcl8b14 mittels konfokaler Mikroskopie erkennen. Wir erzeugten zwei entsprechende transgene Linien, Tg(lyz:Cxcr1-FT) und Tg(lyz:Cxcr2-FT), in denen Neutrophile ein fluoreszierendes Timer-Konstrukt (FT) des Rezeptors exprimieren, d.h. eine Fusion mit einem Tandem aus sfGFP und tagRFP (Abbildung 2 und Referenz14). Die Verwendung der beiden Fluorophore sollte die Überwachung eines breiten Spektrums von Rezeptorschicksalen ermöglichen und Schätzungen der Proteinumsatzzeit an der Plasmamembran liefern, da neu synthetisierte Rezeptoren im Alter von 8,14 Jahren grün fluoreszieren und allmählich rot werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass diese Rezeptoren einen schnellen konstitutiven Umsatz an der neutrophilen Plasmamembran aufweisen und dass die Verweilzeit kürzer war als die Reifezeit von tagRFP, wobei sfGFP eine Membranlokalisation und tagRFP eine vesikuläre Lokalisation im stationären Zustand zeigte (Ergänzendes Video 1 und Referenz14). Daher konzentrierten wir uns auf die Verteilung von sfGFP, um die ligandeninduzierte Internalisierung an Stellen von Gewebeschäden zu überwachen. Das Muster der Rezeptorverteilung wurde mit der Kontrastmetrik quantifiziert, die Intensitätsunterschiede zwischen benachbarten Pixeln meldet. Die Begründung ist, dass, wenn die Rezeptorverteilung membranös und glatt ist, der Kontrastwert niedrig ist. Wenn die Rezeptorverteilung vesikulär und punktförmiger ist, ist der Kontrastwert hoch (Abbildung 3).
Eine alternative Methode besteht darin, das Verhältnis von Rezeptorspiegeln (sfGFP-Intensität) zu den Spiegeln eines Kontrollmembranmarkers, z. B. Membran-CFP (mCFP), zu quantifizieren (Abbildung 3). Beide Methoden konnten die Rezeptorinternalisierung nachweisen, wie es durch ein stärkeres vesikuläres Rezeptorverteilungsmuster weltweit in der Zelle (höherer Kontrastwert) oder niedrigere Rezeptorspiegel an der Membran (niedrigeres sfGFP/mCFP-Verhältnis) angezeigt wird. Die Kontrastmetrik konnte jedoch auch die Rezeptorinternalisierung in Neutrophilenclustern an der Wunde nachweisen, in denen die Membransegmentierung weniger genau und nicht anwendbar war (Abbildung 3). Mit dieser Metrik konnten wir sichtbare Unterschiede zwischen dem Cxcr1- und Cxcr2-Handel mit Neutrophilen an Wunden quantifizieren (Abbildung 4 und ergänzendes Video 2). Cxcr1-FT internalisiert in Zellen an der Wunde, während Cxcr2-FT in Neutrophilen an der Wunde membranös blieb (Abbildung 4A-C, Supplementary Video 2 und Supplementary Video 3). Unterdrückung von Cxcl8a und Cxcl8b durch Morpholino-Behandlung, differentiell beeinflusste Cxcr1-FT-Internalisierung an Wunden (Abbildung 4C,D). Um weiter zu validieren, dass Cxcr1-FT auf Cxcl8a anspricht, führten wir Chemokin-Antwort-Assays in frühen Embryonen durch. Wir fanden heraus, dass Cxcr1-FT deutlich in Embryonen internalisiert wurde, in denen Cxcl8a co-exprimiert wurde (Abbildung 5). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die beschriebenen Methoden eingesetzt werden können, um die Chemokin-induzierte Rezeptorinternalisierung in Neutrophilen zu messen und die Identität des Liganden, der diese Effekte vermittelt, festzustellen.
Abbildung 1: Neutrophile Migration zu ventralen Flossenwunden. (A) (Links) Karikatur der 3 dpf-Larve, die die Lage des kaudalen hämatopoetischen Gewebes (CHT), der Venuszirkulation (VC, blau), der Bauchflosse (VF) und der Wundstelle zeigt. (Rechts) Karikatur, die den Bereich der Wunde (W) mit Neutrophilen darstellt, die von der CHT mobilisiert werden und sich an der Wunde gruppieren. Der Plexus caudalis cauda (CVP) des CHT-Gewebes ist blau gezeichnet. (B) Hellfeldbild (links) und konfokale Projektion (rechts), die die ventrale Flossenwunde und die Verteilung der Neutrophilen in Tg(mpx:GFP)-Larven bei 2 h nach der Wunde zeigt. Gestrichelte Linien zeigen VF- und CHT-Umrisse. Maßstabsleiste = 25 μm. Cartoon und fluoreszierendes Bild modifiziert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Live-Bildgebung des Handels von Chemokinrezeptoren in Neutrophilen. (A) Konstrukte, die für die neutrophilenspezifische transgene Expression von Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) und Cxcr2-FT verwendet werden. Konfokale Projektionen von Neutrophilen im Kopf einer 3 dpf transgenen Larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), oben; Tg(lyz:Cxcr2-FT), unten) mit tRFP (Magenta) und sfGFP (grün) Kanälen. Maßstabsleiste = 20 μm. (B) Anatomisches Schema von 3 dpf Larve wie in Abbildung 1A. Unterhalb der Larve befinden sich Schemata, die den Bereich der Wunde (W) mit Neutrophilen darstellen, die von der CHT (oben) mobilisiert werden oder beim Eintritt in die Bauchflosse (unten) Chemotaxis durchführen. Gestricheltes Quadrat zeigt den Bereich an, der in Schnappschüssen auf der rechten Seite abgebildet ist. (C) Neutrophile in Tg(lyz:Cxcr1-FT)-Larven (sfGFP ist gezeigt) bei Mobilisierung von der CHT (obere Panels) oder Chemotaxis in Richtung der Wunde (untere Panels). Pfeile zeigen die gleichen Zellen im Laufe der Zeit. Zeitpunkte auf dem rechten Bild sind Minuten, die nach dem Bild auf der linken Seite verstrichen sind. Maßstabsstab = 10 μm. (D) Schematische Darstellung des experimentellen Ansatzes für die Live-Bildgebung des Chemokinrezeptor-Transports. Panels A-C modifiziert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Quantifizierungsbeispiele der Rezeptordynamik. Einzelne (blaue) oder geclusterte Neutrophile (grün) an Wunden oder nicht mobilisierte Neutrophile in der CHT (rot, orange) wurden segmentiert und mit verschiedenen Methoden analysiert, um die Ergebnisse zu vergleichen. Die gleichen gezeigten Beispielzellen wurden mit zwei Methoden analysiert, um das, was im Bild zu sehen ist, mit dem extrahierten Wertebereich in Beziehung zu setzen. (A) Die Oberfläche der ausgewählten Beispielzellen wurde basierend auf der Konturdefinition im sfGFP-Kanal segmentiert. (B) Der Kontrast wurde aus den in A gezeigten Beispielzellen berechnet. (C) Die Membran der ausgewählten Beispielzellen wurde auf der Grundlage der Konturdefinition im CFP-Kanal segmentiert. Es folgte eine ratiometrische Analyse von sfGFP/CFP. (D) Das Verhältnis von sfGFP/CFP wurde an den in C gezeigten Beispielzellen berechnet. Fehlerbalken stellen S.E.M. aus einzelnen Zellen dar, im Fall von n>1 wurden die Werte hier nicht für statistische Analysen verwendet, sondern lediglich als Beispiel für Messungen, die mit den verschiedenen Quantifizierungsmethoden erhalten wurden. Maßstabsleiste = 10 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Differentialdynamik von Cxcr1 und Cxcr2 als Reaktion auf Verwundung. (A) Konfokale Projektion von Neutrophilen in Tg(lyz:Cxcr1-FT)- oder Tg(lyz:Cxcr2-FT)-Larven an der Wunde bei 80 min nach der Wunde (sfGFP-Kanal gezeigt). Maßstabsleiste = 10 μm. (B) Vergrößertes Cxcr1-FT-Neutrophil (links) und Cxcr2-FT (rechts) an der Wunde. Grüner Rezeptor ist in Grau dargestellt. Skalenbalken = 5 μm. (C) Normalisierter Kontrast (Kontrast pro individuellem Neutrophilen, normalisiert auf den mittleren Kontrast von nicht mobilisierten Zellen in der CHT). CXCl8A bezieht sich auf die Injektion eines Spleißblockers zusammen mit einem translationsblockierenden Morpholino für CXCL8A. CXCl8B bezieht sich auf die Injektion mit einem Spleiß-blockierenden Morpholino für CXCl8B. Für Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 Zellen (CHT), n=47 Zellen (Wunde) von 8 Larven. Für Tg(lyz:Cxcr1-FT) mit Morpholinos: n=28 Zellen (Cxcl8a-MO) aus 5 Larven, n=16 Zellen (Cxcl8b-MO) aus 5 Larven. Für Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 Zellen (CHT) und n=20 Zellen (Wunde) aus 3 Larven. Die Daten wurden von unabhängigen Larven gepoolt, die in 1-5 Bildgebungssitzungen aufgenommen wurden. Kruskal-Wallis-Test mit Dunns multiplem Vergleichstest für Tg(lyz:Cxcr1-FT), zweiseitiger ungepaarter Mann-Whitney-Test für Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Konfokale Projektion von Neutrophilen in Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgenen Larven, die mit cxcl8a morpholino (MO) (links) und cxcl8b MO (rechts) behandelt wurden, die auf Flossenwunden ansprechen (sfGFP-Kanal grün dargestellt). Schnappschuss aufgenommen zu Zeitpunkten äquivalenter Neutrophilenakkumulation (85 min nach der Verwundung im linken Bild und 45 min nach der Verwundung im rechten Bild). Maßstabsleiste = 10 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Chemokin-Response-Assay in frühen Embryonen. Laserscanning konfokaler Scheiben von gastrulatierenden Embryonen, die Expression und Verteilung von Cxcr1-FT zeigen. 100 pg Cxcr1-FT mRNA wurden in ein Zellstadium Eizellen mit oder ohne 150 pg Cxcl8a mRNA injiziert. Grüne und rote Rezeptoren werden in separaten Kanälen gezeigt. Der Kontrollmembran-CFP-Marker (mCFP) ist im Cyan-Kanal dargestellt. Maßstabsleiste = 20 μm. Abbildung geändert von Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusatzfilm 1: Transgene Neutrophile im Kopf einer Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) und Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) Larve bei 3 dpf. sfGFP (grün), tagRFP (magenta). Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 5 fps. Maßstabsleiste = 20 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Zusatzfilm 2: Neutrophile in Tg(lyz:Cxcr1-FT) (links) und Tg(lyz:Cxcr2-FT) (rechts) transgenen Larven, die auf Flossenwunden reagieren. Der Film beginnt innerhalb von 10 Minuten nach der Wunde und dauert 60 Minuten. sfGFP (grün), tagRFP (magenta). Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 10 fps. CHT = kaudales hämatopoetisches Gewebe. VF = Bauchflosse. Maßstabsleiste = 25 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Zusatzfilm 3. Zusätzliche Beispiele von Neutrophilen aus einer verwundeten transgenen Tg(lyz:Cxcr1- FT)-Larve (andere Larve als in Video 2), die mit höherer Auflösung aufgenommen wurden und eine Rezeptorinternalisierung (sfGFP-Kanal grün dargestellt) bei Mobilisierung in der CHT oder beim Eintritt und Chemotaxis in der Bauchflosse zeigen. Das Bildintervall beträgt 30 Sekunden und die Bildrate 2 fps. Maßstabsleiste = 10 μm. Das Video stammt aus Ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die beschriebene Methode ermöglicht eine Live-Bildgebung der Rezeptordynamik als Reaktion auf endogene Liganden in situ während einer Entzündungsreaktion auf Gewebeschäden. Die Verwendung von Cxcr1/Cxcr2-Neutrophilenreportern könnte auf andere physiologische Umgebungen wie Infektionen, Tumormodelle oder andere Arten von Gewebeschädenausgeweitet werden 14,25,26,27. Darüber hinaus könnten transgene Rettungslinien, bei denen der endogene Rezeptor von einem exogenen mutierten Rezeptor unterdrückt und gerettet wird, nützliche Werkzeuge liefern, um die Bedeutung spezifischer neutrophiler Migrationsmuster bei Immunantworten zu analysieren. Zum Beispiel verursachen Cxcr1-Rezeptor-Mutanten, die eine gestörte Desensibilisierung haben, eine prominentere Neutrophilen-Clusterbildung an Entzündungsstellen14. Dieser Funktionsgewinn-Phänotyp könnte verwendet werden, um die Rolle der Neutrophilenansammlung in verschiedenen physiologischen Prozessen zu verstehen, z. B. Wundreparatur, Infektionskrankheiten oder Tumorevolution, und Rezeptor-Knockdown- / Knockout-Experimente zu ergänzen. Die Methodik bietet auch eine Grundlage, um das Spektrum der verfügbaren Reporter zu erweitern. Die Wahl des fluoreszierenden Reporters ist wichtig zu berücksichtigen und hängt von der biologischen Frage ab. Wir fanden heraus, dass der konstitutive Umsatz dieser Chemokinrezeptoren in Neutrophilen im Vergleich zu Epithelzellen hoch warund dass Reporter mit schneller Reifung (z. B. sfGFP) verpflichtet waren, Membranspiegel im stationären Zustand zu melden und Unterschiede bei Neutrophilenstimulation aufzulösen 8,14. Daher sind Membranverhältnisse von sfGFP / tagRFP nicht anwendbar, um die ligandeninduzierte Internalisierung in diesem Zelltyp zu messen, aber das Muster von tagRFP ermöglicht die Verfolgung der intrazellulären Schicksale des Rezeptors, was in einigen Studien nützlich sein könnte. Wir fanden auch heraus, dass das konzentriertere intrazelluläre Signal von tagRFP für das Screening einzelner Larven nützlich ist. Ein alternativer Ansatz zur Messung der Rezeptorspiegel an der Plasmamembran wäre die Co-Expression eines fluoreszierenden Membranmarkers in Neutrophilen entweder im selben Transgen9 oder in einem unabhängigen Transgen14. Im ersten Szenario würde das Transgen ein zusätzliches Mittel für das Screening der Fische darstellen und die Expressionsniveaus wären zwischen dem Marker und dem Rezeptor vergleichbar. Der letztere Ansatz wäre modularer, da eine Zebrafischlinie mit einem Rezeptorreporter mit verschiedenen Reporterlinien kombiniert werden könnte. In beiden Fällen ist es erwähnenswert, dass die Membranquantifizierung der Rezeptorspiegel bei geclusterten Neutrophilen eine Herausforderung darstellt (siehe unten). Schließlich stellen wir fest, dass eine mögliche Erweiterung dieses Protokolls darin bestehen würde, die Live-Bildgebung durch Immunhistochemie für detailliertere Lokalisierungsanalysen zu verfolgen.
Das Tol2-Transgenesesystem ist gut etabliert7 und der Lysozym-C-Promotor wurde ausgiebig für die neutrophile Expression11,15 verwendet. Der Transgeneseansatz ist daher relativ einfach und das mit diesem Promotor erreichte Expressionsniveau ist hoch genug, um einen ausreichenden Kontrast für die Analyse der Rezeptordynamik zu bieten. Eine mögliche Einschränkung besteht darin, dass das Expressionsniveau nicht die endogenen Rezeptorexpressionsniveaus rekapituliert. Neue CRISPR-Technologien könnten eingesetzt werden, um Knock-in-Leitungen für Rezeptoren von besonderem Interessezu etablieren 28. Diese Technologien sind immer noch umständlich und garantieren möglicherweise nicht die erforderlichen Expressionsniveaus für die subzelluläre Bildgebung, aber ihre erfolgreiche Entwicklung wäre ein wichtiger Durchbruch für das Verständnis der endogenen Signaldynamik. Funktionelle Validierungen sind wichtig, um Daten mit transgenen Rezeptorkonstrukten zu interpretieren. Zum Beispiel können Ligandenerkennungsassays verwendet werden, um festzustellen, dass das fluoreszierende Fusionsprotein funktionell ist, und die Rettung von Knockout-Phänotypen könnte verwendet werden, um festzustellen, ob die transgenen neutrophilen Expressionsniveaus mit der Funktionalitätkompatibel sind 14. Schließlich wäre eine direktere Möglichkeit, die Rezeptorfusion zu validieren, die Verwendung eines in vitro funktionellen Assays mit markiertem Rezeptor neben nicht markierten Versionen14.
Der Quantifizierungsansatz adressiert spezifische Schwierigkeiten bei der genauen Membransegmentierung in Neutrophilen in vivo. In Zellen epithelialer Natur kann die Quantifizierung der Rezeptorspiegel automatisch durchgeführt werden, indem die Membranrezeptorspiegel auf einen Kontrollmarker normalisiert werden, der im Tandem oder separat ausgedrückt werden kann9. In der Tat haben wir einen solchen Ansatz angewandt, als wir den Ligandenerkennungsassay bei gastrulierenden Embryonen14 verwendeten. Neutrophile durchlaufen jedoch in vivo komplexe, schnelle Veränderungen der Zellform, was die Membransegmentierung sowohl in 2D als auch in 3Derschwert 14. Dies ist noch schwieriger, wenn sich Neutrophile häufen, was in vielen physiologischen Umgebungen vorkommt29. Die Kontrastmetrik überwindet diese Einschränkung, da sie keine Membransegmentierung erfordert, sondern den Gesamtzustand der Rezeptorverteilung in der Zelle widerspiegelt (membranös / glatt vs. vesikulär / punktförmig). Es ist wichtig zu beachten, dass die Kontrastmetrik durch den Gesamtkontrast des Bildes beeinflusst werden kann, so dass eine Normalisierung einzelner Zellwerte auf eine interne Referenz erforderlich ist, um die Variabilität des Signals in verschiedenen Embryonen / Proben zu berücksichtigen. Zum Beispiel verwendeten wir den mittleren Zellkontrastwert von nicht reagierenden Neutrophilen in der CHT (d.h. Neutrophilen, die stationär bleiben und nicht in die Bauchflosse wandern)14. Eine zusätzliche Möglichkeit wäre, mit Kontrastwerten eines Kontrollmarkers in derselben Zelle zu normalisieren. Dies würde eine Lösung bieten, wenn keine interne Referenz von nicht reagierenden Zellen verfügbar ist, und könnte wahrscheinlich feinere quantitative Unterschiede in der Rezeptordynamik zwischen verschiedenen Bedingungen auflösen.
Der Speicherort der Bildgebung ist eine weitere zu berücksichtigende Variable. Der Grund für die Wahl der Bauchflossenwunde hier, im Gegensatz zu der häufiger verwendeten Heckflossenwunde Modell16,30, ist, dass der Ort der Verwundung in der Nähe des Ortes des neutrophilen Wohnsitzes / Migrationsursprungs liegt. Dies beschleunigt die Zeitleiste des Assays, da es relativ wenig Zeit braucht, bis Neutrophile ankommen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, das Zellverhalten sowohl am Migrationsursprung (CHT) als auch am Zielort von Interesse (Wunde) zu erfassen. Dies ist hier relevant, da die räumliche und zeitliche Auflösung, die für die subzelluläre Bildgebung erforderlich ist, schwer mit einem großen Sichtfeld oder Multipositions-Scanning zu kombinieren ist. So erlaubt der ventrale Flossenwundassay die Verfolgung der Entwicklung der Migrationsreaktion vom Migrationsursprung und die gleichzeitige Erfassung unspezifischer Rezeptorschwankungen in Zellen, die nicht reagieren. Wie bereits erwähnt, ist letzteres für Quantifizierungszwecke nützlich, da es eine interne Referenz für unspezifische Dynamiken bietet. In anderen Systemen ist es möglicherweise nicht möglich, eine solche interne Referenz zu haben, in diesem Fall würden die Kontrastwerte eines co-exprimierten Membranmarkers eine alternative Kontrolle bieten.
Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass die Methodik auf andere Systeme anwendbar ist und für eine Vielzahl von Zwecken eingesetzt werden kann. Zum Beispiel könnten die gleichen Reporter in anderen entzündlichen Umgebungen wie Infektionseinstellungen oder anderen Krankheitsmodellen eingesetzt werden. Das Repertoire der Zebrafischrezeptor-Reporterlinien könnte auf andere Signalrezeptoren erweitert werden, um Signalmechanismen zu verstehen oder die Ligandendynamik in vivo zu melden. Der Ansatz kann mit Knockdown/Knockout-Techniken kombiniert werden, um die mechanistischen Grundlagen der beobachteten Dynamik zu hinterfragen. Zum Beispiel kann eine Störung der Ligandenexpression die Ligandenabhängigkeit für die beobachtete Rezeptordynamik anzeigen. In Zukunft stellen wir uns vor, dass das System weiter verfeinert werden könnte, um die Knock-in-Einfügung von Reportern zu integrieren. Letztendlich würden Ergebnisse, die diese Methodik verwenden, neue Erkenntnisse liefern, die über die Zebrafischgemeinschaft hinaus wertvoll sind, angesichts der Erhaltung dieser Signalrezeptoren bei Säugetieren und der relativen Herausforderung, diese Studien in größeren Organismen durchzuführen.
Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt
Acknowledgments
Wir danken Christine Holt und Bill Harris für die Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Wir danken Darren Gilmour für die fluoreszierenden Timer-Backbone-Konstrukte und Anna Huttenlocher für den Tol2-Lyz-Backbone-Vektor. Wir danken Steve Renshaw für die Tg(mpx:GFP)i114 Linie. Diese Arbeit wurde vom MRC (MR/L019523/1), dem Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] und ein Isaac Newton Trust Grant 19.23(n). C.C. wurde von einem MRC DTP-Stipendium und teilweise vom Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] gewähren. H.W. wurde von einem MRC DTP Studentship unterstützt. H.P. wurde durch ein Wellcome Trust PhD Grant (105391/Z/14/Z) und teilweise durch einen Wellcome Trust [204845/Z/16/Z] unterstützt; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] Grant und das MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
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