Summary
Nous décrivons ici les protocoles permettant d’effectuer une imagerie en direct et une analyse quantitative de la dynamique des récepteurs chimioattractifs chez les neutrophiles du poisson-zèbre
Abstract
Le guidage des leucocytes par gradients chimiques est essentiel pour les réponses immunitaires. Les neutrophiles sont les premières cellules à être recrutées sur des sites de lésions tissulaires où elles exécutent des fonctions antimicrobiennes cruciales. Leur trafic vers ces loci est orchestré par plusieurs chimioattractants inflammatoires, dont des chimiokines. Au niveau moléculaire, la signalisation chimioattractante est régulée par le trafic intracellulaire des récepteurs correspondants. Cependant, on ne sait toujours pas comment les changements subcellulaires dans les récepteurs de la chimiokine affectent la dynamique de la migration des leucocytes au niveau des cellules et des tissus. Nous décrivons ici une méthodologie pour l’imagerie en direct et l’analyse quantitative de la dynamique des récepteurs de la chimiokine dans les neutrophiles au cours des réponses inflammatoires aux lésions tissulaires. Ces outils ont révélé que le trafic différentiel des récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles du poisson-zèbre coordonne le regroupement et la dispersion des neutrophiles sur les sites de lésions tissulaires. Cela a des implications pour notre compréhension de la façon dont les réponses inflammatoires sont auto-résolues. Les outils décrits pourraient être utilisés pour comprendre les schémas de migration des neutrophiles dans une variété de contextes physiologiques et pathologiques et la méthodologie pourrait être étendue à d’autres récepteurs de signalisation.
Introduction
La migration des leucocytes est d’une importance capitale pour les réponses immunitaires. Les cellules immunitaires sont des cellules migratrices prototypiques, qui sont remarquablement capables de traverser les tissus et les vaisseaux sanguins et de détecter une gamme de signaux de guidage chimique pour migrer de manière directionnelle vers les microbes ou d’autres cellules hôtes importantes. Des directives correctes reposent sur la reconnaissance des chimioattractifs, parmi lesquels les chimiokines représentent la catégorie1 la plus importante. Les chimiokines sont reconnues par des récepteurs couplés à la protéine G à sept transmembranes très spécifiques. Lors de la liaison à la chimiokine, les récepteurs de la chimiokine changent de conformation conduisant à l’activation des protéines G trimériques associées et à leur dissociation en sous-unités de signalisation fonctionnelles qui favorisent les changements cytosquelettiques et la migration dirigée1. Secondairement, les récepteurs de la chimiokine sont phosphorylés, et cette modification conduit à une désensibilisation à l’attractif, qui peut être suivie d’une re-sensibilisation / recyclage rapide ou d’une dégradation intracellulaire et d’une régulation négative de la surface cellulaire2. Ces dynamiques de récepteurs influencent la durée et la dose de signalisation reçues par les cellules, mais la façon dont elles affectent le comportement de migration des leucocytes a été difficile à élucider in vivo.
Le suivi de la dynamique des récepteurs dans les leucocytes vivants dans les systèmes traditionnels des mammifères fait face à plusieurs défis. Pour les études vivantes, les fusions de récepteurs avec des protéines fluorescentes doivent être exprimées dans les cellules. Ceci est difficile dans les leucocytes primaires, en particulier dans les neutrophiles, et des études ont jusqu’à présent utilisé des lignées cellulaires de neutrophiles de substitution pour exprimer les récepteursde chimiokine 3,4. La génération de modèles murins transgéniques, dans lesquels les leucocytes expriment un récepteur fluorescent ou des récepteurs mutants présentant des défauts de trafic informatifs 5,6, implique un investissement considérable en temps et en ressources. Même dans ces cas, la résolution d’imagerie et le contraste pour la dynamique des récepteurs d’imagerie chez l’animal vivant peuvent être limités et des études ont utilisé l’immunohistochimie sur des sections de tissus fixes5. Compte tenu de ces défis techniques, notre compréhension de la façon dont la dynamique des récepteurs chimioattractifs affecte le comportement cellulaire dans un environnement tissulaire vivant est actuellement limitée.
Nous fournissons ici une méthodologie pour surveiller le trafic de récepteurs dans les neutrophiles du poisson-zèbre. Les poissons-zèbres sont génétiquement traitables, comme les souris, mais la transgénèse est relativement plus simple grâce à l’utilisation de systèmes de transposon efficaces et à la manipulation directe des zygotes7. La larve transparente se prête idéalement à l’imagerie. La dynamique des récepteurs de la chimiokine a été visualisée dans les cellules germinales primordiales et la ligne latérale primordium par l’expression de fusions correspondantes avec des rapporteurs fluorescents 8,9,10. Les larves de poisson zèbre sont équipées de neutrophiles matures qui ont des propriétés génétiques et cellulaires hautement conservées par rapport aux neutrophiles de mammifères. La dynamique de signalisation subcellulaire telle que la dynamique du cytosquelette et les régulateurs de polarité ont été visualisées dans ces cellules par la génération de lignées transgéniques correspondantes 11,12,13. Récemment, nous avons visualisé et analysé fonctionnellement la dynamique des récepteurs de la chimiokine chez les neutrophiles au cours des réponses inflammatoires aux lésions tissulaires14. Ici, nous décrivons la génération de lignes rapporteures transgéniques pour la signalisation des chimiokines dans les neutrophiles, la préparation d’embryons pour l’imagerie vivante, un test de plaie pour l’étude de la signalisation des neutrophiles et le protocole d’acquisition et d’analyse d’images. Nous fournissons également un protocole parallèle pour tester les réponses des récepteurs de chimiokine aux ligands candidats, ce qui est utile pour essayer d’établir des modèles de reconnaissance de ligand dans des récepteurs non caractérisés. Ces techniques peuvent être utilisées en combinaison avec d’autres manipulations génétiques, telles que l’inhibition de l’expression endogène de la chimiokine ou la génération de récepteurs mutants avec un trafic altéré induit par un ligand, pour interroger comment la dynamique de signalisation spécifique affecte le comportement des leucocytes in vivo. Les lignées transgéniques exprimant des récepteurs de chimiokine marqués par fluorescence peuvent également être utilisées comme rapporteurs pour les gradients endogènes de chimiokine, qui sont autrement difficiles à détecter par coloration directe des anticorps. La méthodologie décrite permet d’étendre la génération de rapporteurs à d’autres récepteurs d’immuno-signalisation.
Protocol
REMARQUE: Tous les poissons-zèbres ont été gardés conformément aux directives ARRIVE et aux règlements du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni, UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Génération de larves transgéniques de poisson-zèbre rapporteur pour l’imagerie du trafic de récepteurs dans les leucocytes
- Générer une construction basée sur Tol2 pour l’expression spécifique au tissu du récepteur d’intérêt marqué par fluorescence. Pour les neutrophiles, utilisez des séquences promotrices du lysozymeC15 et du gène16 de la myéloperoxydase. La construction peut être conçue comme une fusion avec une seule protéine fluorescente (p. ex. GFP), une minuterie fluorescente en tandem (p. ex., une GFP à pliage rapide et une balise RFP 8,14,17 à maturation plus lente) ou une expression bicistronique de GFP rapporteur et un marqueur de membrane de contrôle9 (voir Discussion pour les considérations à prendre en compte lors du choix de l’approche).
REMARQUE: Cette construction ne récapitule pas les niveaux endogènes d’expression des récepteurs, mais est utile pour obtenir un niveau élevé d’expression des récepteurs dans le type de cellule d’intérêt. Consultez la littérature sur des récepteurs similaires 3,5,6,8,9,10,14 pour décider de la position de l’étiquette fluorescente. - Mettre en place un réservoir contenant des mâles et des femelles adultes de type sauvage suivant les pratiques d’élevage standard18, séparés par une barrière la veille du frai des œufs.
- Le jour du frai des œufs, préparer le mélange de transgénèse pour la microinjection contenant 12,5 ng/μL d’ADN Tol2 et 17,5 ng/μL d’ARNm7 transposase. Soulevez les barrières des aquariums peu de temps après l’arrivée des lumières le matin (cela peut varier selon les installations de pêche) et collectez les œufs dans les 15 minutes pour l’injection d’ARNm.
REMARQUE: Assurez-vous que la solution d’ADN est exempte de RNase pour éviter la dégradation de l’ARNm transposase dans le mélange. Une option pour contourner cela est d’injecter des ovules avec des solutions séparées de Construction Tol2 et de transposase. - Suivez les protocoles standard pour la transgénèse et la microinjection des œufs de poisson-zèbre19.
- Injecter 1 nL de la solution dans la cellule d’embryons à un stade cellulaire.
REMARQUE: Les résultats d’expression sont plus cohérents lors de l’injection à l’intérieur de la cellule et de l’élimination des injections qui peuvent ne pas être clairement à l’intérieur de la cellule. Les embryons au stade unicellulaire sont ciblés en raison de la variabilité de l’injection de volume par cellule lors de l’injection d’embryons au stade cellulaire 2 à 16. Une option serait de séparer les injections d’une étape cellulaire des lots d’injections ultérieures, au cas où celles-ci auraient des efficacités différentes. - Vérifiez les embryons injectés plus tard dans la journée et retirez les œufs non fécondés ou morts pour garder la couvée en bonne santé.
- 3 jours après la fécondation (dpf), dépister les larves au microscope fluorescent. Le marqueur sera visible dans les neutrophiles, en particulier dans le tissu hématopoïétique caudal (CHT), riche en ces cellules.
REMARQUE: Le pourcentage de cellules marquées varie selon les constructions, mais généralement 20 à 60% des neutrophiles sont censés exprimer la construction. Des pourcentages plus faibles prédisent généralement plus de dépistage au stade adulte. C’est une bonne pratique de vérifier également la localisation correcte du récepteur au niveau de la membrane, avec une approche d’imagerie à plus haute résolution, dans un échantillon de ces embryons avant de faire pousser le poisson. - Élever des larves positives selon les pratiques d’élevage standard20. Ceux-ci représentent la génération F0.
- À l’âge de 3 mois, filtrez F0 poisson pour les fondateurs. Croisez des poissons individuels avec un type sauvage non transgénique et filtrez leur progéniture à 3 dpf pour l’expression du récepteur en regardant sous la lunette de dissection. En fonction du succès de la transgénèse, qui varie selon chaque construction, observez un pourcentage de progéniture positive dans un sous-ensemble des croisements.
REMARQUE: Pour une bonne transgénèse, environ un tiers à la moitié des adultes donneront une progéniture positive. Le pourcentage de progéniture positif dans une couvée varie avec le nombre de copies de transgènes insérés et peut se situer entre 10 et 60%. Il est utile de garder une trace des rapports mendéliens dans les couvées pour identifier les transgéniques à insertion unique (ceux-ci sont plus facilement identifiés dans les embrayages F2 en recherchant un rapport de 50% de larves positives)20. - Élevez la progéniture positive, qui représente la génération F1.
- À l’âge de 3 mois, dépister les adultes F1 de la même manière pour établir une lignée transgénique F2 stable.
- Effectuer des expériences sur les larves F2 après avoir validé l’expression spécifique des neutrophiles du transgène.
REMARQUE: Au cours de la transgenèse, on peut observer différents niveaux d’expression des récepteurs et il est conseillé de garder différentes couvées transgéniques pour obtenir le niveau d’expression le plus approprié pour les questions biologiques. Les premiers résultats peuvent être obtenus chez les larves F0 ou F1.
2. Collecte d’embryons de poisson zèbre pour évaluer les réponses des plaies leucocytaires
- Après avoir établi une ligne de rapporteur transgénique stable, mettre en place un croisement entre les poissons transgéniques adultes et femelles et collecter les œufs le lendemain matin.
- Cultiver des embryons à 28,5 °C dans un milieu E3 (ou de l’eau d’œuf18).
- En option, à 24 hpf, incuber les embryons dans un tube centrifuge contenant 50 mL de milieu E3 complété par 0,003% d’eau de Javel pendant 5 min. Rincez ensuite 3 fois dans un milieu E3 en laissant le tube reposer pendant quelques minutes pour permettre aux embryons de se déposer dans le fond, puis décantez et remplacez le milieu.
REMARQUE: Cela fournit un niveau de contrôle sur l’exposition à l’infection des larves, ce qui peut affecter le comportement des leucocytes pendant la blessure. - Après blanchiment, conserver les embryons dans un milieu E3 complété par 0,003% de 1-phényl-2-thiourée pour empêcher la synthèse de la mélanine. Le bleu de méthylène, qui est souvent utilisé pour prévenir les infections fongiques, n’est pas ajouté ici, pour minimiser l’autofluorescence des tissus.
- Laissez les larves éclore naturellement et utilisez à 3 dpf lorsque les neutrophiles sont abondants21.
3. Blessure de la nageoire ventrale des larves
- Préparez les larves à la blessure. Utilisez des larves à 2,5-3,5 dpf, lorsque des neutrophiles abondants sont observés. Transférer les larves dans un milieu E3 complété par 160-200 mg/ L de tricaïne MS222.
REMARQUE: Les solutions concentrées de tricaïne doivent être préparées et congelées dans des aliquotes à l’avance et décongelées le jour même. - Laissez les larves dans un milieu E3+tricaïne pendant 15 min pour vous assurer qu’elles sont anesthésiées. Vérifiez leurs réponses en les touchant doucement avec un petit pinceau ou un outil similaire.
- Sélectionner les larves avec une expression de récepteur transgénique sous une lunette de dissection fluorescente.
- Transférer les larves dans une boîte de Petri de 120 mm en E3 + tricaïne pour les blesser. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez la nageoire ventrale de la larve, tout en observant sous la lunette de dissection (Figure 1).
REMARQUE: L’idée est d’effectuer une coupe suffisamment profonde pour provoquer un recrutement important de neutrophiles, mais sans couper les vaisseaux du CHT. La coupe est faite perpendiculairement à l’axe CHT de sorte que l’incision atteint presque les vaisseaux du CHT. Cela nécessite un peu de pratique et devrait d’abord être effectué avec une surveillance sur les larves qui ne sont pas générées à cette fin (par exemple, les larves en excès d’une autre expérience).
4. Préparation des larves pour l’imagerie vivante
- Dissoudre l’agarose à faible point de fusion (LMP) dans un milieu E3 en chauffant pour obtenir une solution liquide d’agarose à 2 %.
- Laissez refroidir cette solution jusqu’à 60 °C.
REMARQUE: Gardez une fiole ou un tube avec de l’agarose dans un incubateur à 60 ° C pour éviter le réglage de l’agarose entre le montage de différentes larves. - Pipette 0,5 mL du liquide LMP + E3 dans une cuve à fond de verre pour l’imagerie microscopique.
- Pipette une larve de poisson zèbre blessée et anesthésiée avec 0,5 mL de E3 + 2x Tricaine dans le plat à fond de verre.
- Mélangez délicatement les deux solutions pour obtenir une solution 1% LMP/1x agarose Tricaine/E3, en évitant la génération de bulles. Orientez l’embryon latéralement et poussez doucement vers le bas afin que la partie caudale du poisson soit aussi proche que possible du verre.
REMARQUE: Le tissu à imager doit être aussi proche que possible du fond du verre lors de l’imagerie avec un microscope inversé. Le réglage de l’orientation de la larve doit être rapide afin que l’agarose ne se fixe pas avant que la larve ne soit positionnée. - Laissez la solution d’agarose refroidir et solidifier pendant 5-10 min. Testez si l’agarose est fixée en touchant doucement le gel d’agarose avec un petit pinceau ou une pointe.
- Une fois que l’agarose est solide, ajouter 2 mL d’E3 complété par 0,2 mg/mL de tricaïne sur la plaque d’imagerie.
5. Imagerie confocale en direct
REMARQUE : Imagez des embryons sur un microscope confocal à disque rotatif ou équivalent (Figure 2). Un microscope à balayage laser peut également être utilisé, mais la résolution temporelle de la dynamique sera plus limitative. Préparez les paramètres d’imagerie avant d’amener la larve blessée, afin que la réponse puisse être imagée le plus rapidement possible après la blessure. Les neutrophiles arrivent dans la plaie dans les 5 minutes et les récepteurs des premières cellules arrivant peuvent s’internaliser dans ce laps de temps. Avec la pratique, il est possible d’imager dès 15 minutes après la blessure.
- Allumez le microscope: laser, appareil photo et ordinateur selon les instructions du fabricant.
- Utilisez un logiciel d’acquisition pour configurer les paramètres d’imagerie. Choisissez des lasers pour les fluorophores appropriés et des temps d’exposition approximatifs en fonction des expériences précédentes (acquérir GFP avec 488 nm et tagRFP avec laser 561 nm).
- Transférez la plaque avec l’embryon monté, dès que possible après la pose de l’agarose, sur la plate-forme de disque rotatif d’imagerie confocale.
- Utilisez l’oculaire du microscope pour trouver le poisson dans le plat à l’aide du joystick de scène.
- Concentrez-vous sur la zone de la plaie, à l’aide du bouton de mise au point.
REMARQUE: Pour trouver la zone d’intérêt, il peut être plus facile d’utiliser un objectif d’air à faible grossissement (10x). - Sélectionnez le champ à imager autour de la plaie. Utilisez un objectif 30x/40x avec une ouverture numérique élevée pour obtenir une résolution suffisante.
- Utilisez les boutons du logiciel pour régler le temps d’exposition afin que le marqueur fluorescent puisse être vu avec un bon contraste mais sans saturer le signal.
REMARQUE: Le temps d’exposition doit être aussi faible que possible pour minimiser l’exposition aux fluorescents et maximiser la résolution temporelle dans le time-lapse. La puissance du laser dépend de l’état du laser, mais doit être ajustée à un niveau permettant un temps d’exposition suffisamment faible pour l’imagerie dynamique. - Utilisez les boutons du logiciel pour sélectionner le volume à imager en tant que pile z
- Configurez un laps de temps toutes les 30 s pour la durée souhaitée.
REMARQUE: Pour les plaies stériles de la nageoire ventrale, le recrutement maximal est observé de 2 à 3 h. - Avant de lancer le time-lapse, prenez un instantané de champ lumineux pour documenter le champ de vision. Si possible, acquérez un champ lumineux dans le film time-lapse.
6. Quantification de l’internalisation des récepteurs chez les neutrophiles du poisson-zèbre
- Enregistrez l’intervalle de temps de l’acquisition de l’image et la taille en pixels de l’image. Gardez une trace du nombre de minutes après le début de l’imagerie après la blessure.
- Ouvrez les jeux de données d’images à l’aide de Fidji en faisant glisser l’image sur l’interface du logiciel, sélectionnez un cadre d’intérêt représentatif pour chaque jeu de données à l’aide du curseur temporel, par exemple 1 à 1,5 h après la blessure, et enregistrez-le.
- Continuez avec MATLAB pour traiter le jeu de données d’images.
- Créez un nouveau script et incluez des fonctions de lecture d’image (ligne 6 dans le script appelée « select_neutrophils.m » pour la définition centroïde dans le fichier supplémentaire 1), d’ouverture (ligne 11 dans le fichier supplémentaire 1) et de sélection manuelle des points sur l’image (ligne 12 dans le fichier supplémentaire 1).
- Ouvrez le cadre d’intérêt en exécutant ce script (fichier supplémentaire 1), identifiez les neutrophiles à analyser par inspection visuelle, cliquez dessus et enregistrez une estimation de leurs centroïdes, à la fois dans la plaie de la nageoire ventrale et dans le CHT.
NOTE: Les neutrophiles non mobilisés dans le CHT servent de référence interne pour les neutrophiles dont la distribution des récepteurs reste constante. Cela permet de normaliser les valeurs de contraste des cellules au niveau de la plaie à une référence interne. - Procéder à la segmentation des neutrophiles dans chaque cadre en utilisant la technique de contours actifs22 comme décrit dans les étapes ci-dessous.
- Créer une fonction pour inclure les métadonnées requises pour la segmentation par contours actifs (c.-à-d. nombre d’itérations, biais de contour, centroïde estimé, etc.) 22 (voir « données sur les plaies.m » dans le dossier supplémentaire 2).
- Créez un script qui appelle la fonction 'wound_data.m' pour saisir les informations nécessaires à la segmentation de chaque neutrophile (ligne 28 dans le script appelé 'calc_contrast.m' dans le fichier supplémentaire 3).
- Inclure dans le script des commandes pour la lecture d’images (ligne 32 dans le fichier supplémentaire 3).
- Ajoutez la génération d’une image noire (c’est-à-dire une image où les valeurs de pixels sont des zéros) de taille égale à l’image d’entrée (ligne 44 dans le fichier supplémentaire 3) et la définition d’un carré de 10 × 10 pixels autour du centroïde de chaque neutrophile (ligne 45 dans le fichier supplémentaire 3).
- Inclure la segmentation des neutrophiles à l’aide de contours actifs (lignes 48 à 49 dans le fichier supplémentaire 3) et la suppression des petits objets faussement détectés (ligne 52 dans le fichier supplémentaire 3).
REMARQUE: Le contour de segmentation initial est le carré autour du centroïde, qui évolue par la technique du contour actif en fonction de l’intensité des pixels, du nombre d’itérations et du biais du contour. Le résultat de la segmentation est un masque binaire où tous les pixels ont la valeur 0 à l’exception de la zone neutrophile dont les pixels ont la valeur 1. - Incluez la multiplication de l’image binaire segmentée avec l’image d’origine pour obtenir uniquement les intensités en pixels du neutrophile, le reste de l’image n’étant pas un nombre, de sorte qu’il ne contribue pas aux calculs (lignes 56-57 dans le fichier supplémentaire 3).
- Ajouter le calcul de la matrice de cooccurrence de niveau de gris pour chaque neutrophile (GLCM)14,23 (ligne 61 dans le fichier supplémentaire 3). GLCM est une autre représentation de l’image montrant la position relative des pixels en termes d’intensité des pixels.
- Inclure le calcul du contraste du neutrophile basé sur le GLCM (lignes 62,65 dans le dossier supplémentaire 3). La mesure de contraste mesure les différences d’intensité entre les pixels voisins. Les pixels sont comparés à des pixels distants d’une certaine distance, qui peuvent être ajustés empiriquement en fonction de la taille des pics d’intensité locaux. À titre indicatif, pour les images, avec une taille de pixel de 0,389 μm, lorsque le récepteur a montré une distribution vésiculaire, chaque point lumineux était de l’ordre de 5 pixels. Par conséquent, les intensités ont été comparées en pixels espacés de 5 pixels.
- Ajoutez des commandes pour enregistrer les valeurs séparément pour les neutrophiles individuels dans la nageoire ventrale (ligne 68 dans le fichier supplémentaire 3).
- Inclure le calcul de la valeur moyenne de contraste des neutrophiles pour tous les neutrophiles CHT de la même manière que pour les neutrophiles au niveau de la plaie (lignes 72 à 119 dans le dossier supplémentaire 3). Pour les neutrophiles CHT, appelez la fonction « cht_data.m » (ligne 77 dans le fichier supplémentaire 4).
- Inclure la normalisation de la valeur de contraste des neutrophiles individuels au niveau de la plaie par rapport au contraste moyen des neutrophiles CHT calculé ci-dessus à l’étape 6.16 (c.-à-d. division) (ligne 122 du dossier supplémentaire 3). Cela donne un contraste normalisé qui reflète à quel point l’apparence du récepteur est « pointilleuse » dans les cellules répondantes individuelles par rapport aux cellules témoins ne répondant pas (Figure 3 et Figure 4).
- Exécutez le script (fichier supplémentaire 3) en cliquant sur le symbole d’exécution dans le logiciel.
- Répétez toutes les étapes pour différentes conditions.
- Utilisez un logiciel statistique (voir Table des matériaux) pour importer les résultats pour les différentes conditions en créant un tableau de colonnes, en traçant les résultats et en effectuant un test statistique pour vérifier la signification de la différence entre les valeurs moyennes.
REMARQUE: Les codes pour l’analyse peuvent également être trouvés dans GitHub à https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. Tests de réponse à la chimiokine chez les embryons précoces
REMARQUE: Il s’agit d’une expérience secondaire facultative qui permet de tester les changements de distribution des récepteurs en réponse à une chimiokine candidate et est indépendante des expériences décrites ci-dessus concernant l’expression des neutrophiles des constructions du récepteur. Les différences dans le trafic induit par les ligands entre les récepteurs sont difficiles à établir avec cette technique car les niveaux de ligand saturent14. Cependant, si l’on voit l’internalisation d’un ligand d’un récepteur dans ce système, cela peut indiquer que le ligand est reconnu par le récepteur dans les cas où l’identité du ligand n’est pas claire. Ceci est utile, car l’expression des récepteurs de chimiokine dans les lignées cellulaires établies telles que les cellules HEK293T14 peut être lourde.
- Installez un croisement de poissons de type sauvage (p. ex., AB) et ramassez les œufs le lendemain matin peu après avoir soulevé les séparateurs (comme décrit ci-dessus).
- Injecter 100 pg d’ARNm récepteur marqué par fluorescence (p. ex., Cxcr1-FT), ainsi que 100 pg d’ARNm pour un marqueur membranaire (p. ex., CFP membranaire). Inclure dans le mélange des doses variables d’ARNm pour le ligand de chimiokine.
REMARQUE: À titre indicatif, l’ARNm Cxcl8a de 150 pg a donné une internalisation importante du Cxcr1-FT fluorescent (voir la figure 5). - Rincer les embryons avec un milieu E3 et incuber à 28°C.
- À environ 7 hpf, testez l’expression de l’ARNm sur une lunette de dissection fluorescente et sélectionnez les embryons à imager.
- Préparer à l’avance 0,8 % d’agarose LMP et conserver dans un tube de verre dans un bloc chauffant à 60 °C. Utilisez une pipette en verre pour manipuler les embryons. Décoroisonnez doucement les embryons à l’aide d’une pince dans chaque main.
- Aspirer un embryon individuel décchorioné avec la pipette en verre en s’assurant qu’aucune bulle n’est à l’extrémité. Relâchez doucement l’embryon dans le tube d’agarose, ce qui lui permet de s’enfoncer dans le tube.
- Aspirer l’embryon du tube d’agarose, en recueillant de l’agarose liquide en cours de route. Relâchez doucement l’embryon sur le centre d’une boîte d’imagerie à fond de verre. Faire pivoter rapidement l’embryon de sorte que le pôle animal soit orienté vers le bas du plat (ce côté doit être le plus proche de l’objectif lors de l’utilisation d’un microscope inversé).
REMARQUE: Il peut être nécessaire de réajuster l’orientation des embryons pendant que l’agarose est encore en train de se fixer. - Une fois l’agarose réglée, complétez avec 2 mL de milieu E3.
NOTE: Les embryons à ce stade sont très fragiles par rapport aux larves et il faut un peu de pratique pour décchorioner et monter. Il est important d’aspirer et de libérer le plus doucement possible, pour éviter la rupture de l’embryon. - Répétez le processus visant à charger 3 à 5 embryons par plat.
- Imagez des embryons sur un microscope confocal inversé (voir Tableau des matériaux). Utilisez un objectif d’huile 40x/1,3 NA pour obtenir une résolution suffisamment élevée. Visualisez mCFP, sfGFP et tagRFP avec 405, 488 et 552 nm, respectivement, sur l’étendue. Ajustez les filtres et les paramètres pour avoir un contraste élevé tout en évitant la saturation et en minimisant les fuites entre les canaux.
- Répétez le montage et l’imagerie pour différentes conditions.
Representative Results
La blessure de la nageoire ventrale est suivie d’une mobilisation rapide des neutrophiles du TCS dans la nageoire ventrale et d’un regroupement à la marge de la plaie, dans les 30 à 60 minutes (Figure 1). Nous avons visualisé la distribution de deux récepteurs de chimiokine, Cxcr1 et Cxcr2, qui sont exprimés par les neutrophiles de poisson zèbre24 et reconnaissent Cxcl8a et Cxcl8b14, en utilisant la microscopie confocale à disque rotatif. Nous avons généré deux lignées transgéniques correspondantes, Tg(lyz:Cxcr1-FT) et Tg(lyz:Cxcr2-FT), dans lesquelles les neutrophiles expriment une construction de minuterie fluorescente (FT) du récepteur, c’est-à-dire une fusion avec un tandem de sfGFP et de tagRFP (Figure 2 et référence14). L’utilisation des deux fluorophores visait à permettre la surveillance d’un large éventail de devenirs de récepteurs et à fournir des estimations du temps de renouvellement des protéines au niveau de la membrane plasmique, car les récepteurs nouvellement synthétisés se fluorescenceaient en vert et deviendraient progressivement rouges à mesure qu’ils vieillissaientà l’âge de 8,14 ans. Cependant, il a été constaté que ces récepteurs avaient un renouvellement constitutif rapide au niveau de la membrane plasmique neutrophile et que le temps de séjour était plus court que le temps de maturation du tagRFP, le sfGFP montrant la localisation de la membrane et le tagRFP montrant la localisation vésiculeuse à l’état d’équilibre (vidéo supplémentaire 1 et réf14). Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur la distribution de sfGFP pour surveiller l’internalisation induite par les ligands sur les sites de lésions tissulaires. Le modèle de distribution des récepteurs a été quantifié à l’aide de la métrique de contraste, qui rapporte des différences d’intensité entre les pixels voisins. La raison en est que lorsque la distribution du récepteur est membraneuse et lisse, la valeur de contraste est faible. Lorsque la distribution du récepteur est vésiculeuse et plus ponctuée, la valeur de contraste est élevée (Figure 3).
Une autre méthode consiste à quantifier le rapport entre les niveaux de récepteurs (intensité sfGFP) et les niveaux d’un marqueur de membrane de contrôle, par exemple la CFP membranaire (mCFP) (Figure 3). Les deux méthodes pourraient détecter l’internalisation des récepteurs, comme l’indiquent un schéma de distribution plus vésiculeux des récepteurs à l’échelle mondiale dans la cellule (valeur de contraste plus élevée) ou des niveaux de récepteurs plus faibles au niveau de la membrane (rapport sfGFP/mCFP plus faible). Cependant, la mesure de contraste pouvait également détecter l’internalisation des récepteurs dans les grappes de neutrophiles au niveau de la plaie, dans lesquelles la segmentation membranaire était moins précise et non applicable (figure 3). À l’aide de cette mesure, nous avons pu quantifier les différences visibles entre le trafic de neutrophiles Cxcr1 et Cxcr2 au niveau des plaies (figure 4 et vidéo supplémentaire 2). Cxcr1-FT internalisé dans les cellules situées au niveau de la plaie tandis que Cxcr2-FT est resté membraneux dans les neutrophiles au niveau de la plaie (Figure 4A-C, Vidéo supplémentaire 2 et Vidéo supplémentaire 3). La suppression de Cxcl8a et Cxcl8b, par traitement morpholino, a affecté différemment l’internalisation de Cxcr1-FT au niveau des plaies (Figure 4C,D). Pour valider davantage que Cxcr1-FT répond à Cxcl8a, nous avons effectué des tests de réponse à la chimiokine chez les embryons précoces. Nous avons constaté que Cxcr1-FT était nettement internalisé chez les embryons chez lesquels Cxcl8a était co-exprimé (Figure 5). Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que les méthodes décrites peuvent être déployées pour mesurer l’internalisation des récepteurs induite par la chimiokine chez les neutrophiles et établir l’identité du ligand médiant ces effets.
Figure 1 : Migration des neutrophiles vers les plaies de la nageoire ventrale. (A) (À gauche) Caricature de 3 larves de dpf montrant l’emplacement du tissu hématopoïétique caudal (CHT), la circulation vénusienne (VC, bleu), la nageoire ventrale (VF) et le site de la plaie. (À droite) Dessin animé représentant la zone de la plaie (W) avec des neutrophiles mobilisés du CHT et se regroupant sur la plaie. Le plexus de la veine caudale (CVP) du tissu CHT est dessiné en bleu. (B) Image en champ lumineux (à gauche) et projection confocale (à droite) montrant la plaie de la nageoire ventrale et la distribution des neutrophiles chez les larves de Tg(mpx:GFP) 2 h après la blessure. Les lignes pointillées montrent les contours VF et CHT. Barre d’échelle = 25 μm. Dessin animé et image fluorescente modifié à partir de la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Imagerie en direct du trafic des récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles. (A) Constructions utilisées pour l’expression transgénique spécifique aux neutrophiles de Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) et Cxcr2-FT. Projections confocales de neutrophiles dans la tête d’une larve transgénique de 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), en haut; Tg(lyz:Cxcr2-FT), en bas) montrant les canaux tRFP (magenta) et sfGFP (vert). Barre d’échelle = 20 μm. (B) Schéma anatomique de 3 larves de dpf comme dans la figure 1A. Sous la larve se trouvent des schémas représentant la zone de la plaie (W) avec des neutrophiles mobilisés à partir du CHT (en haut) ou effectuant une chimiotaxie à l’entrée de la nageoire ventrale (en bas). Le carré pointillé indique la zone imagée dans les instantanés à droite. (C) Neutrophiles chez les larves de Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP est montré) lors de la mobilisation du CHT (panneaux supérieurs) ou de la chimiotaxie vers la plaie (panneaux inférieurs). Les flèches montrent les mêmes cellules au fil du temps. Les points de temps sur l’image de droite sont des minutes écoulées après l’image de gauche. Barre d’échelle = 10 μm. (D) Représentation schématique de l’approche expérimentale pour l’imagerie en direct du trafic des récepteurs de chimiokine. Panneaux A-C modifiés par rapport à la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Exemples de quantification de la dynamique des récepteurs. Des neutrophiles simples (bleus) ou groupés (verts) au niveau des plaies ou des neutrophiles non mobilisés dans le TCS (rouge, orange) ont été segmentés et analysés par différentes méthodes pour comparer les résultats. Les mêmes exemples de cellules ont été analysés avec deux méthodes pour relier ce qui est vu dans l’image avec la plage de valeurs extraites. (A) La surface des exemples de cellules sélectionnés a été segmentée en fonction de la définition du contour dans le canal sfGFP. (B) Le contraste a été calculé à partir des cellules d’exemple montrées dans A. (C) La membrane des cellules d’exemple sélectionnées a été segmentée en fonction de la définition de contour dans le canal CFP. L’analyse ratiométrique de la SFFP/PCP a suivi. (D) Le rapport sfGFP/CFP a été calculé sur les exemples de cellules présentés dans C. Les barres d’erreur représentent S.E.M. à partir de cellules individuelles, dans les cas de n>1, les valeurs ici n’ont pas été utilisées pour l’analyse statistique mais simplement pour illustrer les mesures obtenues avec les différentes méthodes de quantification. Barre d’échelle = 10 μm. Figure modifiée par rapport à la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Dynamique différentielle de Cxcr1 et Cxcr2 en réponse à la blessure. (A) Projection confocale de neutrophiles chez les larves de Tg(lyz:Cxcr1-FT) ou de Tg(lyz:Cxcr2-FT) au niveau de la plaie à 80 min après la blessure (canal sfGFP montré). Barre d’échelle = 10 μm. (B) Neutrophile Cxcr1-FT agrandi (à gauche) et Cxcr2-FT (à droite) au niveau de la plaie. Le récepteur vert est représenté en gris. Barre d’échelle = 5 μm. (C) Contraste normalisé (contraste par neutrophile individuel normalisé au contraste moyen des cellules non mobilisées dans le CHT). cxcl8a fait référence à l’injection d’un bloqueur d’épissure avec un morpholino bloquant la traduction pour cxcl8a. cxcl8b fait référence à l’injection avec un morpholino bloquant l’épissure pour cxcl8b. Pour Tg(lyz:Cxcr1-FT) : n=24 cellules (CHT), n=47 cellules (plaie) de 8 larves. Pour Tg(lyz:Cxcr1-FT) avec morpholinos : n=28 cellules (Cxcl8a-MO) de 5 larves, n=16 cellules (Cxcl8b-MO) de 5 larves. Pour Tg(lyz:Cxcr2-FT) : n=10 cellules (CHT) et n=20 cellules (plaie) de 3 larves. Les données ont été regroupées à partir de larves indépendantes acquises au cours de 1 à 5 séances d’imagerie. Test kruskal-Wallis avec le test de comparaisons multiples de Dunn pour Tg(lyz:Cxcr1-FT), test mann-Whitney non apparié à deux queues pour Tg(lyz:Cxcr2-FT). (D) Projection confocale de neutrophiles chez des larves transgéniques Tg(lyz:Cxcr1-FT) traitées avec cxcl8a morpholino (MO) (à gauche) et cxcl8b MO (à droite) répondant à des plaies à nageoires (canal sfGFP en vert). Instantané pris à des moments d’accumulation équivalente de neutrophiles (85 min post-blessure dans l’image de gauche et 45 min de post-blessure dans l’image de droite). Barre d’échelle = 10 μm. Figure modifiée par rapport à la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Test de réponse à la chimiokine chez les embryons précoces. Des tranches confocales à balayage laser d’embryons gazogènes montrant l’expression et la distribution de Cxcr1-FT. 100 pg d’ARNm Cxcr1-FT ont été injectés dans des ovules au stade cellulaire avec ou sans ARNm Cxcl8a de 150 pg. Les récepteurs verts et rouges sont montrés dans des canaux séparés. Le marqueur CFP de la membrane de contrôle (mCFP) est représenté dans le canal cyan. Barre d’échelle = 20 μm. Figure modifiée par rapport à la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film supplémentaire 1: Neutrophiles transgéniques dans la tête d’une larve Tg(lyz:Cxcr1-FT) (à gauche) et Tg(lyz:Cxcr2-FT) (à droite) à 3 dpf. sfGFP(vert), tagRFP (magenta). L’intervalle d’images est de 30 secondes et la fréquence d’images est de 5 ips. Barre d’échelle = 20 μm. La vidéo provient de la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Film supplémentaire 2: Neutrophiles chez les larves transgéniques Tg(lyz:Cxcr1-FT) (à gauche) et Tg(lyz:Cxcr2-FT) (à droite) répondant aux plaies des nageoires. Le film commence dans les 10 minutes suivant la blessure et dure 60 min. sfGFP (vert), tagRFP (magenta). L’intervalle d’images est de 30 secondes et la fréquence d’images est de 10 ips. CHT = tissu hématopoïétique caudal. VF = nageoire ventrale. Barre d’échelle = 25 μm. La vidéo provient de la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Film supplémentaire 3. Exemples supplémentaires de neutrophiles provenant d’une larve transgénique Tg(lyz:Cxcr1-FT) blessée (larve différente de celle montrée dans la vidéo 2), acquise à une résolution plus élevée, montrant l’internalisation du récepteur (canal sfGFP en vert) lors de la mobilisation dans le CHT ou à l’entrée et la chimiotaxie dans la nageoire ventrale. L’intervalle d’images est de 30 secondes et la fréquence d’images est de 2 ips. Barre d’échelle = 10 μm. La vidéo provient de la réf.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
La méthode décrite permet l’imagerie en direct de la dynamique des récepteurs en réponse à des ligands endogènes in situ lors d’une réponse inflammatoire à des lésions tissulaires. L’utilisation de rapporteurs de neutrophiles Cxcr1/Cxcr2 pourrait être étendue à d’autres contextes physiologiques, tels que les infections, les modèles tumoraux ou d’autres types de lésions tissulaires 14,25,26,27. En outre, les lignes de sauvetage transgéniques, dans lesquelles le récepteur endogène est supprimé et sauvé par un récepteur mutant exogène, pourraient fournir des outils utiles pour disséquer l’importance de schémas de migration de neutrophiles spécifiques dans les réponses immunitaires. Par exemple, les mutants du récepteur Cxcr1 qui ont une désensibilisation altérée provoquent un regroupement plus important des neutrophiles aux sites inflammatoires14. Ce gain de phénotype fonctionnel pourrait être utilisé pour comprendre le rôle de la congrégation des neutrophiles dans différents processus physiologiques, par exemple la réparation des plaies, les maladies infectieuses ou l’évolution tumorale, et compléter les expériences de destruction / élimination des récepteurs. La méthodologie fournit également une base pour élargir l’éventail des déclarants disponibles. Le choix du rapporteur fluorescent est important à considérer et dépend de la question biologique. Nous avons constaté que le renouvellement constitutif de ces récepteurs de chimiokine dans les neutrophiles était élevé, par rapport aux cellules épithéliales, et que les rapporteurs à maturation rapide (par exemple, sfGFP) étaient tenus de signaler les niveaux membranaires à l’état d’équilibre et de résoudre les différences lors de la stimulation des neutrophiles 8,14. Ainsi, les rapports membranaires de sfGFP/tagRFP ne sont pas applicables pour mesurer l’internalisation induite par les ligands dans ce type de cellule, mais le modèle de tagRFP permet de suivre le destin intracellulaire du récepteur, ce qui pourrait être utile dans certaines études. Nous avons également constaté que le signal intracellulaire plus concentré de tagRFP est utile pour le dépistage des larves individuelles. Une autre approche pour mesurer les niveaux de récepteurs au niveau de la membrane plasmique consisterait à co-exprimer un marqueur de membrane fluorescente dans les neutrophiles soit dans le même transgène9, soit dans un transgèneindépendant 14. Dans le premier scénario, le transgène fournirait un moyen supplémentaire de criblage des poissons et les niveaux d’expression seraient comparables entre le marqueur et le récepteur. Cette dernière approche serait plus modulaire, en ce sens qu’une ligne de poisson-zèbre avec un rapporteur de récepteur pourrait être combinée avec différentes lignes de rapporteur. Dans les deux cas, il convient de noter que la quantification membranaire des niveaux de récepteurs est difficile chez les neutrophiles groupés (voir ci-dessous). Enfin, nous notons qu’une extension possible de ce protocole serait de suivre l’imagerie en direct par immunohistochimie pour des analyses de localisation plus détaillées.
Le système de transgénèse Tol2 est bien établi7 et le promoteur du lysozyme C a été largement utilisé pour l’expression des neutrophiles11,15. L’approche de la transgénèse est donc relativement simple et le niveau d’expression atteint avec ce promoteur est suffisamment élevé pour fournir un contraste suffisant pour l’analyse de la dynamique des récepteurs. Une limitation possible est que le niveau d’expression ne récapitule pas les niveaux d’expression des récepteurs endogènes. De nouvelles technologies CRISPR pourraient être déployées pour établir des lignes d’inction pour les récepteurs présentant un intérêt particulier28. Ces technologies sont encore lourdes et ne garantissent peut-être pas les niveaux d’expression requis pour l’imagerie subcellulaire, mais leur développement réussi serait une percée importante pour la compréhension de la dynamique de signalisation endogène. Les validations fonctionnelles sont importantes pour interpréter les données avec des constructions de récepteurs transgéniques. Par exemple, les tests de reconnaissance de ligand peuvent être utilisés pour établir que la protéine de fusion fluorescente est fonctionnelle et le sauvetage des phénotypes knockout pourrait être utilisé pour établir que les niveaux d’expression des neutrophiles transgéniques sont compatibles avec la fonctionnalité14. Enfin, un moyen plus direct de valider la fusion des récepteurs serait d’utiliser un test fonctionnel in vitro avec un récepteur marqué aux côtés des versions non marquées14.
L’approche de quantification aborde des difficultés spécifiques dans la segmentation précise de la membrane chez les neutrophiles in vivo. Dans les cellules de nature épithéliale, la quantification des niveaux de récepteurs peut être effectuée automatiquement en normalisant les niveaux de récepteurs membranaires en un marqueur de contrôle, qui peut être exprimé en tandem ou séparément9. En effet, nous avons appliqué une telle approche, lors de l’utilisation du test de reconnaissance de ligand dans des embryons gastrulés14. Cependant, les neutrophiles subissent des changements complexes et rapides dans la forme cellulaire in vivo, ce qui rend la segmentation membranaire difficile à la fois en 2D et en 3D14. Ceci est encore plus difficile lorsque les neutrophiles se regroupent, ce qui se produit dans de nombreux contextes physiologiques29. La mesure de contraste surmonte cette limitation car elle ne nécessite pas de segmentation membranaire mais reflète plutôt l’état global de la distribution des récepteurs dans la cellule (membraneuse / lisse vs vésiculeuse / pointilleuse). Il est important de noter que la mesure du contraste peut être affectée par le contraste global de l’image, de sorte que la normalisation des valeurs cellulaires individuelles à une référence interne est nécessaire pour tenir compte de la variabilité du signal dans différents embryons / échantillons. Par exemple, nous avons utilisé la valeur moyenne de contraste cellulaire des neutrophiles non réactifs dans le CHT (c.-à-d. les neutrophiles qui restent stationnaires et ne migrent pas dans la nageoire ventrale)14. Une possibilité supplémentaire serait de normaliser avec les valeurs de contraste d’un marqueur de contrôle dans la même cellule. Cela fournirait une solution lorsqu’une référence interne de cellules non répondantes n’est pas disponible et pourrait probablement résoudre des différences quantitatives plus fines dans la dynamique des récepteurs entre différentes conditions.
L’emplacement de l’imagerie est une autre variable à considérer. La raison du choix de la plaie de la nageoire ventrale ici, par opposition au modèle16,30 de la plaie de la nageoire caudale plus couramment utilisé, est que le site de la blessure est à proximité du site de résidence des neutrophiles / origine migratoire. Cela accélère la chronologie du test, car il faut relativement peu de temps pour que les neutrophiles arrivent. En outre, il offre la possibilité de capturer le comportement des cellules à la fois à l’origine de la migration (CHT) et à l’emplacement cible d’intérêt (plaie). Ceci est pertinent ici, car la résolution spatiale et temporelle requise pour l’imagerie subcellulaire est difficile à combiner avec un grand champ de vision ou un balayage multi-positions. Ainsi, le test de la plaie de la nageoire ventrale permet de suivre l’évolution de la réponse migratoire à partir de l’origine de la migration et de capturer simultanément les fluctuations non spécifiques des récepteurs dans les cellules qui ne répondent pas. Comme mentionné ci-dessus, ce dernier est utile à des fins de quantification car il fournit une référence interne pour les dynamiques non spécifiques. Dans d’autres systèmes, il peut ne pas être possible d’avoir une telle référence interne, auquel cas les valeurs de contraste d’un marqueur membranaire co-exprimé fourniraient un autre contrôle.
En résumé, nous prévoyons que la méthodologie est applicable à d’autres systèmes et peut être déployée à diverses fins. Par exemple, les mêmes rapporteurs pourraient être utilisés dans d’autres contextes inflammatoires, tels que les contextes d’infection ou d’autres modèles de maladie. Le répertoire des lignes rapporteures des récepteurs du poisson-zèbre pourrait être étendu à d’autres récepteurs de signalisation, afin de comprendre les mécanismes de signalisation ou de rapporter la dynamique des ligands in vivo. L’approche peut être combinée avec des techniques knockdown/knockout pour interroger la base mécaniste de la dynamique observée. Par exemple, la perturbation de l’expression du ligand peut indiquer la dépendance du ligand pour la dynamique des récepteurs observée. À l’avenir, nous envisageons que le système pourrait être encore affiné pour intégrer l’insertion directe de journalistes. En fin de compte, les résultats utilisant cette méthodologie fourniraient de nouvelles informations précieuses au-delà de la communauté des poissons-zèbres, compte tenu de la conservation de ces récepteurs de signalisation chez les mammifères et du défi relatif de mener ces études dans des organismes plus grands.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts
Acknowledgments
Nous remercions Christine Holt et Bill Harris pour leur aide en microscopie confocale. Nous remercions Darren Gilmour pour les constructions de l’épine dorsale de la minuterie fluorescente et Anna Huttenlocher pour le vecteur de l’épine dorsale Tol2-Lyz. Nous remercions Steve Renshaw pour la ligne Tg(mpx:GFP)i114 . Ce travail a été soutenu par le MRC (MR/L019523/1), le Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] et une subvention Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. a été soutenu par une bourse d’études mrc DTP et en partie par le Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] subvention. H.W. a été soutenu par une bourse d’études mrc pao. H.P. a été soutenu par une bourse de doctorat Wellcome Trust (105391/Z/14/Z) et en partie par un Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] et la MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
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