Summary
Her beskriver vi protokoller for å utføre levende avbildning og kvantitativ analyse av kjemoattractant reseptordynamikk i sebrafisk nøytrofiler
Abstract
Leukocyttveiledning ved kjemiske gradienter er avgjørende for immunresponser. Nøytrofiler er de første cellene som rekrutteres til steder med vevsskade der de utfører viktige antimikrobielle funksjoner. Deres handel til disse loci er orkestrert av flere inflammatoriske kjemoattractants, inkludert kjemokiner. På molekylært nivå reguleres kjemoattractantsignalering av intracellulær smugling av de tilsvarende reseptorene. Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan subcellulære endringer i kjemokinreseptorer påvirker leukocyttmigrasjonsdynamikken på celle- og vevsnivå. Her beskriver vi en metodikk for levende avbildning og kvantitativ analyse av kjemokinreseptordynamikk i nøytrofiler under inflammatoriske responser på vevsskade. Disse verktøyene har avslørt at differensial kjemokinreseptorhandel i sebrafisk nøytrofiler koordinerer nøytrofilklynge og spredning på steder med vevsskade. Dette har implikasjoner for vår forståelse av hvordan inflammatoriske responser er selvavklart. De beskrevne verktøyene kan brukes til å forstå nøytrofil migrasjonsmønstre i en rekke fysiologiske og patologiske omgivelser, og metodikken kan utvides til andre signalreseptorer.
Introduction
Leukocyttmigrasjon er av avgjørende betydning for immunresponser. Immunceller er prototypiske trekkceller, som er bemerkelsesverdig i stand til å krysse vev og blodkar og registrere en rekke kjemiske veiledningssignaler for å migrere retningsmessig mot mikrober eller andre vertsceller av betydning. Korrekt veiledning er avhengig av anerkjennelse av kjemoattractants, blant annet kjemokiner representerer den mest fremtredende kategori1. Kjemokiner er anerkjent av svært spesifikke syv-transmembrane G proteinkoblede reseptorer. Ved kjemokinbinding endrer kjemokinreseptorer konformasjon som fører til aktivering av tilhørende trimeriske G-proteiner og deres dissosiasjon til funksjonelle signalunderenheter som fremmer cytoskeletale endringer og rettet migrasjon1. For det andre er kjemokinreseptorer fosforilert, og denne modifikasjonen fører til desensibilisering til tiltrekkende, som kan etterfølges av rask re-sensibilisering / resirkulering eller intracellulær nedbrytning og nedregulering fra celleoverflaten2. Disse reseptordynamikkene påvirker varigheten og dosen av signalering mottatt av cellene, men hvordan de påvirker leukocyttmigrasjonsadferd har vært vanskelig å belyse in vivo.
Sporing av reseptordynamikk i levende leukocytter i tradisjonelle pattedyrsystemer står overfor flere utfordringer. For levende studier må reseptorfusjoner med fluorescerende proteiner uttrykkes i cellene. Dette er utfordrende i primære leukocytter, spesielt i nøytrofiler, og studier så langt har brukt surrogat nøytrofile cellelinjer for å uttrykke kjemokinreseptorer 3,4. Generering av transgene musemodeller, der leukocytter uttrykker en fluorescerende reseptor eller mutantreseptorer med informative trafficking defekter 5,6, innebærer betydelig investering av tid og ressurser. Selv i disse tilfellene kan bildeoppløsningen og kontrasten for avbildningsreseptordynamikk i det levende dyret begrenses, og studier har brukt immunhiistokjemi på fast vevsseksjon5. Gitt disse tekniske utfordringene, er vår forståelse av hvordan kjemoattractant reseptordynamikk påvirker celleadferd i en levende vevsinnstilling for tiden begrenset.
Her tilbyr vi en metodikk for å overvåke reseptorhandel i sebrafisk nøytrofiler. Sebrafisk er genetisk gjennomførbare, som mus, men transgenese er relativt enklere ved bruk av effektive transposonsystemer og direkte zygotemanipulering7. Den gjennomsiktige larven er ideelt egnet til avbildning. Kjemokinreseptordynamikken har blitt visualisert i primordiale bakterieceller og sidelinjen primordium ved uttrykk for tilsvarende fusjoner med fluorescerende reportere 8,9,10. Sebrafisk larver er utstyrt med modne nøytrofiler som har høyt bevarte genetiske og cellulære egenskaper med hensyn til pattedyr nøytrofiler. Subcellulær signaldynamikk som cytoskeletal dynamikk og polaritetsregulatorer har blitt visualisert i disse cellene ved generering av tilsvarende transgene linjer 11,12,13. Nylig visualiserte og funksjonelt analyserte vi kjemokinreseptordynamikk i nøytrofiler i løpet av inflammatoriske responser på vevsskade14. Her beskriver vi genereringen av transgene reporterlinjer for kjemokinsignalering i nøytrofiler, fremstilling av embryoer for levende avbildning, en såranalyse for å studere nøytrofilsignalering og protokollen for oppkjøp og analyse av bilder. Vi tilbyr også en sideprotokoll for å teste kjemokinreseptorresponser på kandidatliginer, noe som er nyttig når du prøver å etablere ligandgjenkjenningsmønstre i ukarakteriserte reseptorer. Disse teknikkene kan brukes i kombinasjon med ytterligere genetiske manipulasjoner, for eksempel hemming av endogene kjemokinuttrykk eller generering av mutante reseptorer med endret ligandindusert menneskehandel, for å forhøre hvordan spesifikk signaldynamikk påvirker leukocytt atferd in vivo. De transgene linjene som uttrykker fluorescerende taggede kjemokinreseptorer kan også brukes som reportere for endogene kjemokingradienter, som ellers er vanskelige å oppdage ved direkte antistofffarging. Den beskrevne metodikken gir rom for å utvide genereringen av reportere til andre immunsignalerende reseptorer.
Protocol
MERK: All sebrafisk ble holdt i henhold til ARRIVE-retningslinjene og UK Home Office-forskriftene, UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Generasjon av transgene reporter sebrafisk larver for avbildning reseptorhandel i leukocytter
- Generer Tol2-basert konstruksjon for vevsspesifikk uttrykk for den fluorescerende taggede reseptoren av interesse. For nøytrofiler, bruk promotorsekvenser fra lysozym C15 og myeloperoxidase gen16. Konstruksjonen kan utformes som en fusjon med et enkelt fluorescerende protein (f.eks. GFP), en tandem fluorescerende timer (f.eks. en raskt sammenleggbar GFP og en langsommere modningsmerkeRFP 8,14,17) eller et todelt uttrykk for reporter GFP og en kontrollmembranmarkør9 (se Diskusjon for hensyn når du velger tilnærming).
MERK: Denne konstruksjonen rekapitulerer ikke endogene nivåer av reseptoruttrykk, men er nyttig for å oppnå høyt nivå av reseptoruttrykk i celletypen av interesse. Se litteraturen om lignende reseptorer 3,5,6,8,9,10,14 for å bestemme plasseringen av fluorescerende tag. - Sett opp en tank som inneholder vill type voksne menn og kvinner etter standard husdyrholdpraksis 18, skilt av en barriere dagen før egg gyting.
- På dagen for egggyting, lag transgeneseblanding for mikroinjeksjon som inneholder 12,5 ng/μL Tol2 DNA-konstruksjon og 17,5 ng/μL transposase mRNA7. Løft barrierer fra fisketanker kort tid etter at lysene kommer om morgenen (dette kan variere i forskjellige fiskeanlegg) og samle egg innen 15 min for mRNA-injeksjon.
MERK: Sørg for at DNA-løsningen er RNase fri for å unngå nedbrytning av transposase mRNA i blandingen. Et alternativ for å omgå dette er å injisere egg med separate løsninger av Tol2 konstruksjon og transposase. - Følg standardprotokoller for transgenese og mikroinjeksjon av sebrafiskegg19.
- Injiser 1 nL av løsningen i cellen av encellede embryoer.
MERK: Uttrykksresultatene er mer konsistente når du injiserer inne i cellen og kaster injeksjonene som kanskje ikke er tydelig inne i cellen. Encellede embryoer er rettet mot på grunn av variasjonen av voluminjeksjon per celle ved injeksjon av 2-16 cellestadium embryoer. Et alternativ ville være å skille encellede injeksjoner fra partier med senere injeksjoner, i tilfelle disse har forskjellige effekter. - Kontroller de injiserte embryoene senere på dagen og fjern unfertilized eller døde egg for å holde koblingen sunn.
- Ved 3 dager etter befruktning (dpf), skjerm larver under et fluorescerende mikroskop. Markøren vil være synlig i nøytrofiler, spesielt i kaudal hematopoietisk vev (CHT), som er rik på disse cellene.
MERK: Andelen celler merket varierer med forskjellige konstruksjoner, men vanligvis forventes 20-60% av nøytrofiler å uttrykke konstruksjonen. Lavere prosenter forutsier vanligvis mer screening på voksenstadiet. Det er en god praksis å også verifisere riktig lokalisering av reseptoren ved membranen, med en høyere oppløsningsavbildningstilnærming, i en prøve av disse embryoene før du vokser fisken. - Vokse positive larver etter standard husdyrhold praksis20. Disse representerer F0-generasjonen.
- Ved 3 måneders alder, skjerm F0 fisk for grunnleggere. Kryss individuell fisk med en ikke-transgen vill type og screen deres avkom på 3 dpf for uttrykket av reseptoren ved å se under dissekeringsområdet. Avhengig av transgenesesuksessen, som varierer med hver konstruksjon, observere en prosentandel av positive avkom i en undergruppe av kryssene.
MERK: For god transgenese vil omtrent en tredjedel til en halv av voksne gi positive avkom. Prosentandelen av avkom som er positiv i en kobling, varierer med kopinummeret av transgenes satt inn og kan være mellom 10-60%. Det er nyttig å holde oversikt over mendeliske forhold i koblingene for å identifisere enkeltinnsetting transgenics (disse er lettere identifisert i F2 clutcher ved å lete etter et 50% forhold mellom positive larver)20. - Vokse de positive avkomene, som representerer F1-generasjonen.
- Ved 3 måneders alder, skjerm F1 voksne på samme måte for å etablere stabil F2 transgen linje.
- Utfør eksperimenter på F2 larver etter validering av det nøytrofile uttrykket til transgene.
MERK: Under transgenesen kan man observere forskjellige nivåer av reseptoruttrykk, og det anbefales å holde forskjellige transgene clutcher for å oppnå det mest hensiktsmessige uttrykksnivået for de biologiske spørsmålene. Innledende resultater kan oppnås i F0 eller F1 larver.
2. Innsamling av sebrafiskembryoer for å vurdere leukocyttsårresponser
- Etter å ha etablert en stabil transgen reporterlinje, sett opp en krysning mellom voksen og kvinnelig transgen fisk og samle egg neste morgen.
- Dyrk embryoer ved 28,5 °C i E3-mediet (eller eggvannet18).
- Eventuelt, ved 24 hkf, inkuberer embryoer i et sentrifugerør som inneholder 50 ml E3-medium supplert med 0,003% blekemiddel i 5 minutter. Skyll deretter 3 ganger i E3-mediet ved å la røret stå i et par minutter for å la embryoene slå seg ned i bunnen og deretter dekantere og erstatte mediet.
MERK: Dette gir et nivå av kontroll på larvens infeksjonseksponering, noe som kan påvirke leukocyttenes oppførsel under såring. - Etter bleking, hold embryoer i E3 medium supplert med 0,003% av 1-fenyl-2-thiourea for å forhindre melaninsyntese. Metylenblå, som ofte brukes til å forhindre soppinfeksjoner, legges ikke til her, for å minimere vevs autofluorescens.
- La larver klekke naturlig og bruk ved 3 dpf når nøytrofiler er rikelig21.
3. Ventral fin såring av larver
- Forbered larver for såring. Bruk larver ved 2,5-3,5 dpf, når rikelig nøytrofiler observeres. Overfør larver til E3 medium supplert med 160-200 mg / L trikain MS222.
MERK: Konsentrerte løsninger av trikain bør tilberedes og fryses i aliquots på forhånd og tines på dagen. - La larvene ligge i E3+trikainmedium i 15 minutter for å sikre at de blir bedøvet. Kontroller svarene ved å berøre forsiktig med en liten pensel eller lignende verktøy.
- Velg larver med transgen reseptoruttrykk under et fluorescerende dissekeringsomfang.
- Overfør larver til en 120 mm Petri-tallerken i E3 + trikain for såring. Ved hjelp av en steril skalpell kutt larvens ventrale fin, mens du observerer under dissekeringsområdet (figur 1).
MERK: Tanken er å utføre et dypt nok kutt til å forårsake betydelig nøytrofilrekruttering, men uten å kutte fartøyene til CHT. Kuttet er gjort vinkelrett på CHT-aksen slik at snittet nesten når CHT-fartøyene. Dette tar litt øvelse og bør først utføres med tilsyn på larver som ikke genereres for dette formålet (f.eks. overflødige larver fra et annet eksperiment).
4. Forberedelse av larver for levende avbildning
- Løs opp lavt smeltepunkt (LMP) i E3 medium ved oppvarming for å oppnå en flytende 2% agarose løsning.
- La denne oppløsningen avkjøles ned til 60 °C.
MERK: Oppbevar en kolbe eller et rør med agarose i en inkubator ved 60 °C for å unngå agarose-innstillingen mellom montering av forskjellige larver. - Pipette 0,5 ml av den flytende LMP + E3 i en glassbunnfat for mikroskopiavbildning.
- Pipette en såret, bedøvet sebrafisk larve sammen med 0,5 ml E3 + 2x Tricaine i glassbunnsfatet.
- Bland forsiktig de to løsningene for å oppnå en 1% LMP / 1x Tricaine agarose / E3-løsning, og unngå generering av bobler. Orienter embryoet sidelengs og skyv forsiktig ned slik at den kaudale delen av fisken er så nær glasset som mulig.
MERK: Vevet som skal avbildes må være så nært glassbunnen som mulig ved avbildning med et invertert mikroskop. Innstillingen av orientering for larven må være rask slik at agarose ikke setter før larven er plassert. - La agaroseløsningen avkjøles og størkne i 5-10 min. Test om agarose er satt ved å forsiktig berøre agarose gel med en liten pensel eller spiss.
- Når agarose er solid, tilsett 2 ml E3 supplert med 0,2 mg/ml trikain til bildeplaten.
5. Levende konfektavbildning
MERK: Bildeembryoer på et roterende diskkonfokalt mikroskop eller tilsvarende (figur 2). Et laserskanningsmikroskop kan også brukes, men den tidsmessige oppløsningen til dynamikken vil være mer begrensende. Forbered bildeinnstillingene før du tar med den sårede larven, slik at responsen kan avbildes så raskt som mulig etter såring. Nøytrofiler kommer til såret innen 5 minutter, og reseptorer i de første ankommende cellene kan internalisere innen denne tidsrammen. Med praksis er det mulig å avbilde så tidlig som 15 min etter såring.
- Slå på mikroskopet: laser, kamera og datamaskin i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk anskaffelsesprogramvare til å konfigurere bildeinnstillingene. Velg lasere for passende fluoroforer og omtrentlige eksponeringstider basert på tidligere eksperimenter (skaff GFP med 488 nm og tagRFP med 561 nm laser).
- Overfør platen med det monterte embryoet, så snart som mulig etter at agarosesettene er satt, til den konfokale avbildningsplattformen.
- Bruk mikroskopets øyestykke for å finne fisken i parabolen ved hjelp av trinn joystick.
- Fokuser på sårområdet ved hjelp av fokuseringsknappen.
MERK: For å finne interesseområdet kan det være enklere å bruke et luftmål med lav forstørrelse (10x). - Velg feltet som skal avbildes rundt såret. Bruk et mål på 30x/40x med høy numerisk blenderåpning for å oppnå tilstrekkelig oppløsning.
- Bruk programvareknappene til å justere eksponeringstiden slik at fluorescerende markør kan sees med god kontrast, men uten å mette signalet.
MERK: Eksponeringstiden må være så lav som mulig for å minimere fluorescerende eksponering og maksimere tidsoppløsningen i tidsforløpet. Lasereffekten avhenger av laserens tilstand, men må justeres til et nivå som tillater lav nok eksponeringstid for dynamisk bildebehandling. - Bruk programvareknappene til å velge volumet som skal avbildes som en z-stack
- Sett opp en tidsforløp hver 30.
MERK: For sterile ventrale finsår observeres maksimal rekruttering med 2-3 timer. - Før du starter tidsforløpet, må du ta et øyeblikksbilde av et lyst felt for å dokumentere synsfeltet. Hvis det er mulig, skaff deg lyst felt i tidsforløpfilmen.
6. Kvantifisering av reseptor internalisering i sebrafisk nøytrofiler
- Registrer tidsintervallet for bildeanskaffelse og pikselstørrelsen for bildet. Hold oversikt over hvor mange minutter etter at avbildningen startet.
- Åpne bildedatasettene ved hjelp av Fiji ved å dra bildet til programvaregrensesnittet, velge en representativ ramme av interesse for hvert datasett ved hjelp av tidsglidebryteren, for eksempel ved 1-1,5 timers ettersåring, og lagre det.
- Fortsett med MATLAB for å behandle bildedatasettet.
- Opprett et nytt skript og inkluder funksjoner for bildelesing (linje 6 i skript kalt 'select_neutrophils.m' for centroid-definisjon i tilleggsfil 1), åpning (linje 11 i tilleggsfil 1) og manuelt utvalg av punkter på bildet (linje 12 i tilleggsfil 1).
- Åpne rammen av interesse ved å kjøre dette skriptet (Supplementary file 1), identifisere nøytrofiler å analysere ved visuell inspeksjon, klikk på dem og registrere en estimering av deres centroids, både i ventral fin sår og i CHT.
MERK: De ikke-mobiliserte nøytrofiler i CHT fungerer som en intern referanse for nøytrofiler hvis reseptorfordeling forblir konstant. Dette tillater normalisering av kontrastverdier av celler ved såret til en intern referanse. - Fortsett med segmentering av nøytrofiler i hver ramme ved hjelp av aktiv konturteknikk22 som beskrevet i trinnene nedenfor.
- Opprett en funksjon for å inkludere metadataene som kreves for segmentering av aktive konturer (dvs. antall gjentakelser, konturbias, estimert centroid osv.) 22 (se 'sårdata.m' i tilleggsfil 2).
- Opprett et skript som kaller funksjonen 'wound_data.m' for å legge inn nødvendig informasjon for segmentering av hver nøytrofil (linje 28 i skript kalt 'calc_contrast.m' i tilleggsfil 3).
- Inkluder i skriptkommandoene for bildelesing (linje 32 i tilleggsfil 3).
- Legg til genereringen av et svart bilde (dvs. bilde der bildepunktverdiene er nuller) med lik størrelse på inndatabildet (linje 44 i tilleggsfil 3) og definisjonen av en firkant på 10 × 10 piksler rundt sentrroiden til hver nøytrofil (linje 45 i tilleggsfil 3).
- Inkluder nøytrofilsegmenteringen ved hjelp av aktive konturer (linje 48-49 i tilleggsfil 3) og fjerning av små falske oppdagede objekter (linje 52 i tilleggsfil 3).
MERK: Den første segmenteringskonturen er firkanten rundt centroiden, som utvikler seg ved aktiv konturteknikk basert på pikselintensitetene, antall gjentakelser og konturbias. Resultatet av segmentering er en binær maske der alle bildepunkter har verdien 0 bortsett fra nøytrofilområdet der bildepunktene har verdien 1. - Inkluder multiplikasjonen av det segmenterte binære bildet med det opprinnelige bildet for å få pikselintensitetene til nøytrofil bare, mens resten av bildet ikke er et tall, slik at det ikke bidrar til beregninger (linje 56-57 i tilleggsfil 3).
- Legg til beregningen av matrisen for samtidig forekomst på grått nivå for hver nøytrofil (GLCM)14,23 (linje 61 i tilleggsfil 3). GLCM er en annen representasjon av bildet som viser relativ plassering av piksler når det gjelder pikselintensitet.
- Inkluder beregningen av kontrasten til nøytrofil basert på GLCM (linje 62,65 i tilleggsfil 3). Kontrastmetrikk måler forskjeller i intensitet mellom nærliggende bildepunkter. Bildepunkter sammenlignes med bildepunkter med en viss avstand fra hverandre, som kan justeres empirisk basert på størrelsen på lokale topper i intensitet. Som en indikasjon, for bildene, med en pikselstørrelse på 0,389 μm, da reseptoren viste bilisk fordeling, var hver lyse prikk i området 5 piksler. Derfor ble intensiteter sammenlignet i piksler med avstand 5 piksler fra hverandre.
- Legg til kommandoer for å lagre verdiene separat for individuelle nøytrofiler i ventralfinen (linje 68 i tilleggsfil 3).
- Inkluder beregningen av den gjennomsnittlige nøytrofilkontrastverdien fra alle CHT-nøytrofiler på samme måte som for nøytrofiler ved såret (linje 72-119 i tilleggsfil 3). For CHT-nøytrofiler, kall funksjonen 'cht_data.m' (linje 77 i tilleggsfil 4).
- Inkluder normaliseringen av kontrastverdien til individuelle nøytrofiler ved såret til gjennomsnittskontrasten til CHT-nøytrofiler beregnet ovenfor i trinn 6.16 (dvs. divisjon) (linje 122 i tilleggsfil 3). Dette gir en normalisert kontrast som gjenspeiler hvordan "prikkete" utseendet til reseptoren er i individuelle responderende celler i forhold til å kontrollere celler som ikke svarer (figur 3 og figur 4).
- Kjør skriptet (Tilleggsfil 3) ved å klikke på kjør-symbolet i programvaren.
- Gjenta alle trinnene for ulike forhold.
- Bruk statistisk programvare (se Materialfortegnelse) til å importere resultatene for de ulike betingelsene ved å opprette en kolonnetabell, tegne inn resultatene og utføre statistisk test for å kontrollere betydningen av forskjell mellom gjennomsnittsverdiene.
MERK: Kodene for analysen finner du også i GitHub på https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic
7. Chemokine responsanalyser i tidlige embryoer
MERK: Dette er et valgfritt sideeksperiment som gjør det mulig å teste reseptordistribusjonsendringer som svar på en kandidats kjemokin og er uavhengig av forsøkene beskrevet ovenfor om nøytrofiluttrykk av reseptorkonstruksjonene. Forskjeller i ligandindusert smugling mellom reseptorer er vanskelig å fastslå med denne teknikken, da ligandnivåene metter14. Men hvis man ser ligand-internalisering av en reseptor i dette systemet, kan dette være en indikasjon på at liganden gjenkjennes av reseptoren i tilfeller der ligandidentiteten er uklar. Dette er nyttig, fordi uttrykk for kjemokinreseptorer i etablerte cellelinjer som HEK293T-celler14 kan være tungvint.
- Sett opp et kryss av villfisk (f.eks. AB) og samle egg neste morgen kort tid etter å ha løftet separatorene (som beskrevet ovenfor).
- Injiser 100 pg fluorescerende merket reseptor mRNA (f.eks. Cxcr1-FT), sammen med 100 pg mRNA for en membranmarkør (f.eks. membran CFP). Inkluder i blandingen varierende doser av mRNA for kjemokin ligand.
MERK: Som en indikasjon på 150 pg Cxcl8a mRNA ga fremtredende internalisering av fluorescerende Cxcr1-FT (se figur 5). - Skyll embryoer med E3 medium og inkuber ved 28 °C.
- På ca 7 hpf, test uttrykk for mRNA på en fluorescerende dissekering omfang og velg embryoer til bilde.
- Forbered 0,8 % LMP-agarose på forhånd og oppbevar i glassrør i en varmeblokk ved 60 °C. Bruk en glasspipette for å manipulere embryoene. Dechorionate embryoer forsiktig ved hjelp av et par tang i hver hånd.
- Aspirer et individuelt dechorionated embryo med glasspipetten som sikrer at ingen bobler er på spissen. Slipp forsiktig embryoet inn i agaroserøret slik at det synker inn i røret.
- Aspirer embryoet fra agaroserøret, samle litt væske agarose underveis. Slipp forsiktig embryoet på midten av en glassbunnet bilderett. Roter raskt embryo slik at dyrestangen vender mot bunnen av parabolen (denne siden må være nærmest målet når du bruker et invertert mikroskop).
MERK: Man må kanskje justere retningen på embryoer mens agarose fortsatt er satt. - Etter at agarose er satt, supplere med 2 ml E3 medium.
MERK: Embryoene på dette stadiet er svært skjøre i forhold til larver, og det tar litt øvelse å dechorionate og montere. Det er viktig å aspirere og frigjøre så forsiktig som mulig, for å unngå embryobrudd. - Gjenta prosessen med sikte på å laste 3-5 embryoer per tallerken.
- Bildeembryoer på et invertert konfokalt mikroskop (se Materialtabell). Bruk et 40x/1.3 NA oljemål for å oppnå høy nok oppløsning. Visualiser mCFP, sfGFP og tagRFP med henholdsvis 405, 488 og 552 nm på området. Juster filtre og innstillinger slik at de har høy kontrast, samtidig som du unngår metning og minimerer lekkasje mellom kanalene.
- Gjenta monteringen og avbildningen for ulike forhold.
Representative Results
Ventral finsåring etterfølges av rask nøytrofilmobilisering fra CHT inn i ventralfinen og klynger ved sårmarginen, innen 30-60 min (figur 1). Vi visualiserte fordelingen av to kjemokinreseptorer, Cxcr1 og Cxcr2, som uttrykkes av sebrafisk nøytrofiler24 og gjenkjenner Cxcl8a og Cxcl8b14, ved hjelp av spinnende disk konfokal mikroskopi. Vi genererte to tilsvarende transgene linjer, Tg(lyz:Cxcr1-FT) og Tg(lyz:Cxcr2-FT), der nøytrofiler uttrykker en fluorescerende timer (FT) konstruksjon av reseptoren, det vil si en fusjon med en tandem av sfGFP og tagRFP (figur 2 og referanse14). Bruken av de to fluoroforene var ment å tillate overvåking av et bredt spekter av reseptor skjebner og gi estimater av proteinomsetningstid ved plasmamembranen, da nylig syntetiserte reseptorer ville fluoresce i grønt og gradvis bli rødt når de fylte 8,14 år. Imidlertid ble disse reseptorene funnet å ha rask konstituerende omsetning ved nøytrofil plasmamembranen, og at oppholdstiden var kortere enn modningstiden til tagRFP, med sfGFP som viser membranlokalisering og tagRFP som viser bilisk lokalisering ved steady state (Supplementary Video 1 og ref14). Derfor fokuserte vi på distribusjonen av sfGFP for å overvåke ligandindusert internalisering på steder med vevsskade. Mønsteret for reseptorfordeling ble kvantifisert ved hjelp av kontrastmetrikken, som rapporterer forskjeller i intensitet mellom nærliggende piksler. Begrunnelsen er at når reseptorfordelingen er membranøs og jevn, er kontrastverdien lav. Når reseptorfordelingen er vesikulær og mer punktlig, er kontrastverdien høy (figur 3).
En alternativ metode er å kvantifisere forholdet mellom reseptornivåer (sfGFP-intensitet) over nivåene av en kontrollmembranmarkør, for eksempel membran CFP (mCFP) (figur 3). Begge metodene kan oppdage reseptorinter internalisering, som indikert av mer vesikulær reseptorfordelingsmønster globalt i cellen (høyere kontrastverdi) eller lavere reseptornivåer ved membranen (lavere sfGFP / mCFP-forhold). Kontrastmetrikken kan imidlertid også oppdage reseptorinter internalisering i nøytrofilklynger ved såret, der membransegmentering var mindre nøyaktig og ikke anvendelig (figur 3). Ved hjelp av denne målingen kunne vi kvantifisere synlige forskjeller mellom Cxcr1 og Cxcr2 trafficking i nøytrofiler ved sår (figur 4 og supplerende video 2). Cxcr1-FT internalisert i celler som ligger ved såret, mens Cxcr2-FT forble membranøs i nøytrofiler ved såret (figur 4A-C, tilleggsvideo 2 og tilleggsvideo 3). Undertrykkelse av Cxcl8a og Cxcl8b, gjennom morpholino-behandling, påvirket differensialt Cxcr1-FT internalisering ved sår (figur 4C,D). For ytterligere å bekrefte at Cxcr1-FT reagerer på Cxcl8a, utførte vi kjemokinresponsanalyser i tidlige embryoer. Vi fant at Cxcr1-FT markant internaliserte i embryoer der Cxcl8a ble co-uttrykt (figur 5). Til sammen indikerer disse resultatene at de beskrevne metodene kan brukes til å måle kjemokinindusert reseptorinter internalisering i nøytrofiler og etablere identiteten til ligande mediering av disse effektene.
Figur 1: Nøytrofilmigrasjon til ventrale finsår. (A) (Venstre) Tegneserie av 3 dpf larve som viser plasseringen av kaudal hematopoietisk vev (CHT), venussirkulasjonen (VC, blå), ventralfinen (VF) og sårstedet. (Høyre) Tegneserie som skildrer sårets område (W) med nøytrofiler som blir mobilisert fra CHT og klynger på såret. Kaudale vene plexus (CVP) av CHT vevet er trukket i blått. (B) Bright field image (venstre) og confocal projeksjon (høyre) viser ventral fin sår og distribusjon av nøytrofiler i Tg (mpx:GFP) larver ved 2 h post-såring. Stiplede linjer viser VF- og CHT-omriss. Skalastang = 25 μm. Tegneserie og fluorescerende bilde modifisert fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Levende avbildning av kjemokinreseptorhandel i nøytrofiler. (A) Konstruksjoner som brukes til nøytrofil-spesifikke transgene uttrykk for Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) og Cxcr2-FT. Konfokale projeksjoner av nøytrofiler i hodet på en 3 dpf transgen larve (Tg(lyz:Cxcr1-FT), topp; Tg(lyz:Cxcr2-FT), nederst) som viser tRFP- (magenta) og sfGFP-kanaler (grønn). Skalastang = 20 μm. (B) Anatomisk skjema på 3 dpf larve som i figur 1A. Under larven er ordninger som skildrer sårets område (W) med nøytrofiler som mobiliseres fra CHT (toppen) eller utfører chemotaxis når de kommer inn i ventralfinen (bunnen). Stiplet firkant angir området som er avbildet i mellomkopier til høyre. (C) Nøytrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) larver (sfGFP vises) ved mobilisering fra CHT (topppaneler) eller chemotaxis mot såret (bunnpaneler). Piler viser de samme cellene over tid. Tidspunkter på høyre bilde er minutter brukt etter bilde til venstre. Skalalinje = 10 μm. (D) Skjematisk representasjon av eksperimentell tilnærming for levende avbildning av kjemokinreseptorhandel. Paneler A-C modifisert fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifiseringseksempler på reseptordynamikk. Enkle (blå) eller grupperte nøytrofiler (grønn) ved sår eller ikke-mobiliserte nøytrofiler i CHT (rød, oransje) ble segmentert og analysert ved forskjellige metoder for å sammenligne resultater. De samme eksempelcellene som ble vist, ble analysert med to metoder for å relatere det som ses i bildet, med verdiområdet trukket ut. (A) Overflaten på de merkede eksempelcellene ble segmentert basert på konturdefinisjon i sfGFP-kanalen. (B) Kontrast ble beregnet fra eksempelcellene vist i A. (C) Membranen til de merkede eksempelcellene ble segmentert basert på konturdefinisjon i CFP-kanalen. Ratiometrisk analyse av sfGFP/CFP fulgte. (D) Forholdet mellom sfGFP/CFP ble beregnet på eksempelcellene vist i C. Feilfelt representerer S.E.M. fra enkeltceller, i tilfeller av n>1, ble verdier her ikke brukt til statistisk analyse, men bare for å eksemplifisere målinger oppnådd med de forskjellige kvantifiseringsmetodene. Skalastang = 10 μm. Figur endret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Differensialdynamikken til Cxcr1 og Cxcr2 som svar på sår. (A) Konfokal projeksjon av nøytrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) eller Tg(lyz:Cxcr2-FT) larver ved såret ved 80 min post-såring (sfGFP kanal vist). Skalastang = 10 μm. (B) Forstørret Cxcr1-FT nøytrofil (venstre) og Cxcr2-FT (høyre) ved såret. Grønn reseptor vises i grått. Skalastang = 5 μm. (C) Normalisert kontrast (kontrast per individuelle nøytrofil normalisert til gjennomsnittlig kontrast av ikke-mobiliserte celler i CHT). cxcl8a refererer til injeksjon av en skjøteblokkering sammen med en oversettelsesblokkerende morpholino for cxcl8a. cxcl8b refererer til injeksjon med en skjøteblokkerende morpholino for cxcl8b. For Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 celler (CHT), n=47 celler (sår) fra 8 larver. For Tg(lyz:Cxcr1-FT) med morpholinos: n = 28 celler (Cxcl8a-MO) fra 5 larver, n = 16 celler (Cxcl8b-MO) fra 5 larver. For Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 celler (CHT) og n=20 celler (sår) fra 3 larver. Data ble samlet fra uavhengige larver anskaffet i 1-5 bildebehandlingsøkter. Kruskal-Wallis test med Dunns multippel sammenligningstest for Tg (lyz:Cxcr1-FT), to-tailed unpaired Mann-Whitney test for Tg (lyz:Cxcr2-FT). (D) Konfokal projeksjon av nøytrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) transgene larver behandlet med cxcl8a morpholino (MO) (venstre) og cxcl8b MO (høyre) som reagerer på finsår (sfGFP-kanal vist i grønt). Øyeblikksbilde tatt ved tidspunkter for tilsvarende nøytrofil akkumulering (85 min etter såring i venstre bilde og 45 min etter såring i høyre bilde). Skalastang = 10 μm. Figur endret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kjemokinresponsanalyse i tidlige embryoer. Laserskanning av konfektskiver av gastrulaterende embryoer som viser uttrykk og distribusjon av Cxcr1-FT. 100 pg Cxcr1-FT mRNA ble injisert i ett celletrinnsegg med eller uten 150 pg Cxcl8a mRNA. Grønne og røde reseptorer vises i separate kanaler. CFP-markør (mCFP) for kontrollmembranen vises i cyankanalen. Skalastang = 20 μm. Figur endret fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende film 1: Transgene nøytrofiler i hodet på en Tg(lyz:Cxcr1-FT) (venstre) og Tg(lyz:Cxcr2-FT) (høyre) larve ved 3 dpf. sfGFP(grønn), tagRFP (magenta). Bildeintervallet er 30 sek og bildefrekvensen er 5 bps. Skalastang = 20 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende film 2: Nøytrofiler i Tg(lyz:Cxcr1-FT) (venstre) og Tg(lyz:Cxcr2-FT) (høyre) transgene larver som reagerer på finsår. Filmen starter innen 10 min etter såring og varer 60 min. sfGFP (grønn), tagRFP (magenta). Bildeintervallet er 30 sek og bildefrekvensen er 10 bps. CHT = kaudalt hematopoietisk vev. VF = ventralfin. Skalastang = 25 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende film 3. Ytterligere eksempler på nøytrofiler fra en såret Tg(lyz:Cxcr1- FT) transgen larva (forskjellig larve som vist i Video 2), ervervet ved høyere oppløsning, viser reseptor internalisering (sfGFP kanal vist i grønt) ved mobilisering i CHT eller ved oppføring og chemotaxis i ventralfinen. Bildeintervallet er 30 sek og bildefrekvensen er 2 bps. Skalastang = 10 μm. Videoen stammer fra ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsfil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Metoden som er beskrevet tillater levende avbildning av reseptordynamikk som svar på endogene ligander in situ under en inflammatorisk respons på vevsskade. Bruken av Cxcr1/Cxcr2 nøytrofile reportere kan utvides til andre fysiologiske omgivelser, for eksempel infeksjon, tumormodeller eller andre typer vevsskader 14,25,26,27. I tillegg kan transgene redningslinjer, der den endogene reseptoren undertrykkes og reddes av en eksogen mutantreseptor, gi nyttige verktøy for å dissekere viktigheten av spesifikke nøytrofil migrasjonsmønstre i immunresponser. For eksempel forårsaker Cxcr1-reseptormutanter som har nedsatt desensibilisering mer fremtredende nøytrofilklynge på inflammatoriske steder14. Denne gevinsten av funksjon fenotype kan brukes til å forstå rollen som nøytrofil menighet i ulike fysiologiske prosesser, for eksempel sårreparasjon, smittsom sykdom eller tumorutvikling, og utfylle reseptor knockdown / knockout eksperimenter. Metodikken gir også grunnlag for å utvide utvalget av tilgjengelige reportere. Valget av fluorescerende reporter er viktig å vurdere og avhenger av det biologiske spørsmålet. Vi fant at den konstituerende omsetningen av disse kjemokinreseptorene i nøytrofiler var høy, sammenlignet med epitelceller, og at reportere med rask modning (f.eks. sfGFP) var pålagt å rapportere membrannivåer ved steady state og løse forskjeller ved nøytrofilstimulering 8,14. Dermed er membranforhold av sfGFP / tagRFP ikke aktuelt for måling av ligandindusert internalisering i denne celletypen, men mønsteret til tagRFP tillater sporing av reseptorens intracellulære skjebner, noe som kan være nyttig i noen studier. Vi fant også ut at det mer konsentrerte intracellulære signalet til tagRFP er nyttig for screening av individuelle larver. En alternativ tilnærming for måling av reseptornivåer ved plasmamembranen ville være å uttrykke en fluorescerende membranmarkør i nøytrofiler enten i samme transgene9 eller i en uavhengig transgene14. I det tidligere scenariet ville transgene gi et ekstra middel for å screene fisken og uttrykksnivåene ville være sammenlignbare mellom markøren og reseptoren. Sistnevnte tilnærming ville være mer modulær, ved at en sebrafisklinje med en reseptorreporter kunne kombineres med forskjellige reporterlinjer. I begge tilfeller er det verdt å merke seg at membran kvantifisering av reseptornivåene er utfordrende i klyngede nøytrofiler (se nedenfor). Til slutt merker vi oss at en mulig forlengelse av denne protokollen ville være å følge opp levende avbildning av immunhiistokjemi for mer detaljerte lokaliseringsanalyser.
Tol2 transgenese systemet er godt etablert7 og lysozyme C promotoren har blitt brukt mye for nøytrofil uttrykk11,15. Transgenesetilnærmingen er derfor relativt grei, og uttrykksnivået som oppnås med denne promotoren er høyt nok til å gi tilstrekkelig kontrast til analyse av reseptordynamikk. En mulig begrensning er at uttrykksnivået ikke rekapitlerer endogene reseptoruttrykksnivåer. Nye CRISPR-teknologier kan distribueres for å etablere knock-in linjer for reseptorer av spesiell interesse28. Disse teknologiene er fortsatt tungvint og garanterer kanskje ikke de nødvendige uttrykksnivåene for subcellulær avbildning, men deres vellykkede utvikling vil være et viktig gjennombrudd for å forstå endogen signaldynamikk. Funksjonell validering er viktig for å tolke data med transgene reseptorkonstruksjoner. For eksempel kan ligandgjenkjenningsanalyser brukes til å fastslå at det fluorescerende fusjonsproteinet er funksjonelt og redning av knockout-fenotyper kan brukes til å fastslå at de transgene nøytrofiluttrykksnivåene er kompatible med funksjonalitet14. Endelig ville en mer direkte måte å validere reseptorfusjonen være å bruke en in vitro funksjonell analyse med merket reseptor sammen med ikke-merkede versjoner14.
Kvantifiseringsmetoden tar for seg spesifikke vanskeligheter med nøyaktig membransegmentering i nøytrofiler in vivo. I celler av epitel natur kan kvantifisering av reseptornivåer utføres automatisk ved å normalisere membranreseptornivåer til en kontrollmarkør, som kan uttrykkes i tandem eller separat9. Faktisk har vi brukt en slik tilnærming, når vi bruker ligandgjenkjenningsanalysen i gastrulaterende embryoer14. Imidlertid gjennomgår nøytrofiler komplekse, raske endringer i celleform in vivo, noe som gjør membransegmenteringen vanskelig både i 2D og 3D14. Dette er enda mer utfordrende når nøytrofiler klynger, som forekommer i mange fysiologiske innstillinger29. Kontrastmetrikken overvinner denne begrensningen da den ikke krever membransegmentering, men gjenspeiler i stedet den generelle tilstanden til reseptorfordeling i cellen (membranøs / glatt vs vesikulær / prikk). Det er viktig å merke seg at kontrastmetrikk kan påvirkes av bildets generelle kontrast, så normalisering av individuelle celleverdier til en intern referanse er nødvendig for å ta hensyn til variasjon av signal i forskjellige embryoer / prøver. For eksempel brukte vi den gjennomsnittlige cellekontrastverdien til ikke-responsive nøytrofiler i CHT (dvs. nøytrofiler som forblir stasjonære og ikke migrerer inn i ventralfinen)14. En ekstra mulighet ville være å normalisere med kontrastverdier av en kontrollmarkør i samme celle. Dette vil gi en løsning når en intern referanse til celler som ikke svarer, ikke er tilgjengelig, og sannsynligvis kan løse finere kvantitative forskjeller i reseptordynamikk mellom ulike forhold.
Plasseringen av avbildning er en annen variabel å vurdere. Årsaken til å velge ventralfinsår her, i motsetning til den mer brukte halefinne sårmodellen 16,30, er fordi stedet for sår er i nærheten av stedet for nøytrofil bolig / trekkende opprinnelse. Dette akselererer tidslinjen til analysen, da det tar relativt lite tid for nøytrofiler å ankomme. I tillegg gir det muligheten til å fange celleadferd både ved migrasjonsopprinnelsen (CHT) og målplasseringen av interesse (sår). Dette er relevant her, fordi den romlige og tidsmessige oppløsningen som kreves for subcellulær avbildning, er vanskelig å kombinere med et stort synsfelt eller skanning med flere posisjoner. Dermed tillater ventral fin såranalyse sporing av utviklingen av migrasjonsresponsen fra migrasjonsopprinnelsen og samtidig fangst av uspesifiserte reseptorsvingninger i celler som ikke reagerer. Som nevnt ovenfor er sistnevnte nyttig for kvantifiseringsformål, da det gir en intern referanse for uspesifisert dynamikk. I andre systemer er det kanskje ikke mulig å ha en slik intern referanse, i så fall vil kontrastverdiene til en med-uttrykt membranmarkør gi en alternativ kontroll.
Oppsummert forventer vi at metodikken gjelder for andre systemer og kan distribueres til en rekke formål. For eksempel kan de samme reporterne brukes i andre inflammatoriske omgivelser, for eksempel infeksjonsinnstillinger eller andre sykdomsmodeller. Repertoaret til sebrafiskreseptorreporterlinjer kan utvides til andre signalreseptorer, for å forstå signalmekanismer eller rapportere liganddynamikk i vivo. Tilnærmingen kan kombineres med knockdown/knockout-teknikker for å forhøre det mekanistiske grunnlaget for observert dynamikk. Perturbasjon av liganduttrykk kan for eksempel angi ligandavhengigheten for observert reseptordynamikk. I fremtiden ser vi for oss at systemet kan bli ytterligere raffinert for å innlemme knock-in innsetting av reportere. Til syvende og sist vil funn som bruker denne metoden gi ny innsikt som er verdifull utover sebrafisksamfunnet, gitt bevaring av disse signalreseptorene hos pattedyr og den relative utfordringen med å gjennomføre disse studiene i større organismer.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt
Acknowledgments
Vi takker Christine Holt og Bill Harris for hjelp med konfiskert mikroskopi. Vi takker Darren Gilmour for fluorescerende timer ryggrad konstruksjoner og Anna Huttenlocher for Tol2-Lyz ryggraden vektoren. Vi takker Steve Renshaw for Tg(mpx:GFP)i114-linjen . Dette arbeidet ble støttet av MRC (MR/L019523/1), Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] og en Isaac Newton Trust-stipend 19.23(n). C.C. ble støttet av et MRC DTP-studentskap og delvis av Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] stipend. H.W. ble støttet av et MRC DTP Studentship. H.P. ble støttet av et Wellcome Trust PhD grant (105391/Z/14/Z) og delvis av en Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] stipend og MRC (MR/L019523/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl-2-thiourea | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| 50mL CellStar Centrifuge Tube | Grenier Bio-One Limited | 210270 | |
| Clark capillary glass | Harvard Apparatus | 30-0020 | |
| Cleanline Thin Bleach | Scientific Laboratory Supplies | CLE0301 | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ645 | |
| Dri Block heater | Techne | FDB02AD | |
| Fiji | National Institutes of Health, Bethesda, MD | ||
| Forceps, Jewelers Dumont No. 5 | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Glass pasteur pipette | Fisherbrand | 11795098 | |
| Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | 10391175 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| MATLAB | The MathWorks, Inc., Natick, MA | ||
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Microscope slide | Thermo-Scientific | J1800AMNZ | |
| PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope | Olympus | N/A | |
| Petri dish (120mm) | Grenier Bio-One Limited | 632180 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(A) Tailing Kit | Invitrogen | AM1350 | |
| Prism | GraphPad Software | ||
| Small paintbrush | N/A | ||
| Spectral Applied Research LMM5 laser module | N/A | ||
| Surgical Scalpel Blade No. 23 | Swann-Morton | 233-5528 | |
| Tricaine MS222 | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Volocity software | N/A | ||
| Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner | Yokogawa | N/A |
References
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annual Review of Immunology. 22, 891-928 (2004).
- Cotton, M., Claing, A. G protein-coupled receptors stimulation and the control of cell migration. Cellular Signalling. 21 (7), 1045-1053 (2009).
- Liu, X., et al. Bidirectional regulation of neutrophil migration by mitogen-activated protein kinases. Nature Immunology. 13 (5), 457-464 (2012).
- Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. Journal of Visualized Experiments. (115), e54511 (2016).
- Arnon, T. I., et al. GRK2-dependent S1PR1 desensitization is required for lymphocytes to overcome their attraction to blood. Science. 333 (6051), 1898-1903 (2011).
- Jung, H., Mithal, D. S., Park, J. E., Miller, R. J. Localized CCR2 Activation in the Bone Marrow Niche Mobilizes Monocytes by Desensitizing CXCR4. PloS One. 10 (6), 0128387 (2015).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Donà, E., et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient. Nature. 503 (7475), 285-289 (2013).
- Venkiteswaran, G., et al. Generation and dynamics of an endogenous, self-generated signaling gradient across a migrating tissue. Cell. 155 (3), 674-687 (2013).
- Minina, S., Reichman-Fried, M., Raz, E. Control of receptor internalization, signaling level, and precise arrival at the target in guided cell migration. Current Biology. 17 (13), 1164-1172 (2007).
- Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. Journal of Cell Science. 125, Pt 23 5702-5710 (2012).
- Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Buchan, K. D., et al. A transgenic zebrafish line for in vivo visualisation of neutrophil myeloperoxidase. PLoS One. 14 (4), 0215592 (2019).
- Coombs, C., et al. Chemokine receptor trafficking coordinates neutrophil clustering and dispersal at wounds in zebrafish. Nature Communications. 10 (1), 5166 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Khmelinskii, A., et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics. Nature Biotechnology. 30 (7), 708-714 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), 1115 (2009).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , Elsevier. Burlington. (2004).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Chan, T. F., Vese, L. A.
- Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural features for image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. SMC-3 (6), 610-621 (1973).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 93 (5), 761-769 (2013).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish infection: From pathogenesis to cell biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), 1000562 (2010).
- Poplimont, H., et al. Neutrophil swarming in damaged tissue is orchestrated by connexins and cooperative calcium alarm signals. Current Biology. 30 (14), 2761-2776.e7 (2020).
- Cornet, C., Di Donato, V., Terriente, J. Combining Zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline. Frontiers in Pharmacology. 9, 703 (2018).
- Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
- Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing tissue repair in zebrafish larvae with time-lapse brightfield stereomicroscopy. Journal of Visualized Experiments. (95), e52654 (2015).
